專利名稱：耐熱菌的qc－pcr快速定量檢測所用競爭模板的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品微生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及到耐熱菌的QC-PCR快速定量檢測所用競爭模板的制備方法。
背景技術(shù)：
蘋果濃縮汁中含有的酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)，是環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)的一員，俗稱耐熱菌，是一種嗜熱、嗜酸的細(xì)菌，其芽孢能經(jīng)受酸性條件下的巴氏殺菌過程而存活，在適宜條件下，耐熱菌在果汁中大量繁殖時，不產(chǎn)生氣體，不改變果汁的pH值，但會產(chǎn)生特殊氣味化合物，有時還使果汁產(chǎn)生輕微沉淀或霧狀渾濁，對果汁感官品質(zhì)有很大影響。盡管耐熱菌并不致病，也不產(chǎn)生毒素，但其引起的果汁感官性狀劣變，甚至引起果汁腐敗，完全破壞了果汁的食用性和商品價值。所以，國際貿(mào)易中對蘋果濃縮汁中的耐熱菌含量要求很嚴(yán)，耐熱菌是蘋果濃縮汁產(chǎn)品的必檢項目，也常常成為蘋果濃縮汁貿(mào)易中的技術(shù)壁壘，從而為蘋果濃縮汁的生產(chǎn)、貿(mào)易和商檢提出了新的挑戰(zhàn)。
我國蘋果年產(chǎn)量位居世界第一，蘋果濃縮汁生產(chǎn)發(fā)展迅速，生產(chǎn)量及出口量均居世界第一，2002年我國蘋果濃縮汁加工能力為每小時處理鮮果量1500～2000噸，產(chǎn)品85％以上進(jìn)入國際市場，年出口量30萬噸左右，出口創(chuàng)匯1.5億美元。然而我國蘋果濃縮汁中耐熱菌含量常常嚴(yán)重超標(biāo)，在對外貿(mào)易中因耐熱菌超標(biāo)引起的經(jīng)貿(mào)糾紛時有發(fā)生，嚴(yán)重影響了我國蘋果濃縮汁的出口創(chuàng)匯，從而給蘋果產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。耐熱菌的超標(biāo)成了我國蘋果濃縮汁質(zhì)量安全的一個瓶頸。解決這一問題的關(guān)鍵之一是要有快速、特異、靈敏的檢測技術(shù)手段，以便及時反饋到生產(chǎn)線，實施有效的控制，以保證產(chǎn)品質(zhì)量與安全。
目前國內(nèi)外對蘋果濃縮汁中耐熱菌檢測的通用方法是細(xì)菌平皿培養(yǎng)記數(shù)法，檢測周期為4-5天，不能及時有效控制產(chǎn)品安全質(zhì)量。關(guān)于PCR檢測方法，目前有RT-PCR檢測AJC中的耐熱菌，及實時PCR檢測AJC中的耐熱菌。但前者只能定性，不能定量，況且，由于RNA的提取過程要求苛刻，反轉(zhuǎn)錄又使檢測結(jié)果的不確定因素增多，后者除操作過程復(fù)雜外，對儀器設(shè)備要求也很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要公開一種耐熱菌的QC-PCR(競爭定量PCR)快速定量檢測所用競爭模板的制備方法。
本發(fā)明的操作步驟如下捕集目標(biāo)菌進(jìn)行DNA的提取→競爭模板引物設(shè)計→競爭模板的PCR擴(kuò)增→凝膠電泳檢測→回收競爭模板→測定回收的競爭模板濃度。
具體實施例方式
本發(fā)明按以下具體步驟進(jìn)行a.捕集目標(biāo)菌進(jìn)行DNA的提取b.競爭模板引物設(shè)計采用構(gòu)建競爭模板的原理，設(shè)計出擴(kuò)增耐熱菌競爭模板的引物1和引物3引物15′-ACGGGTAGGCATCTACTTGT-3′；引物35′-AGGAGCTTTCCACTCTCCTTGTGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTT-3′；c.競爭模板的PCR擴(kuò)增
c.1用引物1和引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得比目標(biāo)模板(298bp)中間少51bp外，其它部分相同的競爭模板(247bp)；c.2 50μL PCR擴(kuò)增體系組成Taq DNA聚合酶2U， Mg2+濃度2.0mmol/L，dNTP濃度0.2mmol/L， 引物濃度0.2μmol/L，添加10％的甘油作促進(jìn)劑，10×Buffer緩沖液5μL，提取的耐熱菌DNA模板10μL，其余體積以無菌三蒸水補(bǔ)足；c.3熱啟動及降落PCRc.3.1在冰盒上將PCR反應(yīng)體系各成分混勻c.3.2當(dāng)PCR循環(huán)儀溫度上升至70℃以上時，再將各擴(kuò)增樣品置于循環(huán)儀中擴(kuò)增c.3.3退火溫度由60℃降落到50℃；c.4循環(huán)程序94℃變性4min后進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃30S、60℃降落到50℃30S、72℃30S，擴(kuò)增35個循環(huán)后72℃延伸補(bǔ)足5min；d.凝膠電泳檢測d.1取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物及DNA Marker，加入2μL上樣緩沖液(甘油-溴酚藍(lán)溶液)，充分混勻后上樣d.1.12.0％的瓊脂糖凝膠d.1.280V電壓d.1.3時間30-40min；d.2將電泳后的凝膠從電泳槽中取出，紫外檢測儀觀察電泳結(jié)果；e.回收競爭模板用DNA凝膠分離純化試劑盒分離純化回收競爭模板，f.測定回收的競爭模板濃度f.1核酸/蛋白質(zhì)分析儀測定所回收競爭模板濃度；f.2根據(jù)競爭模板分子量計算競爭模板DNA含量；f.3將制備的競爭模板稀釋成5×100～5×108個拷貝的競爭模板系列；f.4-4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的使用效果以50μL PCR體系，使用引物1、引物3，PCR得到除比目標(biāo)模板(298bp)中間少51bp外，其它部分相同的競爭模板(247bp)，再用DNA分離純化試劑盒可分離純化獲得所需競爭模板。經(jīng)競爭模板與目標(biāo)模板共擴(kuò)增，當(dāng)競爭模板與目標(biāo)模板濃度相近時，二者具有相近的擴(kuò)增效率，且兩者擴(kuò)增產(chǎn)物能夠在凝膠電泳上清楚的分開。本法所制備的競爭模板可成功的用于QC-PCR對耐熱菌的快速定量檢測。
權(quán)利要求
1.耐熱菌的QC-PCR快速定量檢測所用競爭模板的制備方法，其特征是操作步驟如下捕集目標(biāo)菌進(jìn)行DNA的提取→競爭模板引物設(shè)計→競爭模板的PCR擴(kuò)增→凝膠電泳檢測→回收競爭模板→測定回收的競爭模板濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐熱菌的QC-PCR快速定量檢測所用競爭模板的制備方法，其特征是按以下具體步驟進(jìn)行2.a捕集目標(biāo)菌進(jìn)行DNA的提取2.b競爭模板引物設(shè)計采用構(gòu)建競爭模板的原理，設(shè)計出擴(kuò)增耐熱菌競爭模板的引物1和引物3引物15′-ACGGGTAGGCATCTACTTGT-3′；引物35′-AGGAGCTTTCCACTCTCCTTGTGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTT-3′；2.c競爭模板的PCR擴(kuò)增2.c.1用引物1和引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得比目標(biāo)模板(298bp)中間少51bp外，其它部分相同的競爭模板(247bp)；2.c.250μL PCR擴(kuò)增體系組成Taq DNA聚合酶2U， Mg2+濃度2.0mmol/L，dNTP濃度0.2mmol/L， 引物濃度0.2μmol/L，添加10％的甘油作促進(jìn)劑，10×Buffer緩沖液5μL，提取的耐熱菌DNA模板10μL，其余體積以無菌三蒸水補(bǔ)足；2.c.3熱啟動及降落PCR2.c.3.1在冰盒上將PCR反應(yīng)體系各成分混勻2.c.3.2當(dāng)PCR循環(huán)儀溫度上升至70℃以上時，再將各擴(kuò)增樣品置于循環(huán)儀中擴(kuò)增2.c.3.3退火溫度由60℃降落到50℃；2.c.4循環(huán)程序94℃變性4min后進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃30S、60℃降落到50℃30S、72℃30S，擴(kuò)增35個循環(huán)后72℃延伸補(bǔ)足5min；2.d 凝膠電泳檢測2.d.1取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物及DNA Marker，加入2μL上樣緩沖液(甘油-溴酚藍(lán)溶液)，充分混勻后上樣2.d.1.12.0％的瓊脂糖凝膠2.d.1.280V電壓2.d.1.3時間30-40min；2.d.2將電泳后的凝膠從電泳槽中取出，紫外檢測儀觀察電泳結(jié)果；2.e回收競爭模板用DNA凝膠分離純化試劑盒分離純化回收競爭模板，2.f測定回收的競爭模板濃度2.f.1核酸/蛋白質(zhì)分析儀測定所回收競爭模板濃度；2.f.2根據(jù)競爭模板分子量計算競爭模板DNA含量；2.f.3將制備的競爭模板稀釋成5×100～5×108個拷貝的競爭模板系列；2.f.4-4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐熱菌的QC－PCR快速定量檢測所用競爭模板的制備方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行捕集目標(biāo)菌進(jìn)行DNA的提取→競爭模板引物設(shè)計→競爭模板的PCR擴(kuò)增→凝膠電泳檢測→回收競爭模板→測定回收的競爭模板濃度。本發(fā)明以50μLPCR體系，使用引物1、引物3，PCR得到除比目標(biāo)模板(298bp)中間少51bp外，其它部分相同的競爭模板(247bp)，再用DNA分離純化試劑盒可分離純化獲得所需競爭模板，經(jīng)競爭模板與目標(biāo)模板共擴(kuò)增，當(dāng)競爭模板與目標(biāo)模板濃度相近時，二者具有相近的擴(kuò)增效率，且兩者擴(kuò)增產(chǎn)物能夠在凝膠電泳上清楚地分開，本法所制備的競爭模板可成功地用于QC－PCR對耐熱菌的快速定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1900307SQ200510042978
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者李建科, 馮再平, 仇農(nóng)學(xué), 常玉華 申請人:陜西師范大學(xué)