專利名稱：：用亞硫酸鈉加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制取菜籽肽的方法，具體地說(shuō)涉及一種在Na2S03作用下，使用蛋白酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法。
背景技術(shù)：
：菜籽是重要油料作物，世界年產(chǎn)量已超過(guò)4000萬(wàn)噸，我國(guó)是世界上產(chǎn)量最大的菜籽生產(chǎn)國(guó)。菜籽提油后的粕中含有40—50%的蛋白，且菜籽蛋白氨基酸組成平衡，因此菜籽粕可能成為食用蛋白的合適來(lái)源。但菜籽粕中存在硫代葡萄糖甙，植酸和多酚類等抗?fàn)I養(yǎng)因子，只有盡量降低或除去這些物質(zhì)，才能使菜籽粕作為食用蛋白來(lái)源。近年來(lái)，植物蛋白水解物被認(rèn)為是生物活性肽的來(lái)源，它們易于被大腸細(xì)胞吸收進(jìn)入血液，產(chǎn)生有益的生理作用。已報(bào)道的生物活性肽具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗血栓形成和降血壓等生理功能。制取多肽的傳統(tǒng)方法是先通過(guò)堿提取酸沉淀法制取分離蛋白，再使用不同的蛋白酶將分離蛋白水解制取肽。由于菜籽蛋白成分復(fù)雜，難溶于水，通常需要使用pHll以上的強(qiáng)堿提?。患又俗训鞍椎入婞c(diǎn)范圍廣，提取后加酸調(diào)節(jié)等電點(diǎn)析出的分離蛋白得率較低。CN1884572A號(hào)專利文獻(xiàn)公開(kāi)了"一種用菜籽粕直接酶水解制備菜籽肽的方法"，該方法使用酸性水對(duì)菜籽粕進(jìn)行浸泡和洗滌以脫除植酸、硫甙等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，并直接用酶水解菜籽粕制取菜籽肽。該方法與先制取菜籽蛋白，再用酶水解菜籽蛋白制取菜籽肽的傳統(tǒng)方法相比，簡(jiǎn)化了工藝過(guò)程。但酸性水在脫除植酸、硫甙等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，也帶走了部分可溶性蛋白，產(chǎn)生了較多的廢水。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在不足，提供一種水解速度快、蛋白損失少、產(chǎn)品色澤好的酶水解菜籽粕制取菜籽肽的新方法。我們研究發(fā)現(xiàn)，在蛋白酶水解菜籽粕時(shí)加入低濃度的Na2S03水溶液可以顯著加快水解速度，提高蛋白水解度。由于Na2S03作為一種還原劑能夠斷裂蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的二硫鍵，使得斷裂后的菜籽蛋白分子更容易與蛋白酶接觸而提高酶水解速率和水解度，同時(shí)Na2S03斷裂二硫鍵的作用，也破壞了菜籽蛋白中存在的蛋白酶抑制劑分子，使之失去對(duì)于蛋白酶活性的抑制作用。Na2S03對(duì)蛋白酶水解菜籽粕的加速作用已經(jīng)水解曲線和蛋白水解物的凝膠層析圖證實(shí)。Na2S03作為還原劑還能防止菜籽粕中的多酚在水解過(guò)程中氧化，從而使得到的菜籽肽顏色較淡。此外，本發(fā)明在水解后采用膜分離技術(shù)可以同時(shí)去除硫甙、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，減少蛋白損失。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用亞硫酸鈉加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，包括利用蛋白酶對(duì)菜籽粕進(jìn)行水解、滅酶、離心除去不溶物、再經(jīng)超濾和干燥獲得菜籽肽，其特征在于:將菜籽粕粉碎后加入Na2S03水溶液，經(jīng)酶水解得到菜籽肽。在本發(fā)明中具體制取菜籽肽的過(guò)程是a)將菜籽粕粉碎過(guò)60100目篩，將其與0.1%~0.6%的Na2S03水溶液一起加入到反應(yīng)容器中，使基質(zhì)濃度為5~10%w/v，混合后置于水浴加熱至蛋白酶的反應(yīng)溫度，并根據(jù)蛋白酶的反應(yīng)條件調(diào)節(jié)pH值；b)加入蛋白酶，使蛋白酶與基質(zhì)比為1~6%,在攪拌下水解菜籽粕，得到菜籽蛋白水解物；c)調(diào)節(jié)水解物的pH至4.0~4.5并維持30min滅酶，或加熱至80。C100。C并維持5~15min滅酶；d)將水解物離心除去不溶物得到上層清液；e)將上層清液超濾和透析過(guò)濾，濾去抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽；f)將未透過(guò)濾膜的溶液進(jìn)行噴霧干燥得到菜籽肽。在本發(fā)明中所述的蛋白酶為堿性蛋白酶，或中性蛋白酶，或木瓜蛋白酶，或風(fēng)味蛋白酶。在本發(fā)明中超濾中使用濾膜的截留分子量^5000Da;所述抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)為硫代葡萄糖甙、植酸和多酚類物質(zhì)，所述無(wú)機(jī)鹽為亞硫酸鈉和氯化鈉。在本發(fā)明中進(jìn)行噴霧干燥時(shí)，熱空氣的進(jìn)口溫度為180°C，出口溫度為85°C。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于Na2S03作為一種還原劑能夠斷裂蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的二硫鍵，使得斷裂后的菜籽蛋白分子更容易與蛋白酶接觸而提高酶水解速率和水解度，同時(shí)Na2S03斷裂二硫鍵的作用，也破壞了菜籽蛋白中存在的蛋白酶抑制劑分子,使之失去對(duì)于蛋白酶活性的抑制作用，Na2S03作為還原劑還能防止菜籽粕中的多酚在水解過(guò)程中氧化，從而使制取的菜籽肽顏色較淡。圖1是為本發(fā)明的工藝流程圖2是Alcalase水解菜籽粕的水解曲線；圖3是本發(fā)明制取的菜籽肽產(chǎn)物的凝膠層析圖4是對(duì)照組制取的菜籽肽產(chǎn)物的凝膠層析圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明用下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于實(shí)施例。實(shí)施例1將菜籽粕粉碎過(guò)80目篩，再與0.25%的Na2S03水溶液一起加入到反應(yīng)容器中，置于水浴加熱至5(TC，用4NNaOH調(diào)節(jié)pH至8.0,再加入堿性蛋白酶Alcalase于攪拌下水解，酶水解參數(shù)為基質(zhì)濃度5^w/v，酶與基質(zhì)比3%，pH8.0，反應(yīng)溫度50。C。反應(yīng)過(guò)程中加入4mol/L的NaOH維持pH值恒定，并用pH-stat法測(cè)定反應(yīng)水解度(DH)。反應(yīng)120min后用鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)物pH至4.3，并于5(TC維持30min滅酶。將水解物以4000xg離心20min除去不溶物(粕渣)，得到上層清液。將上層清液用截留分子量為3000Da的膜進(jìn)行超濾。膜面積為O.IM2，超濾液的溫度為40QC，超濾后再進(jìn)行透析過(guò)濾。最后將未透過(guò)濾膜的溶液進(jìn)行噴霧干燥得到菜籽肽產(chǎn)物。噴霧干燥時(shí)熱空氣的進(jìn)口溫度為180QC,出口溫度為85GC(本實(shí)施例的工藝流程如fe圖lX按本實(shí)施例制取的菜籽肽產(chǎn)物的指標(biāo)如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>實(shí)施例2用水代替實(shí)施例1中0.25。/。的Na2S03水溶液作為對(duì)照組，按上述相同的試驗(yàn)條件和步驟進(jìn)行酶水解及水解后處理，得到的菜籽肽產(chǎn)物作為對(duì)照物。'水解時(shí)添加Na2S03(本發(fā)明，下同)以及不添加Na2S03(對(duì)照組，下同)的兩組菜籽粕水解曲線一起記錄在附圖2中，從附圖2顯示的水解時(shí)間和水解度的相互關(guān)系可見(jiàn)，Na2S03對(duì)堿性蛋白酶Alcalase水解菜籽粕具有明顯加速作用，在水解120min時(shí)，本發(fā)明與對(duì)照組的水解度分別為12.1%與7.7%，前者是后者的1.6倍。實(shí)施例3使用凝膠層析法測(cè)定實(shí)施例1制取的菜籽肽產(chǎn)物和實(shí)施例2中制取的對(duì)照物的分子量分布。在本實(shí)施例中，所用的凝膠柱為Superose1210/300GL(10x300mm,GEHealthcareBio-ScienceCo.，Piscataway,NJ，USA)，使用紫外檢測(cè)器于215mn檢測(cè)。洗脫液為pH等于7的0.15MNaCl的50mM磷酸鹽緩沖液，樣品液先經(jīng)0.45pM膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為50(^1，洗脫液流速為0.8ml/min。取牛血清蛋白(67000Da)、細(xì)胞色素(12700Da)、VB12(1355Da)和氧化型谷胱甘肽(612Da)為分子量標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)試結(jié)果分別紀(jì)錄在附圖3和附圖4中。附圖3中10000Da以上的峰面積僅占7.8%，而附圖4中10000Da以上的峰面積占了33.5%，說(shuō)明本發(fā)明制取的菜籽肽產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)和大分子肽的數(shù)量小于對(duì)照組制取的菜籽肽?？梢?jiàn)，用亞硫酸鈉加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽能夠明顯提高菜籽蛋白的水解度，使得水解物的分子量減小。具體實(shí)施時(shí)，所述的蛋白酶不僅可以采用堿性蛋白酶，還可以選擇中性蛋白酶，或木瓜蛋白酶，或風(fēng)味蛋白酶等蛋白酶，在選擇不同的蛋白酶時(shí)，應(yīng)該根據(jù)本領(lǐng)域熟知的基本常識(shí)，按照不同蛋白酶的使用條件，調(diào)節(jié)菜籽粕水解的溫度和pH值，以滿足蛋白酶對(duì)菜籽粕進(jìn)行酶水解的條件，同時(shí)在權(quán)利要求的范圍內(nèi)選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)濃度和蛋白酶與基質(zhì)比，充分發(fā)揮蛋白酶的作用，提高蛋白酶的利用率。滅酶時(shí)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)水解物的pH至4.0-4.5并維持30min滅酶，或加熱至80'C100"C并維持5-15min權(quán)利要求1、一種用亞硫酸鈉加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，包括利用蛋白酶對(duì)菜籽粕進(jìn)行水解、滅酶、離心除去不溶物、再經(jīng)超濾和干燥制取菜籽肽，其特征在于將菜籽粕粉碎后加入Na2SO3水溶液，經(jīng)酶水解得到菜籽肽。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用亞硫酸鈉加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，其特征在于制取菜籽肽的方法是a)將菜籽粕粉碎過(guò)60100目篩，將其與0.1%~0.6%的Na2S03水溶液一起加入到反應(yīng)容器中，使基質(zhì)濃度為5~10%w/v，混合后置于水浴加熱至蛋白酶的反應(yīng)溫度，并根據(jù)蛋白酶的反應(yīng)條件調(diào)節(jié)pH值；b)加入蛋白酶，使蛋白酶與基質(zhì)比為1~6%，在攪拌下水解菜籽粕，得到菜籽蛋白水解物；c)調(diào)節(jié)水解物的pH至4.0-4.5并維持30min滅酶，或加熱至80。C100。C并維持515min滅酶；d)將水解物離心除去不溶物得到上層清液；e)將上層清液超濾和透析過(guò)濾，濾去抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽；f)將未透過(guò)濾膜的溶液進(jìn)行噴霧干燥得到菜籽肽。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用亞硫酸鈉加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，其特征在于所述的蛋白酶為堿性蛋白酶，或中性蛋白酶，或木瓜蛋白酶，或風(fēng)味蛋白酶。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用亞硫酸鈉加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，其特征在于超濾中使用濾膜的截留分子量^5000Da;所述抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)為硫代葡萄糖甙、植酸和多酚類物質(zhì)，所述無(wú)機(jī)鹽為亞硫酸鈉和氯化鈉。5、根據(jù)權(quán)利要求24之一所述的用亞硫酸鈉加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，其特征在于:進(jìn)行噴霧干燥時(shí)，熱空氣的進(jìn)口溫度為180°C，出口溫度為85°C。全文摘要本發(fā)明涉及一種用亞硫酸鈉加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，包括利用蛋白酶對(duì)菜籽粕進(jìn)行水解、滅酶、離心除去不溶物、再經(jīng)超濾和干燥得到菜籽肽，其特征在于，將菜籽粕粉碎后加入Na₂SO₃水溶液，經(jīng)酶水解得到菜籽肽。其優(yōu)點(diǎn)是Na₂SO₃作為一種還原劑能夠斷裂蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的二硫鍵，使得斷裂后的菜籽蛋白分子更容易與蛋白酶接觸，提高酶水解速率和水解度，同時(shí)也破壞了菜籽蛋白中存在的蛋白酶抑制劑分子，使之失去對(duì)于蛋白酶活性的抑制作用；Na₂SO₃作為還原劑還能防止菜籽粕中的多酚在水解過(guò)程中氧化，從而使得到的菜籽肽顏色較淡。文檔編號(hào)C12P21/06GK101509029SQ20091002532公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2009年3月23日優(yōu)先權(quán)日2009年3月23日發(fā)明者嚴(yán)梅榮,王丹丹,鞠興榮申請(qǐng)人:南京財(cái)經(jīng)大學(xué)