專利名稱：用于心血管疾病的生物標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于診斷學(xué)領(lǐng)域，更具體地，屬于心血管疾病的診斷、預(yù)測(cè)和治療領(lǐng)域。本 發(fā)明涉及用于診斷和預(yù)測(cè)患者心血管疾病的生物標(biāo)記物，用于診斷和預(yù)測(cè)對(duì)象心血管疾病 的方法，執(zhí)行此種方法的試劑盒，及對(duì)此種方法有用的微陣列和診斷試劑。特別地，診斷的 心血管疾病涉及缺血性心臟病。本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療患心血管疾病(患此病風(fēng)險(xiǎn)增大) 的對(duì)象的方法和適合用于此種治療方法的藥物組合物。
背景技術(shù)：
缺血性心臟病類疾病的特點(diǎn)是供應(yīng)到心臟的血液減少，它是西方世界中發(fā)病率 和死亡率的主要原因。由于患者所需的加強(qiáng)醫(yī)療護(hù)理，該疾病構(gòu)成健康護(hù)理醫(yī)療費(fèi)用 和健康護(hù)理基礎(chǔ)設(shè)施的主要投資。該疾病的早期診斷是困難的。實(shí)際上，沒(méi)有適當(dāng)?shù)?測(cè)試可用于診斷進(jìn)行性缺血(ongoing ischemia)和代償性新血管形成(compensatory neovascularization)。缺血性心臟病的當(dāng)前診斷以功率計(jì)(運(yùn)動(dòng))測(cè)試(ergometric (exercise) testing)或心肌灌注成像為基礎(chǔ)。這些技術(shù)具有有限的靈敏度和專一性。更可靠的方法是 執(zhí)行冠脈血管造影術(shù)(coronary angiography)。但此種經(jīng)皮和侵入性操作伴有相當(dāng)大的風(fēng)險(xiǎn)。所以，需要用于診斷和預(yù)測(cè)缺血性心臟病的可靠的生物標(biāo)記物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在許多情況下與成年血管生成過(guò)程(新血管發(fā)育)相 關(guān)的基因表達(dá)預(yù)示進(jìn)行性缺血，因而這些基因表達(dá)可用于診斷和預(yù)測(cè)缺血。發(fā)明人首次獲 得該發(fā)現(xiàn)是在注意到小鼠Flkl+細(xì)胞中大量基因在血管生成(新血管形成)期間被上調(diào)之 后。詳細(xì)的跨物種驗(yàn)證(trans-species verification)表明這些基因在青春期小鼠模型 中在缺血期間被上調(diào)，在該跨物種驗(yàn)證中細(xì)察了小鼠和斑馬魚(yú)形成血管樹(shù)期間與血管生成 相關(guān)的這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)。這將這些基因的表達(dá)與動(dòng)脈疾病聯(lián)系在一起。本發(fā) 明人因此現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行性缺血和其他心血管疾病的診斷，可通過(guò)檢測(cè)代償性新血管形成 過(guò)程，特別是通過(guò)檢測(cè)與活化的EPC相關(guān)的基因表達(dá)譜。這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物在缺血和 動(dòng)脈修復(fù)期間提供了代償系統(tǒng)，導(dǎo)致代償性血管生成和血管修復(fù)。這些基因的表達(dá)與缺血 之間的聯(lián)系進(jìn)一步通過(guò)單個(gè)基因(克隆)及其基因產(chǎn)物的表達(dá)被分析證實(shí)，其中該基因及 其產(chǎn)物屬于循環(huán)多形核白細(xì)胞(PML)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(作為PML組分的一部分)和血清或血 液樣本的亞群(subset)，該血液樣本來(lái)自患穩(wěn)定型缺血性冠狀動(dòng)脈病和急性冠脈綜合征患 者ο一方面，本發(fā)明現(xiàn)提供診斷或預(yù)測(cè)對(duì)象中心血管疾病的方法，所述方法包括在所 述對(duì)象循環(huán)流體(circulation fluid)的樣本中檢測(cè)活化的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的出現(xiàn)的步
馬聚ο
在此種方法的優(yōu)選實(shí)施例中，所述心血管疾病與動(dòng)脈損傷或心肌損傷相關(guān)。在此種方法的可替換的優(yōu)選實(shí)施例中，所述心血管疾病與缺血相關(guān)。在本發(fā)明的方法中，檢測(cè)活化的EPC的步驟合適地包含在所述樣本中檢測(cè)EPC中 基因表達(dá)水平的升高，該基因?yàn)檫x自下面組中的至少1個(gè)基因和甚至更優(yōu)選的至少2、3、4、 5、10、15、20、25、30、35個(gè)或所有基因，該組由下列基因組成，即，ADORAl、AD0RA2A、AD0RA2B、 AD0RA3、AGTRL 1 (APLNR)、AMPH、APLN、CCBE1、CDC42、CGNL1、CREBBP、CRIPl、CRIP2、CRIP3、 CYB5B、DLL4、DUSP5、EEAl、egr-l、ELKl、ELK3、ELK4(SAPl)、EP300、ERG1(KCNH2)、ETS1、ETS2、 EXOC3L、FO)l、Fa)2、FGD3、Fa)4、FGD5、FLTl、FST、GATA6、GRRPl、HO-l(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、 IFNG、ILlA、ILlB、LAMA4、Lambl-l、LGMN、MMP3、Nos2、PAIl、PHDl、PLVAP、RAB5a、RIN3、R0CK2、 S0X18、S0X7、SRF、STABU STAB2、STUBl、TFEC、THBS1、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSD1、 TNFAIP8，和XLKDl (LYVEl)，該基因又優(yōu)選為選自由下面組中至少1個(gè)基因和更優(yōu)選至少2、 3、4、5、10、15、20、25、30個(gè)或所有基因，該組由下列基因組成，S卩，AD0RA2A、AGTRL1 (APLNR)、 APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、 FGD5、GRRPl、HO-1 (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、LAMA4、Lamb 1-1、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、 S0X18、STABl、STAB2、STUBl、TFEC, THSDl、TNFAIP8，和 XLKDl (LYVEl)。基因表達(dá)水平的提 高可通過(guò)任何合適的方法檢測(cè)并可針對(duì)核酸(例如，mRNA)或蛋白質(zhì)檢測(cè)。上面提及的基 因的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物可由活化的EPC分泌，因而EPC中的基因表達(dá)水平可通過(guò)檢測(cè)全血中 的蛋白質(zhì)檢測(cè)，而不是通過(guò)檢測(cè)全血的EPC組分(fraction)。這個(gè)方法優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)方法的重要優(yōu)勢(shì)(循環(huán)EPC數(shù)目的計(jì)數(shù)或功率計(jì)(運(yùn)動(dòng)) 測(cè)試)在于本方法更靈敏且該疾病可在更早期被檢測(cè)到?；诖?，本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈疾病、缺血和代償性新血管形成的潛在生物 標(biāo)記物，可在血管生成期間在活化的EPC中被上調(diào)的基因和這些基因的表達(dá)產(chǎn)物當(dāng)中找 到，并發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記物可在血液、血液的血清或細(xì)胞組分中檢測(cè)到。另一方面，本發(fā)明現(xiàn)提供用于診斷或預(yù)測(cè)患者的心血管疾病的生物標(biāo)記物，所述 生物標(biāo)記物包含其在血管生成期間表達(dá)被調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述生物標(biāo)記 物包含在血管生成期間其表達(dá)被上調(diào)的基因(促血管生成基因，pro-vasculogenic gene) 的表達(dá)產(chǎn)物。在可替換的優(yōu)選實(shí)施例中，該生物標(biāo)記物存在于內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)或多形核 白細(xì)胞(PMN)或全血中。大體上，本發(fā)明以檢測(cè)對(duì)象的血液中活化的EPC為基礎(chǔ)?；罨腅PC，作為循環(huán)EPC 標(biāo)準(zhǔn)池(normal pool)的一部分，最好通過(guò)它們的特異基因庫(kù)(r印ertoire)(基因表達(dá)譜) 鑒定。因?yàn)榛虮磉_(dá)產(chǎn)物中的一些可被周圍血液中的細(xì)胞分泌，被分泌的生物標(biāo)記物也可 在全血中檢測(cè)到。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述EPC或P麗存在于患者的外周血中。優(yōu)選地，所 述EPC是Flkl+(Flkl陽(yáng)性)細(xì)胞。更優(yōu)選地，活化的EPC顯示基因表達(dá)譜，其中選自下面 組中的至少1個(gè)基因和更優(yōu)選至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35個(gè)或所有基因的表達(dá)水平 與它們?cè)谖椿罨腅PC中相比被上調(diào)，該組由下列基因組成，即ADORA 1、AD0RA2A、AD0RA2B、 AD0RA3、AGTRLl (APLNR)、AMPH、APLN、CCBEl、CDC42、CGNLl、CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、 CYB5B、DLL4、DUSP5、EEAl、egr-l、ELKl、ELK3、ELK4(SAPl)、EP300、ERG1(KCNH2)、ETS1、ETS2、 EXOC3L、FO)l、Fa)2、FGD3、Fa)4、FGD5、FLTl、FST、GATA6、GRRPl、HO-l(HM0X1)、H0_2(HM0X2)、IFNG、ILlA、ILlB、LAMA4、Lambl-l、LGMN、MMP3、Nos2、PAIl、PHDl、PLVAP、RAB5a、RIN3、R0CK2、 S0X18、S0X7、SRF、STABU STAB2、STUBl、TFEC、THBSl、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSD1、 TNFAIP8和XLKDl (LYVEl)，還優(yōu)選選自下面組中至少1個(gè)基因和又更優(yōu)選至少2、3、4、5、 10、15、20、25、30個(gè)或所有基因在與它們?cè)谖椿罨腅PC中的表達(dá)水平被上調(diào)，該組由下列 基因組成，即 AD0RA2A、AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、 ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD5、GRRP1、HO-1 (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、LAMA4、 Lambl-I、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、S0X18、STABl、STAB2、STUBl、TFEC、THSDl、TNFAIP8 和 XLKDl (LYVEl)。本發(fā)明生物標(biāo)記物優(yōu)選為選自下面組中的至少1個(gè)基因和更優(yōu)選至少2、3、4、5、 10、15、20、25、30、35個(gè)或所有基因的表達(dá)產(chǎn)物(多肽或多核糖核苷酸)，該組由下列基因組 成，即 ADORA1、AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、AGTRLl(APLNR)、AMPH、APLN、CCBE1、CDC42、CGNL1、 CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、DLL4、DUSP5、EEAl、egr_l、ELK1、ELK3、ELK4 (SAPl)、 EP300、ERG 1 (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD1、FGD2、FGD3、FGD4、FGD5、FLT1、FST、GATA6、 GRRPl、HO-I (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、IFNG、ILIA、IL1B、LAMA4、Lambl-U LGMN、MMP3、Nos2、 PAI1、PHDl、PLVAP, RAB5a、RIN3、R0CK2、S0X18、S0X7、SRF, STABl、STAB2、STUBl、TFEC, THBSl、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSDl、TNFAIP8，和 XLKDl (LYVEl)，還優(yōu)選為選自下面 組中的至少1個(gè)基因而又更優(yōu)選至少2、3、4、5、10、15、20、25、30個(gè)或所有基因的表達(dá)產(chǎn)物 (多肽或多核糖核苷酸)，該組由下列基因組成，即，AD0RA2A、AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBE1、 CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD5、GRRPl、 HO-I(HMOXl)、H0-2(HM0X2)、LAMA4、Lambl_l、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、S0X18、STABl、 STAB2、STUBU TFEC, THSD1、TNFAIΡ8，禾口 XLKDl (LYVEl)。本發(fā)明生物標(biāo)記物可具有上面提到的基因之一的表達(dá)產(chǎn)物的形式，或可采取蛋白 質(zhì)譜或RNA譜的形式。另一方面，本發(fā)明提供了如上定義的生物標(biāo)記物在診斷或預(yù)測(cè)對(duì)象心血管疾病方 面的用途。另一方面，本發(fā)明提供了如上定義的生物標(biāo)記物作為替代終點(diǎn)標(biāo)記物(surrogate end-point marker)的用途。此種替代終點(diǎn)標(biāo)記物可用在心血管疾病的預(yù)測(cè)研究中并可用 于測(cè)試治療效果。另一方面，本發(fā)明提供了用于診斷或預(yù)測(cè)對(duì)象心血管疾病的方法，該方法包括在 所述對(duì)象血液中檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)記物。所述方法優(yōu)選在所述對(duì)象的血液樣本上進(jìn) 行。在所述方法的其它優(yōu)選實(shí)施例中，檢測(cè)生物標(biāo)記物的步驟可通過(guò)使用微陣列進(jìn)行。在所 述方法的可替換的優(yōu)選實(shí)施例中，檢測(cè)生物標(biāo)記物的步驟可通過(guò)使用串聯(lián)質(zhì)譜法(MS-MS)、 通過(guò)MALDI-FT質(zhì)譜儀、MALDI-FT-ICR質(zhì)譜儀、MALDI三重四極桿質(zhì)譜儀、QPCR或其它雜交 方法或免疫分析進(jìn)行。實(shí)際上，任何合適的檢測(cè)方法均可用于鑒定該生物標(biāo)記RNA或蛋白 質(zhì)。另一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，該試劑盒用于根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)行診斷或預(yù)測(cè)對(duì) 象心血管疾病的方法。所述試劑盒包含至少一個(gè)如上文定義的生物標(biāo)記物，或特異性結(jié)合 到所述生物標(biāo)記物的特異性結(jié)合伴侶。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可選地進(jìn)一步包含下面的一個(gè) 或多個(gè)
至少一種參考樣本或?qū)φ諛颖?；關(guān)于生物標(biāo)記物的參考值的信息；至少一種能夠結(jié)合到所述特異性結(jié)合伴侶的測(cè)試化合物；至少一個(gè)用于檢測(cè)所述生物標(biāo)記物和所述特異性結(jié)合伴侶之間的結(jié)合的可檢測(cè) 的標(biāo)記物。另一方面，本發(fā)明提供了微陣列，該微陣列用于根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行診斷或預(yù)測(cè)對(duì)象 心血管疾病的方法。所述微陣列包含特異性結(jié)合伴侶，該伴侶特異性結(jié)合到至少兩個(gè)如上 文定義的生物標(biāo)記物上，其中該生物標(biāo)記物結(jié)合到固體載體(solid support)上。另一方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合到如上文定義的生物標(biāo)記物上的診斷試劑。 優(yōu)選地，該診斷試劑是與所述生物標(biāo)記物在嚴(yán)格條件下特異性雜交的抗體或核酸分子。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明診斷試劑的診斷組合物。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明診斷組合物在診斷對(duì)象心血管疾病方面的用途。另一方面，本發(fā)明提供了治療患心血管疾病(風(fēng)險(xiǎn)增大)的對(duì)象的方法，所述方法 包括使用如上文定義的生物標(biāo)記物作為治療靶或作為治療劑。在治療對(duì)象的根據(jù)本發(fā)明方法中，所述生物標(biāo)記物作為治療靶或作為治療劑的 所述用途包含影響選自下面組中至少1個(gè)基因和更優(yōu)選至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、 35個(gè)或所有基因的表達(dá)，該組由下列基因組成，即AD0RA1、AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、 AGTRLl (APLNR)、AMPH、APLN、CCBEl、CDC42、CGNLl、CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、 DLL4、DUSP5、EEAU egr_l、ELKU ELK3、ELK4 (SAPl)、EP300、ERGl (KCNH2)、ETSU ETS2、 EX0C3L、FGD1、F⑶2、FGD3、F⑶4、FGD5、FLT1、FST、GATA6、GRRP1、H0-1(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、 IFNG、ILIA、IL1B、LAMA4、Lambl-I、LGMN、MMP3、Nos2、PAI1、PHDl、PLVAP, RAB5a、RIN3、 R0CK2、S0X18、S0X7、SRF、STABU STAB2、STUBl、TFEC、THBS1、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、 THSDU TNFAIP8，和XLKDl (LYVEl)，更優(yōu)選影響選自下面組中至少1個(gè)基因和還更優(yōu)選 至少2、3、4、5、10、15、20、25、30個(gè)或所有基因的表達(dá)，該組由下列基因組成，即AD0RA2A、 AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETSl、 ETS2、EXOC3L、FO)5、GRRP1、HO-1(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、LAMA4、Lambl_l、LGMN、PLVAP、RIN3、 R0CK2、S0X7、S0X18、STABl、STAB2、STUBU TFEC, THSD1、TNFAIP8，和 XLKDl (LYVEl)。優(yōu)選地，所述生物標(biāo)記物作為治療靶的所述用途包含，減少至少一種在患心血管 疾病(風(fēng)險(xiǎn)增大)的對(duì)象中過(guò)度表達(dá)的蛋白質(zhì)量，或增大至少一種在患心血管疾病(風(fēng)險(xiǎn) 增大)的對(duì)象中被低表達(dá)的蛋白質(zhì)的量。另一方面，本發(fā)明提供了用于治療患心血管病癥的風(fēng)險(xiǎn)增大的藥物組合物，包含 選自下面化合物中的至少一種抑制劑化合物針對(duì)本發(fā)明生物標(biāo)記物，優(yōu)選針對(duì)在細(xì)胞膜上被表達(dá)的生物標(biāo)記物的抗體或其 衍生物，且所述衍生物優(yōu)選選自由scFv片段、Fab片段、嵌合抗體、雙功能抗體、胞內(nèi)抗體 (intrabody)、和其他抗體來(lái)源的分子組成的組；如在此定義的生物標(biāo)記物；干擾所述生物標(biāo)記物生物活性的小分子；反義分子，特別是反義RNA或反義寡脫氧核苷酸；RNAi 分子，和
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核酶和合適的賦形劑、載體或稀釋劑。另一方面，本發(fā)明提供了治療對(duì)象的方法，該方法包括給予所述對(duì)象可有效減低 心血管疾病(風(fēng)險(xiǎn))的量的本發(fā)明的藥物組合物。
具體實(shí)施例方式術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)“內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC) ”是指源自骨髓的循環(huán)細(xì)胞群體，其似乎參與血管生成和 血管內(nèi)平衡(血管穩(wěn)態(tài)，vascular homeostasis)。這個(gè)祖(干)細(xì)胞群體首次被Asahara 等人在1997年(Science Vol. 275，964-967)描述為骨髓細(xì)胞中的CD34+CD133+細(xì)胞，但是 祖(干)細(xì)胞可從血液的外周血單核細(xì)胞(PBMC)組分中分離出來(lái)。健康個(gè)體血液中看到 的數(shù)目少，它們的數(shù)目在血管受損之后傾向于增多。到目前為止，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確定EPC在體外 形成集落(colony)的能力，這提示它在血管新生和在維持已有血管壁方面的作用。最近證 據(jù)已提示EPC與腫瘤血管生成相關(guān)。術(shù)語(yǔ)“活化的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC) ”是指具有不同于正常循環(huán)EPC的基因表達(dá)譜的 EPC0這個(gè)基因表達(dá)譜可例如借助表1中基因表達(dá)的上調(diào)識(shí)別。然而，因?yàn)楸?中的基因表 示為可在血液中檢測(cè)到的生物標(biāo)記物，所以這些基因僅包括被上調(diào)并因而引起產(chǎn)物的陽(yáng)性 表達(dá)的基因。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，在活化的EPC中也可觀測(cè)到被下調(diào)的基 因，但此種基因不適合用作生物標(biāo)記物。但此種下調(diào)基因可用作表示活化的EPC表達(dá)譜的 部分基因?？梢酝ㄟ^(guò)以下的方法很好地評(píng)定EPC是否是活化的EPC，通過(guò)評(píng)定EPC表達(dá)譜 和將該譜與如在本文公開(kāi)的包含表1中基因的表達(dá)增多的特異譜進(jìn)行比較，或通過(guò)確定表 1中一個(gè)或更多基因的表達(dá)水平并確定該水平較對(duì)照組EPC(即，正常健康對(duì)象的血液中的 循環(huán)EPC)是否提高?！把苌?vasculogenesis) ”(在本文中也稱為新血管分布 (neovascularisation)或新血管新生(neoangiogenesis))是指在沒(méi)有預(yù)先存在的血管時(shí) 的血管形成，而血管新生(angiogenesis)與之相反，血管新生術(shù)語(yǔ)指來(lái)自現(xiàn)存血管的血管 形成。血管生成最初被認(rèn)為僅在胚胎發(fā)育期間發(fā)生，但現(xiàn)在已得知該過(guò)程也可發(fā)生在成年 有機(jī)體中。血管生成涉及內(nèi)皮前體細(xì)胞(成血管細(xì)胞)的遷移和分化，以對(duì)局部提示(例 如，生長(zhǎng)因子和胞外基質(zhì))和新血管(血管樹(shù))的形成作出反應(yīng)。這些血管樹(shù)然后被修剪 并通過(guò)血管新生延伸。已知循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(干細(xì)胞衍生物)可不同程度地促進(jìn)新血管分 布。術(shù)語(yǔ)“在血管生成期間”，如在本文中使用的，是指基因表達(dá)朝向血管生成，而不是 朝向血管新生的時(shí)期。新血管形成通過(guò)血管生成和血管新生進(jìn)行。在胚胎發(fā)生期間，血管 生成時(shí)期的特點(diǎn)是Flkl-陽(yáng)性胚胎干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)達(dá)到峰值。小鼠Flkl基因編碼主要信號(hào) 受體、針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)，且對(duì)早期 胚胎中血管和造血系統(tǒng)的發(fā)育是必要的。在小鼠中，小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞分化成Flkl+細(xì) 胞，該Flkl+細(xì)胞可產(chǎn)生兩種類型的細(xì)胞，即周細(xì)胞(可通過(guò)(但并不排它地)α -平滑肌 肌動(dòng)蛋白的表達(dá)鑒定的血管平滑肌細(xì)胞；SMA+)和內(nèi)皮細(xì)胞(可通過(guò)(但并不排它地)血小 板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)鑒定；PECAMI+)。這些周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞隨后組裝成原始血管。因而，源自胚胎干細(xì)胞的Flkl-陽(yáng)性細(xì)胞可用作血管祖細(xì)胞(vascular progenitors) 0血管生成與血管新生可按如下方式區(qū)分。血管生成是血管從干細(xì)胞(祖細(xì)胞)從 頭合成并涉及這些多向性(pleitrophic)細(xì)胞的募集和分化，而血管新生是從現(xiàn)存血管形 成新血管(內(nèi)皮細(xì)胞的去分化，遷移/增生并再次分化成新管且重塑成重要的血液動(dòng)力學(xué) 血管(“修剪”)。術(shù)語(yǔ)“缺血性心血管事件”或簡(jiǎn)稱“缺血事件”，如在本文中使用的，是指向器官或 組織的血液供給中斷。缺血事件通常是血栓(blood cloth)引起的，且在動(dòng)脈粥樣硬化狹 窄(atherosclerotic stenosis)患者中，當(dāng)栓子離開(kāi)動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)時(shí)該缺血事件最 經(jīng)常發(fā)生。因這個(gè)阻塞造成的動(dòng)脈或其他血管狹窄，或窄化或堵塞，可導(dǎo)致許多有害狀態(tài)， 其中許多對(duì)對(duì)象有嚴(yán)重后果。在本文中提及的缺血性心血管事件包括，但不局限于中風(fēng)/ 短暫性缺血發(fā)作或腦血管病發(fā)作、心肌梗塞、心肌缺血(心絞痛)、任何心肌癥并發(fā)心肌缺 血癥(例如，有癥狀的主動(dòng)脈狹窄，H0CM)、腦出血、外周(不穩(wěn)定型)心絞痛、間歇性跛行 (claudicatio intermittens)(外周動(dòng)脈粥樣硬化疾病)和血管中發(fā)生的其他主要異?，F(xiàn) 象。術(shù)語(yǔ)“血管中發(fā)生的異?，F(xiàn)象”包括提及的冠脈(coronary)和腦血管事件，以及外周 血管疾病。術(shù)語(yǔ)“缺血性心血管事件”通常是被術(shù)語(yǔ)“心血管疾病”廣泛包括的醫(yī)療病癥的 急性階段。術(shù)語(yǔ)“缺血”，如這里使用的，是指向器官、身體部分或組織的血液供給的絕對(duì)或相 對(duì)短缺，或流向器官、身體部分或組織的血的不足。相對(duì)短缺是指血供給(氧輸送)和血需 要(經(jīng)組織消耗的氧)之間的差異(discr印ancy)。血供給的限制，一般因血管中的因素 引起，最經(jīng)常，但不排他地，由血栓栓塞(血凝)或動(dòng)脈粥樣硬化(阻塞動(dòng)脈管腔的載脂斑 塊(lipid-laden plaque))致使的血管收縮(constriction)或堵塞引起。缺血導(dǎo)致組織 損傷或功能異常。心肌缺血導(dǎo)致心絞痛，且在本文中指缺血性心臟病。術(shù)語(yǔ)“心血管疾病(CVD) ”一般是指影響心臟和循環(huán)系統(tǒng)的一些疾病，包括動(dòng)脈瘤、 心絞痛、心律不齊、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌癥、腦血管破裂(中風(fēng))、腦血管疾病、先天性心臟 病、充血性心力衰竭、冠心病(CHID)，也稱為冠狀動(dòng)脈病(CAD)、缺血性心臟病或動(dòng)脈粥樣 硬化性心臟病，擴(kuò)張性心肌病、舒張功能不全、心內(nèi)膜炎、心力衰竭、高血壓病(高血壓)、肥 厚型心肌病、二尖瓣脫垂、心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、心肌炎、外周性血管疾病、風(fēng)濕性心臟 病、瓣膜疾病和靜脈血栓栓塞。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“心血管疾病”也包括提及的缺血，因物 理?yè)p傷(動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)(endartiectomie)，氣囊血管成形術(shù)(balloon angioplasty))造 成的或由于慢性損傷(包括動(dòng)脈粥樣硬化)引起的動(dòng)脈損傷(對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞譜系的損傷)，心 肌損傷(心肌壞死)，和肌壞死。總的來(lái)說(shuō)，可引出新血管新生反應(yīng)的任何生理學(xué)或病理生 理學(xué)病癥均包括在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“心血管疾病”中。術(shù)語(yǔ)“循環(huán)流體”是指淋巴流體和血液，優(yōu)選血液。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可交換地用于指氨基酸殘基的聚合物。該 術(shù)語(yǔ)可用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的類似 物或模擬物(mimetic)，該術(shù)語(yǔ)也可用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽可被修飾，例如，通 過(guò)加入碳水化合物殘基修飾，從而形成糖蛋白。該術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”包括糖蛋 白和包含任何其他修飾的蛋白質(zhì)，以及非糖蛋白和另外的未經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)?！暗鞍踪|(zhì)譜”，如在本文中使用的，是指樣本中存在的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段，或肽的集合(collection)。蛋白質(zhì)譜可包含集合中蛋白質(zhì)的確認(rèn)(identity)(例如，已知蛋白 質(zhì)的種名或氨基酸序列特性，或分子量或關(guān)于還沒(méi)有進(jìn)一步表征的蛋白質(zhì)的其他描述性信 息)，而沒(méi)有提及存在的數(shù)量。在其他實(shí)施例中，蛋白質(zhì)譜包括樣本中示出的蛋白質(zhì)的數(shù)量 信息。類似地，如在本文中使用的“基因表達(dá)譜”，是指樣本中存在的基因表達(dá)產(chǎn)物的集合 (包括如蛋白質(zhì)和RNA分子的這種產(chǎn)物)。如在本文中處使用的，有關(guān)基因表達(dá)譜中基因表達(dá)產(chǎn)物的“定量”，是指確定樣本 中存在的特定蛋白、肽或RNA量。定量可以是絕對(duì)量(例如，yg/mL)或相對(duì)量(例如，信 號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度)。通常，此種操作可通過(guò)專用的生物化學(xué)試驗(yàn)，例如色譜、質(zhì)譜或雜交試驗(yàn)進(jìn) 行。如在本文中使用的，有關(guān)循環(huán)流體中細(xì)胞的“定量”是指確定細(xì)胞的絕對(duì)或相對(duì)數(shù)目。 通常，此種操作可通過(guò)專用的細(xì)胞計(jì)數(shù)器執(zhí)行，例如流式細(xì)胞儀?！皹?biāo)記物”和“生物標(biāo)記物”可交換地用于指基因表達(dá)產(chǎn)物，將從兩個(gè)不同對(duì)象，例 如，測(cè)試對(duì)象或患缺血事件(患此病風(fēng)險(xiǎn))的患者中采取的樣本與從參照組對(duì)象(例如，沒(méi) 有患缺血事件(或患此病風(fēng)險(xiǎn))的對(duì)象、正常或健康的對(duì)象)采取的可比較的樣本相比較， 該表達(dá)產(chǎn)物差別地存在于二者樣本中?？商鎿Q地，該術(shù)語(yǔ)指相對(duì)另外的細(xì)胞群體，差別存在 于細(xì)胞群體中的基因表達(dá)產(chǎn)物。短語(yǔ)“差別地存在”是指將從測(cè)試對(duì)象采取的樣本與從對(duì)照組對(duì)象采取的樣本相 比較，存在于二者樣本中的標(biāo)記物數(shù)量或頻率(發(fā)生的發(fā)病率)是有差別的。例如，標(biāo)記物 可以是，與參照組對(duì)象樣本相比，有風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象(risk subject)血液樣本中存在的水平升 高或降低的基因表達(dá)產(chǎn)物?；蛘?，標(biāo)記物可以是，與對(duì)照組對(duì)象樣本相比，可在有風(fēng)險(xiǎn)的對(duì) 象血液樣本中檢測(cè)到的頻率更高或更低的基因表達(dá)產(chǎn)物。如果一個(gè)樣本中的基因表達(dá)產(chǎn)物數(shù)量與另一個(gè)樣本中的基因表達(dá)產(chǎn)物數(shù)量在統(tǒng) 計(jì)學(xué)上顯著不同，則該基因表達(dá)產(chǎn)物“差別地存在”于這兩個(gè)樣本中。例如，如果它存在于 一個(gè)樣本中的量是存在于另一個(gè)樣本中的量的至少約120%、至少約130%、至少約150%、 至少約180%、至少約200%、至少約300%、至少約500%、至少約700%、至少約900%，至 少約1000%之多，或如果它在一個(gè)樣本中可檢測(cè)到而在另一個(gè)樣本中不可檢測(cè)到，則該基 因表達(dá)產(chǎn)物差別地存在于這兩個(gè)樣本中。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”和“多種抗體”是指單克隆抗體、多特異性抗體、合 成的抗體、人抗體、人化抗體、嵌合抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、 二硫鍵接(disulfide-linked)的Fvs (sdFv)和抗獨(dú)特型(anti-Id)抗體(包括，例如，本 發(fā)明抗體的anti-Id抗體)，和上面任何一個(gè)抗體的抗原表位結(jié)合片段。特別地，本發(fā)明抗 體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子， 該抗原結(jié)合位點(diǎn)特異地免疫結(jié)合到多肽抗原，該多肽抗原被包括在基因組區(qū)中的基因編碼 或受表1中列出的基因組區(qū)中的遺傳轉(zhuǎn)化影響。本發(fā)明免疫球蛋白分子可以是任何類型的 (例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、任何類別的(例如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4, IgA1 和 IgA2)或可以是免疫球蛋白分子的亞類(subclass)?！懊庖叻治觥笔侵甘褂每贵w特異性結(jié)合抗原(例如，標(biāo)記物)的試驗(yàn)。免疫分析的 特點(diǎn)是利用特定抗體的特異性結(jié)合特性來(lái)分離、靶向，和/或量化抗原。多種免疫分析法 可用于挑選與特定蛋白特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫分析通常用于挑選 與蛋白特異性免疫反應(yīng)的抗體(參見(jiàn)，例如，Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual (1988)，用于描述可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫分析法和條件)。典型地，特 異性或選擇性反應(yīng)強(qiáng)度是本底(background)信號(hào)或噪音的至少兩倍和更典型地大于本底 的10 100倍。當(dāng)提及抗體時(shí)的短語(yǔ)“特異性(或選擇性)結(jié)合”，或當(dāng)提及蛋白質(zhì)或肽時(shí)的短語(yǔ)
“與......特異性(選擇性)免疫反應(yīng)”，是指對(duì)蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)和其他生物物質(zhì)的異質(zhì)性
群體中的存在起決定性作用的結(jié)合反應(yīng)。因而，在指定的免疫分析條件下，給定的抗體結(jié)合 到特定蛋白的強(qiáng)度至少是本底的兩倍，且沒(méi)有大量的抗體顯著結(jié)合到樣本中存在的其他蛋 白質(zhì)上。在此種條件下，與抗體的特異性結(jié)合，需要挑選對(duì)特定蛋白有特異性的抗體。蛋白質(zhì)或基因的術(shù)語(yǔ)“影響表達(dá)”和“調(diào)整表達(dá)”，如這里使用的，應(yīng)當(dāng)理解為， 調(diào)節(jié)、控制、阻斷(block)、抑制、刺激、增強(qiáng)、活化、模仿(mimick)、繞開(kāi)(bypass)、糾正 (correct)、移出，和/或取代所述表達(dá)，在更一般的術(shù)語(yǔ)中，應(yīng)當(dāng)理解為干預(yù)所述表達(dá)，例 如通過(guò)影響編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”或“患者”在本文中可交換地使用，并包括但不局限于，有機(jī)體、哺乳動(dòng) 物和非哺乳動(dòng)物，其中哺乳動(dòng)物包括，例如，人、非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、豬、牛、山羊、貓、 兔、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、馬、猴、綿羊或其他非人的哺乳動(dòng)物；非哺乳動(dòng)物包括，例如，非哺乳動(dòng) 物的脊椎動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物的無(wú)脊椎動(dòng)物，非哺乳動(dòng)物的脊椎動(dòng)物為，例如禽(例如，雞或 鴨)、兩棲動(dòng)物和魚(yú)。優(yōu)選實(shí)施例的描述生物標(biāo)記物1999年，Asahara最先描述了患者外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)構(gòu)成募集的內(nèi)皮 前體細(xì)胞池，內(nèi)皮前體細(xì)胞對(duì)缺血和動(dòng)脈損傷作出反應(yīng)。其后，這些細(xì)胞被顯示涉及生理狀 態(tài)和病理生理狀態(tài)下的新血管新生(新血管形成)。而且，EPC涉及內(nèi)皮細(xì)胞譜系損傷之后 出現(xiàn)的進(jìn)行性動(dòng)脈修復(fù)和/或再生，該內(nèi)皮細(xì)胞譜系不僅可由物理?yè)p傷(動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)， 氣球血管成形術(shù))導(dǎo)致，而且可由慢性損傷(包括動(dòng)脈粥樣硬化)和缺血/肌壞死(引出 新血管新生反應(yīng))導(dǎo)致。除了這些知識(shí)，迄今還沒(méi)有提供用于診斷或預(yù)測(cè)心血管疾病的生物標(biāo)記物。用于 心肌損傷的標(biāo)記物(心肌壞死標(biāo)記物)通常用在心臟學(xué)實(shí)踐中，但主要包含細(xì)胞內(nèi)心肌酶 的鑒定，細(xì)胞內(nèi)心肌酶是在心肌組織損傷之后在循環(huán)中釋放的，心肌組織包括肌鈣蛋白和 肌酐激酶MB亞組分(creatinin kinase MB subfraction)。然而，至今還沒(méi)有可以量化進(jìn) 行性缺血事件或缺血前(previous ischemic)事件的標(biāo)記物。穩(wěn)定型心絞痛構(gòu)成心血管實(shí) 踐的大部分且在西方社會(huì)包含相當(dāng)多的患者人數(shù)(就發(fā)病率和死亡率而言)?？商鎿Q的診 斷方法包括運(yùn)動(dòng)測(cè)試和灌注成像，這些方法并不是成本高效的且缺乏合適的靈敏度和特異 性。這種嚴(yán)重的健康威脅促進(jìn)合適的生物標(biāo)記物來(lái)鑒定處于危險(xiǎn)中的患者和評(píng)價(jià)對(duì)抗缺血 治療的合適反應(yīng)。為了搜尋此種標(biāo)記物，本發(fā)明人已進(jìn)行小鼠和斑馬魚(yú)的胚胎血管形成的全基因組 分析(使用RNA微陣列分析)，并鑒定了以某些方式參與動(dòng)脈形成的2000個(gè)以上的基因。 這大量基因最初是在使用Flkl+胚胎干細(xì)胞與Flkl-(陰性)群體(不相關(guān)細(xì)胞)之間的 差別表達(dá)，確定8-11天大的小鼠胚胎中Flkl+胚胎干細(xì)胞的RNA表達(dá)譜之后發(fā)現(xiàn)的。通過(guò) 使用整體原位雜交(WISH)，1150個(gè)基因被選作提供潛在的生物標(biāo)記物。發(fā)明人進(jìn)一步挑選和證實(shí)這些候選基因在小鼠和斑馬魚(yú)的血管樹(shù)形成中的表達(dá)，以及在缺血期間它們?cè)谇啻?期小鼠模型中的上調(diào)?；谥毕低次锼阉鳎l(fā)明人在2000+個(gè)細(xì)胞中，鑒定出涉及人、鼠科動(dòng)物和斑 馬魚(yú)血管生成的26個(gè)克隆。Flkl+細(xì)胞包括(designate)早期造血干細(xì)胞、專門的成 血管細(xì)胞(dedicated angioblasts)，和完全分化的內(nèi)皮細(xì)胞，因此包括從血管母細(xì)胞 (hemangioblasts)到內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的全分化過(guò)程。已知Flkl和Tail是早期發(fā)育期間專 門的成血管細(xì)胞上最早期標(biāo)記物中的兩個(gè)，而Flkl的表達(dá)在胚外(extra-embryonic)造 血干細(xì)胞中被迅速下調(diào)，因?yàn)樗鼈兿蛟煅V系(hematopoietic lineage)轉(zhuǎn)化。在斑馬魚(yú) 中運(yùn)用原位雜交研究，發(fā)明人初始可以顯示，通過(guò)差別顯示分析(differential display analysis)比較Flkl+與Flkl-細(xì)胞所鑒定的基因的23%在血管生成位點(diǎn)被專門地表達(dá)， 其中另外的30%在血管生成和神經(jīng)元及視網(wǎng)膜上皮樣組織(retinal epitheloid tissue) 的位點(diǎn)被表達(dá)。這強(qiáng)調(diào)了本發(fā)明人的原始實(shí)驗(yàn)原理的正確性，從而通過(guò)這個(gè)特定基因篩 選鑒定血管生成的基因調(diào)節(jié)物(genetic regulator)。本發(fā)明人鑒定了在血管樹(shù)中在小 鼠發(fā)育期間被差別表達(dá)的2000+鼠科動(dòng)物基因，并在斑馬魚(yú)發(fā)育期間進(jìn)行血管生成的高 通量整體原位雜交，以及使用從缺血的鼠科動(dòng)物模型和人疾病中采集的各種組織，進(jìn)行 挑選的基因的定量PCR分析，從而證實(shí)斑馬魚(yú)發(fā)育期間發(fā)育血管床中的適當(dāng)?shù)臅r(shí)空表達(dá) (spatiotemperal expression)。使用這種涉及小鼠、斑馬魚(yú)和人血管生成的不同表現(xiàn)形式 的基因的篩選，發(fā)明人可以鑒定在各種物種和不同模型中保留的通用的調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物，并 可以鑒定胚胎和成年小鼠中血管生成的通用基因調(diào)節(jié)子(regulator)。血管生成在成年新血管形成中的作用已充分確立，其是許多科學(xué)論文的主題。然 而，該過(guò)程的基因調(diào)節(jié)至今仍不清楚。發(fā)明人已研究并比較作為模型的小鼠和斑馬魚(yú)發(fā)育 期間的血管形成，從而在沒(méi)有血生成和血管新生的情況下在體內(nèi)分析血管形成過(guò)程。隨后 本發(fā)明人使鑒定出的克隆表達(dá)與肢體缺血的(成年)小鼠模型和人疾病中的表達(dá)交叉關(guān) 聯(lián)。通過(guò)這樣做，本發(fā)明人可以鑒定在胚胎和成年血管生成期間被表達(dá)的克隆。在后肢缺 血的(成年)小鼠模型中并通過(guò)利用發(fā)育斑馬魚(yú)中的(嗎啉環(huán))敲低(knock down)分析， 對(duì)這些克隆進(jìn)行了進(jìn)一步的體內(nèi)研究。使用這些技術(shù)，本發(fā)明人可以鑒定26個(gè)涉及成年和 胚胎血管生成的候選調(diào)節(jié)基因。盡管成年和胚胎血管生成是否由共同路徑(common pathways)調(diào)節(jié)仍然不清楚， 但發(fā)明人可以鑒定出共有的表達(dá)模式，也許可以鑒定共有的基因調(diào)節(jié)物。最后，單個(gè)克隆的誘導(dǎo)表達(dá)可通過(guò)在血液樣本的循環(huán)PML亞群(subset)中進(jìn)行的 QPCR分析來(lái)證實(shí)，該血樣樣本從穩(wěn)定型缺血性冠狀動(dòng)脈疾病患者和急性冠脈綜合征患者中獲得?；谕ㄟ^(guò)這些研究得到的結(jié)果，發(fā)明人獲得對(duì)缺血疾病和動(dòng)脈修復(fù)中的血管生成 和成血管分化的分子機(jī)制的必要理解，并鑒定了基因庫(kù)或基因表達(dá)譜，該基因庫(kù)或基因表 達(dá)譜的特點(diǎn)是涉及EPC募集、活化和遷移的基因，其中該遷移是指遷移到因缺血和動(dòng)脈受 損造成的新血管形成區(qū)域中，且該基因庫(kù)或表達(dá)譜可用作活化的EPC存在的指示物，作為 特異性EPC表型，并因而可用作，在一般情況下的缺血和動(dòng)脈受損之后，特別是與動(dòng)脈損 傷、心肌損傷或缺血相關(guān)的那些心血管疾病之后出現(xiàn)的進(jìn)行性血管生成和動(dòng)脈修復(fù)的指示 物。
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共發(fā)現(xiàn)26個(gè)基因構(gòu)成活化的EPC表型，且證明了它們作為用于這些障礙的生物 標(biāo)記物的價(jià)值。技術(shù)人員應(yīng)很快理解，這些基因不僅適合作為上面提及的病狀的生物標(biāo)記 物，而且適合作為用于血管生成，優(yōu)選成年對(duì)象血管生成的生理過(guò)程的生物標(biāo)記物，且這些 基因可用作治療靶，以治療這些病狀，或用以刺激血管生成的生理過(guò)程。這些基因列在表1 中。表1.列出了在缺血性心臟病期間被上調(diào)的33個(gè)基因。應(yīng)當(dāng)理解其它物種的同源 物(homolog)包括在此。
權(quán)利要求
一種診斷或預(yù)測(cè)對(duì)象的心血管疾病的方法，所述方法包括在所述對(duì)象循環(huán)流體的樣本中檢測(cè)活化的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的出現(xiàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述心血管疾病與動(dòng)脈損傷或心肌損傷相關(guān)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述心血管疾病與缺血相關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測(cè)活化的EPC步驟包括在所 述樣本中檢測(cè)EPC中基因表達(dá)水平的提高，所述基因?yàn)檫x自以下組中的至少1個(gè)基因和 甚至更優(yōu)選至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35個(gè)或所有基因，所述組由下列基因組成，即 ADORAU AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、AGTRLl (APLNR)、AMPH、APLN, CCBEU CDC42、CGNLU CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、DLL4、DUSP5、EEAl、egr_l、ELK1、ELK3、ELK4 (SAPl)、 EP300、ERG1 (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD1、FGD2、FGD3、FGD4、FGD5、FLT1、FST、GATA6、 GRRPl、HO-I (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、IFNG、ILIA、IL1B、LAMA4、Lambl-U LGMN、MMP3、Nos2、 PAIU PHDU PLVAP, RAB5a、RIN3、R0CK2、S0X18、S0X7、SRF, STABU STAB2、STUBU TFEC, THBSl、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSDl、TNFAIP8、和 XLKDl (LYVEl)，所述基因又優(yōu)選為 選自以下組中至少1個(gè)基因和還更優(yōu)選至少2、3、4、5、10、15、20、25、30個(gè)或所有基因，所述 組由下列基因組成，即 AD0RA2A、AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、 DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD5、GRRP1、HO-1 (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、 LAMA4、Lamb1-1、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、SOX18、STAB1、STAB2、STUB1、TFEC、THSD1、 TNFAIP8、和 XLKDl (LYVEl)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中EPC中基因表達(dá)水平的所述提高可通過(guò)檢測(cè)蛋白 質(zhì)來(lái)檢測(cè)。
6.一種用于診斷或預(yù)測(cè)患者的心血管疾病的生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物包含內(nèi)皮祖 細(xì)胞(EPC)的基因表達(dá)產(chǎn)物，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞的基因表達(dá)在血管生成期間被調(diào)節(jié)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物標(biāo)記物，其中所述生物標(biāo)記物包含內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的 基因表達(dá)產(chǎn)物，與血管新生相比，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞的基因表達(dá)在血管生成期間被上調(diào)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的生物標(biāo)記物，其中所述生物標(biāo)記物存在于內(nèi)皮祖細(xì)胞 (EPC)、多形核白細(xì)胞(PMN)或全血中。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物標(biāo)記物，其中所述EPC或PMN存在于患者的外周血中。
10.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的生物標(biāo)記物，其中所述EPC是Flkl-陽(yáng)性細(xì)胞。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物標(biāo)記物，其中所述生物標(biāo)記物為選自以下 組中的至少1個(gè)基因和甚至更優(yōu)選至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35個(gè)或所有基因的表 達(dá)產(chǎn)物，所述組由下列基因組成，即 AD0RA1、AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、AGTRLl (APLNR)、 AMPH、APLN、CCBE1、CDC42、CGNL1、CREBBP、CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、DLL4、DUSP5、EEA1、 egr-1、ELKU ELK3、ELK4 (SAPl)、EP300、ERGl (KCNH2)、ETSU ETS2、EX0C3L、FGDU FGD2、 FGD3、FO)4、FGD5、FLT1、FST、GATA6、GRRP1、HO-1 (HMOXl)、H0_2 (HM0X2)、IFNG、ILIA、IL1B、 LAMA4、Lambl-I、LGMN、MMP3、Nos2、PAI1、PHDl、PLVAP, RAB5a、RIN3、R0CK2、S0X18、S0X7、 SRF, STABl、STAB2、STUBl、TFEC, THBSl、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、THSDl、TNFAIP8，禾P XLKDl (LYVEl)，還優(yōu)選為選自下組中的至少1個(gè)基因和又更優(yōu)選至少2、3、4、5、10、15、20、 25,30個(gè)或所有基因的表達(dá)產(chǎn)物，所述組由下列基因組成，即AD0RA2A、AGTRLl (APLNR)、 APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETS1、ETS2、EX0C3L、FGD5、GRRPl、HO-1 (HMOXl)、H0-2 (HM0X2)、LAMA4、Lambl-I、LGMN、PLVAP、RIN3、R0CK2、S0X7、 S0X18、STABl、STAB2、STUBUTFEC,THSD1、TNFAIP8，禾口 XLKDl (LYVEl)。
12.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物標(biāo)記物，其中所述表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)或 RNA分子。
13.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物標(biāo)記物，其中所述生物標(biāo)記物是蛋白質(zhì)譜 或RNA譜。
14.根據(jù)權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)限定的生物標(biāo)記物在診斷或預(yù)測(cè)對(duì)象缺血方面的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)所述的生物標(biāo)記物作為替代終點(diǎn)標(biāo)記物在確定治療 方法功效方面的用途。
16.一種診斷或預(yù)測(cè)對(duì)象中缺血的方法，包含在所述對(duì)象血液中檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求 6-13中任一項(xiàng)所述的生物標(biāo)記物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述方法是在所述對(duì)象的血液樣本上進(jìn)行的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述檢測(cè)通過(guò)使用微陣列進(jìn)行。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述檢測(cè)通過(guò)使用串聯(lián)質(zhì)譜法(MS-MS)、 通過(guò)MALDI-FT質(zhì)譜儀、MALDI-FT-ICR質(zhì)譜儀、MALDI三重四極桿質(zhì)譜儀或免疫分析進(jìn)行。
20.用于執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求1-5或16-19中任一項(xiàng)所述的方法的試劑盒，包含至少一種 如權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)限定的生物標(biāo)記物或特異性結(jié)合于所述生物標(biāo)記物的特異性結(jié) 合伴侶，所述試劑盒可選地進(jìn)一步包含下面的一個(gè)或多個(gè)至少一種參考樣品或?qū)φ諛悠?；關(guān)于所述生物標(biāo)記物的參考值的信息；至少一種能夠結(jié)合于所述特異性結(jié)合伴侶的測(cè)試化合物；至少一種用于檢測(cè)所述生物標(biāo)記物和所述特異性結(jié)合伴侶之間的結(jié)合的可檢測(cè)的標(biāo) 記物。
21.用于執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)所述的方法的微陣列，包含特異性結(jié)合伴 侶，所述特異性結(jié)合伴侶特異性結(jié)合到至少兩個(gè)如權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)限定的生物標(biāo) 記物上，其中所述生物標(biāo)記物結(jié)合在固體載體上。
22.—種特異性結(jié)合到如權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)限定的生物標(biāo)記物上的診斷試劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的診斷試劑，其中所述診斷試劑是與所述生物標(biāo)記物在嚴(yán)格 條件下特異性雜交的抗體或核酸分子。
24.一種包含根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的診斷試劑的診斷組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的診斷組合物在診斷對(duì)象缺血方面的用途。
26.一種治療患缺血(風(fēng)險(xiǎn)增大)的對(duì)象的方法，所述方法包括使用如權(quán)利要求6-13 中任一項(xiàng)限定的生物標(biāo)記物作為治療靶或治療劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述生物標(biāo)記物作為治療靶或作為治療劑的 所述用途包含影響選自以下組中至少1個(gè)基因和更優(yōu)選至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、 35個(gè)或所有基因的表達(dá)，所述組由下列基因組成，即AD0RA1、AD0RA2A、AD0RA2B、AD0RA3、 AGTRLl (APLNR)、AMPH、APLN、CCBEl、CDC42、CGNLl、CREBBP, CRIPl、CRIP2、CRIP3、CYB5B、 DLL4、DUSP5、EEAU egr_l、ELKU ELK3、ELK4 (SAPl)、EP300、ERGl (KCNH2)、ETSU ETS2、EXOC3L、FGDl、FO)2、FGD3、Fa)4、FGD5、FLTl、FST、GATA6、GRRPl、HO-l(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、 IFNG、ILIA、IL1B、LAMA4、Lambl-I、LGMN, MMP3、Nos2、PAI1、PHDl、PLVAP, RAB5a、RIN3、 R0CK2、S0X18、S0X7、SRF、STABU STAB2、STUBl、TFEC、THBS1、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5、 THSDU TNFAIP8，和XLKDl (LYVEl)，又優(yōu)選影響選自下組中至少1個(gè)基因和還更優(yōu)選至 少2、3、4、5、10、15、20、25、30個(gè)或所有基因的表達(dá)，所述組由下列基因組成，即AD0RA2A、 AGTRLl (APLNR)、APLN、CCBEl、CGNLl、CRIP2、CYB5B、DLL4、DUSP5、ELK3、ERGl (KCNH2)、ETSl、 ETS2、EXOC3L、FO)5、GRRP1、HO-1(HMOXl)、H0_2(HM0X2)、LAMA4、Lambl_l、LGMN、PLVAP、RIN3、 R0CK2、S0X7、S0X18、STABl、STAB2、STUBU TFEC, THSD1、TNFAIP8，和 XLKDl (LYVEl)。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的方法，其中所述生物標(biāo)記物作為治療靶的所述用途包 括減少在患缺血(風(fēng)險(xiǎn)增大)的對(duì)象中被過(guò)度表達(dá)的所述至少一種基因編碼的至少一種蛋 白質(zhì)的量，或增大在患缺血(風(fēng)險(xiǎn)增大)的對(duì)象中被低表達(dá)的所述至少一種基因編碼的至 少一種蛋白質(zhì)的量。
29.一種用于治療患心血管事件風(fēng)險(xiǎn)增大的藥物組合物，包括選自下面的至少一種抑 制劑化合物針對(duì)權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)所述的生物標(biāo)記物，優(yōu)選針對(duì)在細(xì)胞膜上表達(dá)的生物標(biāo) 記物的抗體或其衍生物，并且所述衍生物優(yōu)先選自由scFv片段、Fab片段、嵌合抗體、雙功 能抗體、胞內(nèi)抗體、和其他抗體來(lái)源的分子組成的組； 權(quán)利要求6-13中任一項(xiàng)所述的生物標(biāo)記物； 干擾所述生物標(biāo)記物生物活性的小分子； 反義分子，特別是反義RNA或反義寡脫氧核苷酸； RNAi分子， 核酶，和干擾指定的標(biāo)記物/調(diào)節(jié)基因的功能的化學(xué)化合物，以及合適的賦形劑、載體或稀釋劑。
30.一種治療對(duì)象的方法，包含給予所述對(duì)象有效降低缺血(風(fēng)險(xiǎn))的量的權(quán)利要求 29所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及診斷或預(yù)測(cè)對(duì)象的心血管疾病的方法，所述方法包括在所述對(duì)象的循環(huán)流體樣本中檢測(cè)活化的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)出現(xiàn)的步驟。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于診斷或預(yù)測(cè)患者體內(nèi)的心血管疾病的生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物包含在血管生成期間其表達(dá)被調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101946009SQ200880126603
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月12日
發(fā)明者亨利克斯·約翰內(nèi)斯·迪凱爾 申請(qǐng)人:鹿特丹伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)療中心