專利名稱：樹突狀細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種樹突狀細(xì)胞的制備方法，并提供制備的樹突狀細(xì)胞及其利用方法。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞(dendritic cell ;DC)是存在于外周血、皮膚、淋巴器官及胸腺中的 抗原遞呈細(xì)胞(APC)之一，富集于淋巴組織及非淋巴組織中(參照Steinman， R. M. 1991， Ann. Rev. Immunol. 9 :271 ;Banchereau， J. B.及R. M. Stei麗n， 1998， Nature 392 :245)。樹 突狀細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗原遞呈能力，可將抗原肽表達(dá)到樹突狀細(xì)胞的I類和II類上，并分 別激活CD4、CD8T細(xì)胞，由此誘導(dǎo)活體內(nèi)對特定抗原(病原微生物抗原、腫瘤抗原、移植抗原 等)的免疫應(yīng)答。 DC的強(qiáng)大免疫誘導(dǎo)功能非常適用于多種腫瘤的免疫療法(DC治療)。本發(fā)明
者們的以往報(bào)告表明，在小鼠試驗(yàn)中，用仙臺(tái)病毒(SeV)剌激的DC具有較強(qiáng)的抗腫瘤效
果(S. Shibata et al. ， J.Immunol,2006177:3564-3576 ;Yoneyama， Y. et al. ， Biochem.
Biophys. Res. Commun. ，2007,355 :129-135)。而抗腫瘤療效頗受DC接種量的影響。臨床試
驗(yàn)也認(rèn)為接種的DC量很大程度影響到治療效果，但出于患者狀態(tài)的原因，可提取的DC前體
細(xì)胞(DCprogenitors)數(shù)量大多極為有限，不能獲取足夠數(shù)量的DC，因而無法達(dá)到理想的
治療效果。所以，如何高效率地?cái)U(kuò)增有限的DC前體細(xì)胞，是解決問題的關(guān)鍵。 非專利文獻(xiàn)1 Stei麗n， R. M. ， 1991， Ann. Rev. Immunol. 9 :271-296 非專利文獻(xiàn)2 Banchereau， J. B.禾口 R. M. Steinman， 1998， Nature 392 :245—252 非專利文獻(xiàn)3 Shibata， S. et al. ， J. Immunol, 2006177 :3564-3576 非專利文獻(xiàn)4 Yoneyama， Y. et al. ， Biochem. Biophys. Res. Commun. ，2007,355 :
129-135 發(fā)明的內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題 鑒于以上情況，本發(fā)明所要解決的問題是提供一種可有效制備大量樹突狀細(xì)胞的 方法。 解決問題的方法 為開發(fā)能夠有效擴(kuò)增DC前體細(xì)胞并使其分化成DC的方法，本發(fā)明者們通過添加 各種細(xì)胞因子，將DC前體細(xì)胞按不同時(shí)間培養(yǎng)，分化成DC后，以DC表面標(biāo)記為指標(biāo)，分 析了擴(kuò)增的細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含有干細(xì)胞因子(Stem cell factor ;SCF)和白細(xì)胞介素 (IL) -3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的DC前體細(xì)胞明顯增殖。而在上述SCF和IL-3以外再加入Flt_3 配體和IL-6(即含有Flt-3配體、SCF、IL-3、IL-6(簡稱FS36))的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的DC前體 細(xì)胞的擴(kuò)增更加明顯。與抽取后直接分化相比，通過GM-CSF和IL-4、以及GM-CSF和SCF分 化擴(kuò)增細(xì)胞所得的DC量高達(dá)幾百倍。尤其在FS36中培養(yǎng)約3周后分化的細(xì)胞集團(tuán)，其DC比 例明顯提高，由此表明FS36培養(yǎng)3周左右是極為優(yōu)良的DC擴(kuò)增方法。與以往分化方法所得DC同樣，擴(kuò)增后所得細(xì)胞可通過RNA病毒的感染和LPS等，提高co-stimuratory molecules 的CD80和CD86的表達(dá)水平。另外，在含有GM-CSF和SCF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人CD34+細(xì)胞也 可以顯著擴(kuò)增DC。與上述方法相同，所得DC可通過LPS提高CD86的表達(dá)水平。所以，本發(fā) 明提供一種可大量擴(kuò)增DC前體細(xì)胞的方法，以及將所得DC前體細(xì)胞高效率分化為DC的方 法。通過這些方法制備的DC可用于癌癥及感染性疾病的免疫療法。 S卩，本發(fā)明涉及一種樹突狀細(xì)胞的制備方法、所制備的樹突狀細(xì)胞以及該細(xì)胞的 利用方法，具體涉及 〔1〕 一種制備樹突狀細(xì)胞的方法，其包含在多種細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞 前體細(xì)胞的步驟。 〔2〕 〔1〕所述的方法，其中所述的多種細(xì)胞因子是粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落剌激因子 (GM-CSF)以及干細(xì)胞因子(SCF)。 〔3〕 〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述的樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞是來自人的細(xì)胞。
〔4〕 〔 2〕或〔3〕所述的方法，其中，所述的步驟是在lng/ml以上的GM-CSF、和0. 5ng/ ml以上的SCF的存在下，培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞的步驟。 〔5〕 〔4〕所述的方法，其中，所述的步驟是在10ng/ml以上的GM-CSF、和5ng/ml以 上的SCF的存在下，培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞的步驟。 〔6〕〔4〕所述的方法，其中，所述的步驟是在lng/ml-100ng/ml的GM-CSF、和0. 5ng/ ml-50ng/ml的SCF的存在下的培養(yǎng)步驟。 〔7〕 〔5〕或〔6〕所述的方法，其中，所述的步驟是在10ng/ml-100ng/ml的GM-CSF、
和5ng/ml-50ng/ml的SCF的存在下，培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞的步驟。 上述各項(xiàng)中，引用同一項(xiàng)的各項(xiàng)所述的兩項(xiàng)發(fā)明或兩項(xiàng)以上任意組合后的發(fā)明，
已包括在被引用的前項(xiàng)發(fā)明內(nèi)。另外，本說明書所述的任意發(fā)明要素及其任意組合也包括
在本說明書中。從這些發(fā)明中去除本說明書所述的任意要素或其任意組合外的發(fā)明也包括
在本說明書中。本說明書不僅披露說明書優(yōu)選的特定形態(tài)，還披露包括其形態(tài)之外的發(fā)明。 發(fā)明的效果 樹突狀細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫誘導(dǎo)功能，本發(fā)明的方法所得樹突狀細(xì)胞可作為樹突 狀細(xì)胞(DC)疫苗用于癌癥及感染性疾病等的免疫治療。例如，腫瘤免疫治療時(shí)，可通過與 腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞溶解物(cell lysate)混合、肽電脈沖、腫瘤抗原基因?qū)霕渫粻罴?xì)胞等方 法，將腫瘤抗原遞呈給樹突狀細(xì)胞，用于腫瘤的DC治療。使用本發(fā)明的方法，即使從患者體 內(nèi)提取的DC量少，也可以調(diào)制出獲得治療效果所需的足夠細(xì)胞數(shù)的DC。


下述圖1、圖2、圖4-圖10、圖13、圖15、圖21(A)、圖21(B)、圖22(A)、圖28、圖29
中的圖像縱軸刻度標(biāo)記的意思如下。 1. E+04、 le4和1. 00E+04 :1. 0 X 104 (個(gè)) 1. E+05禾P 1. 00E+05 :1. 0 X 105 (個(gè)) 1. E+06禾P 1. 00E+06 :1. 0 X 106 (個(gè)) 1. E+07禾P 1. 00E+07 :1. 0 X 107 (個(gè)) 1. E+08禾P 1. 00E+08 :1. 0 X 108 (個(gè))
1. E+09禾P 1. 00E+09 :1. 0 X 109 (個(gè))
1. E+10和1. 00E+10 :1. 0 X 1010 (個(gè))
1. E+l 1禾口 1. 00E+11 :1. 0 X 1011 (個(gè))
1. E+12和1. 00E+12 :1. 0 X 1012 (個(gè))圖1FS36給藥組、GMSCF給藥組、GMIL-4給藥組培養(yǎng)的DC前體細(xì)胞的增殖曲線 圖。FS36給藥組培養(yǎng)了 42天。圖2下述(i)-(iii)DC調(diào)制過程的增殖曲線圖和(1)、 (2)、 (3)各時(shí)點(diǎn)的DC及 DC前體細(xì)胞形態(tài)照片。在(1)和(3)時(shí)點(diǎn)可觀察到樹突狀突起((3))。不同條件培養(yǎng)的DC 分別按以下(i)-(iii)步驟進(jìn)行調(diào)制。 (i)在FS36給藥組的條件下培養(yǎng)前體細(xì)胞42天后所得DC。 (ii)在FS36給藥組的條件下培養(yǎng)前體細(xì)胞21天后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥 組，再培養(yǎng)7天后所得DC。 (iii)在GMIL-4給藥組的條件下培養(yǎng)前體細(xì)胞7天后所得DC。圖3DC前體細(xì)胞增殖培養(yǎng)期間的CDllb、 c_kit、 CD131陽性率推移圖。左柱為
CDllb+細(xì)胞率，中柱為c-kit+細(xì)胞率，右柱為CD131細(xì)胞率。圖中記載的(1) (6)樣品
分別為以下培養(yǎng)條件下制備的DC。 (1):正常DC(normal DC)。 (2):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)一周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一 周。 (3):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)二周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一 周。 (4):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一 周。 (5):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)四周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一 周。 (6):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)五周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一 周。圖4在FS36給藥組(1) 、GMIL-4給藥組(2) 、GMSCF給藥組(3)的條件下培養(yǎng)1 周的DC前體細(xì)胞的增殖曲線和CDllb+/CDllc+率。圖5各樣品(1) (4)中的CDllb7CDllc+率和培養(yǎng)期間的增殖曲線圖。
(1) (4)為以下培養(yǎng)條件下制備的DC。 (1):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)一周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一 周。 (2):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)一周后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)一周。
(3):在GMIL-4給藥組條件下培養(yǎng)二周。
(4) :GMSCF給藥組培養(yǎng)二周。圖6各樣品(1) (2)中的CDllb7CDllc+率和培養(yǎng)期間的增殖曲線圖。
(1) (2)為以下培養(yǎng)條件下制備的DC。 (1):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)二周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周。 (2):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)二周后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)一周。 [OO57]圖7各樣品(1) (2)中的CDllb7CDllc+率和培養(yǎng)期間的增殖曲線圖。
(1) (2)為以下培養(yǎng)條件下制備的DC。 (1):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥，再培養(yǎng)一周。
(2):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更培養(yǎng)基為GMSCF給藥，再培養(yǎng)一周。
圖8各樣品(1) (2)中的CDllb7CDllc+率和培養(yǎng)期間的增殖曲線圖。
(1) (2)為以下培養(yǎng)條件下制備的DC。 (1):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)四周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一 周。 (2):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)四周后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)一周。
圖9各樣品(1) (2)中CDllb7CDllc+率和培養(yǎng)期間的增殖曲線圖。
(1) (2)為以下培養(yǎng)條件下制備的DC。 (1):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)五周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一 周。 (2):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)五周后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)一周。
圖10DC前體細(xì)胞在FS36給藥組條件下培養(yǎng)后，按GMIL-4給藥組和GMSCF給藥 組條件培養(yǎng)期間的細(xì)胞量的推移以及所得CDllb+CDllc+細(xì)胞量。圖11在以下(A) (D)的DC中加入F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF)(圖中表 述為DC(SeV))或LPS(圖中表述為DC(LPS))，2天后的CD80、CD86、MHC class 1I以及CD40 表達(dá)量的比較圖。同時(shí)顯示了無添加的對照結(jié)果(圖中表述為DC(NT))。
圖中(A) (D)使用的DC如下。 (A):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周 所得DC。 (B):正常DC (normal DC)。 (C):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)二周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周 所得DC。 (D):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)四周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周 所得DC。圖12在以下(A) (D)的DC中加入F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF)或LPS， 2天后的CD80、 CD86及CD40的表達(dá)量比較圖。同時(shí)顯示了無添加的對照結(jié)果(圖中表述 為DC(畫。 圖中的(A) (D)使用的DC如下。 (A):在GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)一周所得DC。 (B):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)二周后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)一周 所得DC。 (C):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)一周 所得DC。 (D):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)四周后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)一周
6所得DC。圖13人CD34+細(xì)胞增殖曲線圖。GMIL-4給藥組(1)和GMSCF給藥組培養(yǎng)基的 細(xì)胞增殖。圖14人CD34+細(xì)胞的CDllc+率推移圖。在GMIL-4給藥組(1)禾P GMSCF給藥組 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，確定了 CDllc+率的推移。圖15人CD34+細(xì)胞所得CDllc+細(xì)胞數(shù)(全細(xì)胞XCDllc+率)的推移圖。在 GMIL-4給藥組(1)或GMSCF給藥組培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并檢測了 CDllc+細(xì)胞數(shù)。
圖16GMSCF給藥組培養(yǎng)35天后的人CD34+細(xì)胞與35天中的最后3天經(jīng)LPS剌 激的人CD34+細(xì)胞的CD86表達(dá)量比較圖。通過GM-CSF和SCF擴(kuò)增并同時(shí)分化來自人臍血 的DC前體細(xì)胞。圖17在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng) 一周所得DC的ELISA法測定的細(xì)胞因子產(chǎn)量。DC中加入F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF) (圖中標(biāo)為SeV)或LPS(圖中標(biāo)為LPS)，2天后將培養(yǎng)上清液(105cells/ml)作為樣品，檢 測了細(xì)胞因子的產(chǎn)量。圖中的DC(NT)為無添加F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF)和LPS的 樣品。與未進(jìn)行細(xì)胞因子處理的DC同樣，在GMIL-4給藥組條件下培養(yǎng)一周的DC中，確認(rèn) 到IL-12及IFN-P的產(chǎn)生。
圖中的(1) (4)具體如下所示。 (1):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周 所得DC中的IFN-P產(chǎn)量的檢測結(jié)果。 (2):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周 所得DC中的IL-12產(chǎn)量的檢測結(jié)果。 (3):正常DC(normal DC)中IFN-P產(chǎn)量的檢測結(jié)果。
(4):正常DC(normal DC)中IL-12產(chǎn)量的檢測結(jié)果。圖18在FS36給藥組條件下培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，向再培養(yǎng)1周 所得DC中加入F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF)或LPS， 2天后檢測了 FITC-dextran吞噬能 力(endo-/phagocytotic activity)。圖中的DC(NT)為無添加F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/ dF)(圖中標(biāo)為SeV)和LPS(圖中標(biāo)為LPS)的樣品。DC的FITC-dextran (麗=40， 000)吞 噬在37。C下表現(xiàn)活躍，4。C下被阻斷。在37。C和4。C條件下，用FITC-dextranlmg/ml攝取各 項(xiàng)反應(yīng)30分鐘。FS36給藥組培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)1周所得DC保持 了抗原吞噬能力。圖中的(1)、 (2)具體如下。 (1) :FS36給藥組培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周所得DC 的檢測結(jié)果。 (2):正常DC(normal DC)的檢測結(jié)果。圖19在FS36給藥組條件下培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)1周所 得DC對T cell(C57BL/6)的增殖剌激強(qiáng)度的檢測結(jié)果。T細(xì)胞全部為106細(xì)胞。在FS36 給藥組條件下培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)1周所得DC保持了 T細(xì)胞增殖、 活性化功能。 (1):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周 所得DC(無F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF)和LPS剌激樣品)的檢測結(jié)果。
(2):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周 所得DC中加入F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF)。圖為2天后的樣品檢測結(jié)果。
(3):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周 所得的DC前體細(xì)胞中加入LPS。圖為2天后的樣品檢測結(jié)果。 (4):正常DC(normal DC)(無添加F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF)和LPS剌激的 DC)的檢測結(jié)果。 (5):正常DC(normal DC)中加入F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF) ， 2天后的樣品 檢測結(jié)果。 (6):正常DC(normal DC)中加入LPS, 2天后樣品的檢測結(jié)果。 (7):同系淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)樣品的檢測結(jié)果。 (8):正常DC(normal DC)本身(無T細(xì)胞)的檢測結(jié)果。圖20在FS36給藥組條件下培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)1周所 得DC的體內(nèi)(in vivo)治療效果。圖中的樣品(1) (4)具體如下。
(1):未給藥DC的小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果。 (2):正常DC(normal DC)給藥到小鼠尾靜脈，小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果。
(3):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)二周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周 后所得DC給藥到小鼠尾靜脈，小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果。 (4):在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMSCF給藥組，再培養(yǎng)一周 后所得DC給藥到小鼠尾靜脈，小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果。圖21人臍血CD34+細(xì)胞增殖分化的曲線圖(A)、(B)以及增殖的細(xì)胞C D 11c陽 性細(xì)胞的比例(C)。圖(B)為圖(A)的樣品(5)給藥組和樣品(6)給藥組培養(yǎng)期間0-15天 的上述細(xì)胞增殖的詳細(xì)示意圖。此外，圖(D)為其它實(shí)驗(yàn)中在GMSCF培養(yǎng)基中培養(yǎng)5周的人 臍血CD34+細(xì)胞的FACS解析結(jié)果(CDllc陽性率88. 87% )。圖(D)的黑色部分為CIDllc 抗體結(jié)果，白色為同型對照(iso)結(jié)果。圖(D)中的右側(cè)數(shù)值為CDllc抗體，左側(cè)數(shù)值為同 型對照(iso)中的M1區(qū)域的細(xì)胞數(shù)率(％ )。圖(A)中的樣品(1) (8)具體如下。圖 (A)和圖(B)所述樣品(1) (8)標(biāo)記的末尾A E意為來自不同受試者細(xì)胞的結(jié)果。 [cmo] (l)-(5):在GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)。 [O川](6):在GMIL4給藥組(2)條件下培養(yǎng)。 [cm2] (7)和(8):在GMIL4給藥組(1)條件下培養(yǎng)。圖22來自人G-CSF外周血的CD34+細(xì)胞的增殖曲線圖(A)和增殖的細(xì)胞CDllc 陽性細(xì)胞的比例圖(B)。圖中的樣品(1) (3)具體如下。圖(A)的樣品(1) (3)標(biāo)記 末尾的A和B意為來自不同受試者細(xì)胞的結(jié)果。
(1)和(2):在GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)。
(3):在GMIL4給藥組(1)條件下培養(yǎng)。圖23在人臍血CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)期間，GMSCF給藥組培養(yǎng)35天的細(xì)胞中有無樹 突狀突起的檢測結(jié)果。B圖為A圖中部樣品(在GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)5周后，經(jīng)LPS剌 激48小時(shí))的放大圖。明顯可見樹突狀突起。圖24在人臍血CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)期間，培養(yǎng)14天(2W)和35天(5W)的細(xì)胞(在 GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)的細(xì)胞)中的CDllb、 CD33、 HLA-ABC表達(dá)解析結(jié)果。
8
圖25在人臍血CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)期間，培養(yǎng)35天的細(xì)胞中，經(jīng)LPS處理或SeV/dF處理后，ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80以及CCR7的表達(dá)解析結(jié)果。圖中標(biāo)記的意思如下。 iDC :iDC處理;SeV :SeV/dF處理;LPS :LPS處理。圖26在人臍血CD34+細(xì)胞培養(yǎng)期間，培養(yǎng)35天的細(xì)胞(在GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)的細(xì)胞)中，未成熟DC(iDC)或加入LPS兩天后的DC的FITC-dextran吞噬能力(endo-/phagocytotic activity)的檢測結(jié)果。樹突狀細(xì)胞的FITC-dextran (麗=40， 000)吞噬能力在37。C下表現(xiàn)活躍，4。C下被阻斷。在37。C和4。C下，用FITC-dextran lmg/ml攝取各項(xiàng)反應(yīng)30分鐘。與樹突狀細(xì)胞同樣，上述細(xì)胞的FITC-dextran(麗=40， 000)吞噬在
37t:下表現(xiàn)活躍，4t:下被阻斷。圖27在人臍血CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)期間，通過ELISA法測定了培養(yǎng)35天細(xì)胞(在
GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)的細(xì)胞)中的細(xì)胞因子產(chǎn)量。對上述培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行了以下特定處
理。以上述處理后的培養(yǎng)上清液(105cells/ml)為樣品，測定了細(xì)胞因子產(chǎn)量。圖中的NT
為未進(jìn)行下述特定處理的樣品。所謂"特定處理"具體為 (l)iDC處理圖中表示為iDC。 (2) SeV/dF處理圖中表示為SeV。 (3)LPS處理圖中表示為LPS。 (4)Poly(I:C)處理圖中表示為Poly (I: C)。 (5)CpG處理圖中表示為CpG。 (6)R-848處理圖中表示為R-848。 (7)0K432處理圖中表示為0K432。圖28在人臍血CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)期間內(nèi)，檢測了培養(yǎng)35天的細(xì)胞(在圖21所
述(1)或(2)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞)對T細(xì)胞(allogenicT cell fromvolunteer)的增殖剌
激強(qiáng)度。T細(xì)胞全部為105細(xì)胞。在右上圖中，DC細(xì)胞數(shù)1.00E+03(lXl(f個(gè))的結(jié)果對
應(yīng)于DC : CD3+T細(xì)胞=1 : 100 (混合組1) ， DC細(xì)胞數(shù)1. 00E+04 (1 X 104個(gè))的結(jié)果對應(yīng)
于DC : CD3+T細(xì)胞二1 : 10(混合組2)。 iDC :iDC+T細(xì)胞；SeV :用SeV剌激的DC+T細(xì)胞；
LPS :用LPS剌激的DC+T細(xì)胞；單iDC :只有iDC無T細(xì)胞；單T :只有T細(xì)胞。圖29人臍血CD34+細(xì)胞在以下(1) (3)條件下的培養(yǎng)結(jié)果。 (1):在GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)(圖中表示為"GMSCF")。 (2):在0. 1GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)(圖中表示為"GMSCFO. 1")。 (3):在0. 01GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)(圖中表示為"GMSCFO. 01")。圖30圖29的星號(*)所示時(shí)點(diǎn)(35天培養(yǎng)時(shí)點(diǎn))培養(yǎng)的細(xì)胞CDllc陽性細(xì)胞
率的檢測結(jié)果。圖標(biāo)記的意思如下。 (l)GMSCF :在GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)。 (2)GMSCF0. 1 :在0. 1GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)。 (3)GMSCF0. 01 :條件下0. 01GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)。 發(fā)明的實(shí)施方案 本發(fā)明涉及一種樹突狀細(xì)胞制備方法，其包含在多種細(xì)胞因子培養(yǎng)基中培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞的步驟。該步驟可有效地?cái)U(kuò)增及/或分化DC前體細(xì)胞。本發(fā)明的方法可在添加多種細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)DC前體細(xì)胞。多種細(xì)胞因子優(yōu)選包含SCF和白細(xì)胞介素3(IL_3)，更優(yōu)選包含F(xiàn)LT-3配體(FLT-3L)或白細(xì)胞介素6 (IL_6)。即適用于所有添加FLT-3L、 SCF、 IL_3、 IL_6的培養(yǎng)基，即使從患者提取的DC量少，也可以調(diào)制出能夠獲得治療效果所需的大量細(xì)胞數(shù)的DC。 更優(yōu)選的步驟是，在添加所有FLT-3L、SCF、 IL_3、 IL_6的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，追加在有(i)GM-CSF和IL-4或者(ii)GM-CSF和SCF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。更加有效地將DC前體細(xì)胞高效率地分化成DC。即使從患者提取的DC量少，也可以調(diào)制出獲得治療效果所需的足夠細(xì)胞數(shù)的DC。 本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell ;DC)是指在成熟狀態(tài)下呈樹突狀形態(tài)，具有遞呈抗原、激活T細(xì)胞能力的細(xì)胞。本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞是指在適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子(即，G-CSF、GM-CSF、TNF-a 、 IL_4、 IL-13、SCF (c-kit配體)、Flt-3配體及其組合)存在下可分化為DC的細(xì)胞，優(yōu)選4周以內(nèi)、更優(yōu)選20天以內(nèi)、更優(yōu)選18天以內(nèi)、更優(yōu)選16天以內(nèi)可分化為樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞。這種細(xì)胞例如有CD34+干細(xì)胞、造血原始細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞等。這些細(xì)胞可調(diào)制成細(xì)胞組分。細(xì)胞組分是指細(xì)胞分離(或組分)所得細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞組分可以是細(xì)胞以及藥學(xué)上可容許的承運(yùn)體的組合物。承運(yùn)體例如有生理鹽水、磷酸緩沖液(PBS)、培養(yǎng)液、血清等可懸浮于活細(xì)胞的所需溶液。樹突狀細(xì)胞的分化可以是，例如在SCF(50ng/ml) 、GM-CSF(500U/ml) 、TNF_ a (50ng/ml)存在下培養(yǎng)約3天后，再于SCF(50ng/ml)、GM-CSF(500U/ml) 、IL-4(250U/ml) 、TNF-a (50ng/ml)中進(jìn)行培養(yǎng)。更優(yōu)選在GM-CSF (20ng/ml)和IL-4(20ng/ml)，或GM-CSF(20ng/ml)和SCF(10ng/ml)中進(jìn)行培養(yǎng)。
樹突狀細(xì)胞包含分布于活體內(nèi)各組織器官的來自于骨髓細(xì)胞的呈樹枝狀形態(tài)的細(xì)胞組、在體外in vitro利用細(xì)胞因子等對來自骨髓或血液的干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的分布于活體組織器官中呈樹枝狀形態(tài)的細(xì)胞、以及與此同等的細(xì)胞組。樹突狀細(xì)胞具體包含，例如淋巴細(xì)胞系樹突狀細(xì)胞(可以是誘導(dǎo)Th2或誘導(dǎo)免疫耐受)、骨髓細(xì)胞系樹突狀細(xì)胞(一般使用的樹突狀細(xì)胞。包含未成熟樹突狀細(xì)胞和成熟樹突狀細(xì)胞)、胰島細(xì)胞(皮膚抗原遞呈細(xì)胞中重要的樹突狀細(xì)胞)、連結(jié)細(xì)胞(分布于淋巴結(jié)、脾臟的T細(xì)胞領(lǐng)域，對T細(xì)胞起抗原遞呈作用的細(xì)胞)、濾泡樹突狀細(xì)胞(是重要的對B細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，抗原和抗體復(fù)合體、抗原和補(bǔ)體復(fù)合體通過抗體受體、補(bǔ)體受體遞呈到樹突狀細(xì)胞，抗原遞呈給B細(xì)胞。)等，優(yōu)選可高水平表達(dá)MHC I類和II類，更優(yōu)選表達(dá)CDllc的細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選使用由骨髓和外周血回收的細(xì)胞提取的DC和DC前體細(xì)胞。對DC的來源生物種類沒有特別限制，可以是人、猴等靈長類，也可以是小鼠、大鼠等嚙齒目和兔、牛、山羊等哺乳類的DC。
此外，樹突狀細(xì)胞可以是呈樹枝狀形態(tài)，從CDllc、 HLA-class II (HLA-DR、-DP或-DQ)、CD40及CDla組選擇出來的表面標(biāo)記2個(gè)以上陽性的細(xì)胞。本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞優(yōu)選HLA-class II+和CDllc+細(xì)胞，更優(yōu)選CDla+、HLA-class II+及CDllc+細(xì)胞中不表達(dá)系統(tǒng)標(biāo)記為陰性(Lin—)的T細(xì)胞標(biāo)記(CD3)、B細(xì)胞標(biāo)記(CD19、CD20) 、NK細(xì)胞標(biāo)記(CD56)、中性粒細(xì)胞標(biāo)記(CD15)、單核細(xì)胞標(biāo)記(CD14)的細(xì)胞。骨髓細(xì)胞系樹突狀細(xì)胞(Myeloid DC)更優(yōu)選表達(dá)CD 11 b 。本發(fā)明的DC包含CD 1 lb+CD 11 c+細(xì)胞。淋巴細(xì)胞系樹突狀細(xì)胞(LymphoidDC)中還可表達(dá)CD8。 本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞還包含成熟的樹突狀細(xì)胞或未成熟的樹突狀細(xì)胞。所謂未成熟的樹突狀細(xì)胞是指其T細(xì)胞激活能力明顯低于成熟狀態(tài)的樹突狀細(xì)胞。具體來說，與加入LPS(l g/ml)后培養(yǎng)2天誘導(dǎo)后成熟的樹突狀細(xì)胞相比，未成熟樹突狀細(xì)胞的抗原遞呈能力低于l/2，優(yōu)選低于1/4?？乖f呈能力可通過以下兩種方法進(jìn)行定量。 一種方法是通過同種異型T細(xì)胞激活能力(混合淋巴細(xì)胞試驗(yàn)將同種異型T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞以l : 10比例混合培養(yǎng)，優(yōu)選變化比例進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后的8小時(shí)之前加入3H-胸腺嘧啶糖苷(thymidine)，根據(jù)其T細(xì)胞DNA中的攝取量，定量T細(xì)胞增殖能力。文獻(xiàn)Gene Therapy 2000 ;7 ;249-254)進(jìn)行定量；另一種方法是通過肽的特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的誘導(dǎo)能力試驗(yàn)(在樹突狀細(xì)胞中加入已知具有某種抗原Class I限制性的肽，將提取的正常人樹突狀細(xì)胞與其本人的外周血T細(xì)胞共同培養(yǎng)(第3天以后使用25U/ml的IL-2、優(yōu)選100U/ml)(優(yōu)選21天內(nèi)進(jìn)行3次樹突狀細(xì)胞剌激，更優(yōu)選14天內(nèi)進(jìn)行2次樹突狀細(xì)胞剌激)，將由此所得效應(yīng)細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞(肽限制性Class I陽性腫瘤細(xì)
胞)以ioo : i 2.5 : i(ioo : i、50 : i、25 : 1、20 : i、i2.5 : i、io : i、5 : i或
2.5 : 1)、優(yōu)選10 : 1的比例混合培養(yǎng)4小時(shí)后，通過耙細(xì)胞的"Cr釋放量(文獻(xiàn)ArchDermatol Res 2000 ;292 ;325-332))進(jìn)行定量。另外，未成熟樹突狀細(xì)胞優(yōu)選具有抗原吞噬能力，更優(yōu)選誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的共剌激受體的表達(dá)水平降低(例如，明顯低于上述LPS誘導(dǎo)的成熟DC)或?yàn)殛幮?。另一方面，所謂成熟樹突狀細(xì)胞是指激活T細(xì)胞的抗原遞呈能力明顯高于未成熟狀態(tài)的樹突狀細(xì)胞。具體來說，成熟樹突狀細(xì)胞是加入LPS (lii g/ml)培養(yǎng)2天后，具有成熟誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的一半以上抗原遞呈能力的細(xì)胞，優(yōu)選具有同等以上抗原遞呈能力。成熟樹突狀細(xì)胞優(yōu)選抗原吞噬能力降低或不具備抗原吞噬能力的細(xì)胞，更優(yōu)選誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的共剌激受體的表達(dá)為陽性的細(xì)胞。所謂樹突狀細(xì)胞的活化是指未成熟樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟樹突狀細(xì)胞，活化的樹突狀細(xì)胞的范疇還包含成熟樹突狀細(xì)胞以及通過活化剌激誘導(dǎo)共剌激的CD80、CD86表達(dá)提高的途中經(jīng)過的那些樹突狀細(xì)胞。
成熟人樹突狀細(xì)胞是CD40、 CD80、 CD86以及HLA-class II的表達(dá)為陽性的細(xì)胞。例如，以CD80和CD86組成群中選擇出來的標(biāo)記為基礎(chǔ)，可以分辨出未成熟樹突狀細(xì)胞和成熟樹突狀細(xì)胞。未成熟樹突狀細(xì)胞優(yōu)選這些標(biāo)記較弱或?yàn)殛幮裕墒鞓渫粻罴?xì)胞則為陽性。 如上所述，未成熟樹突狀細(xì)胞通常具有強(qiáng)大的吞噬能力。在樹突狀細(xì)胞中加入LPS(liig/ml)培養(yǎng)2天后，樹突狀細(xì)胞被活化，而吞噬能力卻下降。吞噬能力可通過測定樹突狀細(xì)胞的小分子吞噬量或者吞噬細(xì)胞的比例進(jìn)行測定，優(yōu)選通過樹突狀細(xì)胞內(nèi)的小分子吞噬量來測定。例如，用直徑lym左右的著色玻璃珠來測定樹突狀細(xì)胞內(nèi)的玻璃珠的吞噬量，再減去4t:下呈陽性的背景后進(jìn)行定量。所謂高強(qiáng)的吞噬能力是指，與經(jīng)上述LPS(lyg/ml)剌激2天后的樹突狀細(xì)胞相比，樹突狀細(xì)胞內(nèi)的小分子吞噬量為4倍以上、優(yōu)選5倍以上、更優(yōu)選6倍以上的吞噬能力?；蛘?，吞噬小分子的細(xì)胞的比例為2倍或以上，更優(yōu)選3倍以上。所謂低吞噬能力是指，與經(jīng)上述LPS(liig/ml)剌激2天后的樹突狀細(xì)胞相比，樹突狀細(xì)胞內(nèi)的小分子吞噬量低于4倍，優(yōu)選低于2倍，更優(yōu)選低于1. 5倍。或者，吞噬小分子的細(xì)胞的比例低于2倍，優(yōu)選低于1. 5倍。 本專業(yè)人士通常都可分辨成熟樹突狀細(xì)胞，上述各標(biāo)記及其表達(dá)的測定方法也為本專業(yè)人士熟知。例如，CDllc是分子量約為150kD的粘附糖蛋白(pl50，整合素a鏈)。有報(bào)告說，CDllc結(jié)合于CD18，形成CDllc/CD18復(fù)合體，具有對纖維蛋白原的結(jié)合能力，成為iC3b和ICAM-1的受體。另有報(bào)告說，CDllc/CD18可作為結(jié)合于被剌激的上皮受體的粘附分子發(fā)揮作用(Kn即p， W.et al. ， eds. ， 1989， Leucocyte TypingIV :White CellDifferentiation Antigens, Oxford University Press, New York ;Barclay, N. A. etal. ， eds. ，1993， The Leucocyte Antigen FactsBook， CD11 Section,AcademicPress Inc. ， San Diego， California, p. 124 ;Stacker， S.A. and T.A. Springer,1991， J. Immunol. 146 :648)。 CDla是分子量約為49kD的多肽，與P2微球蛋白結(jié)合。CDla在結(jié)構(gòu)上被認(rèn)為與MHC class I的抗原相似，具有抗原遞呈功能(Kn即p， W. et al. ， eds. ， 1989， LeucocyteTyping IV :White Cell Differentiation Antigens,OxfordUniversity Press,New York;Schlossman， S. et al. ， eds. ，1995， Leucocyte TypingV :White Cell DifferentiationAntigens. Oxford University Press,New York ;Hanau，D.et al. ，1990，J. InvestigativeDermatol. 95 :503 ;Calabi， F. and A.Bradbury. ，1991. ， Tissue Antigens 37 :1)。
CDllb也稱為整聯(lián)蛋白a M鏈、Mac-1、 CR3、 iC3bR (complement rec印tortype3)、Mol，是分子約165 170的I型跨膜通糖蛋白質(zhì)。以補(bǔ)體(iC3b)、血纖維蛋白原、凝固因子X的受體機(jī)能參與吞食細(xì)胞活動(dòng)(Todd R. F. et al. J. Immunol. ， 126，1435-1442(1981) ;Leong A. S. Y. Appl. I匪nohistochem. Surg. Pathol. ， 120-128 (1993);Todd R.F.et al. Hybridoma， 1， 329-337 (1982) ;Cobbold S. et al. Leucocyte Typing III，788-803(1987) ;Keizer G. et al. Eur. J. Immunol. ，15，1142-1148. (1985) ;Laffon A. etal. J. Clin. Invest. ，88,546-552(1991) ;Acevedo A. et al. J. Invest. De皿to1. ， 97，659-666(1991))。 CDllc(整聯(lián)蛋白a4亞基或pl50白細(xì)胞表面抗原)是整聯(lián)蛋白家族的成員，與其他白細(xì)胞整聯(lián)蛋白(CDlla、CDllb、CDlld)同樣，非共價(jià)性地與整聯(lián)蛋白P 2亞基(CD18)結(jié)合。已知CDllc是分子量145-150kDa的跨膜糖蛋白，是樹突狀細(xì)胞的標(biāo)記(Molica S. etal. Blood，81，2466(1993) ;Van der Vieren M. et al. Immunity,3，683-690(1995) ;HoggN.et al. LeucocyteTyping 111,576-602(1987))。 CD14是分子量53-55kD的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨型單鏈糖蛋白，在細(xì)網(wǎng)樹突狀細(xì)胞以及某種朗格罕斯細(xì)胞中表達(dá)。CD14被定性為對LPS與血清LPS結(jié)合蛋白質(zhì)(LPB)的復(fù)合體具有高親和性的表面受體(McMichael， A. J. et al. ， eds. ， 1987， LeucocyteTyping III :White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, NewYork ;Knapp， W. et al. ， eds. ，1989， LeucocyteTyping IV :White Cell DifferentiationAntigens, Oxford University Press, NewYork ;Schlossman， S. et al. ， eds. ，1995，Leucocyte Typing V:White CellDifferentiation Antigens. Oxford University Press,New York ;Wright， S.D.etal. ，1990， Science 249 :1434)。 CD40是分子量45-48kD的I型內(nèi)在膜蛋白(type I integralmembraneglycoprotein)，抗CD40抗體常作為細(xì)胞標(biāo)記使用(Schlossman, S. et al. ， eds.，1995， Leucocyte Typing V:White Cell Differentiation Antigens. OxfordUniversityPress, New York ;Galy， A. H. M. ;and H. Spits， 1992， J. Immunol. 149 :775 ;Clark， E. A. andJ. A. Ledbetter， 1986， Proc. Natl. Acad. Sci. 83 :4494 ;Itoh， H. et al. ， 1991， Cell 66 :233 ;Barclay，N. A. et al. ，1993，The Leucocyte AntigenFacts Boo k. ，Academic Press)。
CD80是分子量約60kD的跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超家族(Igsupergenefamily)中的 一 員。CD80是在T細(xì)胞中表達(dá)的CD28以及CD152 (CTLA-4)的配體(Schlossman， S. et al. ， eds. ，1995， Leucocyte Typing V:WhiteCell DifferentiationAntigens. Oxford University Press, New York ;Schwarts， R. H. ，1992， Cell 71 :1065 ;Azuma， M. et al. ， 1993， J. Exp. Med. 177 :845 ;Koulova， L. et al. ， 1991， J. Exp. Med. 173 :759 ;Freeman， G. J. et al. ，1998， J. Immunol. 161 :2708 ;Behrens， L. et al. ，1998，J. Immunol. ，161 (11) :5943 ;Guesdon， J.-L.et al. ，1979， J. Histochem. Cytochem. 27 :1131-1139)。 CD83是分子量約45kD的跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族中的一員。CD83具有短鏈V型Ig細(xì)胞外區(qū)域和C末端的細(xì)胞質(zhì)尾tail區(qū)域。CD83主要在濾泡樹突狀細(xì)胞、循環(huán)樹突狀細(xì)胞、淋巴組織連結(jié)(interdigitating)樹突狀細(xì)胞、體外(in vitro)生成的樹突狀細(xì)胞以及胸腺樹突狀細(xì)胞中表達(dá)(Zhou， L-J. ， and T. F. Tedder, 1995， J. Immunol. 154. 3821 ;Zhou， L-J. et al. ， 1992， J. Immunol. 149 :735 ;S翻ers， K. L. et al. ， 1995， Clin Exp.Immunol. 100 :81 ;Weissman， D. et al. ，1995， Proc.Natl. Acad. Sci USA. 92 :826 ;Hart，D.N. J. ， 1997， Blood 90 :3245)。 CD86 (B70/B7-2)是分子量約75kD的細(xì)胞表面蛋白，是CD28以及CTLA-4的第2配體，在初期免疫應(yīng)答中作為T細(xì)胞的共剌激發(fā)揮著重要的作用(Azuma M. et al. ， 1993，Nature 366 :76 ;Nozawa Y. et al. ， 1993， J. Pathology 169 :309 ;Engle， P. et al. 1994.，Blood 84 :1402 ;Engel， P. et al. ， CD86 Workshop Report. In丄eukocyte TypingV. Schlossman， S. F. et al. eds. ， 1994， Oxford University Press ;Yang， X. F. et al.，1994，Upregulation of CD86antigen on TPAstimulated U937 cells,1994， (abstract).American Society ofHematology， Nashville, TN ;Guesdon， J._L.et al. ，1979，J. Histochem. Cytochem. 27 :1131-1139)。CCR7是也稱為BLR-2、 EBI-1及CMKBR7的7回膜貫穿型G蛋白質(zhì)結(jié)合受體，是CC趨化因子MIP-3 P /Exodus 3/ELC/CCL19禾P 6Ckine/Exodus2/SLC/TCA4/CCL21的受體(Sallusto， F. et al. ，1999， Nature 401 :708-12 ;Lipp， M. et al. ，2000， Curr. Top.Microbiol. Immunol. 251 :173-9 ;Birkenbach， M. et al. ，1993， J. Virol. 67 :2209-20 ;Schweickart， V.L et al. ，1994， Genomics 23 :643-50 ;Burgstahler， R. et al. ，1995，Biochem. Biophys. Res. Commun. 215 :737—43 ;Yoshida， R. et al. ， 1997， J. Biol. Chem. 272 :13803-9 ;Yoshida， R. et al. ，1998， J. Biol. Chem. 273 :7118-22 ;Yoshida， R. et al. ，1998，Int.Immunol. 10 :901-10 ;Kim， C.H. et al. ，1998， J. Immunol. 161:2580-5 ;Yanagihara，S. et al. ， 1998， J. Immunol. 161 :3096-102)。 HLA-class II有DR、 DP和DQ，可通過與其全部結(jié)合的抗體進(jìn)行網(wǎng)篩式檢 測 (Pawelec， G. et al. ， 1985， Human Immunology 12 :165 ;Ziegler， A. et al.，1986， I匪nobiol. 171 :77) 。 HLA-DR是人類class (主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibility complex,MHC)) II的抗原之一，是由a鏈(36kDa)和P亞基(27kDa)組成的跨膜糖蛋白。在表皮的朗格漢斯細(xì)胞中與CDla共同表達(dá)。CDla在抗原遞呈過程中，對細(xì)胞的相互作用發(fā)揮重要作用(Barclay，N. A. et al. ，1993，The Leucocyte AntigenFacts Book. p. 376. Academic Press)。 以上述標(biāo)記基因及其相同的基因產(chǎn)物為指標(biāo)，可對人類以及人類以外的哺乳動(dòng)物
13鑒定樹突狀細(xì)胞。該標(biāo)記的抗體例如可從BD公司(BDPharMingen)購入，詳細(xì)情況可參考該公司或其銷售代理店的網(wǎng)頁。 關(guān)于樹突狀細(xì)胞的標(biāo)記還可參考以下Kiertscher等以及0ehler等的文獻(xiàn)(Kiertscher SM，Roth MD，Human CD14+leukocytes acquire the phenotypeand functionof antigen-presenting dendritic cells when cultured in GM-CSFand IL_4， J. Leukoc. Biol. ， 1996， 59 (2) :208_18 ;0ehler丄et al.，Neutrophilgra皿locyte—committed cells can be driven to acquire dendriticcellcharacteristics. ， J. Exp. Med. ，1998,187(7) :1019-28)。關(guān)于流式細(xì)胞分析術(shù)，可參考0kano等以及Stites等的文獻(xiàn)(0kano， S. et al. ， Recombinant Sendaivirusvectors for activated T lymphocytes. ， Gene Ther. ，2003，10 (16) :1381-91 ;Stites，D. et al. ， Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDSusingmonoclonal antibodies and simultaneous dual immunofluorescence. ， Clin. Immunol,mmunopathol. ， 1986,38 :161-177)。如用同型對照抗體(isotypecontrol antibody)染色時(shí)，各標(biāo)記的表達(dá)以陽性率不超過1%的螢光強(qiáng)度為界限，1%及其以上為陽性，小于1%為陰性。 樹突狀細(xì)胞及其前體細(xì)胞可按照已知的方法進(jìn)行調(diào)制。例如，可以從血液(如外周血和臍血)、骨髓、淋巴結(jié)、其它淋巴器官、脾臟、皮膚中分離(Bishop et al. ， Blood 83 :610-616， 1994 ;Bontkes， H. J. et al. (2002) J丄eukoc. Biol. 72， 321-329 ;Katsuaki ， S. etal. (1998)CRY0BI0L0GY 37,362-371 ;Ladan， K. et al. (2006)Stem Cells 24,2150-2157;Ueda， T. et al. (2000) J. Clin. Invest. 105 :1013-1021)。本發(fā)明中使用的樹突狀細(xì)胞優(yōu)選從血液或骨髓提取。另外，本發(fā)明中使用的樹突狀細(xì)胞也可以是皮膚的朗格罕斯細(xì)胞、輸入淋巴管的隱蔽細(xì)胞、濾泡樹突狀細(xì)胞、脾臟樹突狀細(xì)胞以及淋巴器官的指狀突起細(xì)胞等。本發(fā)明使用的樹突狀細(xì)胞還包含從來自CD34+樹突狀細(xì)胞、來自骨髓的樹突狀細(xì)胞、來自單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞、來自脾細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞、來自皮膚的樹突狀細(xì)胞、濾胞樹突狀細(xì)胞以及胚中心樹突狀細(xì)胞等組成的組群中選擇出來的樹突狀細(xì)胞。DC前體細(xì)胞尤其優(yōu)選骨髓或外周血提取的造血干細(xì)胞或造血始原細(xì)胞等。造血干細(xì)胞或造血始原細(xì)胞可通過市銷試劑盒的陰性試劑和CD34+等陽性試劑單離(參考美國專利08/539， 142)。已知的方法例如有，利用磁珠、螢光標(biāo)簽分類、生物素或親和素結(jié)合承運(yùn)體等單離表面抗原細(xì)胞(Berenson etal. ， J. Immunol. Meth. ，91 :11,1986 ;W0 93/08268)。 從含有DC和DC前體細(xì)胞以及其它細(xì)胞的組合物中選擇(或濃縮)DC及DC前體細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選實(shí)施所謂的陰性選擇，以便去除DC及DC前體細(xì)胞以外的細(xì)胞。采取陰性選擇，DC-中性細(xì)胞(granulocytes)的前體細(xì)胞(precursor) (J. Exp. Med. ， 1998， 187 :1019-1028 ;Blood，1996，87 :4520-4530)則不被去除而得以保留，不僅可以獲取粘付性CD14細(xì)胞分化的DC，還可獲取那些前體細(xì)胞(precursor)分化的DC，載體導(dǎo)入DC時(shí)，可望降低細(xì)胞毒性。 例如，在T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞等中使用特異性抗體，去除這些細(xì)胞，可濃縮DC。具體來說，優(yōu)選CD2、 CD3、 CD8、 CD19、 CD56、 CD66b中的表面標(biāo)記或者其任意組合的表達(dá)低(low)或?yàn)殛幮?negative)的細(xì)胞。更優(yōu)選CD2、 CD3、 CD8、 CD19、 CD56以及CD66b全部表
14達(dá)低(low)或?yàn)殛幮?negative)的細(xì)胞。因此，可以使用這些標(biāo)記的抗體，去除表達(dá)這些標(biāo)記的細(xì)胞(Hsu et al. (1996)Nature Med. 2 :52)。陰性選擇也可以使用多價(jià)抗體，或者磁珠細(xì)胞分離(MACS)時(shí)利用磁珠也能進(jìn)行同樣的篩分。用血球分離等方法采集單核細(xì)胞來大量調(diào)制細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選使用磁珠。例如，從活體細(xì)胞溶液濃縮單核細(xì)胞，陰性選擇后調(diào)制的DC前體細(xì)胞適于本發(fā)明優(yōu)選使用。 樹突狀細(xì)胞的具體單離方法如Cameron et al. ， 1992， Science 257:383、Langhoff et al. ， 1991， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :7998、Chehimi et al. ， 1993， J. Gen-Viol. 74 :1277、 Cameron et al. ， 1992， Clin. Exp. Immunol. 88 :226、 Thomas et al. ， 1993，J. Immunol. 150 :821、 Karhumaki et al. ， 1993， Clin. Exp. Immunol. 91 :482等所述。利用流式細(xì)胞分析術(shù)單離樹突狀細(xì)胞的方法如Thomas et al. ， 1994， J. Immunol. 153 :4016、Ferbas et al. ， 1994， J. Immunol. 152 :4649、以及0' Dohelrty et al. ， 1994， Immunology82:487所述。細(xì)胞磁珠分選方法如Miltenyi et al. ， 1990， Cytometry 11 :231-238所述。
人樹突狀細(xì)胞單離和增殖可采用Macatonia et al. ， 1991， Immunol. 74 :399-406、0' Doherty et al. ，1993，J. Exp. Med. 178 :1067—1078、Markowicz et al. ，1990，J. Clin.Invest. 85 :955-961、 Romani et al. ， 1994， J. Exp. Med. 180 :83-93、 Sallusto et al.，1994， J. Exp. Med. 179 :1109-1118、 Berhard et al. ， 1995， J. Exp. Med. 55 :1099-1104等所述方法。由骨髓、臍血、外周血等獲取的CD34+細(xì)胞和來自外周血單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞形成可依Van Tendeloo et al. ， 1998， Gene Ther. 5 :700-707所述方法進(jìn)行。
DC前體細(xì)胞在含一種到多種細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中擴(kuò)增。例如，若培養(yǎng)基中只含IL-3， 10天可擴(kuò)增DC前體細(xì)胞，但較長時(shí)間的擴(kuò)增則顯不足。本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，在含有SCF和IL-3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)DC前體細(xì)胞，可高效率擴(kuò)增具有分化DC能力的細(xì)胞。所以，2周以上的擴(kuò)增優(yōu)選IL-3和SCF的組合。尤其在含有FLT-3L、SCF、IL-3及IL_6的4種細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)DC前體細(xì)胞，可大量獲取具有高DC分化能力的DC前體細(xì)胞。本發(fā)明涉及DC的制備方法，該方法包含在以下3種培養(yǎng)基中擴(kuò)增DC前體細(xì)胞的步驟。
1.含IL-3和SCF，不含F(xiàn)LT-3L和IL-6的培養(yǎng)基；
2.含F(xiàn)LT-3L、 SCF和IL_3，不含IL-6的培養(yǎng)基;
3.含SCF、 IL-3和IL_6，不含F(xiàn)LT-3L的培養(yǎng)基。 本發(fā)明還涉及DC的制備步驟，該步驟包含在含有FLT-3L、SCF、IL-3及IL-6，但明顯不含G-CSF、 GM-CSF、 IL-4及TNF- a中的其中1種以上(或其任意組合)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中擴(kuò)增DC前體細(xì)胞的步驟。 FLT-3L(Fms樣酪氨激酶3配體)是Flt_3配體，可促進(jìn)造血系前體細(xì)胞的分化增殖(Namikawa R. et al. ，BL00D 87 :1881-1890,1996)。 EP0627487A2及W0 94/2839所述的一組多肽包含在本發(fā)明的Flt-3L中。人FLT-3L cDNA可從accession humber ATCC 69382的American Type CultureCollection (ATCC)獲得。SCF也稱c-kit配體、肥大細(xì)胞增殖因子(MGF)、或青灰因子(Zsebo et al. ，Cell 63 :195-201,1990 ;Huan，E.Cell 63 :225-233 ;Williams,D. E. ，Cell 63 :167-174，1990 ;Toksoz. D et al，PNAS 89 :7350-7354，1992)。SCF包含EP 423，980所述的多肽。 IL-3是由激活的T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的造血因子。本發(fā)明的IL-3中包含美國專利第5， 108,910號所述的IL-3多肽。編碼人IL-3蛋白質(zhì)的DNA序列可從
15accession number ATCC 67747獲得。已發(fā)現(xiàn)IL-6是B細(xì)胞的分化誘導(dǎo)因子，不僅具有抗體生產(chǎn)體系，還具有多種生理活性，如肝臟急性蛋白活體合成誘導(dǎo)、與IL-3的相互作用下促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖等(Paul SR et al. ， Blood， 1991， 77 :1723-1733) 。 IL-4主要通過輔助T細(xì)胞生產(chǎn)，在T細(xì)胞、B細(xì)胞以及其它血球細(xì)胞內(nèi)有多種生理活性(Mosley et al.，Cell59 :335(1989) ;Idzerda et al. ， J. Exp. Med. 171 :861(1990) ;Galizzi et al. ， Intl.Immunol. 2 :669(1990)) 。 GM-CSF是作為含有巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)成長剌激因子而單離出來的細(xì)胞因子(美國專利第5， 108， 910號以及5， 229， 496號)。GM-CSF是粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞成長和生成所需的因子，剌激骨髓芽球及單芽球，誘導(dǎo)分化。
各細(xì)胞因子的濃度可適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整，例如FLT-3L，可調(diào)整為5 35ng/ml，優(yōu)選10 30ng/ml，更優(yōu)選15 25ng/ml，更優(yōu)選約20ng/ml。使用FS36等不含GM-CSF的培養(yǎng)基時(shí)，SCF、 IL-3、 IL-6可調(diào)整為3 20ng/ml，優(yōu)選5 15ng/ml，更優(yōu)選7 12ng/ml，更優(yōu)選約10ng/ml，但不限于此。培養(yǎng)基可使用RPMI1640和MDM。培養(yǎng)基中可適當(dāng)加入5 20%的血清，優(yōu)選加入10%左右，更優(yōu)選適當(dāng)加入牛胎血清(FBS)。 DC前體細(xì)胞可從1 X 105 5 X 105細(xì)胞左右開始培養(yǎng)，如從約2. 5 X 105細(xì)胞開始培養(yǎng)。優(yōu)選3 4天傳代一次。傳代時(shí)，優(yōu)選調(diào)整細(xì)胞數(shù)至濃度低于2X107ml。人CD34+細(xì)胞等靈長類CD34+細(xì)胞與GM-CSF、 SCF混合培養(yǎng)時(shí)，GM-CSF的使用量為1 500ng/ml (1 200ng/ml或1 100ng/ml)，優(yōu)選2 300ng/ml，例如5 200ng/ml，更優(yōu)選10 150ng/ml，更優(yōu)選20 120ng/ml，更優(yōu)選30 100ng/ml。 SCF可使用0. 5 500ng/ml (0. 5 100ng/ml禾口 0. 5 50ng/ml)，優(yōu)選1 300ng/ml ，更優(yōu)選2 200ng/ml ，更優(yōu)選5 100ng/ml ，例如10 70ng/ml ，更優(yōu)選20 60ng/ml，更優(yōu)選25 50ng/ml左右。 本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)DC前體細(xì)胞的擴(kuò)增以3 4周為最佳，此后的DC分化效率明顯提高。雖然培養(yǎng)更長時(shí)間可以提高細(xì)胞的收獲量，但DC分化效率隨之降低。尤其在FS36培養(yǎng)基中培養(yǎng)5周擴(kuò)增的DC前體細(xì)胞，DC的分化效率明顯降低。所以，在使用FS36等不含GM-CSF的培養(yǎng)基時(shí)，DC前體細(xì)胞培養(yǎng)宜在3-4周左右，優(yōu)選3周左右，如18 24天，更優(yōu)選20 22天，避免在含有相同細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)基中超過該期間擴(kuò)增DC前體細(xì)胞。培養(yǎng)上述期間后，如以下所述，在DC分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分化DC。例如，在含有FLT-3L、 SCF、IL-3和IL-6的培養(yǎng)基中培養(yǎng)DC前體細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)上述期間后，在不含任何FLT-3L、 SCF、IL-3及IL-6的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 擴(kuò)增的DC前體細(xì)胞可通過細(xì)胞因子分化為DC。例如，通過粒細(xì)胞集落因子(G-CSF) 、 GM-CSF、腫瘤壞死因子(TNF)-a 、 IL_4、 IL_13、 SCF(c-kit配體)、Flt-3配體、或其組合進(jìn)行分化。優(yōu)選將在不含GM-CSF的培養(yǎng)基(FS36等)中擴(kuò)增的DC前體細(xì)胞，在GM-CSF和IL-4或在GM-CSF及SCF中培養(yǎng)分化為DC。也可分化成用TNF- a剌激的成熟樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選依上述方法，將在不含GM-CSF的培養(yǎng)基(FS36等)中擴(kuò)增的DC前體細(xì)胞，在GM-CSF和IL-4或在GM-CSF和SCF中培養(yǎng)。細(xì)胞因子濃度可適當(dāng)調(diào)整，在不含GM-CSF的培養(yǎng)基中擴(kuò)增的DC前體細(xì)胞，其GM-CSF及IL-4濃度宜為1 500ng/ml，具體為2 300ng/ml，例如5 100ng/ml，優(yōu)選10 50ng/ml，更優(yōu)選15 25ng/ml，更優(yōu)選約20ng/ml。 SCF宜為1 200ng/ml，具體為2 100ng/ml、2 80ng/ml或2 60ng/ml，更具體說宜為3 20ng/ml，優(yōu)選5 15ng/ml，更優(yōu)選7 12ng/ml，更優(yōu)選約10ng/ml。培養(yǎng)基可使用RPMI1640和MDM?？蛇m當(dāng)加入5 20%的血清，優(yōu)選加入10%左右，優(yōu)選加入胎牛血清(FBS)。培養(yǎng)期間為5 15天，優(yōu)選6 10天，更優(yōu)選7天左右。在FS36中擴(kuò)增細(xì)胞時(shí)，與GM-CSF和IL-4比較，在GM-CSF和SCF中分化更能有效地獲取DC。
如果是人CD34+細(xì)胞等人DC前體細(xì)胞和其它靈長類DC前體細(xì)胞，即使不在SCF和IL-3 (S3)或FS36中進(jìn)行如上擴(kuò)增，也可通過在GM-CSF和IL-4、或GM-CSF和SCF中培養(yǎng)，擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行分化。此時(shí)，培養(yǎng)期間為1 10周，例如1 6周，優(yōu)選2 5周，更優(yōu)選3 6周、3 5周、4 5周。作為靈長類CD34+細(xì)胞，可使用例如臍血CD34+細(xì)胞、骨髓CD34+細(xì)胞以及外周血CD34+細(xì)胞等。 培養(yǎng)液可使用所需的培養(yǎng)基。例如DMEM(Dulbecco' s Modified EagleMedium)、MEM(Minim咖Essential Medium) 、 RPMI_1640、 X-VIVOTM(Lonza)、頂DM(Iscove ' sModified Dulbecco' s Medium)等。最優(yōu)選使用MDM。優(yōu)選適當(dāng)加入血清，如1 20%(v/v)，更優(yōu)選2 20X，更優(yōu)選5 15%，更優(yōu)選5 10% (如10%左右)。優(yōu)選使用牛血清，最優(yōu)選使用胎牛血清(FCS)。從人CD34+細(xì)胞擴(kuò)增iDC時(shí)，優(yōu)選不添加TNF- a及/或IL-4。培養(yǎng)基中的TNF-a和IL_4濃度優(yōu)選不明顯超過加入的血清中所含各濃度，例如為血清(如正常FCS)中各細(xì)胞因子濃度的3、2或1倍以下，優(yōu)選1/2以下，更優(yōu)選1/3以下，更優(yōu)l/5以下，具體為50ng/ml以下，優(yōu)選40、30、20、 10、5、3和lng/ml以下。從人CD34+細(xì)胞擴(kuò)增iDC時(shí)，優(yōu)選只加入GM-CSF及SCF細(xì)胞因子的培養(yǎng)基。優(yōu)選僅含GM-CSF和SCF細(xì)胞因子，不含其它細(xì)胞因子的培養(yǎng)基。 本發(fā)明提供包含GM-CSF和SCF的樹突狀細(xì)胞擴(kuò)增用組合物、樹突狀細(xì)胞調(diào)制用組合物、樹突狀細(xì)胞制備用組合物、樹突狀細(xì)胞擴(kuò)增用培養(yǎng)基、樹突狀細(xì)胞調(diào)制用培養(yǎng)基以及樹突狀細(xì)胞制備用培養(yǎng)基。組合物可包含所需的消毒液、緩沖液、鹽水等。培養(yǎng)基有如上所述的培養(yǎng)液，但不限于此。培養(yǎng)基可含或不含血清。也可含或不含抗生物。本發(fā)明還涉及制備該組合物和培養(yǎng)基時(shí)的GM-CSF及SCF的使用方法。本發(fā)明還涉及以GM-CSF及SCF為試劑盒組成要素的樹突狀細(xì)胞擴(kuò)增用試劑盒、樹突狀細(xì)胞調(diào)制用試劑盒、樹突狀細(xì)胞制備用試劑盒。該試劑盒還可包含培養(yǎng)液(如不含血清)或調(diào)制培養(yǎng)液所需的粉劑(含氨基酸和鹽等，不含血清和抗生物質(zhì)等)。這些組合物、培養(yǎng)基及試劑盒優(yōu)選用于人等靈長類樹突狀細(xì)胞的擴(kuò)增、調(diào)制及制備，更優(yōu)選用于來自人等靈長類CD34+細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞的擴(kuò)增、調(diào)制及制備，且優(yōu)選不含TNF- a及/或IL-4。例如，含血清時(shí)，組合物及培養(yǎng)基中的TNF- a和IL-4濃度優(yōu)選不明顯超過血清所含細(xì)胞因子的各濃度，例如為血清(如正常FCS)中的各細(xì)胞因子濃度的3、2和1倍以下，優(yōu)選1/2以下，更優(yōu)選1/3以下1/5以下，具體為50ng/ml以下，優(yōu)選40、30、20、10、5、3和lng/ml以下。不含血清時(shí)，優(yōu)選只含GM-CSF及SCF細(xì)胞因子。 按照本發(fā)明的方法，從CD34+細(xì)胞擴(kuò)增DC可達(dá)102倍，優(yōu)選0. 5X 103倍，更優(yōu)選1 X 103倍，更優(yōu)選0. 5 X 104倍，更優(yōu)選1 X 104倍，更優(yōu)選0. 5 X 105倍，更優(yōu)選1 X 105倍，更優(yōu)選0.5X106倍以上。例如，培養(yǎng)1周，細(xì)胞能夠以5倍的速度增加，優(yōu)選6、7、8、9、10、11、12和13倍以上。擴(kuò)增的細(xì)胞包含高度提純DC(iDC)。擴(kuò)增的細(xì)胞的Dllc陽性率(所有細(xì)胞中的CDllc+細(xì)胞比例)為30%以上，優(yōu)選40%以上，更優(yōu)選50%以上、60%以上、70%以上、75%以上、80%以上和85%以上。另夕卜，將iDC經(jīng)LPS和Poly (I:C)、或仙臺(tái)病毒等處理，可獲取成熟DC。 按照本發(fā)明的方法所得樹突狀細(xì)胞可望通過免疫誘導(dǎo)提高感染性疾病、癌癥及其它疾病的治療效果，作為DC疫苗用于針對性疾病的免疫治療。例如，在腫瘤免疫治療時(shí)，為使樹突狀細(xì)胞遞呈腫瘤抗原，可將樹突狀細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的cell lysate(細(xì)胞溶解物)混合后肽沖擊，或通過腫瘤抗原基因?qū)氲确椒?，使樹突狀?xì)胞遞呈抗原，用于腫瘤的DC治療。 如果將腫瘤抗原基因?qū)霕渫粻罴?xì)胞，與腫瘤提取液或肽沖擊相比，可望在體內(nèi)in vivo延長腫瘤抗原遞呈時(shí)間，還具有不依存HLA限制(使用的肽是來自抗原的某種肽，根據(jù)肽與HLA的結(jié)合關(guān)系，如果HLA的種類變化，其抗原中所用肽的部位也發(fā)生變化)等優(yōu)點(diǎn)。 樹突狀細(xì)胞的基因?qū)胼d體有質(zhì)粒導(dǎo)入的核糖體法、電穿孔法(electroporation)等(Cancer Gene Ther 1997， 4， 17-25)。較實(shí)用的載體有以下3種i)腺病毒載體(J. I匪otherapy 2002 ;25 ;445-454， Gene therapy2000 ;7 ;249-254) ;ii)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(J. Leuko. Biol. ， 1999 ;263-267. ， Br. J. Haematol. 2000 ;108 ;817-824);iii)慢病毒載體(J. Gene Med. 2001 ;3 ;311—320， J. Immunol. Meth. 2002 ;153—165， Mol.Ther. ，2002 ;283-290，CancerGene Ther即y 2002 ;9 :715-724)。載體與樹突狀細(xì)胞的接觸可在體內(nèi)in vivo或體外in vitro，例如可在培養(yǎng)液、生理鹽水、血液、血槳、血清、體液等所需的生理溶液中進(jìn)行。 使用例如慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因?qū)隒 D34陽性干細(xì)胞后，可在體外invitro獲取樹突狀細(xì)胞。此外，在猴免疫不全病毒(SIV)的輔助構(gòu)建(helper construct)中保留vpx (促進(jìn)前病毒DNA核內(nèi)轉(zhuǎn)移)，或用HIV插入DNA-f lap序列(也可促進(jìn)前病毒DNA的核內(nèi)轉(zhuǎn)移)，可使基因?qū)胪庵苎獊碓吹膯魏思?xì)胞和分化的樹突狀細(xì)胞(Mol. Ther. 2002 ;283-290)。 此外，由于腺病毒可直接高效率(約80%)基因?qū)氲椒只臉渫粻罴?xì)胞中，故可望成為樹突狀細(xì)胞基因?qū)胼d體(J. Immnotherapy 2002 ;25 ;445-454)。然而，可提高基因?qū)胄实腗0I具有降低同種異型T細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocytereaction ;MLR)的免疫抑制作用(GeneTher即y 2000 ;7 ;249-254)，所以要慎重使用高M(jìn)0I(尤其高DC : T的比例)。此外，為了稀釋細(xì)胞游離基(印isome)，與基因?qū)隒D34陽性細(xì)胞的干細(xì)胞后使其分化樹突狀細(xì)胞相比，優(yōu)選在分化進(jìn)展階段導(dǎo)入基因。
除上述病毒載體外，還可導(dǎo)入負(fù)鏈RNA病毒等RNA病毒。負(fù)鏈RNA病毒載體導(dǎo)入基因，只需短時(shí)間接觸即可獲得接近100X的導(dǎo)入效率，且同種異型T細(xì)胞應(yīng)答抑制程度較輕，可保持T細(xì)胞的剌激性(W02005/042737)。所謂負(fù)鏈RNA病毒是指以負(fù)鏈(相對于編碼病毒蛋白的有義鏈互補(bǔ)的反義鏈)RNA為基因組的病毒，也稱為(-)鏈RNA病毒。本發(fā)明所使用的負(fù)鏈RNA病毒包含副粘病毒(包含Paramyxoviridae科Respirovirus屬、Morbillivirus屬、Rubulavirus屬及Pneumovirus屬等)、彈狀病毒(包含Rhabdoviridae禾斗Vesiculovirus屬丄yssavirus屬及Ephemerovirus屬等)、纖絲病毒(Filoviridae禾斗)、正粘病毒(包含Orthomyxoviridae禾斗Infuluenza virus A，B，C，及Thogoto-like viruses等)、布尼亞病毒(包含Bunyaviridae禾斗Bunyavirus屬、Hantavirus屬、Nairovirus屬及Phlebovirus屬等)、沙粒病毒(Arenaviridae科)等科屬病毒。 本發(fā)明中的負(fù)鏈RNA病毒優(yōu)選使用副粘病毒亞科(包含呼吸道病毒屬J思腺炎病毒屬、麻疹病毒屬)屬病毒和其誘導(dǎo)體，更優(yōu)選使用包含仙臺(tái)病毒的呼吸道病毒屬(ge皿s
18Respirovirus)(也禾爾為畐ij豐占病毒屬(genusParamyxovirus))病毒禾口其i秀導(dǎo)亍本。為了不破壞病毒基因?qū)牍δ?，誘導(dǎo)體包含改變了病毒基因的病毒和化學(xué)修飾病毒等。較適用的病毒有F基因缺失型負(fù)鏈RNA病毒。各種負(fù)鏈RNA病毒的重組病毒的制備方法為已知(W097/16539 ;W097/16538 ;Durbin， A. P. et al. ，1997， Virology 235 :323—332 ;Whelan，S. P. et al. ， 1995， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :8388-8392 ;Schnell. M. J. et al. ， 1994，EMBO J. 13 :4195-4203;Radecke， F. et al. ，1995， EMBO J. 14 :5773—5784 ;Lawson， N. D. etal. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :4477-4481 ;Garcin， D. et al. ， 1995， EMBO J. 14 :6087-6094 ;Kato， A. et al. ，1996， Genes Cells 1:569-579 ;Baron， M.D. and Barrett,T.，1997， J. Virol. 71 :1265-1271 ;Bridgen， A. and Elliott, R.M. ， 1996，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 93 :15400-15404)。 非活性化狀態(tài)(未成熟狀態(tài))樹突狀細(xì)胞的負(fù)鏈RNA病毒載體的導(dǎo)入效率明顯高于成熟樹突狀細(xì)胞。所以，負(fù)鏈RNA病毒載體優(yōu)選與未成熟樹突狀細(xì)胞接觸，或與含有未成熟樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞組分混合。樹突狀細(xì)胞通過與細(xì)菌或脂多糖(LPS)、雙鏈RNA或RNA病毒等接觸產(chǎn)生活化。用此方法另行激活導(dǎo)入基因的樹突狀細(xì)胞時(shí)，可以激活后再導(dǎo)入載體，但為不降低載體的導(dǎo)入效率，優(yōu)選在載體基因?qū)牒?或載體與樹突狀細(xì)胞接觸的同時(shí))，
而不是在載體導(dǎo)入前進(jìn)行活化操作。 將用本發(fā)明方法擴(kuò)增的DC前體細(xì)胞在GM-CSF和SCF中進(jìn)行培養(yǎng)，分化成DC后，再在LPS或RNA病毒中培養(yǎng)，使DC活化。培養(yǎng)時(shí)間可適當(dāng)調(diào)整，例如2 7天。負(fù)鏈RNA病毒等RNA病毒除用于免疫賦活(腫瘤免疫等)時(shí)可使用基因?qū)胪?，RNA病毒感染本身可引起樹突狀細(xì)胞活化，所以可省去導(dǎo)入后細(xì)胞因子等的活性化操作，有利于維持細(xì)胞存活(viability)，并降低成本和減少回體ex vivo的操作時(shí)間。此外，使用RNA病毒載體基因?qū)氲臉渫粻罴?xì)胞，可容易在回體ex vivo短時(shí)高效誘導(dǎo)T細(xì)胞移植療法所需的活化T細(xì)胞，特別是腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(W02005/042737 ;W02006/001122)。
DC可與藥學(xué)上可接受的承運(yùn)體混合制成組合物。承運(yùn)體有生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水(PBS)、培養(yǎng)液、血清等可懸浮活體細(xì)胞的所需溶液。組合物可以包含樹突狀細(xì)胞遞呈的抗原肽。此外，將DC用于疫苗時(shí)，還可在疫苗組合物中加入提高免疫原性的細(xì)胞因子、霍亂毒素、沙門氏菌毒素等免疫促進(jìn)劑。疫苗中還可混合明礬、不完全Fre皿d' s佐劑、MF59 (油乳化劑)、MTP-PE (來自分枝桿菌細(xì)胞壁的muramyl trip印tide)及QS-21 (來自so即bark tree Quilaja s即onaria)等佐劑。 抗原可通過與抗原細(xì)胞提取液的混合、肽沖擊或載體編碼的抗原基因?qū)隓C，使其遞呈到DC。抗原有與感染微生物、病毒、寄生蟲、病原體及癌等有關(guān)的所需抗原，可以是結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白。該抗原(或者其加工肽)結(jié)合于樹突狀細(xì)胞表面的MHC分子，被遞呈到細(xì)胞表面，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。 作為疫苗使用時(shí)，可適用于例如腫瘤、感染性疾病及其它一般疾病。用于治療感染性疾病時(shí)，可解析例如感染性微生物的抗原蛋白表位，并將其在樹突狀細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和遞呈。病原體來源的抗原有攜帶甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、S肝炎病毒、乳頭瘤病毒抗原、單純皰疹病毒(HSV)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV) 、EB病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、HIV、瘧疾等的蛋白質(zhì)或其部分肽(G. L. Mandell et al. (Ed. )Hinman et al. ， Principlesand Practice of Infectious Diseases,3rd Ed. ， Churchill Livingstonelnc. ， NY，卯.2320-2333)?？蓪⑦f呈這些抗原的DC用于感染性疾病的預(yù)防和治療。具體來說，用于流感治療的例如有強(qiáng)毒株H5N1型包膜；用于日本腦炎治療的例如有日本腦炎病毒包膜蛋白質(zhì)(Vaccine, vol. 17， No. 15-16， 1869-1882 (1999));用于艾滋病治療的例有如HIV gag和SIV gag蛋白質(zhì)(J. Immunology (2000) vol. 164,4968-4978) 、 HIV包膜蛋白質(zhì)、Nef蛋白質(zhì)及其它病毒蛋白等；用于霍亂治療的例如有霍亂毒素的B亞單位(CTB)(Arakawa T， et al. ， Nature Biotechnology (1998) 16 (10) :934-8、 Arakawa T， etal.，Nature Biotechnology (1998) 16 (3) :292-7);用于狂犬病治療的例如有狂犬病病毒的糖蛋白(Lodmell DL et al. ，1998，Nature Medicine 4(8) :949-52);用于宮頸癌治療的例如有人類乳頭瘤病毒6型的衣殼蛋白Ll(J.Med.Virol，60，200-204(2000))等。還可使用日本腦炎的JE-E抗原蛋白質(zhì)(特開昭64-74982、特開平1-285498)、人純皰疹病毒病毒gD2蛋白質(zhì)(特開平5-252965)、丙型肝炎病毒來源的多肽(特開平5-192160)、假性狂犬病病毒來源的多肽(特表平7-502173)等。也可用來解析感染這些病原性微生物的患者的細(xì)胞，同定抗原遞呈細(xì)胞(APC)中被遞呈的抗原蛋白表位。優(yōu)選適當(dāng)選擇HLA型，同定所需HLA型表位。 為特異性促進(jìn)腫瘤的免疫應(yīng)答，可使l種以上的腫瘤抗原遞呈到樹突狀細(xì)胞。腫瘤相關(guān)抗原可通過調(diào)制例如腫瘤細(xì)胞的抽取液或純化部分抗原而得(Cohen et al.，Cancer Res. 54 :1055 (1994) ;Cohen et al.，Eur.J. Immunol. 24 :315 (1994) ;Itoh et al.，J. Immunol. 153 :1202 (1994))?？蛇M(jìn)一步提純所得腫瘤抗原，并作為重組肽進(jìn)行合成和表達(dá)。 將抗原電脈沖(暴露)到純化的樹突狀細(xì)胞，抗原一旦被DC吞噬，就會(huì)被其處理后遞呈于細(xì)胞表面(Germain, R.N. ， Cell 76 :287(1994))。用抗原電脈沖樹突狀細(xì)胞的方法很多已公開，本行業(yè)人士日常根據(jù)遞呈的抗原選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。本發(fā)明提供含有本發(fā)明方法制備的DC遞呈的抗原組合物以及用于免疫治療的使用方法。本發(fā)明的組合物可通過注射、連續(xù)點(diǎn)滴、移植的持續(xù)釋放或其它方法給藥，以剌激免疫應(yīng)答。代表性的方法有，與生理學(xué)上可接受的承運(yùn)體、賦形劑或稀釋劑混合給藥含有樹突狀細(xì)胞的組合物。承運(yùn)體有，所使用的劑量和濃度對給藥個(gè)體沒有明顯毒性的生理鹽水等。 腫瘤抗原可以是腫瘤細(xì)胞特有的(即，存在于腫瘤細(xì)胞中，不存在于非腫瘤細(xì)胞中)，也可以是比同類型的非腫瘤細(xì)胞更高水平存在于腫瘤細(xì)胞的物質(zhì)。通過給藥該樹突狀細(xì)胞，可剌激免疫系統(tǒng)。CTL作為主要免疫效應(yīng)物發(fā)揮作用時(shí)，抗原可使用在細(xì)胞內(nèi)外表達(dá)的所需腫瘤抗原。使用樹突狀細(xì)胞，誘發(fā)繼CD4T細(xì)胞活化后的B細(xì)胞活化剌激的抗體產(chǎn)生，以抗體為主要免疫效應(yīng)物發(fā)揮作用時(shí)，優(yōu)選使用表露于細(xì)胞表面的抗原，例如可使用細(xì)胞表面受體或細(xì)胞粘附蛋白。腫瘤抗原有用于卵巢癌等的Muc-l和Muc-l樣漿液性串聯(lián)重復(fù)肽(美國專利第5， 744， 144號)、誘發(fā)宮頸癌的人乳頭瘤病毒蛋白E6和E7、黑色素瘤抗原MART-1、 MAGE-1、 -2、 -3、 gp100以及酪氨激酶、前列腺癌抗原PSA，此外還有CEA(Kim， C. etal. ， Cancer Immunol. I匪nother. 47 (1998) 90-96)及Her2麗(HER2p63-71、 p780_788 ;Eur. J. Immunol. 2000 ;30 :3338-3346)等。 本發(fā)明調(diào)制的樹突狀細(xì)胞可有效用于癌癥以及感染性疾病的免疫治療。腫瘤抗原或感染性疾病相關(guān)抗原的基因所導(dǎo)入的樹突狀細(xì)胞或用該樹突狀細(xì)胞剌激的T細(xì)胞的免疫感可有效誘導(dǎo)患者的抗腫瘤和抗感染性疾病免疫。本發(fā)明還涉及本發(fā)明方法獲取的樹突
20狀細(xì)胞的免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的利用方法。該方法具體涉及在腫瘤和感染性疾病治療中的利用方 法。本發(fā)明還涉及本發(fā)明方法所得樹突狀細(xì)胞在制備免疫活性劑中的利用方法。具體涉及 在制備抗腫瘤制劑(腫瘤抑制劑)和感染性疾病治療制劑中的利用方法。
本發(fā)明調(diào)制的樹突狀細(xì)胞還可用于一般疾病的治療，例如糖尿病的治療可考慮 使用I型糖尿病患者或其模型動(dòng)物的胰島素片段肽作為表位(Coon， B. et al. ， J. Clin. Invest. ， 1999， 104(2) :189-94)。 DC組合物還可包含可溶性細(xì)胞因子受體或細(xì)胞因子或其它免疫控制分子 (Schrader， J. W. Mol. Immunol. 28 :295 (1991))。這些細(xì)胞因子可與DC組合物分開，另行調(diào) 制其它組合物，給藥時(shí)可與DC同時(shí)或分別、依次給藥。此外，如果由樹突狀細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因 子類，可剌激免疫系統(tǒng)，提高對感染性微生物和癌癥的免疫應(yīng)答，所以，導(dǎo)入了編碼細(xì)胞因 子基因的樹突狀細(xì)胞也可在癌癥及其它細(xì)胞因子治療中有效發(fā)揮作用。攜帶編碼免疫剌激 性細(xì)胞因子的基因的載體所導(dǎo)入的樹突狀細(xì)胞可成為有效免疫誘導(dǎo)劑。免疫剌激性細(xì)胞因 子包含白細(xì)胞介素(例如IL-la 、IL-1P 、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-12、 IL-15、 IL-18、 IL-19、 IL-20、 IL-21、 IL-23、 IL-27)、干擾素(例如I FN-a 、IFN_P 、 IFN-Y)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-P 、粒細(xì)胞集落因子(G-CSF)、巨噬細(xì) 胞集落剌激因子(M-CSF)、GM-CSF、IL-3和GM-CSF融合蛋白質(zhì)、胰島素樣生長因子(IGF)-I、 IGF-2、Flt-3配體、Fas配體及c-kit配體、CD40配體(CD40L)以及其它免疫調(diào)節(jié)蛋白(趨 化因子及共剌激分子等)?？蓡为?dú)或混合使用這些剌激性細(xì)胞因子。 這些細(xì)胞因子的氨基酸序列為本行業(yè)專業(yè)人員所周知，IL-4可參照Arai等 (1989) 、J. Immunol. 142 (1) 274-282文獻(xiàn)；IL-6可參照Yasukawa等(1987) 、EMB0 J. 、6(10): 2939-2945文獻(xiàn)；IL-12可參照Wolf等(1991) 、J. Immunol. 146(9) :3074-3081文獻(xiàn)；IFN-a 可參照Gren等(1984) J. InterferonRes. 4 (4) :609-617及Weismann等(1982)Princess Takamatsu Symp. 12 :1-22文獻(xiàn)；TNF可參照Pennica等(1984)Nature 312 :724-729 ;G-CSF 可參照Hirano等(1986) Nature 324 :73-76文獻(xiàn)；GM-CSF可參照Cantrell等(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)82(18) :6250-6254文獻(xiàn)。具體來說，編碼GM-CSF的核酸序列包含 Accession number NM 000758的第84 461位序歹lj (氨基酸序列為NP—000749的第18 144位)；編碼IL-4的核酸序列包含Accession皿mber NM_000589的第443 829位序列 (氨基酸序列為NP 000580的第25 153位)?？衫镁幋a這些細(xì)胞因子的天然基因或者 基因暗號的簡并，構(gòu)建包含編碼功能性細(xì)胞因子的變異基因載體，并導(dǎo)入到樹突狀細(xì)胞。
另外，可以對基因進(jìn)行修飾以表達(dá)這些細(xì)胞因子的修飾體。例如，表達(dá)具有前體及 成熟體兩種形態(tài)的細(xì)胞因子(例如，切除信號肽生成活性片段的細(xì)胞因子，或通過蛋白質(zhì) 的限定分解生成活性片段的細(xì)胞因子等)時(shí)，可對基因進(jìn)行修飾，使其表達(dá)前體或成熟體 的任何一種形態(tài)。也可利用其它修飾體(例如，細(xì)胞因子的活性片段和異種序列(如異種 信號肽)的融合蛋白)。 樹突狀細(xì)胞可用于體內(nèi)in vivo剌激患者自身的T細(xì)胞，或體外in vitro剌激T 細(xì)胞。將感作的T細(xì)胞給藥患者，可介導(dǎo)回體免疫療法剌激患者的免疫系統(tǒng)。例如，可通過 遞呈抗原的成熟樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞接觸，制備樹突狀細(xì)胞剌激的T細(xì)胞。在樹突狀細(xì)胞 中遞呈的抗原可以是由載體表達(dá)的蛋白質(zhì)(或其加工的產(chǎn)物)，也可由外部電脈沖到樹突 狀細(xì)胞。通過激活的T細(xì)胞誘導(dǎo)CTL。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明方法制備的樹突狀細(xì)胞剌激免疫系統(tǒng)的方法。例如，可 在患有感染性疾病或癌癥的患者體內(nèi)進(jìn)行剌激免疫系統(tǒng)的治療。該方法包含給藥樹突狀細(xì) 胞或T細(xì)胞的步驟。具體包含將本發(fā)明制備的DC或該DC剌激的T細(xì)胞的有效劑量給藥到 患者的步驟。將抗原肽電脈沖到樹突狀細(xì)胞，遞呈所需抗原，可誘導(dǎo)對所需抗原的免疫。在 體外進(jìn)行T細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞接觸時(shí)，優(yōu)選使用患者的T細(xì)胞，進(jìn)行回體給藥。
個(gè)體給藥DC或含有T細(xì)胞的組合物時(shí)，本行業(yè)人員可根據(jù)疾病的種類、患者的體 重、年齡、性別、癥狀、給藥目的、給藥組合物的形態(tài)、給藥方法等適當(dāng)調(diào)整給藥量。給藥途徑 可適當(dāng)選擇，優(yōu)選直接給藥到患部。 一般采取肌肉、腹腔、皮下或靜脈注射、或者直接向淋巴 結(jié)注射給藥。優(yōu)選皮下、腹腔內(nèi)注射或淋巴結(jié)直接注射給藥患者。樹突狀細(xì)胞一般可在約為 105-109細(xì)胞的范圍內(nèi)給藥，優(yōu)選106_108細(xì)胞，更優(yōu)選約107。給藥次數(shù)視臨床容許的副作 用范圍內(nèi)，采取一次給藥或反復(fù)給藥。對給藥對象沒有特別限制，例如包括雞、鵪鶉、小鼠、 大鼠、狗、豬、貓、牛、兔、綿羊、山羊、猴及人等在內(nèi)的禽類、哺乳動(dòng)物(人或非人類的哺乳動(dòng) 物)以及其它脊椎動(dòng)物。 樹突狀細(xì)胞可作為抗腫瘤藥物使用。例如，可通過將遞呈腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞 給藥到腫瘤部位，抑制腫瘤的增長。腫瘤部位是指腫瘤和其周邊(例如距腫物5mm以內(nèi)，優(yōu) 選3mm以內(nèi))范圍。給藥樹突狀細(xì)胞前，先將腫瘤抗原與樹突狀細(xì)胞接觸，可提高療效。腫 瘤抗原與樹突狀細(xì)胞的接觸可采用樹突狀細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞細(xì)胞溶解物(cell lysate)混合 的方法、腫瘤抗原肽電脈沖到樹突狀細(xì)胞的方法、或?qū)⒛[瘤抗原基因?qū)霕渫粻罴?xì)胞后表 達(dá)的方法等。此外，用攜帶IFN-P和IFN-P基因的載體導(dǎo)入DC或直接注射到腫瘤，可望 增強(qiáng)抗腫瘤效果。例如，攜帶IFN-P基因的RNA病毒載體(如負(fù)鏈RNA病毒載體)是非常 有效的抗腫瘤藥物。組合使用導(dǎo)入RNA病毒載體的樹突狀細(xì)胞給藥和直接將攜帶IFN-P 基因的載體注射到腫瘤患部給藥，更能發(fā)揮高強(qiáng)的抗癌效果。 給藥由樹突狀細(xì)胞活化后的T細(xì)胞時(shí)，可通過靜脈注射給藥，T細(xì)胞的劑量為平均 lm2體表面積約105 109細(xì)胞，優(yōu)選106 109細(xì)胞，更優(yōu)選108 109細(xì)胞(參照Ridell 等，1992、Science 257:238-241)?？筛鶕?jù)需要定期注射給藥(如每個(gè)月)。給藥注射期間 或給藥后，根據(jù)情況要觀察患者有無副作用。此時(shí)，優(yōu)選使用由同一患者自身的樹突狀細(xì)胞 活化的T細(xì)胞?；蛘邚幕颊咛崛細(xì)胞，剌激T細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞可使用來自其他健康人 的HLA配型。反之，也可通過患者體內(nèi)提取樹突狀細(xì)胞，剌激來自其他健康人HLA配型的T 細(xì)胞。 本發(fā)明制備的疫苗有效成分為樹突狀細(xì)胞，包含該樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞可作為治療 疫苗接種到人體，為確保安全，可去除該細(xì)胞的增殖性。例如，臍血單核細(xì)胞經(jīng)過分化誘導(dǎo)， 其增殖能力會(huì)極度下降，為更加安全地使用疫苗，可通過加熱處理、放射線處理或絲裂霉素 C(匪C)處理等，在不破壞疫苗治療功能的同時(shí)，使其喪失增殖能力。例如，采用X線照射時(shí)， 可用總放射量1000 3300Rad進(jìn)行照射。采用絲裂霉素C處理時(shí)，可在樹突狀細(xì)胞中加入 25 50ii g/ml的絲裂霉素C，然后在37t:中溫育30 60分鐘。采用細(xì)胞熱處理時(shí)，可在 50 65。C下加熱處理20分鐘。
實(shí)施例 以下通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。此外，
22本說明書所引用的文獻(xiàn)全部納為本說明書的一部分。 實(shí)施例1、2、4、5和實(shí)施例圖面中的FS36給藥組、GMSCF給藥組及GMIL-4給藥組 的組合成分如下。 FS36給藥組含有Flt-3配體(20ng/ml)、干細(xì)胞因子(Stem cell factor ;SCF) (lOng/ml) 、 IL-3(10ng/ml) 、 IL-6 (lOng/ml)(簡稱為FS36) 、10% FBS的RPMI 1640。
GMIL-4給藥組含有GM-CSF (20ng/ml) 、 IL-4 (20ng/ml) 、 10% FBS的RPMI 1640。
GMSCF給藥組含有GM-CSF(20ng/ml) 、 SCF(10ng/ml) 、10% FBS的RPMI 1640。
實(shí)施例3、6、7和實(shí)施例圖面中的GMIL-4給藥組(1) 、GMIL-4給藥組(2)、GMSCF給 藥組、0. 1GMSCF給藥組和0. 01GMSCF給藥組的組合成分如下。 GMIL-4給藥組(1):含有重組人GM-CSF(25ng/ml) (Wako， Japan)、重組人 IL-4(50ng/ml) (Wako， J即an) 、10% FBS的MDM。 GMIL-4給藥組(2):含有重組人GM-CSF (100ng/ml) (Wako， Japan)、重組人 IL-4(50ng/ml) (Wako， J即an) 、10% FBS的MDM。 GMSCF給藥組含有重組人GM-CSF(100ng/ml) (Wako， Japan)、重組人SCF(50ng/ ml) (Wako， J即an) 、10% FBS的MDM。 0. 1GMSCF給藥組含有重組人GM-CSF (lOng/ml) (Wako， J即an)、重組人SCF(5ng/ ml) (Wako， J即an) 、10% FBS的MDM。 0. 01GMSCF給藥組含有重組人GM-CSF (lng/ml) (Wako， J即an)、重組人 SCF(O. 5ng/ml) (Wako， J即an) 、10% FBS的MDM。 實(shí)施例6和實(shí)施例圖面中的(1) iDC處理、(2)SeV/dF處理、(3) LPS處理分別為如 下處理。 (1) iDC處理在以下濃度的培養(yǎng)基中溫育2天。
含有10XFBS的MDM (2) SeV/dF處理在以下濃度的培養(yǎng)基中溫育2天。
含有F基因缺失仙臺(tái)病毒(moi = 50) 、10% FBS的MDM
(3)LPS處理在以下濃度的培養(yǎng)基中溫育2天。
含有LPS (1 ii g/ml) 、 10% FBS的MDM
本實(shí)驗(yàn)使用以下LPS。 SIGMA商品目錄No. L7895-1MG(生物來源=Salmonella typhosa) (4)Poly(I:C)處理在以下濃度的培養(yǎng)基中溫育2天。 含有Poly(I:C) (100 ii g/ml) 、 10% FBS的MDM (5)CpG處理在以下濃度的培養(yǎng)基中溫育2天。 含有CpG(lO ii g/ml) 、10% FBS的MDM (6)R_848處理在以下濃度的培養(yǎng)基中溫育2天。 含有R-848(l ii g/ml) 、10% FBS的MDM (7)0K432處理在以下濃度的培養(yǎng)基中溫育2天。含有0K432(0. 5KE/ml)(中外制藥日本標(biāo)準(zhǔn)商品分類號874299) 、 10% FBS的IMDM〔實(shí)施例1〕細(xì)胞因子的樹突狀細(xì)胞(DC)前體細(xì)胞擴(kuò)增和分化的確認(rèn) 首先，從小鼠(C3H)股骨、脛骨骨髓進(jìn)行陰性選擇，提取造血前體細(xì)胞(SpinS印
23mouse hematopoietic progenitor enrichment kit, StemCelltechnologies， Canada)。 將該前體細(xì)胞分為FS36給藥組、GMIL-4給藥組和GMSCF給藥組共三組進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)由 2. 4X 105cellS開始，每3 4天在低于200萬細(xì)胞/ml的濃度下傳代培養(yǎng)6周。培養(yǎng)期間 調(diào)制樹突狀細(xì)胞(DC)前體細(xì)胞(圖1)，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，確認(rèn)擴(kuò)增速度，并用抗CDllb-FITC、抗 CDllc-PE、抗c-kit-PE、抗CD131-PE染色后進(jìn)行FACS解析，確認(rèn)到上述前體細(xì)胞的分化能 力(圖3)。 與其它給藥組相比，F(xiàn)S36給藥組小鼠的造血前體細(xì)胞明顯擴(kuò)增，21天擴(kuò)增到了約 10，000倍(圖1、圖2)。圖2(1)的照片對應(yīng)圖表(1)時(shí)點(diǎn)，為小鼠造血前體細(xì)胞在GMIL-4 給藥組的條件下培養(yǎng)7天所得DC細(xì)胞的形態(tài)照片(顯微鏡觀察)，實(shí)施例1、2、4、5及圖面 所示正常DC (normal DC)是指該細(xì)胞即小鼠造血前體細(xì)胞在GMIL-4給藥組的條件下培養(yǎng)7 天所得DC。正常DC (normal DC)也可確認(rèn)到樹突狀突起。圖2 (3)是在圖8的FS36給藥組 條件下培養(yǎng)四周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周所得DC的細(xì)胞形態(tài)照片(顯 微鏡觀察)，確認(rèn)到樹突狀突起。圖2中的照片(3)為曲線(ii)培養(yǎng)過程。
小鼠造血前體細(xì)胞經(jīng)FS36給藥組培養(yǎng)后，在GM-CSF及IL-4中再培養(yǎng)一周，擴(kuò)增 了具有樹突狀細(xì)胞標(biāo)記的CDllc陽性細(xì)胞分化能力的前體細(xì)胞。小鼠造血前體細(xì)胞通過 FS36培養(yǎng)，21天后擴(kuò)增到了約10， 000倍(圖1、圖2)。再將這些細(xì)胞通過GM-CSF和IL_4、 或GM-CSF及SCF分化所得DC的CDllb+CDllc+細(xì)胞數(shù)，是提取后即刻分化的約470倍。
該擴(kuò)增為6周(圖1)，分化能力從4周擴(kuò)增后逐漸下降。擴(kuò)增5周后，分化后的 CDllc陽性細(xì)胞數(shù)急劇減少。所以判明，能夠大量獲取CDllc陽性細(xì)胞數(shù)的是擴(kuò)增3周后分 化1周或擴(kuò)增4周后分化1周(圖10)。 圖4-圖9為FS36給藥組、GMIL-4給藥組、GMSCF給藥組的小鼠造血前體細(xì)胞培 養(yǎng)1周的DC前體細(xì)胞的增殖曲線和抗CDllb-FITC、抗CDllc-PE的細(xì)胞分化結(jié)果。各圖表 示了CDllb7CDllc+率(％)。培養(yǎng)方法為，每周從FS36給藥組擴(kuò)增傳代培養(yǎng)的小鼠骨髓造 血前體細(xì)胞提取106左右的細(xì)胞，將該細(xì)胞在GMIL-4給藥組或GMSCF給藥組的條件下培養(yǎng) 7天。通過抗CDllb-FITC、抗CDllc-PE的FACS解析，確認(rèn)分化后，再用CDllb+/CDllc+率確 認(rèn)細(xì)胞分化率。最高CDllb+/CDllc+率的條件是在圖7所示的FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周 后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組后再培養(yǎng)一周。此處的最高CDllb+/CDllc+率是指DC前體 細(xì)胞分化成DC的細(xì)胞比例高。圖2(3)顯示了圖7所示的在FS36給藥組條件下培養(yǎng)四周 后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周所得DC細(xì)胞形態(tài)的照片(顯微鏡觀察)，可從 中確認(rèn)到樹突狀突起。
〔實(shí)施例2〕DC分化 用moi50將F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF)感染到小鼠造血前體細(xì)胞所得DC， 或加入LPS(l ii g/ml)后再培養(yǎng)2天，使用CD80-PerCP、 CD86-PerCP、 MHC classII-PerCP、 CD40-PerCP，通過Flow cytometer分析了 DC表面標(biāo)記表達(dá)(圖11、圖12)。結(jié)果表明， 通過仙臺(tái)病毒的感染或LPS，與正常DC(normal DC)同樣(圖11 (B))，在FS36給藥組條 件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組，再培養(yǎng)一周后制備的DC中，確認(rèn)到了 co-stimuratory molecule CD80和CD86表達(dá)、MHC ClassII表達(dá)和粘付分子(CD40)表達(dá) (圖11(A))。 〔實(shí)施例3 〕通過GM-CSF和SCF擴(kuò)增DC
將人臍血CD34+細(xì)胞(購自Cambrex公司)在GMSCF給藥組和GMIL-4給藥組(1) 的條件下培養(yǎng)35天后進(jìn)行擴(kuò)增和分化。在培養(yǎng)期間內(nèi)，每3 7天用Flow cytometer分析 c-kit、CDllc、CD86表達(dá)。將1 X 105人臍血CD34+細(xì)胞在加入GM-CSF和SCF的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，CDllc+細(xì)胞逐漸擴(kuò)增，35天后獲得3. 8 X 109。培養(yǎng)第32天加入LPS, 3天后用CDllc-PE、 CD86-PE進(jìn)行了 FACS。結(jié)果表明，與上述實(shí)施例2同樣確認(rèn)到LPS可提高CD86的表達(dá)水平 (圖16)。所以，小鼠和人都可通過細(xì)胞因子的混合擴(kuò)增CDllc+細(xì)胞(圖13、14和15)。
〔實(shí)施例4〕擴(kuò)增的DC細(xì)胞因子產(chǎn)量和抗原吞噬能力以及T細(xì)胞的增殖、活化能力 的研究 關(guān)于在FS36給藥組的條件下培養(yǎng)并更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組后培養(yǎng)1周所得 DC，調(diào)查了細(xì)胞因子產(chǎn)量(圖17)和抗原吞噬能力(圖18)以及T細(xì)胞的增殖、活化能力 (圖19)。 與正常DC (normal DC)(將小鼠造血前體細(xì)胞在GMIL-4給藥組條件下培養(yǎng)7天 所得)同樣，將小鼠骨髓造血前體細(xì)胞在FS36給藥組條件下培養(yǎng)三周后，更換培養(yǎng)基為 GMIL-4給藥組再培養(yǎng)一周后所得DC也確認(rèn)到IL-12及IFN_|3的生產(chǎn)(圖17)，并具有抗 原吞噬能力(圖18)及T細(xì)胞的增殖、活化能力(圖19)。
〔實(shí)施例5〕給藥擴(kuò)增DC對小鼠骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的控制
〈調(diào)制樣品〉 在小鼠造血前體細(xì)胞的D C (1 X 105個(gè))中加入腫瘤溶解液(含有3 X 105個(gè)腫瘤 細(xì)胞)，溫育8小時(shí)。然后，將F基因缺失型仙臺(tái)病毒(SeV/dF) (moi50)導(dǎo)入該DC，再培養(yǎng) 2天。將該培養(yǎng)后的DC尾部靜脈注射到小鼠(C 3H、7周齡雌小鼠)。給藥2天后，將L M8 小鼠骨肉瘤細(xì)胞尾部靜脈給藥到小鼠。給藥17天后，開胸解剖小鼠，肉眼計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié) 數(shù)(圖20)。
〈結(jié)果> 與給藥正常D C (normal DC)(將小鼠造血前體細(xì)胞在GMIL-4給藥組條件下培養(yǎng) 7天所得)同樣，在FS36給藥組的條件下培養(yǎng)后，更換為GMIL-4給藥組和GMSCF給藥組培 養(yǎng)1周，給藥所得DC(參照圖20的(3)和(4))也確認(rèn)到了癌癥肺轉(zhuǎn)移得到控制。這表明 在FS36給藥組的條件下培養(yǎng)，更換培養(yǎng)基為GMIL-4給藥組和GMSCF給藥組，再培養(yǎng)1周所 得DC可有效用于癌癥治療?！矊?shí)施例6〕 GM-CSF和SCF的人樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞的DC擴(kuò)增(其1)
〈實(shí)驗(yàn)1> 將人臍血CD34+細(xì)胞(購自Lonza公司)和人G-CSF處理后的外周血CD34+細(xì)胞 (購自Lonza公司)在含有GM-CSF和SCF的培養(yǎng)基培養(yǎng)35天，進(jìn)行了擴(kuò)增和分化。
〈實(shí)驗(yàn)1的結(jié)果> 圖21 (A) 、 (B)結(jié)果表明，在含有GM-CSF和SCF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)臍血CD34+細(xì)胞和 人G-CSF處理后的外周血CD34+細(xì)胞，也能大量獲取細(xì)胞(圖21、圖22)。其細(xì)胞的CDllc 陽性(+)細(xì)胞比例較高(圖21(C) 、 (D)、圖22(B))。 在圖中的GMSCF給藥組中，對培養(yǎng)35天的細(xì)胞進(jìn)行上述LPS處理后，確認(rèn)到樹突 狀突起(圖23)。
〈實(shí)驗(yàn)2>
25
在實(shí)驗(yàn)1所示人臍血CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)期間內(nèi)，用Flow cytometer分析了培養(yǎng)14 天和培養(yǎng)35天的細(xì)胞中的CDllc陽性(+)細(xì)胞的CDllb、CD33、HLA-ABC表達(dá)(圖24)。成 熟樹突狀細(xì)胞呈現(xiàn)CDllc陽性(+)且CDllb陽性(+)、 CDllc陽性(+)且CD33陽性(+)、 CDllc陽性(+)且HLA-ABC陽性(+)的傾向。 此外，在人臍血CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)期間，用Flow cytometer分析了對培養(yǎng)35天細(xì) 胞進(jìn)行LPS處理或SeV/dF處理后的ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80及CCR7表達(dá)(圖25)。 與無處理(iDC處理)相比，成熟樹突狀細(xì)胞經(jīng)LPS處理或SeV/dF處理后，其ICAM-l、CD86、 HLA-DR、 CD40、 CD80及CCR7表達(dá)呈亢進(jìn)傾向(Nauta AJ. ， et al. Mesenchymal stemcells inhibit generation and function of both CD34+_derived Midmonocyte-derived dendritic cells.J Immunol 177(4)，2080-2087 (2006)) (Yoneyama， Y. ， et al. Development of imm皿ostimulatory virother即y usingnon—transmissible Sendai virus-activated dendritic cells. Biochem Biophys ResCommun 355,129-135(2007))。
〈實(shí)驗(yàn)2的結(jié)果〉 圖24結(jié)果顯示為(參照圖面箭頭)CDllc陽性(+)且CDllb陽性(+) 、 CIDllc陽 性(+)且CD33陽性(+)以及CDllc陽性(+)且HLA-ABC陽性(+)的傾向。
圖25結(jié)果顯示，與無處理(iDC處理)相比，經(jīng)LPS處理或SeV/dF處理的ICAM-l、 CD86、 HLA-DR、 CD40、 CD80及CCR7表達(dá)呈亢進(jìn)傾向。 圖24和圖25結(jié)果顯示，根據(jù)表面標(biāo)記的表達(dá)傾向，在GM-CSF和SCF的培養(yǎng)基中
培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞有可能是樹突狀細(xì)胞。
〈實(shí)驗(yàn)3> 在人臍血CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)期間內(nèi)，調(diào)查了培養(yǎng)35天的細(xì)胞的吞噬功能(吞噬作 用)(圖26)。〈實(shí)驗(yàn)3的結(jié)果> 試驗(yàn)表明，與細(xì)胞的吞噬作用能力極為低下的4t:條件相比，37t:條件下細(xì)胞的吞
噬能力呈亢進(jìn)(圖26)。 在37t:條件下，LPS處理比iDC處理后的細(xì)胞吞噬能力低。鑒于樹突狀細(xì)胞的吞噬 會(huì)g力隨成熟而降低的已知情況(Yoneyama，Y. ，et al. Development of immunostimulatory virother鄰y using non_transmissible Sendaivirus—activated dendritic cells. Biochem Biophys Res Commun 355， 129-135 (2007))，表明本實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞(在含有 GM-CSF和SCF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞)可能是樹突狀細(xì)胞。
〈實(shí)驗(yàn)4> 在人臍血CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)期間內(nèi)，調(diào)查了培養(yǎng)35天細(xì)胞的細(xì)胞因子生產(chǎn)能力。 本實(shí)驗(yàn)使用了美國碧迪公司(Becton， Dickinson and Company)的Human Inflammation Kit(商品目錄號551811)(圖27)。
〈實(shí)驗(yàn)4的結(jié)果> LPS等的剌激提高了 IL-6、TNF-a 、IL_1 P的生產(chǎn)能力。在含有GM-CSF和SCF的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞可認(rèn)為具有細(xì)胞因子的生產(chǎn)能力(圖27)。
〈實(shí)驗(yàn)5> 淋巴細(xì)胞的增殖剌激能力的研究結(jié)果(圖28)。將人臍血CD34+細(xì)胞在GMSCF培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得DC，經(jīng)絲裂霉素C(匪C)處理后，與CD3+T細(xì)胞按以下比例混合。
混合組1 匪C處理的DC數(shù)CD3+T細(xì)胞數(shù)二1 : 100
混合組2 匪C處理的DC數(shù)CD3+T細(xì)胞數(shù)二1 : 10 將上述混合細(xì)胞培養(yǎng)5天。檢測了混合組2的T細(xì)胞增殖?！磳?shí)驗(yàn)5的結(jié)果〉 與混合組1相比，混合組2的LPS等剌激效果高(圖28)。表明上述DC具有T細(xì) 胞增殖、活化能力(圖28)。 實(shí)驗(yàn)1到實(shí)驗(yàn)5的結(jié)果表明，人臍血CD34+細(xì)胞在GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)所得 細(xì)胞是成熟的樹突狀細(xì)胞。 以上結(jié)果表明，所得細(xì)胞的特征為，l.通過剌激可形成典型的樹突狀突起；2.可 表達(dá)MHC Class II分子、粘附分子和co-stimulatory分子；3.可表達(dá)炎癥性細(xì)胞因子(包 含IL-6、TNF-a 、IL-1P) ;4.具有吞噬活性和allostimulatory活性。即實(shí)驗(yàn)2到5的結(jié) 果表明，可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)1所示GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)的細(xì)胞是具有生物活性的樹突狀細(xì) 胞。由此表明，在含有GM-CSF和SCF的培養(yǎng)基中，可由樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞制備樹突狀細(xì) 胞。 〔實(shí)施例7 〕 GM-CSF和SCF的人細(xì)胞的DC擴(kuò)增(其2) 圖29顯示了 GM-CSF/SCF的濃度對DC增殖的影響。即使將GM-CSF(100ng/ml)和 SCF(50ng/ml)的濃度降至1/10 (10ng/ml GM-CSF， 5ng/ml SCF)，細(xì)胞數(shù)雖有減少，但仍維持 其較高的增殖性。GM-CSF(100ng/ml)和SCF(50ng/ml)的濃度降1/100 (lng/ml GM-CSF， 0. 5ng/ml SCF)，仍可擴(kuò)增DC。此外，35天培養(yǎng)的CDllc陽性細(xì)胞率如圖30所示。各給藥 組都顯示出較高的CDllc陽性細(xì)胞率。 圖29和圖30的數(shù)據(jù)表明，為有效擴(kuò)增DC，優(yōu)選GM-CSF濃度高于lng/ml、 SCF濃 度高于0. 5ng/ml。此外，即使在0. 01GMSCF給藥組條件下培養(yǎng)也可擴(kuò)增DC，表明用少量的 細(xì)胞因子也可高效率地?cái)U(kuò)增DC。由此，本發(fā)明的方法可望成為生產(chǎn)成本低的DC制備方法。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性 本發(fā)明使大量制備樹突狀細(xì)胞變?yōu)榭赡?。制備的DC可遞呈癌癥抗原，用于抗腫瘤 DC疫苗。利用本發(fā)明的方法，即使從患者體內(nèi)提取的DC前體細(xì)胞量少，也能夠高效率地制 備大量的DC。該制備方法所得DC具有高效抗腫瘤效果，可作為DC疫苗應(yīng)用于癌癥和感染 性疾病的免疫治療。本發(fā)明可望為癌癥的免疫療法做出重大貢獻(xiàn)。
2權(quán)利要求
一種制備樹突狀細(xì)胞的方法，其包含在多種細(xì)胞因子的存在下培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞的步驟。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多種細(xì)胞因子是粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落剌激 因子(GM-CSF)以及干細(xì)胞因子(SCF)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞是來自人的細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，所述步驟是在lng/ml以上的粒細(xì)胞/巨噬 細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF)和0.5ng/ml以上的干細(xì)胞因子(SCF)的存在下，培養(yǎng)樹突狀 細(xì)胞前體細(xì)胞的步驟。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述步驟是在10ng/ml以上的粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞 集落剌激因子(GM-CSF)和5ng/ml的干細(xì)胞因子(SCF)的存在下，培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞前體細(xì) 胞的步驟。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其中，所述步驟是在lng/ml-100ng/ml的粒細(xì)胞/巨噬細(xì) 胞集落剌激因子(GM-CSF)和O. 5-50ng/ml的干細(xì)胞因子(SCF)的存在下，培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞 前體細(xì)胞的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供DC制備方法，并提供制備的樹突狀細(xì)胞及其利用方法，該制備方法包含在多種細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)DC前體細(xì)胞的步驟。本發(fā)明的方法可大量制備具有DC高分化能力的DC前體細(xì)胞。本發(fā)明可由少量的DC前體細(xì)胞獲取大量的DC，所以，可望在DC的抗腫瘤免疫療法和感染性疾病治療中，較容易地加大DC給藥量，提高DC的疫苗效果。
文檔編號C12N5/0784GK101755045SQ20088002510
公開日2010年6月23日 申請日期2008年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日
發(fā)明者井上誠, 原田結(jié), 米滿吉和, 長谷川護(hù) 申請人:生物載體株式會(huì)社;上田泰次