專利名稱：乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)及乳糖濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乳糖濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳糖是嬰幼兒主要的能量來(lái)源，進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是嬰幼兒腦發(fā)育的必需物質(zhì)，與嬰幼兒大腦的迅速成長(zhǎng)有密切聯(lián)系。為防止乳 清粉中摻加用其他還原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的檢測(cè)十分必要。 牛奶是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食品，但如飲用不當(dāng)，也會(huì)給健康帶來(lái)不良影B向。很多人在 飲奶后出現(xiàn)腹部不適、腹脹、多屁、腹痛甚至腹瀉等癥狀，這種現(xiàn)象在醫(yī)學(xué)上稱為乳糖不耐 受癥，其原因是這些人小腸缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖進(jìn)入結(jié)腸后，經(jīng)結(jié)腸 中的細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生大量氣體、醋酸等物質(zhì)所致。大量研究證實(shí)，患有乳糖不耐受的人還有 大部分沒有任何癥狀、只有人體生化指標(biāo)改變的隱性不耐受者，醫(yī)學(xué)上稱為乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界都存在乳糖不耐受的問(wèn)題，其中亞洲人發(fā)生率最高，為 95%-100%。據(jù)中國(guó)疾病控制中心調(diào)查，我國(guó)北京、上海、廣州等地3_13歲兒童乳糖不耐受 癥和乳糖吸收不良的發(fā)生率約為80%。乳糖不耐受除引起消化道癥狀外，還可造成人體營(yíng) 養(yǎng)吸收不良。據(jù)國(guó)外研究，乳糖不耐受可減少鈣的攝入、減少峰值骨量、增加骨丟失從而引 發(fā)骨質(zhì)疏松癥，乳糖不耐受可影響鐵和鋅的吸收，造成鐵缺乏和鋅缺乏，并可影響小兒的腦 發(fā)育，對(duì)人體健康危害很大。 在食品分析領(lǐng)域中，酶分析法是廣為使用并倍受諸如ISO等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)推薦的 一種方法。酶析法理論發(fā)展成熟并且已為實(shí)驗(yàn)室普遍接受。使用高質(zhì)量經(jīng)純化的酶可以實(shí) 現(xiàn)對(duì)復(fù)雜物質(zhì)中特定成份的檢測(cè)。該方法可以檢測(cè)的目標(biāo)代謝物有糖類、酸類及其鹽類、醇 類和其他物質(zhì)等。由此，各種食品樣品均可被快速檢測(cè)并獲得良好的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量通過(guò)酶聯(lián)反應(yīng)生成噴嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導(dǎo)致在400-700nm波長(zhǎng)處吸光度的上升，得以測(cè) 定乳糖濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，采 用該試劑不僅可以在可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行乳糖濃度測(cè)定，而且測(cè) 定速度快、靈敏度大、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明乳糖濃度測(cè)定方法如下 乳糖+尿苷二磷酸乳糖合成酶尿苷二磷酸_半乳糖+葡萄糖
葡萄糖+氧葡萄糖氧化酶葡糖酸內(nèi)酯+過(guò)氧化氫
過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亞胺色原+水 這個(gè)方法應(yīng)用乳糖合成酶(lactose synthase ;EC 2. 4. 1. 22)(偶)聯(lián)葡萄糖氧化 酶(Glucose Oxidase ;EC 1. 1. 3. 4)及過(guò)氧化物酶(peroxidase ;EC 1. 11. 1. 7)酶促反應(yīng)終 點(diǎn)比色法。乳糖合成酶酶解乳糖反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖，再通過(guò)(偶)聯(lián)合葡萄糖氧化酶的作用， 最后生成的過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶的作用下，將無(wú)色的還原型色原體組合氧化成有色的染 料，從而可以通過(guò)可見光分析儀器，在400-700nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波 長(zhǎng)處，測(cè)定染料-噴嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)-含量高 低的光吸收大?。煌ㄟ^(guò)測(cè)量400-700nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升 的程度，得出乳糖濃度大小測(cè)定結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，如下成分 關(guān)系的本發(fā)明乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)較為理想
緩沖液
穩(wěn)定劑
過(guò)氧化物酶
乳糖合成酶
葡萄糖氧化酶
尿苷二磷酸
還原型色原體組合
100,1/L
500,1/L
30000U/L
10000U/L
12000U/L
6mmol/L
0. 1-20,1/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個(gè)組合中的任何一個(gè)配對(duì)組 -2-苯噻唑酮腙
3-
石碳酸 3-甲基 乙基
N-3-N， 3-2， 3-2， 3-3， 3-3， 3-N-3-
仨 3-
2-苯噻唑酮腙 N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺 2-苯噻唑酮腙 雙乙基-m-甲苯胺 2-苯噻唑酮腙
4- 雙氯石碳酸 甲基-2-苯噻唑酮腙
4，6-仨溴-3-羥基-甲基-2-苯噻唑酮腔
5- 雙氯石碳酸磺酸 甲基-2-苯噻唑酮腔
5-雙氯-2-羥基 甲基-2-苯噻唑酮腙
乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽 甲基-2-苯噻唑酮腙 溴羥基苯甲酸
2-苯噻唑酮腙





































雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2， 2， -AZIN0-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3_甲基-乙基. 4_氨基抗砒 石碳酸
氨基抗砒
乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺 氨基抗砒
N-雙乙基-m-甲苯胺 氨基抗砒
4- 雙氯石碳酸 氨基抗砒
4，6-仨溴-3-羥基 氨基抗砒
5- 雙氯石碳酸磺酸 氨基抗砒 5-雙氯-2-羥基 氨基抗砒
乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽 氨基抗砒 溴羥基苯甲酸 氨基抗砒 雙甲基苯胺
4_氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4_氨基抗砒
2， 2， -AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4_氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4_氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
本發(fā)明的乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成
4-N-4-N， 4-2， 4-2， 4-3， 4-3， 4-N-4-
仨 4—
酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、尿苷二磷酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶。
過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸在試劑1 或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、尿苷二磷酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶。 過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)-實(shí)施例一
-步的說(shuō)明,









本實(shí)施例的乳糖診斷/; 三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑 乳糖合成酶 葡萄糖氧化酶 過(guò)氧化物酶 尿苷二磷酸 4_氨基抗砒 石碳酸
J定試劑為單試劑，包括
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 10000U/L 12000U/L 30000U/L 6mmol/L 2mmol/L
10mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37 °C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)505nm，測(cè) 試副波長(zhǎng)600nm，被測(cè)乳糖樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 檢測(cè)方法為終點(diǎn)比色法，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)505nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。















實(shí)施例二
本實(shí)施例的乳糖診斷/: 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
尿苷二磷酸
2，4，6-仨溴-3-羥基_ 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
乳糖合成酶
葡萄糖氧化酶
過(guò)氧化物酶
4_氨基抗砒
J定試劑為雙試劑，包括
鹽酸緩沖液100mmol/L 50mmol/L 6mmol/L 0.2mmol/L
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 10000U/L 12000U/L 30000U/L 0. 6mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37 °C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)546nm，測(cè) 試副波長(zhǎng)600nm，被測(cè)乳糖樣品與試劑的體積比例為1/20，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 檢測(cè)方法為終點(diǎn)比色法，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)546nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。 0124] 實(shí)施例三
J定試劑為三試劑，包括
0125] 0126] 0127] 0128] 0129] 0130] 0131] 0132] 0133] 0134] 0135] 0136] 0137] 0138] 0139] 0140] 0141] 0142]
本實(shí)施例的乳糖診斷/; 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
尿苷二磷酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
葡萄糖氧化酶
過(guò)氧化物酶
雙甲基苯胺
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑 乳糖合成酶
鹽酸緩沖液100mmol/L 50mmol/L 6mmol/L 0.6mmol/L
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 12000U/L 30000U/L 2mmol/L
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37 °C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)578nm，領(lǐng)試副波長(zhǎng)660nm，被測(cè)乳糖樣品與試劑的體積比例為1/30，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 檢測(cè)方法為終點(diǎn)比色法，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)578nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出乳糖的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均 能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所 需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0012 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)15mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確 度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±4% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 0018±0. 0009 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩(wěn)定一年；—— 本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
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權(quán)利要求
一種酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乳糖濃度測(cè)定方法，其方法如下乳糖+尿苷二磷酸 乳糖合成酶 尿苷二磷酸-半乳糖+葡萄糖葡萄糖+氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸內(nèi)酯+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合 過(guò)氧化物酶 吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測(cè)400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收程度，得出乳糖濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、尿苷二磷酸、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成。過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、尿苷二磷酸、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶組成。過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于所述還原型色原體組緩沖液穩(wěn)定劑過(guò)氧化物酶乳糖合成酶葡萄糖氧化酶尿苷二磷酸還原型色原體組合合可以是下列28個(gè)組合中的任一個(gè)配對(duì)組合 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸·3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺·3-甲基-2-苯噻唑酮腙N， N-雙乙基-m-甲苯胺·3-甲基-2-苯噻唑酮腙·2 ，4-雙氯石碳酸·3-甲基-2-苯噻唑酮腙·2， 4， 6-仨溴-3-羥基-苯磺酸·3-甲基-2-苯噻唑酮腙·3， 5-雙氯石碳酸磺酸·3-甲基-2-苯噻唑酮腙·3，5-雙氯_2-羥基-苯磺酸·3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽·3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸·3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺·3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺·3-甲基-2-苯噻唑酮腙·2， 2， -AZIN0-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)·3- 甲基-2-苯噻唑酮腙·4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3-甲基-乙基-羥基苯胺 4_氨基抗砒石碳酸·4_氨基抗砒N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺·4_氨基抗砒N， N-雙乙基-m-甲苯胺·4_氨基抗砒·2 ，4-雙氯石碳酸·4_氨基抗砒·2， 4， 6-仨溴-3-羥基-苯磺酸`4_氨基抗砒`3， 5-雙氯石碳酸磺酸`4_氨基抗砒`3，5-雙氯_2-羥基-苯磺酸 4_氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽`4_氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸`4_氨基抗砒雙甲基苯胺`4_氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4_氨基抗砒`2， 2， -AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4_氨基抗砒`4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4_氨基抗砒`3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乳糖診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乳糖濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、尿苷二磷酸、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)，最終將無(wú)色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過(guò)可見光分析儀器，在400-700nm波長(zhǎng)處，測(cè)定染料含量的高低，進(jìn)而直接反映出乳糖濃度的大小。
文檔編號(hào)C12Q1/54GK101793703SQ20091002821
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司