專利名稱：乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)及乳糖濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乳糖濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳糖是嬰幼兒主要的能量來源，進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是嬰幼兒腦發(fā)育的必需物質(zhì)，與嬰幼兒大腦的迅速成長(zhǎng)有密切聯(lián)系。為防止乳 清粉中摻加用其他還原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的檢測(cè)十分必要。 牛奶是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食品，但如飲用不當(dāng)，也會(huì)給健康帶來不良影B向。很多人在 飲奶后出現(xiàn)腹部不適、腹脹、多屁、腹痛甚至腹瀉等癥狀，這種現(xiàn)象在醫(yī)學(xué)上稱為乳糖不耐 受癥，其原因是這些人小腸缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖進(jìn)入結(jié)腸后，經(jīng)結(jié)腸 中的細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生大量氣體、醋酸等物質(zhì)所致。大量研究證實(shí)，患有乳糖不耐受的人還有 大部分沒有任何癥狀、只有人體生化指標(biāo)改變的隱性不耐受者，醫(yī)學(xué)上稱為乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界都存在乳糖不耐受的問題，其中亞洲人發(fā)生率最高，為 95%-100%。據(jù)中國(guó)疾病控制中心調(diào)查，我國(guó)北京、上海、廣州等地3_13歲兒童乳糖不耐受 癥和乳糖吸收不良的發(fā)生率約為80%。乳糖不耐受除引起消化道癥狀外，還可造成人體營(yíng) 養(yǎng)吸收不良。據(jù)國(guó)外研究，乳糖不耐受可減少鈣的攝入、減少峰值骨量、增加骨丟失從而引 發(fā)骨質(zhì)疏松癥，乳糖不耐受可影響鐵和鋅的吸收，造成鐵缺乏和鋅缺乏，并可影響小兒的腦 發(fā)育，對(duì)人體健康危害很大。 在食品分析領(lǐng)域中，酶分析法是廣為使用并倍受諸如ISO等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)推薦的 一種方法。酶析法理論發(fā)展成熟并且已為實(shí)驗(yàn)室普遍接受。使用高質(zhì)量經(jīng)純化的酶可以實(shí) 現(xiàn)對(duì)復(fù)雜物質(zhì)中特定成份的檢測(cè)。該方法可以檢測(cè)的目標(biāo)代謝物有糖類、酸類及其鹽類、醇 類和其他物質(zhì)等。由此，各種食品樣品均可被快速檢測(cè)并獲得良好的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric
Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量通過酶聯(lián)反應(yīng)生成噴嗒胺色原(Indamine
dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導(dǎo)致在400-700nm波長(zhǎng)處吸光度的上升，得以測(cè)
定乳糖濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，采
用該試劑不僅可以在可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行乳糖濃度測(cè)定，而且測(cè)
定速度快、靈敏度大、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明乳糖濃度測(cè)定方法如下 乳糖+水乳糖酶半乳糖+葡萄糖 葡萄糖+氧葡萄糖氧化酶葡糖酸內(nèi)酯+過氧化氫 過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或
5
醌亞胺色原+水 這個(gè)方法應(yīng)用乳糖酶(lactase ;EC 3. 2. 1. 108)(偶)聯(lián)葡萄糖氧化酶 (GlucoseOxidase ;EC 1. 1. 3. 4)及過氧化物酶(peroxidase ;EC 1. 11. 1. 7)酶促反應(yīng)終點(diǎn) 比色法。乳糖酶酶解乳糖反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖，再通過(偶)聯(lián)合葡萄糖氧化酶的作用，最后生 成的過氧化氫在過氧化物酶的作用下，將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從 而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長(zhǎng)處， 測(cè)定染料-吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)-含量高低的光 吸收大?。煌ㄟ^測(cè)量400-700nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的程 度，得出乳糖濃度大小測(cè)定結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，如下成分 關(guān)系的本發(fā)明乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)較為理想
緩沖液 穩(wěn)定劑 過氧化物酶 乳糖酶
葡萄糖氧化酶 還原型色原體組合
100,1/L
500,1/L
30000U/L
10000U/L
12000U/L
0. 1-20,1/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個(gè)組合中的任何一個(gè)配對(duì)組
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N， N-雙乙基-m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2 ，4-雙氯石碳酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羥基 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3， 5-雙氯石碳酸磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3， 5-雙氯_2-羥基. 3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)_m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2， 2' -AZIN0-雙(3_乙基苯噻唑_6_磺酸) 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3-甲基_乙基_羥基苯胺 4-氨基抗砒 石碳酸 4-氨基抗砒 N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺 4-氨基抗砒 N， N-雙乙基-m-甲苯胺 4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸 4-氨基抗砒 2， 4， 6-仨溴-3-羥基 4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸 4-氨基抗砒 3，5-雙氯-2-羥基. 4-氨基抗砒 N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)_m-甲苯胺鈉鹽 4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸 4-氨基抗砒 雙甲基苯胺 4-氨基抗砒 N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒 2， 2' -AZINO-雙(3_乙基苯噻唑_6_磺酸) 4-氨基抗砒 4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺。 本發(fā)明的乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。試劑 (盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、乳糖酶、葡萄糖氧化酶。
過氧化物酶、還原型色原體組合、乳糖酶、葡萄糖氧化酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。 也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、乳糖酶、葡萄糖氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的乳糖診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
乳糖酶 10000U/L
葡萄糖氧化酶 12000U/L
過氧化物酶 30000U/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37 °C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)505nm，測(cè)
試副波長(zhǎng)600nm，被測(cè)乳糖樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，
檢測(cè)方法為終點(diǎn)比色法，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)505nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的乳糖診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括0108] 試齊[J 1
O109] 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 0110] 穩(wěn)定劑
0111] 2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 0112] 試劑2
0113]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液
0114] 穩(wěn)定劑
01巧]乳糖酶
0116] 葡萄糖氧化酶
0117] 過氧化物酶
0118] 4-氨基抗砒
0119] 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
0120] 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37 。C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)546nm，測(cè) 試副波長(zhǎng)600nm，被測(cè)乳糖樣品與試劑的體積比例為1/20，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 檢測(cè)方法為終點(diǎn)比色法，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
0121] 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)546nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。
100,1/L 50mmol/L 0. 2mmol/L
100,1/L 500,1/L 10000U/L 12000U/L 30000U/L 0. 6mmol/L
J定試劑為三試劑，包括
鹽酸緩沖液
鹽酸緩沖液
實(shí)施例三
本實(shí)施例的乳糖診斷/; 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
葡萄糖氧化酶 過氧化物酶 雙甲基苯胺
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑 乳糖酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37 °C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)578nm，測(cè) 試副波長(zhǎng)660nm，被測(cè)乳糖樣品與試劑的體積比例為1/30，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 檢測(cè)方法為終點(diǎn)比色法，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)578nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。
0122, 0123: 0124: 0125: 0126: 0127: 0128: 0129:
0130: 0131:
0132: 0133: 0134: 0135: 0136: 0137: 0138: 0139'
鹽酸緩沖液
100,1/L 50mmol/L 0. 6mmol/L
100,1/L 500,1/L 12000U/L 30000U/L 2mmol/L
100,1/L 500,1/L 10000U/L
申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均 能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)0. 0012 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升 曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)15mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度， 其相對(duì)偏差不超過±4%;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈 敏度可達(dá)O. 0018±0. 0009 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā) 明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乳糖濃度測(cè)定方法，其方法如下乳糖+水 乳糖酶 半乳糖+葡萄糖葡萄糖+氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸內(nèi)酯+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶 吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測(cè)400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收程度，得出乳糖濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成雙劑試 劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶、 葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成。過氧化物酶、還原型色原體組合、乳糖 酶、葡萄糖氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧 化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶組成。過氧化 物酶、還原型色原體組合乳糖酶、葡萄糖氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不 限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一 種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于所述還原型色原體組 合可以是下列28個(gè)組合中的任一個(gè)配對(duì)組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙緩沖液 穩(wěn)定劑過氧化物酶 乳糖酶葡萄糖氧化酶 還原型色原體組合石碳酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N， N-雙乙基-m-甲苯胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`2 ，4-雙氯石碳酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`2， 4， 6-仨溴-3-羥基-苯磺酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`3， 5-雙氯石碳酸磺酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`3，5-雙氯_2-羥基-苯磺酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽`3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`2， 2， -AZIN0-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)`3- 甲基-2-苯噻唑酮腙`4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3-甲基-乙基-羥基苯胺 4_氨基抗砒石碳酸`4_氨基抗砒N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺`4_氨基抗砒N， N-雙乙基-m-甲苯胺`4_氨基抗砒`2 ，4-雙氯石碳酸`4_氨基抗砒`2， 4， 6-仨溴-3-羥基-苯磺酸`4_氨基抗砒`3， 5-雙氯石碳酸磺酸4_氨基抗砒，3，5_雙氯_2-羥基-苯磺酸 4_氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4_氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4_氨基抗砒雙甲基苯胺4_氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4_氨基抗砒，2， 2， -AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4_氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4_氨基抗砒3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乳糖濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應(yīng)，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長(zhǎng)處，測(cè)定染料含量的高低，進(jìn)而直接反映出乳糖濃度的大小。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101793685SQ20091002857
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司