專利名稱：模擬ibdv多表位基因的分子設計及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及模擬傳染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位基因epis的分子設計、 序列(包括epis部分以及n次重復序列)、表達質粒構建以及疫苗制備方法，屬于生 物制藥領域。
二背景技術：
傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害幼雞 淋巴組織，特別是中樞免疫器官一法氏囊為主要特征的傳染病。該病在國內外廣泛流 行，其危害主要包括兩個方面 一是引起3 8周齡的雞發(fā)病和死亡，尤其是近年來超 強毒株(vvIBDV)的出現(xiàn)使雛雞死亡率大大增加；二是雛雞早期感染本病，則引起 免疫抑制，導致雞群對其它疫病的易感性增高和對疫苗的免疫應答能力降低或失敗， 造成巨大的間接經濟損失。
IBDV屬雙RNA病毒科，基因組包括大(A)小(B)兩個片段，已確認有五種 病毒蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4禾BVP5。 VP1為病毒自身編碼的依賴RNA的RNA 聚合酶，由B片段編碼。其它四種病毒蛋白由A片段編碼，VP2和VP3是病毒的主 要結構蛋白，構成病毒衣殼，VP2相對含量較多，中和抗原表位主要存在于VP2上， 且多為構象依賴性，用構象依賴性中和抗原表位誘導的中和抗體能被動地保護宿主不 受IBDV感染，VP4為病毒自身蛋白酶，VP5的功能尚不明確。大腸桿菌表達的VP2 免疫原性較差，表明VP2的后加工過程對VP2的結構形成至關重要。
目前，IBD仍然是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一，雖然研制了多種商品化的弱毒 疫苗和滅活疫苗，但其安全性和制造工藝尚有不盡人意之處，如為抵抗超強毒的攻擊， 使用中強毒力的毒株研制活疫苗，給IBD的防制帶來極大的隱患，滅活疫苗存在著抗 原制備的困難。因此，國內外學者一直在探索免疫原性好且安全性高的新型疫苗，先 后運用大腸桿菌、酵母、雞痘病毒載體、桿狀病毒以及核酸疫苗載體單獨或者共同表 達了A片段cDNA、 VP2、 VP3和VP4基因。分析這些研究成果，從重組亞單位疫苗 到病毒載體疫苗以及核酸疫苗，有的不能產生中和抗體，有的則不能兼顧高保護力和 囊損傷問題，有的還存在著表達量低、保護率低、免疫程序復雜以及難以工業(yè)化標準 生產等缺點。
蛋白質分子上的抗原表位(亦稱抗原決定簇)是蛋白質抗原性的物質基礎。近年 來研究發(fā)現(xiàn)的模擬抗原表位，本質上是構象依賴性表位，雖然模擬表位的氨基酸順序 與蛋白質分子一級結構的氨基酸順序截然不同，卻可以引起特異性的免疫反應，因此， 在免疫應答中的地位極為重要。用常規(guī)基因克隆表達方法研制的重組亞單位疫苗，盡 管人們采用多種方法進行復性，仍然難以完全恢復到天然的構象，導致部分構象依賴
3性抗原表位丟失，其中可能是中和抗原表位，從而影響到機體產生完全有效的保護性 免疫應答。IBDV的中和抗原表位主要存在于結構蛋白VP2上，均為構象依賴性，因 此，采用克隆表達IBDV病毒結構蛋白基因研制IBD基因工程疫苗的常規(guī)思路和方法， 使重組蛋白難以完成天然的蛋白質構象，導致部分構象依賴性抗原表位缺失或改變， 其中很多是重要的具有保護作用的中和抗原表位，從而影響到機體產生完全有效的保 護性免疫應答。對此，人們采用了不同的研究策略，例如，改變表達方法和表達系統(tǒng)、 對重組蛋白結構進行充分地復性等，這些措施采取后，蛋白質結構問題可能部分解決， 但又會出現(xiàn)表達量低、制備工藝復雜或生產成本高等新的問題。這表明，采用新的研 究思路和技術路線制備新型IBD基因工程疫苗的必要性與緊迫性。
發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明針對IBD基因工程疫苗研究難點，將抗原表位免疫應答的分 子免疫學理論應用于基因工程疫苗研究，突破了以往采用克隆表達病毒結構蛋白基因 方法進行基因工程疫苗研究的傳統(tǒng)思路和方法。制備IBDV中和表位與優(yōu)勢抗原表位 單克隆抗體，綜合運用單克隆抗體與噬菌體展示隨機肽庫技術，分析IBDV保護性免 疫應答相關的中和抗原表位和優(yōu)勢抗原表位，設計合成具有免疫保護功能的模擬 IBDV多表位基因epis，制備IBDV表位基因工程疫苗。在進行epis分子設計時，由 于采用線性化序列模擬了 IBDV空間構象依賴性表位基序，因此大腸桿菌表達的重 組IBDV多表位蛋白rEPIS制備工藝簡單、成本低、生物安全性高。
技術方案
模擬IBDV多表位基因epis，其特征在于，該基因的長度為471bp，編碼155aa， 命名為epis，其序列為SEQIDNO.l。其所編碼的多表位蛋白rEPIS，其氨基酸序列為 SEQIDN0.2。模擬IBDV多表位基因epis的重組表達質粒pET-epis，其構建方法為
化學合成上述IBDV多表位基因epis，用pMD18-T載體克隆，獲得epis重組克 隆質粒pMD-epis，根據pET28b(+)啟動子下游閱讀框，將epis基因的克隆質粒 pMD-epis和pET28b(+)質粒用限制性內切酶Sacl和HindIII酶切，經瓊脂糖凝膠電泳 后，回收pMD-epis的epis基因片段和pET28b的載體片段，用T4 DNA連接酶連接 兩片段，轉化大腸桿菌JM109，涂布于含終濃度為30pg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板 上，37。C培養(yǎng)14h，挑取單菌落，接種在3mL含kan的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)14h， 抽提質粒，酶切鑒定，獲取陽性重組表達質粒pET-epis。
模擬IBDV多表位基因epis的重組表達質粒pET-epis轉化大腸桿菌BL21(DE3) 獲得重組菌pET-epis/BL21 。培養(yǎng)誘導重組菌pET-epis/BL21 ， 10000 r/min高速離心20 min沉淀菌體，棄上清液，用pH7.2的PBS緩沖液懸浮菌體，置于0X:冰水浴，超聲 波破碎菌體(超聲功率500~600W、每次超聲時間10min、重復2~4次)直至渾濁菌 液變?yōu)橥该骶?，即為抗原重組模擬IBDV多表位蛋白rEPIS，用PBS調整抗原濃度 至1000pg/mL，抗原與白油佐劑按1:1配比，乳化，制備IBDV表位基因工程疫苗。 IBDV表位基因工程疫苗可在制備傳染性法氏囊病診斷抗原方面的應用。
4有益效果本發(fā)明的特點和優(yōu)點如下
IBDV基因組包括大(A)小(B)兩個片段，編碼5種病毒蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4和VP5。 VP2和VP3是病毒的主要結構蛋白，也是病毒主要保護性抗原， 目前已知的IBDV中和表位主要存在于VP2上，為構象依賴性。用常規(guī)的分子克隆技 術直接克隆病毒結構蛋白，在原核或真核系統(tǒng)中表達，難以兼顧表達量、制備工藝和 生產成本等方面的問題。因此，如何使重組蛋白保持IBDV保護性免疫所必須的構像， 以形成有效的中和表位，成為IBD基因工程疫苗亟待解決的問題。
本發(fā)明針對IBD基因工程疫苗研究難點，將抗原表位免疫應答的分子免疫學理論 應用于基因工程疫苗研究，突破了以往采用克隆表達病毒結構蛋白基因方法進行基因 工程疫苗研究的傳統(tǒng)思路和方法。運用IBDV單克隆抗體和噬菌體隨機肽庫獲取IBDV 抗原表位基序，設計合成具有免疫保護功能的模擬IBDV多表位基因，利用線性序列 來模擬替代構象依賴性的中和表位序列，使基因工程方法表達的重組蛋白一級結構具 有所需的中和表位序列，把中和表位的構象依賴性轉變成線性而使問題得到解決。此 外，由于單個抗原表位分子量小、結構簡單，免疫原性弱，在體內易被降解，以往通 常采用表位肽與載體蛋白進行偶聯(lián)的方法來提高免疫原性，用這種偶聯(lián)蛋白免疫動物 產生的抗體絕大部分是針對載體蛋白的，本發(fā)明采用多個抗原表位模擬肽串聯(lián)并重復 兩次，構建模擬IBDV多表位基因epis，提高了重組蛋白的分子量、免疫原性和穩(wěn)定 性。將設計的epis利用表達量高且生產工藝簡便的大腸桿菌表達系統(tǒng)制備IBDV表位 基因工程疫苗。用SPF雞進行免疫攻毒試驗證明，重組多表位蛋白rEPIS可誘導機體 產生抗IBDV感染的保護性免疫應答，可用于制備IBDV表位基因工程疫苗，同時具 備良好的生物安全性。
在進行epis分子設計時，由于采用線性化序列模擬了 IBDV空間構象依賴性表位 基序，因此大腸桿菌表達的重組IBDV多表位蛋白rEPIS制備工藝簡單、成本低、
生物安全性高。
本發(fā)明拓寬了IBDV基因工程疫苗的研究思路，不僅巨大的生產應用前景，而且 具有重要的理論意義。
四

圖1模擬IBDV多表位基因epis序列
圖2模擬IBDV多表位基因印is重組克隆質粒pMD-epis圖譜 圖3模擬IBDV多表位基因epis重組表達質粒pET-epis圖譜
五具體實施例方式
本發(fā)明是制備IBDV中和表位與優(yōu)勢抗原表位單克隆抗體，綜合運用單克隆抗 體和噬菌體隨機肽庫技術，獲取IBDV抗原表位基序，根據表位基序進行分子設計、 化學合成模擬IBDV多表位基因epis，運用基因工程技術構建重組表達質粒pET-epis， 使epis基因在大腸桿菌中獲得高效表達，然后以大腸桿菌表達的重組IBDV多表位蛋 白rEPIS作為抗原，加上相應的佐劑制成IBDV表位基因工程疫苗。本發(fā)明采用的具體技術路線包括以下三個方面
1.模擬IBDV多表位基因epis的分子設計、表達質粒構建以及在大腸桿菌 中的表達
1) 抗IBDV單克隆抗體免疫活性分析
通過單克隆抗體對應抗原表位分析與單克隆抗體病毒中和能力的測定兩個試驗 鑒定抗IBDV單克隆抗體的免疫活性，篩選IBDV中和表位單抗與優(yōu)勢抗原表位單抗。
(1) 單克隆抗體對應抗原表位分析
采用間接ELISA相加實驗。將腹水單克隆抗體分別稀釋至達飽和時的工作濃度， 在此濃度下各取50%兩兩混勻。分別測定混合的單克隆抗體及飽和濃度下單一腹水單 克隆抗體的爿45o值。計算加成指數(shù)AM2Ah2/(A!+A2)—1]x100X (Ai、八2分別為兩
株不同單克隆抗體所測的J45G值，Ai+2為兩兩混合抗體所測的山5()值)，每組重復試
驗3次，計算其平均值。Al值^50。/a寸，認為兩種單克隆抗體識別不同的抗原表位。 相加間接ELISA結果表明，單克隆抗體HNF1、 HNF7、 B34、 2B1和2G8與不同的 IBDV抗原表位反應(單克隆抗體HNF1、 HNF7、 B34、 2B1和2G8均為公知公用見 參考文獻l王軍，李銀，范紅結，周宗安，施正良，王永山(通訊作者).傳染性法氏 囊病病毒抗原表位分析——單克隆抗體的制備與鑒定.中國預防獸醫(yī)學報， 2005,27(3):171-174; 2陳光華，蔣桃珍，董琳琳，龔人雄.雞傳染性法氏囊病病毒單 克隆抗體的研究.中國獸藥雜志，2000,34(3):9-13)。
(2) 單克隆抗體病毒中和能力的測定
采用固定病毒-稀釋抗體的中和試驗法分析單克隆抗體對IBDV的中和能力。用 MEM營養(yǎng)液(GIBCO公司產品)將IBDV病毒培養(yǎng)物(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸 醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，毒種編號cvccAV8)稀釋成200 TCIDWO.lml，將無菌 采取的各單克隆抗體腹水分別用MEM營養(yǎng)液從1:100起10倍比連續(xù)稀釋，取每個稀 釋度的單克隆抗體溶液0.1 ml加入0.1 ml病毒液(200 TCID5o)， 37 'C感作1 h，然后 加入到預先做好的雞胚成纖維細胞(CEF)(用中牧集團乾元浩生物股份有限公司南京 生物藥廠SPF雞胚制備，制備方法文獻殷震，劉景華主編.動物病毒學(第二版). 北京科學出版社，1997， 223.)單層培養(yǎng)孔中，于37'C、 5% (302和飽和濕度條件 下繼續(xù)培養(yǎng)接種后的CEF，觀察CEF生長情況。試驗同時設立IBDV病毒、IBDV陽 性血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、SPF雞血清(購自中牧集團乾元浩生物股份有限 公司南京生物藥廠SPF雞)、腹水和MEM營養(yǎng)液空白對照。在病毒中和試驗中，單 克隆抗體B34和2G8對病毒有較強的中和能力，腹水單抗的中和效價為105，而單克 隆抗體HNF1、 HNF7和2B1則沒有明顯的中和能力，是IBDV優(yōu)勢抗原表位，腹水 單抗的病毒中和效價小于102。
2) 傳染性法氏囊病病毒抗原表位基序的獲取
用純化的抗IBDV中和表位與優(yōu)勢抗原表位單克隆抗體HNF1、 HNF7、 B34、 2B1和2G8分別包被ELISA微孔板，濃度100|iig/ml， 15(HiL/ L， 4。C過液，用1%牛血清 白蛋白(BSA)封閉，PBST (含0.1% Tween-20 )洗滌6遍，加入含2xl010 pfii噬 菌體展示隨機12肽庫原液(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit試劑盒的組 成部分，該試劑盒購自NEW ENGLAND 8101^^@公司)，室溫置lh; PBST洗滌10 遍；用100i!L0,2mol/LGly-HCl(pH2.2)洗脫8min;加入15pL lmol/L Tris-HCl (pH9.1 ) 中和洗脫液。用常規(guī)方法滴定洗脫液中的噬菌體，計算噬菌體的產出率產出率(％) =洗脫噬菌體數(shù)(Output) /淘洗用噬菌體數(shù)(Input) xl00%。將洗脫液接種到20mL 新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌ER2738 (該菌株是Ph.D,12TM Phage Display Peptide Library Kit 試劑盒的組成部分)培養(yǎng)液中，37。C振蕩培養(yǎng)4.5h， 4°C、 10000r/min離心lOmin， 收集上清液，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液(含20% PEG,o和2.5mol/LNaCl)， 4°C 過液，4°C、 10000 r/min離心15 min,用lmL TBS重懸沉淀，按照上述方法用 PEG/NaCl再次沉淀，最終用200pL TBS重懸沉淀，滴定后置4'C保存。將單克隆抗 體的包被濃度降低至50pg/mL，洗滌用的PBST中Tween-20的濃度提高到0.5%，按 上述步驟再淘洗2次。經過3次淘洗后，從每株單克隆抗體篩出的噬菌斑中隨機挑取 單克隆藍色噬菌斑12個，擴增。用夾心ELISA、單克隆抗體競爭抑制ELISA和IBDV 競爭抑制ELISA等免疫學方法分析篩選肽與IBDV抗原表位的相關性。根據ELISA 和競爭抑制試驗分析結果，從每株單克隆抗體挑出的12個單克隆藍色噬菌斑中選定 10個，制備單鏈DNA模板，測序，分析單克隆抗體對應的抗原表位12肽優(yōu)勢序列。 5株IBDV單克隆抗體對應的抗原表位12肽優(yōu)勢序列為
HNF1 CCT AAG ACT CAT AAT TCT GGT CGT TCT AAT GTG GAT
PKTHNSGRSNVD HNF7 ACG CTT CAT CTG CCG CAT TTG TGG CGG CCT CTT TCT
TLHLPHLWRPLS B34 CAT AAT GCG AAG TAT GTG TCG GCT GAG TCT TGG GGG
HNAKYVSAESWG 2B1 CAT CCG GAT AGT ATT CAT CCG TTT CTG GCG TCT CCT
HPDSIHP.FLASP 2G8 GAT ACT CTT CAT GGG CAT GGT TTT ACT AAT TGG TTT
DTLHGHGFTNWF
(1) 噬菌體短肽的ELISA檢測方法的操作步驟分別以5株單克隆抗體HNF1、 HNF7、 B34、 2B1和2G8包被ELISA板，包被濃度5ng/mL， 1。/。BSA封閉，加入對 應單克隆抗體篩出的單克隆噬菌體擴增培養(yǎng)物，室溫放置60min，洗滌，加入HRP-羊抗M13單克隆抗體(Amersham Pharmacia Biotech公司產品)，進行間接ELISA。 檢測在篩選12肽內是否存在IBDV單克隆抗體結合位點。以J值均大于1.00為陽性 判定標準。
(2) 單克隆抗體競爭抑制ELISA方法的操作步驟為驗證篩選肽的特異性， 分別以5株單克隆抗體包被ELISA板，以對應游離的單克隆抗體作為競爭抑制物， 分別與對應單克隆抗體篩出的噬菌體培養(yǎng)物共同反應60min，洗滌，加入HRP-羊抗 M13單克隆抗體，進行競爭抑制ELISA。計算抑制率，分析篩選12肽與單克隆抗體 結合的特異性。以抑制率大于40%為陽性判定標準。(3) IBDV競爭抑制ELISA方法的操作步驟與上述單克隆抗體競爭抑制ELISA
相似，只是以游離的IBDV作為競爭抑制物，分別與對應單克隆抗體篩出的噬菌體培
養(yǎng)物共同反應。計算抑制率，進一步驗證篩選12肽內的IBDV抗原表位。以抑制率
大于40%為陽性判定標準。
TOM^ O —未摻入競爭抑制物的^值一摻入競爭抑制物的^值扁0/
未摻入競爭抑制物的^值 ° 將上述5個12肽的氨基酸序列分別與GenBank中IBDV基因組A片段(GenBank
登錄AF443294, AF362776, AF454945)和B片段(GenBank登錄AF362774，
AF455136)編碼蛋白的氨基酸序列進行比較，發(fā)現(xiàn)2B1篩選肽有4個連續(xù)氨基酸殘
基L-A-S-P與IBDV基因組A片段編碼多聚蛋白的第536-599氨基酸殘基一致，推測
2B1為線性表位；而HNF1、 HNF7、 B34和2G8篩選肽均沒找到有3個以上連續(xù)氨
基酸殘基與IBDV基因組編碼蛋白氨基酸殘基相同之處，是構象依賴性表位。
3 )模擬IBDV多表位基因epis的分子設計
參照5株單克隆抗體對應的抗原表位優(yōu)勢序列設計模擬IBDV多表位基因epis， 方法是將5個抗原表位用GGGS四肽串聯(lián)(HNF1-HNF7-B34-2B1-2G8)并重復一 次(HNF1-HNF7-B34-2B1-2G8-HNF1-HNF7-B34-2B1-2G8)，該模擬IBDV多表位基 因的長度為471bp，編碼155aa，命名為印is，其序列為:
ATG CCT AAG ACT CAT AAT TCT GGT CGT TCT AAT GTG GAT GGT GGA GGT TCG ACG CTT
MPKTHNSGRSNVDGGGSTL CAT CTG CCG CAT TTG TGG CGG CCT CTT TCT GGT GGA GGT TCG CAT AAT GCG MG TAT
HLPHLWRPLSGGGSHNAKY GTG TCG GCT GAG TCT TGG GGT GGA GGT TCG CAT CCG GAT AGT ATT CAT CCG TTT CTG
VSAESWGGGSHPDSIHPFL GCG TCT CCT GGT GGA GGT TCG GAT ACT CTT CAT GGG CAT GGT TTT ACT AAT TGG TTT
ASPGGGSDTLHGHGFTNWF GGT GGA GGT TCG CCT AAG ACT CAT MT TCT GGT CGT TCT AAT GTG GAT GGT GGA GGT
GGGSPKTHNSGR'SNVDGGG TCG ACG CTT CAT CTG CCG CAT TTG TGG CGG CCT CTT TCT GGT GGA GGT TCG CAT AAT
STLHLPHLWRPLSGGGSHN GCG AAG TAT GTG TCG GCT GAG TCT TGG GGT GGA GGT TCG CAT CCG GAT AGT ATT CAT
AKYVSAESWGGGSHPDSIH CCG TTT CTG GCG TCT CCT GGT GGA GGT TCG GAT ACT CTT CAT GGG CAT GGT TTT ACT
PFLASPGGGSDTLHGHGFT AAT TGG TTT TAA TAG
NWF水 承
4)重組表達質粒pET-epis的構建及其在大腸桿菌中表達
公
化學合成IBDV多表位基因epis，用pMD18-T載體(購自大連寶生物TaKaRa 司)克隆，獲得epis重組克隆質粒pMD-epis。根據pET28b(+)(購自Novagen公司) 啟動子下游閱讀框，將epis基因的克隆質粒pMD-epis和pET28b(+)質粒用限制性內 切酶Sad和HindIII酶切，經瓊脂糖凝膠電泳后，回收pMD-epis的epis基因片段(約 500bp)和pET28b(+)的載體片段(約5.3kb)，用T4 DNA連接酶連接兩片段，轉化大 腸桿菌JM109 (Novagen公司)，涂布于含終濃度為30嗎/mL卡那霉素(kan)的LB
8瓊脂平板上，37。C培養(yǎng)14h。挑取單菌落，接種在3mL含kan的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)14h，抽提質粒，酶切鑒定，獲取陽性重組表達質粒pET-epis。
用pET-印is轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen公司)，獲得重組菌pET-epis/BL21 ，挑取單菌落，接種在3mL含kan的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)14h。次日，以1%接種在含kan的新鮮LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)2h后，向LB培養(yǎng)基中加入終濃度為lmmol/L的IPTG， 37。C繼續(xù)培養(yǎng)4h，誘導生產重組IBDV多表位蛋白rEPIS。取1.5mL細菌培養(yǎng)液，高速離心，SDS-PAGE分析，掃描分析rEPIS的表達量與分子量。rEPIS的表達量約30%，分子量約20kDa。
5)重組IBDV多表位蛋白rEPIS免疫反應性分析
以免疫印跡法(Western-blotting)用IBDV單克隆抗體和多克隆抗體進行平行試驗，分析rEPIS的特異性和免疫反應性。方法是將誘導前后的重組菌pET-epis/BL21進行SDS-PAGE (分離膠濃度15%)，然后電轉移到硝酸纖維膜(Amersham PharmaciaBiotech公司產品)上，將膜按泳道剪成條，用抗IBDV單克隆抗體HNF1、 HNF7、B34、 2B1、 2G8混合液和堿性磷酸酶(AP)標記的兔抗鼠IgG (購自南京生興生物技術公司)先后與轉移膜反應，顯色，觀察顯色條帶位置，分析rEPIS的特異性和免疫反應性。在用IBDV多克隆抗體(購自南京生興生物技術公司)進行的平行對照試驗中，只是用IBDV多克隆抗體和AP標記的羊抗兔(購自南京生興生物技術公司)IgG替代對應抗體，其它與單克隆抗體試驗相同。試驗同步設BL21(DE3)和pET28b轉化的BL21(DE3)菌對照。在免疫印跡試驗中，IBDV單克隆抗體和多克隆抗體均可與rEPIS反應，在約20kDa處出現(xiàn)一條蛋白印跡，與SDS-PAGE的分析結果一致，表明rEPIS具有IBDV特異性和免疫反應性。
2.表達重組IBDV多表位蛋白rEPIS的免疫攻毒實驗
1) 免疫抗原的制備
用PBS調整重組IBDV多表位蛋白rEPIS的蛋白抗原濃度至至1000嗎/mL，抗原與白油佐劑按l:l配比，乳化。
2) 動物分組與免疫
14日齡SPF來航雞(中牧集團乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠)180只，隨機分成3組rEPIS加佐劑免疫組、單用佐劑對照組和飼養(yǎng)對照組，60只/組，隔離飼養(yǎng)。rEPIS加佐劑免疫組，胸部肌肉注射佐劑型rEPIS免疫物，rEPIS的有效免疫劑量為50ng/只/次，單用佐劑對照組則只注射等體積的佐劑，均免疫注射2次，間隔7d;詞養(yǎng)對照組中的雞不進行免疫，只是與兩個免疫組在相同條件下飼養(yǎng)。實驗雞每間隔7d經翅下靜脈采血，以常規(guī)間接ELISA測定血清中IBDV抗體的效價。
3) 攻毒
在第2次免疫7d后，用1:100稀釋的IBDV強毒株GX8/99 (參考文獻崔治中，孫淑紅，單忠芳，蔣玉雯，金文杰.雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株GX8/99株的致病性.病毒學報，2002, 18(2):162-166.)感染雞法氏囊組織懸液在實驗雞的眼和鼻內各滴0.1mL (病毒量約200個ELD50)，實驗觀察7d，及時取出死亡雞、剖解檢查法氏囊變化，記錄實驗結果。4)免疫攻毒實驗結果
用IBDV間接ELISA檢測rEPIS免疫雞血清抗體，第一次免疫7d后抗體效價為1:1600;第二次免疫7d后抗體效價升高到1:12800 (表1)。從攻毒后的第3d，單用佐劑和飼養(yǎng)對照兩個組的攻毒雞開始死亡，在7d的實驗觀察期間，單用佐劑對照組的發(fā)病率為83.3% (50/60)(發(fā)病率包括IBD臨床癥狀陽性、法氏囊組織IBD病變陽性和IBDV檢測陽性)、死亡率為35.0% (21/60)，飼養(yǎng)對照組的發(fā)病率為85.0% (51/60)、死亡率為36.7% (22/60);rEPIS加佐劑組攻毒后的發(fā)病率為0.0% (0/60)、死亡率為1.7%(1/60)、免疫保護率為98.3% (59/60)(表2)。攻毒實驗結果表明，注射免疫100嗎重組IBDV多表位蛋白rEPIS的SPF雞(50嗎/次><2次)能夠抵抗IBDV強毒的攻擊。表1重組IBDV多表位蛋白rEPIS免疫SPF雛雞后的血清抗體檢測結果
分組0了142128
rEPIS+佐劑100320012800256000512000
佐劑對照100100100100100
空白對照100100100100100
表2重組IBDV多表位蛋白rEPIS免疫SPF雛雞的攻毒試驗結果
分組抗攻毒時的抗體效價發(fā)病率#死亡率免疫保護率
rEPIS+佐劑128000.0%(0/60)1.7% (1/60)98.3% (59/60)
佐劑對照10083.3%(50/60)35.0% (21/60)_
空白對照100■85.0% (51/60)36.7% (22/60)_
#發(fā)病率包括IBD臨床癥狀陽性、法氏囊組織IBD病變陽性和IBDV檢測陽性。
3. IBDV表位基因工程疫苗的制備與使用
疫苗制備方法培養(yǎng)誘導重組菌pET-epis/BL21， 10000 r/min高速離心20 min沉淀菌體，棄上清液，用PBS緩沖液(pH7.2)懸浮菌體，置于O'C冰水浴，超聲波破碎菌體(超聲功率500~600W、每次超聲時間10min、重復2~4次)直至渾濁菌液變?yōu)橥该骶?，即抗原重組IBDV多表位蛋白rEPIS。用PBS調整抗原濃度至1000嗎/mL，抗原與白油佐劑按1:1配比，乳化，即為IBDV表位基因工程疫苗。
疫苗使用方法肌肉注射0.2ml/只/次(rEPIS的有效含量50嗎)，兩周后進行第2次免疫，可使免疫雞產生有效的抗IBDV抗體。SEQUENCE LISTING
<110> 江蘇省農業(yè)科學院
中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所
<120>模擬IBDV多表位基因的分子設計及其應用<130> 說明書<160> 12
<170>Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221>模擬IBDV多表位基因epis序列<222> (1)..(471)<223><400> 1
atgcctaaga ctcataattc tggtcgttct aatgtggatg gtggagg"c gacgcttcat 60
ctgccgcatt tgtggcggcc tctttctggt ggaggttcgc ataatgcgaa gtatgtgtcg 120
gctgagtcU ggggtggagg Ucgcatccg gatagtattc atccgtttct ggcgtctcct 180
ggtggaggtt cggatactct tcatgggcat ggttttacta attggtttgg tggaggttcg 240
cctaagactc ataattctgg tcgttctaat gtggatggtg gaggttcgac gcttcatctg 300
ccgcatttgt ggcggcctct ttctggtgga ggttcgcata atgcgaagta tgtgtcggct 360
gagtcUggg gtggaggttc gcatccggat agtattcatc cgtttctggc gtctcctggt 420
ggaggttcgg atactcttca tgggcatggt tttactaatt ggttttaata g 471
<210> 2
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工合成<220>
<221> 多表位蛋白rEPIS
<222> (1)..(155)<223>
<400> 2
11Met Pro Lys Thr His Asn Ser Gly Arg Ser Asn Val Asp Gly Gly Gly15 10 15
Ser Thr Leu His Leu Pro His Leu Trp Arg Pro Leu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Ser His Asn Ala Lys Tyr Val Ser Ala Glu Ser Trp Gly Gly Gly Ser
35 40 45
His Pro Asp Ser lie His Pro Phe Leu Ala Ser Pro Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Asp Thr Leu His Gly His Gly Phe Thr Asn Trp Phe Gly Gly Gly Ser65 70 75 80
Pro Lys Thr His Asn Ser Gly Arg Ser Asn Val Asp Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Thr Leu His Leu Pro His Leu Trp Arg Pro Leu Ser Gly Gly Gly Ser
100 105 110
His Asn Ala Lys Tyr Val Ser Ala Glu Ser Trp Gly Gly Gly Ser His
115 120 125
Pro Asp Ser lie His Pro Phe Leu Ala Ser Pro Gly Gly Gly Ser Asp
130 135 140
Thr Leu His Gly His Gly Phe Thr Asn Trp Phe145 150 155
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> IBDV單克隆抗體
<220>
<221> HNFl基因
<222> (1)..(36)<223>
<400> 3
cctaagactc ataattctgg tcgttctaat gtggat 36
<210> 412PRT
IBDV單克隆抗體
<211><212><213><220><221><222><223>
<400>Pro Lys1
<210><211><212><213><220>
HNFl抗原表位12肽優(yōu)勢序列("…(12)
4
Thr His Asn Ser Gly Arg Ser Asn Val Asp5 10
36
DNA
IBDV單克隆抗體<formula>formula see original document page 13</formula><400> 9
catccggata gtattcatcc gUtctggcg tctcct 36
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> IBDV單克隆抗體 <220>
<221> 2B1抗原表位12肽優(yōu)勢序列
<222> (1)..(12) <223>
<400> 10
His Pro Asp Ser lie His Pro Phe Leu Ala Ser Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> IBDV單克隆抗體
<220>
<221> 2G8基I大J
<222> (1)..(36) <223>
<400> 11
gatactcttc atgggcatgg ttttactaat tggttt 36
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213》 IBDV單克隆抗體 <220>
<221> 2G8抗原表位12肽優(yōu)勢序列
<222> (1)..(12) <223>
<400> 12
Asp Thr Leu His Gly His Gly Phe Thr Asn Trp Phe 1 5 10
1權利要求
1、模擬IBDV多表位基因epis，其特征在于，該基因的長度為471bp，編碼155aa，命名為epis，其序列為SEQ ID NO.1。
2、 權利要求1所述模擬IBDV多表位基因epis的所編碼的多表位蛋白rEPIS， 其氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
3、 權利要求1所述模擬IBDV多表位基因epis的基因工程應用。
4、 權利要求1所述模擬IBDV多表位基因epis的重組表達質粒pET-epis。
5、 根據權利要求4的所述模擬IBDV多表位基因epis的重組表達質粒pET-epis， 其構建方法為化學合成權利要求1所述IBDV多表位基因epis，用pMD18-T載體克隆，獲得 epis重組克隆質粒pMD-epis，根據pET28b(+)啟動子下游閱讀框，將epis基因的克隆 質粒pMD-epis和pET28b(+)質粒用限制性內切酶Sacl和HindIII酶切，經瓊脂糖凝膠 電泳后，回收pMD-epis的epis基因片段和pET28b的載體片段，用T4 DNA連接酶 連接兩片段，轉化大腸桿菌JM109，涂布于含終濃度為30ng/mL卡那霉素的LB瓊脂 平板上，37t:培養(yǎng)14h，挑取單菌落，接種在3mL含kan的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng) 14h，抽提質粒，酶切鑒定，獲取陽性重組表達質粒pET-epis。
6、 權利要求4或5所述模擬IBDV多表位基因epis的重組表達質粒pET-epis轉 化大腸桿菌BL21(DE3)而獲得的重組菌pET-epis/BL21 。
7、 權利要求1所述模擬IBDV多表位基因epis的IBDV表位基因工程疫苗。
8、 根據權利要求7所述的IBDV表位基因工程疫苗，其制備方法為 培養(yǎng)誘導權利要求5所述的重組菌pET-epis/BL21 ， 10000 r/min高速離心20 min沉淀菌體，棄上清液，用pH7.2的PBS緩沖液懸浮菌體，置于Or冰水浴，超聲功率 500 600W、每次超聲時間10min、重復2~4次超聲波破碎菌體直至渾濁菌液變?yōu)橥该?菌液，即為抗原重組模擬IBDV多表位蛋白rEPIS，用PBS調整抗原濃度至1000ng/mL， 抗原與白油佐劑按l:l配比，乳化，即為IBDV表位基因工程疫苗。
9、 權利要求7或8所述IBDV表位基因工程疫苗在制備傳染性法氏囊病診 斷抗原方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及模擬IBDV多表位基因的分子設計及其應用，屬于生物制藥領域。根據對免疫保護有效的抗原表位基序設計合成具有免疫保護功能的模擬IBDV多表位基因epis，運用基因工程技術構建重組表達質粒pET-epis，使epis基因在大腸桿菌中表達，然后以大腸桿菌表達的重組IBDV多表位蛋白rEPIS作為抗原，加上相應的佐劑制成IBDV表位基因工程疫苗，可用于預防控制傳染性法氏囊病。在進行epis分子設計時，由于采用線性化序列模擬了IBDV空間構象依賴性表位基序，因此重組大腸桿菌表達的rEPIS制備工藝簡單、成本低、生物安全性高。
文檔編號C12N15/40GK101487011SQ20091002557
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月10日 優(yōu)先權日2009年2月10日 公開號200910025577.發(fā)明者唐雨德, 夏興霞, 張改平, 施正良, 銀 李, 歐陽偉, 英 潘, 潘群興, 王忠燦, 王曉麗, 王永山, 王選年, 諸玉梅, 譚維國, 陳光華 申請人:江蘇省農業(yè)科學院;中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所