專利名稱：：?jiǎn)伟费趸冈\斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)中，測(cè)定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免疫抑制法和化學(xué)分光光度法。熒光法是以e-苯乙胺作為底物來(lái)檢測(cè)單胺氧化酶，其依據(jù)是e-苯乙胺在10100mg時(shí)反應(yīng)速度最大，高于芐胺和5-羥色胺的反應(yīng)速度。免疫學(xué)方法則利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應(yīng)用較多的單克隆抗體有MA0-A3C9、MA0-A4F10、MA0-A7B10、MA0-A7E10和MA0-B1C2等。相對(duì)而言，化學(xué)分光光度法應(yīng)有更為普遍?？梢杂脝伟费趸复呋奉愥尫懦龅倪^(guò)氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲?；?3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)等發(fā)色劑進(jìn)行測(cè)定，也可以應(yīng)用芐胺(Benzylamine)、對(duì)苯甲胺-l3-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、|3-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyr咖ine，又稱"3-對(duì)羥基苯乙胺，，，3-pa:rahdroxyphenylethyl咖ine)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine)等作為反應(yīng)底物來(lái)測(cè)定單胺氧化酶的活性。其中，應(yīng)用苯甲胺類型底物測(cè)得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物測(cè)得的活性約為3-對(duì)羥基苯乙胺作底物的30%。目前，單胺氧化酶測(cè)定多用芐胺和對(duì)苯甲胺-e-偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛，然后在強(qiáng)堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng)，生成醛苯腙，這在生化儀上測(cè)定較困難；對(duì)苯甲胺-P_偶氮萘酚方法則需要用環(huán)乙烷提取，限制了該方法的實(shí)用性，且不能應(yīng)用全自動(dòng)生化儀分析。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的單胺氧化酶診斷/測(cè)定試劑(盒)，采用該試劑(盒)不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行單胺氧化酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法如下胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧輔酶A+3-甲酰乙酸+輔酶丙二酸_半醛脫氡酶二氧化碳+乙酰-輔酶A+還原型輔酶這種方法應(yīng)用單胺氧化酶(MonoamineOxidase;EC1.4.3.4;EC1.4.3.6)酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(pyruvateoxidase(CoA-acetylating);EC1.2.3.6)、丙二酸-半醛脫氫酶(malonate-semiEildehydedehydrogenase;EC1.2.1.18)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。單胺氧化酶酶解胺類化合物反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，再通過(guò)(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、丙二酸-半醛脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算單胺氧化酶的活性濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷/測(cè)定試劑較為理想<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明測(cè)定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對(duì)苯甲胺_P_偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、P_苯乙基胺、酪胺、5_羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。碳酸氫鈉(二氧化碳)可以用其它碳酸氫鹽取代。本發(fā)明的單胺氧化酶診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸氧化酶、丙二酸-半醛脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳h乙酰輔酶AJ-甲酰乙酸。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳h乙酰輔酶AJ-甲酰乙酸。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙二酸_半醛脫氫酶。輔酶、丙酮酸氧化酶、丙二酸-半醛脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、3-甲酰乙酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳h乙酰輔酶AJ-甲酰乙酸。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙二酸_半醛脫氫酶。試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶。輔酶、丙酮酸氧化酶、丙二酸-半醛脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、3_甲酰乙酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例一本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500,1/L輔酶3mmol/L丙酮酸氧化酶12000U/L丙二酸_半醛脫氫酶10000U/L芐胺5mmol/L碳酸氫鈉12mmol/L乙酰輔酶A3mmol/L3-甲酰乙酸3mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值4180。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。實(shí)施例二本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑50mmol/L輔酶3mmol/L芐胺乙酰輔酶A3-甲酰乙酸試劑2三(羧甲基)氨基甲烷穩(wěn)定劑丙酮酸氧化酶丙二酸_半醛脫氫酶5mmol/L12mmol/L3mmol/L3mmol/L鹽酸緩沖液100mmol/L500,1/L12000U/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.l，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值2170。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑50mmol/L輔酶3mmol/L節(jié)胺5mmol/L碳酸氫鈉12mmol/L乙酰輔酶A3mmol/L3-甲酰乙酸3mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500mmol/L丙二酸-半醛脫氫酶10000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500mmol/L丙酮酸氧化酶12000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測(cè)定單胺氧化酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.l，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值2170。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上
發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉?？傊?，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線上升；試劑可測(cè)有效(R>0.99)線形范圍可達(dá)500U/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±5%;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《3%;試劑的靈敏度可達(dá)O.0002±0.0001AA/min/U/L;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。權(quán)利要求一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法，其方法如下胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧輔酶A+3-甲酰乙酸+輔酶丙二酸-半醛脫氫酶二氧化碳+乙酰-輔酶A+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小測(cè)定結(jié)果。2.一種單胺氧化酶診斷／測(cè)定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液20一一500ram(’l／L穩(wěn)定劑l一一4000mm(’l／L輔酶l一一6ram(1l／L丙酮酸氧化酶1000一一80000[J／L丙二酸一半醛脫氫酶1000一一80000[J／L胺類化合物l一一50mmc，l／L碳酸氫鈉(二氧化碳)l一一50ram(1l／L乙酰輔酶A工一一50ram(1l／L3一甲酰乙酸l一一50ram(1l／L本發(fā)明測(cè)定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述“胺類化合物”優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對(duì)苯甲胺一p一偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、p一苯乙基胺、酪胺、5一羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。碳酸氫鈉(二氧化碳)可以用其它碳酸氫鹽取代。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷／測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸氧化酶、丙二酸一半醛脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、3一甲酰乙酸組成單劑試劑。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷／測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸氧化酶、丙二酸一半醛脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、3一甲酰乙酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、3一甲酰乙酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙二酸一半醛脫氫酶組成。輔酶、丙酮酸氧化酶、丙二酸一半醛脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、3一甲酰乙酸在試劑l或試劑2中的位置可以不限。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷／測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸氧化酶、丙二酸一半醛脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、3一甲酰乙酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、3一甲酰乙酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙二酸一半醛脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶組成。輔酶、丙酮酸氧化酶、丙二酸_半醛脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳h乙酰輔酶AJ-甲酰乙酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A、3-甲酰乙酸、丙酮酸氧化酶、丙二酸-半醛脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。文檔編號(hào)C12Q1/26GK101793690SQ20091002820公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2009年2月4日優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日發(fā)明者王爾中申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司