專利名稱：一種耐熱非-k12大腸桿菌植酸酶及其生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生物化學(xué)、及植酸酶的發(fā)酵和后加工等領(lǐng)域。更確切的說，本發(fā)明涉及一種新的非-K12大腸桿菌基因編碼的耐熱植酸酶的克隆和表達(dá)。
背景技術(shù)：
植酸酶(肌型肌醇-六磷酸鹽磷酸水解酶，EC 3. 1. 3. 8)是一種能夠?qū)⒅菜?肌型肌醇-六磷酸鹽)水解為肌醇和無機(jī)磷的酶。眾所周知植酸酶是很有價值的飼料添加劑。 20世紀(jì)末，植酸酶作為動物飼料添加劑的年銷售額估計(jì)超過一億五千萬美元，并且還在逐步增加。目前，禽、豬日糧以谷類、豆類和油籽產(chǎn)品為主。這些飼料中所含有的磷約有三分之二以植酸和植酸鹽的形式存在。植物中的植酸磷是鈣-鎂-鉀植酸鹽的混合物，其以螯合物的形式存在，溶解度很低。這種形式的磷很難被人、豬、禽等單胃動物所消化。使用植酸酶水解植酸中鍵合磷基團(tuán)的酯鍵，可以提高植酸磷以及結(jié)合在植酸復(fù)合物中的礦物質(zhì)和微量元素的利用率。植酸酶是一種特殊的磷酸酶，其能夠水解植酸成為一系列肌醇和磷酸鹽的低磷酸酯。已知的植酸酶有兩種類型3_植酸酶和6-植酸酶，以其首先易于攻擊的磷酸酯鍵的位置作為區(qū)別。雖然單胃動物缺乏能有效利用植酸磷的足夠的植酸酶，但是很多真菌、細(xì)菌和酵母能生產(chǎn)植酸酶，并可用于對動物口糧進(jìn)行補(bǔ)充。補(bǔ)充植酸酶能夠有效提高磷消化率，這已經(jīng)在動物實(shí)驗(yàn)中得到了很好的證明 (Mroz et al.，1994 ；Kornegay et al.，1996 ；Rao et al.，1999 ；Ravindran et al.，1999)。 所使用的酶的功效，不僅取決于酶的類型、反應(yīng)速率和存在的酶活力水平，還取決于酶在通過胃腸道時所遇到的不同環(huán)境中，以及在食品或飼料制劑預(yù)處理時所采用的條件下保持其活性的能力。雖然有眾多的植酸酶可用于添加劑，但是很多酶都存在一定的缺陷。例如，許多目前使用的植酸酶在飼料造粒過程中由于熱處理會喪失其活性。另外，許多目前使用的植酸酶對動物消化系統(tǒng)中的胃蛋白酶和胰蛋白酶等沒有足夠的抗性。因此，迫切需要可用于動物飼料和食品加工的優(yōu)良性質(zhì)的植酸酶產(chǎn)品。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供一個分離的核酸分子，其包含一個選自以下組中的核酸序列a) 一個核酸序列所編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示；b) 一個在嚴(yán)格的雜交條件下與a)中的序列所雜交的核酸序列，其所述核酸序列編碼 有非-K12大腸桿菌植酸酶活性的多肽；或c) 一個與a)或b)中的序列互補(bǔ)的核酸序列；在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所分離的核酸分子含有一個選自以下組中的核酸序列a) 一個核酸序列，其組成核苷酸67-1296如SEQ ID NO 1所示；
b) 一個核酸序列，其組成核苷酸1-1230如SEQ ID NO 2所示；c) 一個如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；d) 一個在嚴(yán)格條件下與a)到c)中任一個所雜交的核酸序列，其編碼有非-K12大腸桿菌植酸酶活性的多肽；或e) 一個與a)到d)中任一個所互補(bǔ)的核酸序列。另一方面，本發(fā)明提供一個載體，其包含本發(fā)明所分離的核酸分子，優(yōu)選的，所述的載體是一個表達(dá)載體。例如，所述載體可以選自下組中pTrcHis2-PhE，pPIC9K_PhE， pMET-PhE 和 pKLAC-PhE。另一方面，本發(fā)明提供一個分離的細(xì)胞，其包含本發(fā)明中所述的分離的核酸分子， 優(yōu)選的，所述的分 離的核酸分子是一個組成的表達(dá)載體。優(yōu)選的，所述的細(xì)胞是酵母細(xì)胞。 例如，所述的細(xì)胞可以選擇大腸桿菌(Escherichia coli.)，畢氏酵母(Pichia pastoris)， 甲醇酵母(Pichia methanolica)和克魯維乳酸酵母(Kluyeromyces lactis)。更具體的說，所述細(xì)胞可以選擇 E. coli MG1655, P. pastoris GS115, P. methanolica PMAD16 和 Kluyeromyces lactis GG799。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所選擇的細(xì)胞包括轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒 pTrcHis2-PhE 的 E. coli MG1655,轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒 pPIC9K_PhE 的 P. pastoris SMDl 168，轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pMET-PhE的P. methanolica PMD16和轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pKLAC-PhE 的 Kluyeromyces lactis GG799。另一方面，本發(fā)明提供一個多肽，其包含一個選自以下組中的氨基酸序列a) 一個如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列；或b) 一個與SEQ ID NO 3的相似性不低于99%的氨基酸序列；其所述的多肽有非-K12大腸桿菌植酸酶活性。另一方面，本發(fā)明提供通過發(fā)酵生產(chǎn)非-K12大腸桿菌植酸酶的工藝，其包括在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)含有本發(fā)明所分離的核酸分子的細(xì)胞，使其有效表達(dá)從而獲得有非-K12大腸桿菌植酸酶活性的多肽。優(yōu)選的，所述的細(xì)胞可選自下組中轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒 pTrcHis2-PhE 的 E. coli MG1655,轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒 pPIC9K_PhE 的 P. pastoris SMDl 168, 轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pMET-PhE的P. methanolica PMD16和轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pKLAC-PhE的 Kluyeromyces lactis GG799。


圖1來源于大腸桿菌Escherichia coli ATCC 9637菌株的編碼非-K12大腸桿菌植酸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO :1)和本發(fā)明的一個實(shí)施例中的編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。劃線部分所示為信號肽，該核苷酸序列第67-1296位的核苷酸編碼成熟蛋白質(zhì)。用“*” 所標(biāo)示的為終止子TAA。圖2本發(fā)明的另一個實(shí)施例中編碼非-K12植酸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)， 其密碼子已經(jīng)過優(yōu)化，適合在酵母系統(tǒng)中進(jìn)行基因表達(dá)。該核苷酸序列的第1-1230位的核苷酸編碼成熟蛋白質(zhì)。用“*”所標(biāo)示的為終止子TAA。圖3本發(fā)明的實(shí)施例中所使用的用于克隆核酸分子的引物序列。圖4本發(fā)明的非-K12植酸酶與其它兩個已知的植酸酶氨基酸序列的比較。圖5本發(fā)明的幾個實(shí)施例中所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖。在質(zhì)粒pTrcHis2-PhE中插入如SEQ ID NO 1所示的“植酸酶”序列，而質(zhì)粒pPIC9k_PhE，pMET_PhE 和pKLAC-PhE則插入如SEQ ID NO 2所示的“植酸酶”序列。圖6重組非K-12植酸酶的最適反應(yīng)pH。圖7重組非K-12植酸酶的最適反應(yīng)溫度。圖8發(fā)酵過程中不同時間點(diǎn)重組非-K12植酸酶的酶活力。圖9發(fā)酵過程中不同時間點(diǎn)重組非-K12植酸酶產(chǎn)物樣品的SDS-PAGE。圖10重組非-K12植酸酶對胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性。圖11本發(fā)明的一個實(shí)施例中畢氏酵母(Pichia pastoris)所分泌的重組非-K12 植酸酶的分子量。圖12本發(fā)明的一個實(shí)施例中所表達(dá)的重組非-K12植酸酶的pH耐受性。圖13本發(fā)明的一個實(shí)施例中所表達(dá)的重組非-K12植酸酶的熱穩(wěn)定性。圖14本發(fā)明中干燥制劑的重組非-K12植酸酶的熱穩(wěn)定性。圖15本發(fā)明的非-K12植酸酶與其它K12大腸桿菌植酸酶和來源于真菌黑曲霉 (Aspergillus niger)的植酸酶熱穩(wěn)定性的比較。圖16本發(fā)明的非-K12植酸酶與其它K12大腸桿菌植酸酶和來源于真菌黑曲霉 (Aspergillus niger)的植酸酶pH耐受性的比較。發(fā)明詳述在本文稿中使用了大量的詞組和縮寫。除非特別申明，否則均應(yīng)用以下的定義。這里所使用的詞組“含有”意思是存在一定的特征、數(shù)組、步驟或組成，其是在權(quán)利要求中所提及的，但是那并不排除會存在或增加一個或多個其它特征、數(shù)組、步驟、組成或群組。詞組“耐熱的”表示即使暴露在給定的溫度下，酶仍然能夠保持其活性。這里所使用的詞組“pTrcHis2-PhE” 是指質(zhì)粒 pTrcHis2 (Invitrogen Biotechnology Co. , Ltd)含有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，該核酸受LacO啟動子和一個pBR322功能區(qū)的調(diào)控，并使用bla (Apm)基因進(jìn)行DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)化的篩選，見圖5所不。這里所使用的詞組“pPIC9K-PhE” 是指質(zhì)粒 pPIC9K (Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)含有如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，其定位見圖5所示。這里所使用的詞組“pMET-PhE”是指質(zhì)粒pMETalphaA (Novagen, Inc.)含有如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，其定位見圖5所示。這里所使用的詞組“pKLAC-PhE”是指質(zhì)粒pKLAC (New England Biolabs，Inc.)含有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，其定位見圖5所示。這里所使用的“分離的核酸片段”或“分離的多聚核苷酸”是一個RNA或DNA多聚體，其 可以是單鏈或雙鏈，可選擇地含有人工合成的、非天然的、或已改變的核苷酸堿基。分離的核苷酸片段是包括一個或多個cDNA片段、基因組DNA、或人工合成DNA在內(nèi)的DNA多聚體的一種形式。“密碼子簡并性”是指在不影響其所編碼多肽的氨基酸序列的條件下，基因編碼允許核苷酸序列發(fā)生變異的性質(zhì)。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及任何編碼所有或大部分如圖1和圖2 中所示的微生物多肽的氨基酸序列的核酸片段。本領(lǐng)域中熟練的技術(shù)人員都很清楚對于具體的宿主細(xì)胞所表現(xiàn)出的“密碼子偏倚性”，并能對于具體的給定的氨基酸使用適當(dāng)?shù)暮塑账崦艽a子。因此，為了提高合成基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，需要對基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其密碼子使用頻率接近宿主細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子頻率。詞組“序列分析軟件”是指任何可用于分析核苷酸或氨基酸序列的計(jì)算機(jī)算法或軟件程序?！靶蛄蟹治鲕浖笨梢允鞘惺鄣幕蚴亲孕醒兄频?。通常的序列分析軟件將包括但不局限于 GCG 程序組件(Wisconsin Package Version 9· 0，Genetics Computer Group (GCG) ,Madison,Wis.),BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul et al.，J. Mol. Biol. 215 403-410(1990)，禾口 DNASTAR(DNASTAR，Inc. 1228 S. Park St. Madison, Wis. 53715 USA), 以及融合了史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm) (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res. ，[Proc. Int. Symp. ](1994),Meeting Date 1992,111 20. Editor(s) Suhai, Sandor. Publisher =Plenum, New York, N. Y.)的 FASTA 程序。詞組“MEME” 是指一個用于鑒定保守性的軟件程序，其診斷程序的主旨基于隱馬爾可夫模型(hidden Markov model)(Timothy L. Bailey and Charles Elkan, Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36，AAAI Press, Menlo Park, Calif. (1994))?！癕AST”(Timothy L. Bailey and Michael Gribskov, " Combining evidence u sing p-values !application to sequence homology searches" Bioinformatics, Vol. 14,pp. 48-54(1998)) 禾中/人MEME 禾呈 巾■ 取輸出的程序，并從EMBL和SwissProt等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜尋鑒定相關(guān)的主題。在其應(yīng)用范圍內(nèi)，都可使用序列分析軟件進(jìn)行分析，并且分析結(jié)果將以程序參考的“缺省值”為依據(jù)，除非另有指定。這里的“缺省值”意思是當(dāng)?shù)谝淮纬跏蓟瘯r原本軟件所附帶的任何可設(shè)定的值或參數(shù)集。這里所使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，并且已經(jīng)公開發(fā)表的，例如，Sambrook, J.，F(xiàn)ritsch, E. F. and Maniatis，Τ.等所著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) (hereinafter " Maniatis " )), Silhavy, T. J. , Bennan, M. L. and Enquist, L. W.等所著的《基因融合實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor, N. Y. (1984) (hereinafter " Silhavy"))，以及Ausubel，F(xiàn). Μ.等所著的《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) (hereinafter" Ausubel" )·)。本發(fā)明提供一個從大腸桿菌Escherichia coli ATCC 9637 (American Type Culture Collection(ATCC)，P. 0. Box 1549, Manassas, VA 20108，USA)中分離得到的多聚核苷酸，和一個人工合成的編碼所述多肽的核苷酸序列。分離的多肽是非-K12大腸桿菌植酸酶。表達(dá)所得到的植酸酶能水解植酸成為相應(yīng)的肌醇和無機(jī)磷。本發(fā)明亦提供轉(zhuǎn)化微生物宿主細(xì)胞表達(dá)該多肽的方法。本發(fā)明還提供，使用該轉(zhuǎn)化微生物生產(chǎn)多肽催化劑的方法， 以及用該催化劑轉(zhuǎn)化植酸成為肌醇和無機(jī)磷的方法。在本發(fā)明的所有內(nèi)容中，詞組“非-K12大腸桿菌植酸酶”，“非-K12植酸酶”和“耐熱植酸酶”可替換使用，均是指一種耐熱植酸酶，其在80°C的溫度下1小時仍能保留至少 17%的植酸酶活性；優(yōu)選的，在90°C的溫度下1小時仍能保留至少33%的植酸酶活性；更優(yōu)選的，在100°C的溫度下1小時仍能保留至少26%的植酸酶活性；并且其對動物消化系統(tǒng)中的酸性環(huán)境和蛋白酶也有很好的穩(wěn)定性。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種制備耐熱植酸酶的方法。該方法包括在微生物宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，其所使用的表達(dá)機(jī)構(gòu)含有連接在編碼耐熱植酸酶核苷酸分子上的啟動子。微生物宿主細(xì)胞可以是原核生物細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌、芽孢桿菌等)； 也可以是真核生物細(xì)胞，如酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母、裂殖酵母、畢赤酵母、或克魯維乳酸酵母等)。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，用來制備重組耐熱植酸酶的微生物細(xì)胞其所產(chǎn)生的植酸酶以糖基化的形式存在。本發(fā)明提供編碼耐熱植酸酶的核酸分子的克隆和序列測定方法，該核酸分子含有 1296個核苷酸，其編碼含有432個氨基酸的蛋白質(zhì)，包括一個有22個氨基酸的信號肽。序列比對(圖4，其中的“W-植酸酶”是指本發(fā)明的非-K12植酸酶)的結(jié)果表明本發(fā)明提供了一種新的植酸酶多肽。優(yōu)選的，編碼耐熱植酸酶的多聚核苷酸(第一個多聚核苷酸)被操作性的與至少一個調(diào)控序列相連接，如啟動子、增強(qiáng)子、終止序列、或任何組合物，編碼信號肽序列的第二個多聚核苷酸指引第一個核苷酸序列所編碼的植酸酶到特定的細(xì)胞位置如定位到細(xì)胞外。 啟動子可以是構(gòu)成型的啟動子或誘導(dǎo)型的啟動子。

母本多聚核苷酸可以從任何來源中獲取，包括細(xì)菌或真菌核酸，并且本發(fā)明可采用多種方法從所選擇的母本多聚核苷酸中制備人工合成的多聚核苷酸，例如組合誘變、循環(huán)誘變和/或DNA修飾。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供在嚴(yán)格的雜交條件下，與指定的序列(如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2)雜交的核酸序列。“嚴(yán)格的雜交條件”可以是如先前在相關(guān)文獻(xiàn)(例如 Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Edition(1989), Sambrook et al, . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.).)中所描述的一個常規(guī)條件，例如，一個嚴(yán)格的雜交條件為0. 1XSSC，0. 1%SDS,650其它典型的雜交條件還包括(1) 高度嚴(yán)格:0. 1XSSPE,0. 1% SDS, 65 ； (2)中度嚴(yán)格0. 2XSSPE，0. 1% SDS, 50 ； (3)低度嚴(yán)格1. 0XSSPE，0. 1% SDS，50。明顯地，使用替代性的緩沖液、鹽和溫度可是達(dá)到等同的嚴(yán)格度。因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，耐熱植酸酶對于相應(yīng)的植酸酶(文獻(xiàn))有一個或多個氨基酸替換，這些替換與在溫度等于或高于60°C下酶活性保持力相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選的，該耐熱植酸酶在80°C的溫度下1小時仍能保留至少17%的植酸酶活性；更優(yōu)選的，其在90°C 的溫度下1小時仍能保留至少33%的植酸酶活性；最優(yōu)選的，其在100°C的溫度下1小時仍能保留至少26%的植酸酶活性。本發(fā)明的一個典型的耐熱植酸酶為非-K12大腸桿菌植酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示(圖1)。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明還提供一個多肽，其含有一個與SEQ ID NO :3存在一定相似性的氨基酸序列，其所述的多肽具有非-K12大腸桿菌植酸酶活性。詞組“相似性”在本發(fā)明中與多肽關(guān)聯(lián)使用時，其定義為候選序列與目標(biāo)序列(如SEQ ID NO 3)中相同的氨基酸殘基的百分比，即候選序列與目標(biāo)序列進(jìn)行比對后，所達(dá)到的最大的相似性百分比。氨基酸相似性可通過許多已知的方法進(jìn)行測定，如Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48 443-453(1970))序列比對法，或使用商品化地程序。因此許多序列相似性水平被用于標(biāo)識相關(guān)聯(lián)的多肽序列。在本發(fā)明的考慮范圍內(nèi)，所使用的相似性包括但不限于50%、55%、 60%,65%,70%,75%,80%,85%,86%,90%,95%,99%^； 100%，也包括介于它們之間的值。本發(fā)明還提供，含有本發(fā)明的表達(dá)結(jié)構(gòu)或多聚核苷酸的質(zhì)粒，和含有本發(fā)明的多聚核苷酸、表達(dá)結(jié)構(gòu)或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化微生物細(xì)胞。本發(fā)明的質(zhì)?？删幋a不止一個包括不止一個耐熱植酸酶的多肽，或編碼一個含有本發(fā)明耐熱植酸酶的融合多肽，并且轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞可含有不止一個本發(fā)明的質(zhì)粒。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞用于生產(chǎn)本發(fā)明的重組耐熱植酸酶。由此，本發(fā)明提供從本發(fā)明轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞中分離的耐熱植酸酶，以及人工合成制備的植酸酶。另外，本發(fā)明提供通過一個含有非-K12大腸桿菌植酸酶基因的酵母菌株發(fā)酵制備耐熱植酸酶的方法。采用所提供的用于生產(chǎn)植酸酶的發(fā)酵工藝，蛋白質(zhì)的產(chǎn)量可達(dá)到 2. 7g/L。由此所制備的植酸酶，估計(jì)有部分糖基化，其在SDS-PAGE上所表現(xiàn)出的分子量為 52kDa(實(shí)施例7)。本發(fā)明的植酸酶的最適pH范圍為pH2_7. 5，優(yōu)選pH3_6。

另外，本發(fā)明的植酸酶有能力抵抗在工業(yè)造粒機(jī)中進(jìn)行飼料造粒時所遇到的高溫環(huán)境。本發(fā)明還提供動物飼料的加工方法，例如加工硬粒狀地飼料顆粒應(yīng)使用耐熱植酸酶。 進(jìn)行飼料加工，先將粉狀的植酸酶與飼料組分進(jìn)行混合，在制粒機(jī)中有混合蒸汽的條件下預(yù)熱處理后(至少可保留60%的酶活力)，將飼料擠壓通過一個顆粒染色裝置。該植酸酶本身可作為動物飼料添加劑使用，此外也可與維生素、礦物質(zhì)、其它飼用酶制劑、農(nóng)副產(chǎn)品 (例如小麥麩或玉米麩粉)等聯(lián)合使用。本發(fā)明的植酸酶也可添加到糊狀食物中，例如沒有進(jìn)行造粒加工的食物。由于目前可供使用的商品植酸酶都不耐熱，所用其經(jīng)常在造粒后應(yīng)用，通常將植酸酶溶液噴涂到飼料顆粒表面。噴涂法存在以下的一些問題僅有一小部分的飼料顆粒與酶接觸，酶僅存在與包被飼料顆粒的表面，并且飼料加工廠還需投資和操作一個復(fù)合型的噴涂設(shè)備。相比之下，本發(fā)明的耐熱植酸酶，其比活力高達(dá)3146U/mg，可在造粒前加入，其改善了飼料中酶的分布，因此，可促進(jìn)飼料生產(chǎn)。微生物重組表達(dá)基因和直接序列的基因產(chǎn)物可在同源宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，特別是在微生物宿主細(xì)胞中。重組微生物宿主中的表達(dá)方法可用于表達(dá)各種途徑的中間體；對于在宿主細(xì)胞中已經(jīng)存在的調(diào)節(jié)途徑，或?qū)τ谌斯ず铣傻男庐a(chǎn)品，迄今為止還不能使用宿主。優(yōu)選的，用于表達(dá)直接的基因和核酸片段的同源宿主細(xì)胞為微生物宿主細(xì)胞，這種微生物宿主在真菌和細(xì)菌家族中廣泛存在，其可在寬的溫度、PH值范圍下生長，并有強(qiáng)的溶劑耐受性。例如，以上所述范圍內(nèi)的任何細(xì)菌、酵母和絲狀真菌都可作為適合的宿主表達(dá)本發(fā)明的核酸片段。由于轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)的生物合成一樣都與細(xì)胞原料無關(guān)，所以與碳原料用于生成細(xì)胞生物質(zhì)無關(guān)的功能基因能夠被表達(dá)。對于光合作用型和化學(xué)自養(yǎng)型宿主來說，大規(guī)模的微生物生長和功能基因表達(dá)可廣泛利用簡單的或復(fù)合的碳水化合物、有機(jī)酸和醇類，甲烷或二氧化碳等飽和烴。盡管如此，功能基因也會被特殊的生長條件所調(diào)控、 抑制或減少，其所述的條件包括氮、磷、硫、氧、碳的形態(tài)和含量，或包括小的無機(jī)離子在內(nèi)的任何微量元素。另外，通過存在或缺乏添加到培養(yǎng)基中地特殊的調(diào)節(jié)分子，也可實(shí)現(xiàn)對功能基因的調(diào)控，其所述的調(diào)節(jié)分子不是常規(guī)的營養(yǎng)源或能量源。實(shí)例的宿主菌株包括，但不限于細(xì)菌、真菌或酵母，如曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、啤酒酵母屬(Saccharomyces)、畢氏酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬 (Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、 不云力細(xì)菌屬(Acinetobacter)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、 赤桿菌屬(Erythrobacter)、綠菌屬(Chlorobium)、黃桿菌紅素(Flavobacterium)、 噬胞菌屬(Cytophaga)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈霉菌屬 (Streptomyces)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、奇異球菌屬(Deinococcus)、大腸桿菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛生菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus) > EPS^^M (Methylosinus) > ^W^tMM (Methylomicrobium) > 甲基胞囊菌屬(Methylocystis)、甲基營養(yǎng)細(xì)菌屬(Methylobacterium)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、集胞藻屬(Synechocystis)、聚球藻屬(Synechococcus)、項(xiàng)圈藻屬 (Anabaena) > Λ τ Slff ^M (Thiobacillus) > 甲;^ff 胃M (Methanobacterium) > 氏菌屬(Klebsiella)、粘球菌屬(Myxococcus)禾口葡萄球菌屬(Staphylococcus)。在一個實(shí)施例中，適合的宿主菌株從以下組中選取曲霉屬(Aspergillus)、釀酒酵母屬 (Saccharomyces)、畢氏酵母屬(Pichia)、念珠酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansuela)、 芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈霉菌屬(Str印tomyces)、短桿菌屬 (Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria)、大腸桿菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、集胞藻屬(Synechocystis)禾口克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)。在另一個實(shí)施例中，適合的宿主菌株從以下組中選取芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、大腸桿菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)和甲基單胞菌屬(Methylomonas)?？芍苯痈咝П磉_(dá)外源蛋白質(zhì)的微生物表達(dá)系統(tǒng)和含有調(diào)控序列表達(dá)載體均為本領(lǐng)域中熟練的技術(shù)人員所共知。其中的任何一個都能用于構(gòu)建嵌合型基因，以用于表達(dá)本發(fā)明的植酸酶。通過轉(zhuǎn)換將這些嵌合型基因?qū)氲竭m合的宿主細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)酶的高水平表達(dá)。據(jù)此預(yù)計(jì)，例如，在恰當(dāng)啟動子的控制下，采用嵌合型基因編碼細(xì)菌植酸酶，將有效提高植酸向磷酸鹽和肌醇轉(zhuǎn)化。慎重考慮其對同時在天然宿主細(xì)胞，以及同源宿主細(xì)胞中表達(dá)直接基因的益處。將已有的基因?qū)氲教烊凰拗髦袑?dǎo)致所存在的植酸酶活力水平的變化。可用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主細(xì)胞的載體或結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域中熟練的技術(shù)人員所共知。典型 的載體或結(jié)構(gòu)包含相關(guān)基因的直接轉(zhuǎn)錄和翻譯序列，選擇性標(biāo)記，以及允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。適合的載體由一個控制轉(zhuǎn)錄起始的5’區(qū)基因和一個控制轉(zhuǎn)錄終止的3’ 區(qū)DNA片段所組成。最優(yōu)選的為當(dāng)兩個控制區(qū)的來源都和與轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞基因同源時，盡管，眾所周知，這樣的控制區(qū)不是必須來自于選作生產(chǎn)宿主的特定菌株的天然基因。用于促進(jìn)預(yù)定宿主細(xì)胞中即時開放式閱讀框表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動子有很多，并為本領(lǐng)域中熟練的技術(shù)人員所熟悉。幾乎任何能夠促進(jìn)這些基因表達(dá)的啟動子，都適用于本發(fā)明，包括但不限于 CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、 LEU2、ENO, TPI(用于釀酒酵母中的表達(dá))，AOXl(用于畢氏酵母中的表達(dá))，與lac、ara、 tet、trp、IP. sub. L、IP. sub. R、T7、tac、禾口 trc (用于大腸桿菌中的表達(dá))，以及 amy, apr, npr啟動子和各種用于芽孢桿菌表達(dá)的噬菌體啟動子。外加，脫氧木酮糖磷酸合成酶或甲醇脫氫酶操縱型啟動子(Springer et al.，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 160:119-124(1998))， 進(jìn)行聚羥鏈燒酸合成的啟動子(Foellner et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol. 40 284-291 (1993))，從甲基營養(yǎng)菌天然質(zhì)粒中鑒定出來的啟動子(EP 296484)，從甲烷氧化菌中鑒定出來的啟動子(PCT/US03/33698)，以及與抗生素抗性相關(guān)聯(lián)的啟動子[e. g.， 卡那霉素(Springer et al. , supra ；Ueda et al. , Appl. Environ. Microbiol. 57 924-926 (1991))或四環(huán)素(U. S. Pat. No. 4，824，786)]，均適用于表達(dá)現(xiàn)有編碼序列，尤其是在Cl代謝中。同樣，終止控制區(qū)也可源自優(yōu)選的宿主所產(chǎn)生的各種基因。隨意地，可以不必需一個終止位點(diǎn)，盡管最優(yōu)選為含有終止位點(diǎn)。操縱基因途徑的方法為本領(lǐng)域中常規(guī)的及眾所周知的方法。通過各種方法對特定途徑中所選擇的基因進(jìn)行正調(diào)控或負(fù)調(diào)控。另外，通過基因打斷和相似的方法，消除或凈化競爭性途徑。一旦完成關(guān)鍵基因途徑的鑒定和測序，可對具體的基因進(jìn)行正調(diào)控以增加該途徑的產(chǎn)量，例如，在如PBR322等多拷貝質(zhì)粒上，增加可導(dǎo)入宿主細(xì)胞的目標(biāo)基因的拷貝數(shù)?；蛘邔δ繕?biāo)基因進(jìn)行修飾，以便其置于非原生啟動子的調(diào)控之下。預(yù)期的途徑操控在細(xì)胞周期的特定點(diǎn)， 或在發(fā)酵過程中進(jìn)行，使用調(diào)控型或誘導(dǎo)型啟動子替換目標(biāo)基因的原生啟動子。同樣地，在某些情況下，可對原生或內(nèi)源性啟動子進(jìn)行改造，以提高基因表達(dá)水平。例如，可通過體內(nèi)突變、缺失、和/或替換等方法改變內(nèi)源性啟動子(see，Kmiec, U. S. Pat. No. 5，565，350 ；Zarling et al.，PCT/US93/03868)?；蛘?，在一個途徑中，或一個可作為能量或碳源競爭匯的競爭性途徑中，需要降低或消除某些基因的表達(dá)。已經(jīng)開發(fā)出的基因負(fù)調(diào)控法可用于實(shí)現(xiàn)此目的。若已經(jīng)知道何處的基因序列需要被打斷，一個最有效的基因負(fù)調(diào)控方法是靶基因打斷，即將外源DNA插入到該位置的結(jié)構(gòu)基因中，從而中斷轉(zhuǎn)錄。這能夠通過創(chuàng)建的基因結(jié)構(gòu)盒予以實(shí)現(xiàn)，其由被插入DNA(通常是一個基因標(biāo)記)所組成，并且該被插入DNA的兩端含有與需要被打斷的基因部分有高度相似性的序列。將基因結(jié)構(gòu)盒導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，使得外源DNA通過細(xì)胞原生 DNA 復(fù)制機(jī)制插入到結(jié)構(gòu)基因中(Hamilton et al. , J. Bacteriol. 171 4617-4622 (1989)； Balbas et al., Gene 136:211-213(1993) ；Gueldener et al. , Nucleic Acids Res. 24 2519-2524(1996) ；and Smith et al.，Methods Mol. Cell. Biol. 5 :270_277(1996))。反義核酸技術(shù)是在目標(biāo)基因序列已知條件下，實(shí)現(xiàn)基因負(fù)調(diào)控的另一個方法。為此，需從預(yù)期的基因上克隆一個核酸片段，并將其操作性連接到一個啟動子上，從而使RNA 的反義鏈能夠被轉(zhuǎn)錄。然后將該構(gòu)建子導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，細(xì)胞中將產(chǎn)生RNA的反義鏈。反義RNA通過阻止編碼插入蛋白質(zhì)的mRNA的累積而抑制基因表達(dá)。本領(lǐng)域中熟練的技術(shù)人員均熟知與使用反義核酸技術(shù)以降低特定基因的表達(dá)相關(guān)聯(lián)的特殊事項(xiàng)。例如，技術(shù)人員熟知需要使用不同的嵌合型基因，利用不同的調(diào)控組件，以獲得適合的反義基因的表達(dá)水平。
雖然靶基因打斷和反義核酸技術(shù)是序列已知時實(shí)現(xiàn)基因負(fù)調(diào)控的有效手段，但其它不依賴序列的低特異性方法也得到了開發(fā)。例如，可將細(xì)胞暴露在紫外線輻射下，接受一定劑量的輻射后，從中篩選預(yù)期的顯型。化學(xué)試劑誘變也是一個獲得傳代突變體有效方法， 通常使用的物質(zhì)包括影響非復(fù)制性DNA的化合物如HNO2和NH2OH,以及影響復(fù)制性DNA的試劑如吖啶燃料，其對引起移碼突變有顯著效果。使用輻射或化學(xué)試劑構(gòu)建突變型的具體方法在本領(lǐng)域中有充分的文獻(xiàn)可作依據(jù)(例如，Thomas D. Brock. Biotechnology :A Textbook of Industrial Microbiology,第二版(1989) Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, Mass.(在下文中"Brock"),或 Deshpande, Mukund V. , App 1. Biochem. Biotechnol. , 36 227(1992)(在下文中〃 Deshpande “)。另一個基因打斷的非特異性方法是使用轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子是隨機(jī)插入到DNA中的基因元件，但隨后能夠根據(jù)序列進(jìn)行檢索來確定插入點(diǎn)所在的位置。體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)座方法都是已知的。兩種方法都涉及使用一個與一個轉(zhuǎn)座酶相結(jié)合的轉(zhuǎn)座元件。在轉(zhuǎn)座酶存在的情況下，當(dāng)轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子與一個核酸片段接觸時，轉(zhuǎn)座元件將隨機(jī)插入到該核酸片段中。該技術(shù)可用于隨機(jī)突變和基因分離，因?yàn)榭筛鶕?jù)轉(zhuǎn)座元件的序列對打斷基因進(jìn)行鑒定。用于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座的試劑盒為市售的產(chǎn)品(例如，The Primer Island Transposition Kit,訂購于 Perkin Elmer Applied Biosystems, Branchburg, N. J.,基于
^ Μτ ^ ；The Genome Priming System, iT^T New England Biolabs, Beverly, Mass.,基于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子 Tn7 ；禾口EZ: :TN Transposon Insertion Systems,訂購于Epicentre Technologies, Madison, Wis.，基于 Tn5 細(xì)菌轉(zhuǎn)座元件。)。

生物催化轉(zhuǎn)化植酸為磷酸鹽和肌醇通過將肌醇六磷酸與適當(dāng)植酸酶的水懸液相混合，制備含有植酸的水相反應(yīng)混合物。通過測定5. Ommol/L植酸底物(植酸鈉)溶液中，植酸轉(zhuǎn)化為期望的磷酸鹽和肌醇產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，以確定植酸酶的比活力(U/mg酶，“U/mg”)。植酸酶活性測定是依據(jù)在700nm下， 使用鉬酸銨作為顯色劑，比色定量通過植酸水解所釋放出的游離磷。在測試條件下(PH5. 0， 37°C，植酸鈉底物濃度0. 005mol/L)，每分鐘釋放Iumol無機(jī)正磷酸鹽所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。水解反應(yīng)的溫度選擇反應(yīng)速率和植酸酶穩(wěn)定性均最佳時的溫度。反應(yīng)溫度可在從反應(yīng)混合物的凝固溫度(大約0°c)至65°C的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整，一個優(yōu)選的反應(yīng)溫度范圍為5-45°C。植酸酶溶液可通過將植酸酶懸浮于蒸餾水中進(jìn)行制備；或?qū)⑵鋺腋∮谑狗磻?yīng)的初始PH保持在5. 0-10. O之間的緩沖液的水相反應(yīng)混合物中，優(yōu)選pH6. 0-8. O之間；或?qū)⒐潭ɑ菜崦笐腋∮谙嗨频幕旌衔镏校换蛲ㄟ^制備細(xì)胞提取物溶液，尤其是純化的或純的植酸酶；或?qū)⒓?xì)胞培養(yǎng)物上清液溶于相似的混合物中。底物加入后，反應(yīng)即開始進(jìn)行，由于產(chǎn)物的形成，反應(yīng)混合物的PH可能會變化。無pH控制下，反應(yīng)可一直進(jìn)行至完全轉(zhuǎn)化植酸， 或在反應(yīng)過程中添加適當(dāng)?shù)乃峄驂A，以維持預(yù)期的PH。
實(shí)施例在以下的實(shí)施例中，本發(fā)明所作的進(jìn)一步的描述，將展示本發(fā)明中優(yōu)選的實(shí)施方式。一個本領(lǐng)域中熟練的技術(shù)人員，都能夠從以上的討論及那些實(shí)例中明確本發(fā)明的基本特征，即針對各種用途和條件對其進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑旌托揎?，但不偏離其本質(zhì)和范圍。
常規(guī)方法使用植酸酶活性分析的標(biāo)準(zhǔn)方法，從不同大腸桿菌菌株中篩選耐熱植酸酶。將大腸桿菌菌株在LB培養(yǎng)基中37°C震蕩培養(yǎng)16hr。使用弗氏細(xì)胞壓碎器將細(xì)胞破碎后，懸浮于緩沖液中，在設(shè)定的條件下進(jìn)行植酸酶活性分析。耐熱植酸酶篩選的另一個方法為，使用根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的植酸酶基因序列設(shè)計(jì)的序列引物，通過基因組DNA序列分析技術(shù)對新的植酸酶基因進(jìn)行鑒定。實(shí)施例中所使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)均為本領(lǐng)域中所熟知的技術(shù)。例如，可在《分子克隆手冊 3》(Joseph Sambrook & David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory)查找實(shí)驗(yàn)操作與實(shí)驗(yàn)條件的相關(guān)說明。適用于細(xì)菌保藏和生長的培養(yǎng)材料和方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。適用于以下實(shí)施例的技術(shù)可在《普通細(xì)菌生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法指南》(Phillip Gerhardt,R. G. Ε. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds. ,American Society for Microbiology,Washington,D. C. (1994))中找至Ij0說明書中與測量單位、技術(shù)、特定或組分相應(yīng)的縮寫詞如下“sec"代表秒，“min"代表分鐘，“h〃代表小時，“d〃代表天，“mL〃代表毫升，“L"代表升，“mM〃代表毫摩爾每升，“M"代表摩爾每升，“mmol"代表毫摩爾，“rpm〃代表旋轉(zhuǎn)周每分鐘，“slpm"代表標(biāo)準(zhǔn)升每分鐘，“psig"磅每平方英尺，“wt"代表重量."HPLC"代表高壓液相色譜，“ca"意思為大約，“O.D.“代表特定波長下的光密度值，“dew"代表細(xì)胞干重，和〃 IU"代表國際單位。實(shí)施例1非-K12大腸桿菌植酸酶的克隆將大腸桿菌(ATCC 9637，從ATCC訂購)在LB培養(yǎng)基(LB營養(yǎng)瓊脂，北京陸橋生物技術(shù)有限公司)中37°C震蕩培養(yǎng)過夜。按照生產(chǎn)廠商的產(chǎn)品說明書，使用Puregene DNA提取試劑盒(Gentra Systems,Minneapolis,Minn.)提取所培養(yǎng)大腸桿菌的基因組DNA。設(shè)計(jì)并合成(Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)用于克隆非-K12大腸桿菌植酸酶的基因序列 PCR 引物(0LIG0 ID NO 1-6，圖 3)。使用 InsT/Aclone PCR產(chǎn)物克隆試劑盒(Fermentas Life Sciences)進(jìn)行PCR反應(yīng)，以獲取基因序列。PCR反應(yīng)混合物0. ImM dNTP，0.05mM引物，IOng基因組模板DNA，2U Taq DNA聚合酶，5mM MgCl2，和IOmM Tris-HCl緩沖液，反應(yīng)液總體積為0. Iml0將以上0. Iml反應(yīng)液在0. 2ml反應(yīng)管中混合，并置于DNA熱循環(huán)儀中 (Perkin-Elmer Thermocycler Type 2400)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，所使用的溫度程序?yàn)橄?95°C 3min;然后 94°C lmin,58°C lmin,72°C lmin，進(jìn)行 35 個循環(huán)；再 94°C 7min。使用2個多聚物(由Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd合成)對通過PCR從大 腸桿菌ATCC 9637菌株中獲得的非-K12植酸酶編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增。5’端引物編碼成熟多肽的N端MQSEPELKL，并含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)和限制性酶切位點(diǎn)NcoI (0LIG0 ID N0. 7，圖3)。 3’端引物編碼植酸酶多肽的C端IPACSL，并含有TAA終止子和限制性酶切位點(diǎn)SnaBI (0LIG0 ID N0. 8，圖3)。在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示其為1.4kb的DNA片段。使用DNA凝膠純化系統(tǒng)(Qiagen Biochemical Co.)分離純化該DNA片段。用限制性內(nèi)切酶NcoI/SnaBI (Fermentas Life Sciences)對純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后連接到質(zhì)粒pTrcHis2 (Invitrogen Biotechnology Co. ,Ltd)上，獲得重組質(zhì)粒pTrcHis2_PhE(見圖5)。重組質(zhì)粒pTrCHis2-PhE的序列分析結(jié)果表明目標(biāo)序列得到了正確插入，其序列如SEQ ID NO :1所示，但不包括信號肽序列。將Iul連接反應(yīng)液與50ul感受態(tài)大腸桿菌MG1655細(xì)胞(ATCC 700926，從ATCC訂購)混合。將混合液置于高壓脈沖儀(Bio-Rad electroporation system)上進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。 然后將反應(yīng)液加入到0.45ml SOC培養(yǎng)基(0.5%酵母粉，2.0%蛋白胨，IOmM NaCl, 2. 5mM KCl, IOmM MgCl2, IOmM MgSO4和20mM葡萄糖)中，37°C震蕩孵育lhr。再將培養(yǎng)液涂布到含有100mg/ml硫酸氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)過夜。挑選轉(zhuǎn)化子克隆(pTrCHis2-PhE/ MG1655)，并用于進(jìn)行植酸酶基因表達(dá)。實(shí)施例2在大腸桿菌中表達(dá)非-K12大腸桿菌植酸酶(W-PhE) 將實(shí)施例1所獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基(1%蛋白胨，0.5%酵母粉，氯化鈉，50ug/ml氨芐青霉素)中，37°C震蕩培養(yǎng)20小時。按照1/100的體積比率將過夜培養(yǎng)物加入到與以上相同的新鮮培養(yǎng)基中，然后在同樣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)至OD55tl = 0. 5 時，加入IM IPTG，使其終濃度為ImM。然后繼續(xù)培養(yǎng)20小時，誘導(dǎo)植酸酶基因表達(dá)。離心收集菌體細(xì)胞，用無菌水洗滌2次，然后按IOOmg細(xì)胞濕重/ml的濃度將其沖洗懸浮在乙酸-乙酸鈉緩沖液中(0. 1M，ρΗ5· 8)。使用超聲波破碎儀(COSMO BIO CO.，LTD)對所得到的細(xì)胞進(jìn)行破碎。從破碎液中分離上清液，并用于進(jìn)行SDS-PAGE分析。通過電泳對表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明存在分子量為47kDa的蛋白，與理論分子量一致。另外，使用埃德曼降解法(Edman degradation)對以下實(shí)施例7所述的純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行N端氨基酸序列測定，結(jié)果表明其與SEQ ID NO 3中的氨基酸序列一致。對所收獲的細(xì)胞進(jìn)行植酸酶活性分析。在常溫下，將50mg/ml收獲細(xì)胞， 0. 3M植酸酶溶液和0. IM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.8)混合。參考文獻(xiàn)“Chen QC, Li Bff(2003)Separation of phytic acid and other related inositol phosphates by high-performance ionchromatography and its applications. J Chromatogr A 1018 41-52”，使用高效液相色譜儀測定植酸轉(zhuǎn)化率。實(shí)施例3通過大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)非-K12大腸桿菌植酸酶(W-PhE)^ 14L ^ Braun Biostat C ^(B. Braun Biotech International Gmbh, Melsungen, Germany)中，使用含有葡萄糖、氨水和酵母粉(0X0ID LTD.，BASINFST0KE HAMPSHIRE, ENGLAND)的礦質(zhì)培養(yǎng)基，生產(chǎn)非-K12大腸桿菌植酸酶。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含有實(shí)施例1所制備的質(zhì)粒pTrCHis2-PhE的大腸桿菌菌株 pTrcHis2-PhE/MG1655，以制備用于發(fā)酵接種的種子。在2L三角瓶中培養(yǎng)500ml種子，37°C、 300rpm下培養(yǎng)至ODU . = 550) > 2. O0這可能需要大約10小時。先在容器中用無菌水配制7. 5L初始培養(yǎng)基(含:32g KH2PO4,8. Og MgSO4 · 7H20， 8. 0g(NH4)2S04，50g酵母粉，和 IOmL Mazu DF204 消泡劑(BASF Corporation,Mount Olive, N.J.))。將所配制的培養(yǎng)基倒入發(fā)酵罐中，用蒸汽進(jìn)行滅菌。滅菌后，再向發(fā)酵罐中無菌加入369g葡萄糖的水溶液(60%，w/v)(已進(jìn)行蒸汽滅菌)、160mL微量元素溶液(表1)(已過濾滅菌)、和氨芐青霉素溶液(已經(jīng)過濾滅菌，使其在發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的終濃度為IOOmg/ L)。然后再用 NH4OH(40%, w/v)和 H2SO4(20%, w/v)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH 至 6. 8。表1微量元素溶液
權(quán)利要求
1.一個分離的核酸分子，其含有一個選自以下組中的核苷酸序列(a)一個核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的多肽；(b)一個在嚴(yán)格雜交條件下與(a)雜交的核苷酸序列，其所述核苷酸序列編碼具有非-K12大腸桿菌植酸酶活性的多肽；或(c)一個與(a)或(b)互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其含有一個選自以下組中的核苷酸序列(a)一個由如SEQ ID NO 1中所示第67-1296位核苷酸所組成的核素序列；(b)一個由如SEQ ID NO 2中所示第1-1230位核苷酸所組成的核素序列；(c)一個如SEQ ID NO 1所示的核酸序列；(d)一個在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(c)中任一個雜交的核酸序列，其編碼具有非-K12大腸桿菌植酸酶活性的多肽；或(e)一個與(a)至(d)中任一個互補(bǔ)的核苷酸序列。
3.一個含有如權(quán)利要求1中所述分離的核酸分子的載體。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其是一個表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的載體，其可以從由pTrcHis2-PhE，pPIC9K_PhE，pMET-PhE和 pKLAC-PhE所組成的組中選取。
6.一個含有如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子的細(xì)胞；
7.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其所述的分離的核酸分子包含在一個表達(dá)載體上。
8.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其是一個酵母細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其可以從由大腸桿菌(Escherichiacoli.)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇酵母(Pichia methanolica)和克魯維乳酸酵母 (Kluyeromyces lactis)所組成的組中選取。
10.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其可以選自以下組中E.coli MG1655, P. pastoris GS115, P. methanolica PMAD16 禾口 Kluyeromyces lactis GG799。
11.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其可以選自以下組中轉(zhuǎn)化有pTrcHis2-PhE載體的E. coli MG1655細(xì)胞，轉(zhuǎn)化有pPIC9K-PhE載體的P. pastoris SMD1168細(xì)胞，轉(zhuǎn)化有 pMET-PhE 載體的 P. methanolica PMD16 細(xì)胞和轉(zhuǎn)化有 pKLAC-PhE 載體的 Kluyeromyces lactis GG799 細(xì)胞。
12.—個多肽，其含有一個選自以下組中的氨基酸序列(a)一個如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列；或(b)一個與SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的相似性99%以上的氨基酸序列，其所述的多肽具有非-K12大腸桿菌植酸酶活性。
13.—個通過發(fā)酵生產(chǎn)非K-12大腸桿菌植酸酶的工藝，其包括在一個有利于表達(dá)的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，以獲得具有非-K12大腸桿菌植酸酶活性的多肽。優(yōu)選的，所選擇的細(xì)胞株為轉(zhuǎn)化有pTrcHis2-PhE載體的E. coli MG1655細(xì)胞，轉(zhuǎn)化有pPIC9K-PhE載體的P. pastoris SMDl 168細(xì)胞，轉(zhuǎn)化有pMET-PhE載體的 P. methanolicaPMD16 細(xì)胞和轉(zhuǎn)化有 pKLAC-PhE 載體的 Kluyeromyces lactis GG799 細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及來源于非-K12大腸桿菌Escherichia coli strain ATCC 9637耐熱植酸酶基因的克隆和測序，植酸酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)，密碼子優(yōu)化及其在巴斯德畢氏酵母(Pichia pastoris)、甲醇酵母(Pichia methanolica)和克魯維乳酸酵母(Kluyeromyces lactis)中的表達(dá)。使用經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的植酸酶基因，通過巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)發(fā)酵，可獲得高產(chǎn)率的耐熱植酸酶。
文檔編號C12N15/55GK102209785SQ200880131973
公開日2011年10月5日 申請日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者葉秀云, 李仁寬, 陳彩芳, 靳偉剛 申請人:福建福大百特科技發(fā)展有限公司