專利名稱:乳糖診斷/測定試劑(盒)及乳糖濃度測定方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種乳糖診斷/測定試劑(盒),同時本發(fā)明還涉及測定乳糖濃度的方
法,屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域。
背景技術:
乳糖是嬰幼兒主要的能量來源,進入體內后經(jīng)小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖,半乳糖是嬰幼兒腦發(fā)育的必需物質,與嬰幼兒大腦的迅速成長有密切聯(lián)系。為防止乳 清粉中摻加用其他還原糖如葡萄糖替代乳糖,乳糖的檢測十分必要。 牛奶是一種營養(yǎng)豐富的食品,但如飲用不當,也會給健康帶來不良影B向。很多人在 飲奶后出現(xiàn)腹部不適、腹脹、多屁、腹痛甚至腹瀉等癥狀,這種現(xiàn)象在醫(yī)學上稱為乳糖不耐 受癥,其原因是這些人小腸缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖,乳糖進入結腸后,經(jīng)結腸 中的細菌發(fā)酵,產生大量氣體、醋酸等物質所致。大量研究證實,患有乳糖不耐受的人還有 大部分沒有任何癥狀、只有人體生化指標改變的隱性不耐受者,醫(yī)學上稱為乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 據(jù)統(tǒng)計,全世界都存在乳糖不耐受的問題,其中亞洲人發(fā)生率最高,為 95%-100%。據(jù)中國疾病控制中心調查,我國北京、上海、廣州等地3_13歲兒童乳糖不耐受 癥和乳糖吸收不良的發(fā)生率約為80%。乳糖不耐受除引起消化道癥狀外,還可造成人體營 養(yǎng)吸收不良。據(jù)國外研究,乳糖不耐受可減少鈣的攝入、減少峰值骨量、增加骨丟失從而引 發(fā)骨質疏松癥,乳糖不耐受可影響鐵和鋅的吸收,造成鐵缺乏和鋅缺乏,并可影響小兒的腦 發(fā)育,對人體健康危害很大。 在食品分析領域中,酶分析法是廣為使用并倍受諸如ISO等國際標準機構推薦的 一種方法。酶析法理論發(fā)展成熟并且已為實驗室普遍接受。使用高質量經(jīng)純化的酶可以實 現(xiàn)對復雜物質中特定成份的檢測。該方法可以檢測的目標代謝物有糖類、酸類及其鹽類、醇 類和其他物質等。由此,各種食品樣品均可被快速檢測并獲得良好的結果。
發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術,計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化,得以測定乳糖濃度的方法,同時,本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn) 該方法的乳糖診斷/測定試劑(盒),采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行乳糖濃度測定,而且測定速度快、準確度高,因而可以得到切實的推 廣應用。 本發(fā)明乳糖濃度測定方法如下 乳糖+水半乳糖苷酶葡萄糖+半乳糖 葡萄糖+氧葡萄糖氧化酶葡糖酸內酯+過氧化氫 過氧化氫+輔酶NAD(P)H氧化酶還原型輔酶+氧
3[OCrn] 這種方法應用半乳糖苷酶(lactose synthase ;EC 2. 4. 1. 22)酶(偶)聯(lián)葡萄糖 氧化酶(Glucose Oxidase ;EC 1. 1. 3. 4) 、NAD(P)氧化酶(NAD(P)H oxidase ;ECl. 6. 3. 1)酶
促反應速率比色法/終點法。半乳糖苷酶酶解乳糖反應產生葡萄糖,再通過(偶)聯(lián)合葡 萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶的作用,最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原 型輔酶(在340nm處有吸收峰),從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度, 通過測量340nm處吸光度上升的程度,可以測算乳糖的濃度大小。 實驗表明,從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮,無論是單 劑、雙劑還是三劑,如下成分關系的本發(fā)明乳糖診斷/測定試劑(盒)較為理想
100,1/L 500,1/L 3mmol/L 半乳糖苷酶 10000U/L 葡萄糖氧化酶 12000U/L NAD(P)氧化酶 12000U/L 本發(fā)明的乳糖診斷/測定試劑(盒)可以是單劑,包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶。
輔酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖苷酶。 輔酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試 劑,直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑,本發(fā)明測定乳糖濃度的方法,其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
液劑
沖定酶
緩穩(wěn)輔
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具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的乳糖診斷/測定試劑為單試劑,包括 [O(HO] 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3,1/L
半乳糖苷酶 10000U/L
葡萄糖氧化酶 12000U/L
NAD(P)氧化酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進行冷凍干燥,制成干粉試劑;使用前,加入純凈 水,復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:,反應時間10分鐘,起始吸光度《0. l,測
試主波長340nm,測試副波長405nm,被測乳糖樣品與試劑的體積比例為1/25,反應方向為
正反應(上升反應),延遲時間大約0分鐘左右,檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應,最終將反應物置于生化分析儀下,檢測
主波長340nm吸光度上升的程度,從而測算出乳糖的濃度大小。 實施例二 本實施例的乳糖診斷/測定試劑為雙試劑,包括
試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 半乳糖苷酶 10000U/L 葡萄糖氧化酶 12000U/L NAD(P)氧化酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:,反應時間10分鐘,起始吸光度《0. l,測
試主波長340nm,測試副波長405nm,被測乳糖樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,
反應方向為正反應(上升反應),延遲時間大約0分鐘左右,檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應,最終將反應物置于生化分析儀下,檢測
主波長340nm吸光度上升的程度,從而測算出乳糖的濃度大小。 實施例三 本實施例的乳糖診斷/測定試劑為三試劑,包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3,1/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
葡萄糖氧化酶 12000U/L
NAD(P)氧化酶 12000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 半乳糖苷酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。測定乳糖濃度時,在全自動生化分析儀上設定溫度37t:,反應時間IO分鐘,起始
吸光度《0. 1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測乳糖樣品與試劑1、試劑2、試劑3
的體積比例為4/40/5/5,反應方向為正反應(上升反應),延遲時間大約0分鐘左右,檢測
時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應,最終將反應物置于生化分析儀下,檢測 主波長340nm吸光度上升的程度,從而測算出乳糖的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證,采用以上發(fā)明內容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的,鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同,不另一一例舉。 總之,實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0008 ;吸光度時間反應曲線應呈上 升曲線直至終點;試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達30mmol/L ;試劑測試的不準確 度,其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 0016±0. 0008 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存,活性可以穩(wěn)定一年;—— 本發(fā)明靈敏度高、精確度好,線形范圍寬廣,穩(wěn)定期長,足以便于推廣應用。
權利要求
一種酶比色法及酶聯(lián)法的乳糖的濃度測定方法,其方法如下乳糖+水 半乳糖苷酶 葡萄糖+半乳糖葡萄糖+氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸內酯+過氧化氫過氧化氫+輔酶 NAD(P)H氧化酶 還原型輔酶+氧將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的程度,測算出乳糖的濃度大小測定結果。
2. —種乳糖診斷/測定試劑(盒),主要成分包括 緩沖液 20-500mmol/L穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L輔酶 1-6mmol/L半乳糖苷酶 1000——80000U/L 葡萄糖氧化酶 1000——80000U/L NAD(P)氧化酶 1000-80000U/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍;在此范圍內效果較好,在此范圍外,試劑仍會 反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液 體試劑,直接使用。
3. 根據(jù)權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒),其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒),其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶組成雙劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、 NAD(P)氧化酶組成。輔酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。
5. 根據(jù)權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒),其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶組成多劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化 酶組成;試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖苷酶組成。輔酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、 NAD(P)氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒),其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一 種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的乳糖診斷/測定試劑(盒),同時本發(fā)明還涉及測定乳糖濃度的方法、試劑的組成及成分,屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)氧化酶及穩(wěn)定劑;通過將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生一系列的酶促反應,再將反應物置于紫外/可見光分析儀下,檢測主波長340nm處吸光度上升的程度,從而測算出乳糖的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101793794SQ20091002856
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司