專利名稱：降低基質(zhì)效應的裝置和方法
降低基質(zhì)效應的裝置和方法
本申請要求2007年5月16日提交的美國專利申請?zhí)?1/803， 824的優(yōu)先權(quán)。 發(fā)明領域 本發(fā)明總體上涉及制備分析測試用的生物分析樣品的裝置和方法。

背景技術：
生物分析測試(bioanalytical testing)和定量測定方法受到污染物的干擾，所 述污染物能降低或增加對樣品中各種分析物的靈敏度，而這種靈敏度的增加或降低與分析 物的豐度不成比例。液相色譜-質(zhì)譜法/質(zhì)譜法(LC/MS-MS)是藥物代謝研究的優(yōu)選方法； 然而，基質(zhì)效應(matrix effect)可導致明顯的分析誤差，應該研究該效應以確保精確度、 選擇性和靈敏度不受損。(Little, J丄等，(2006) J. Chro腿tog. 833,219)。具體地說，磷脂， 例如磷脂酰膽堿通過降低分析物靈敏度而干擾電噴霧MS檢測中的分析物電離，通常稱為 離子抑制或基質(zhì)效應。參見Ahnoff，M.和Hagelin，H."電噴霧電離中的基質(zhì)效應血漿磷脂 作為電離效率的阻遏劑/增強劑的表征"(Matrix Effects inElectrospray Ionization: Characterization of Plasma Phospholipids asSuppressors/Enhancers of Ionization Efficiency)，在美國質(zhì)譜學協(xié)會(American Society for Mass Spectrometry)第52屆 質(zhì)譜學大會(52ndConference on Mass Spectrometry)上作出，(2004))。各種動物種 類的不同樣品，例如血漿中脂質(zhì)組成不同可改變分析物的響應并對定量測定造成問題使 得該問題更加復雜。這些基質(zhì)效應的其它討論見以下報道Be皿ett等，報道了磷脂污 染生物分析樣品可導致校正曲線偏離和保留時間偏移"生物分析中磷脂基質(zhì)效應的控 制，，(Managing Phospholipid-Based Matrix Effectsin Bioanalysis) ，www. tandemlabs. com/capabilities publications, html (入口 2-26-07);"強保留的磷脂和鄰苯二甲 酸二辛酯的電離抑制作用是不精確度的原因"(A Source of Imprecision Resulting from Ionization Suppression fromStrongly Retained Phospholipids and Dioctyl Phthalate)，在美國質(zhì)譜學協(xié)會第52屆質(zhì)譜學大會上作出，(2004))。 此外，存在污染物可導致溶劑提取不完全，因此會低估分析物的濃度，或者其可在 分析儀器上累積、破壞靈敏度或在進行清洗流程時導致故障。污染物，例如磷脂會在沉淀血 漿樣品的反復分析期間累積在典型的反相HPLC柱上。累積的磷脂會在隨后的注射中沖下 (bleed off)，從而在多次注射期間可導致分析物靈敏度漂移。參見Bennett和Liang，"在 定量LC/MS/MS中通過選擇性提取克服生物學磷脂導致的基質(zhì)效應"(Overcoming Matrix Effects Resulting fromBiological Phospholipids Through Selective Extractions in QuantitativeLC/MS/MS)，在美國質(zhì)譜學協(xié)會第52屆質(zhì)譜學大會上作出，(2004)。除去磷脂 需用大量溶劑清洗以將柱再生至合適條件。 已嘗試了各種方法來解決這些問題。目前除去生物分析樣品中磷脂的方法包括液 液提取(LLE)和固相提取(SPE)，這些方法復雜并需要開發(fā)許多方法且分析物可能損失。例 如，在SPR中利用洗脫強度較強的溶劑會因基質(zhì)效應而反常地導致樣品檢測降低，估計是 因為磷脂污染了樣品。然而，限制溶劑的強度以避免磷脂污染樣品可導致低極性分析物的回收不完全。為除去污染物，LLE方法需要大量的工作和時間以除去污染的磷脂，例如進行 提取和分離步驟，以及干燥或冷凍樣品。例如，Bonfiglio等討論了幾種常規(guī)提取方法除去 在電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法中導致離子抑制作用的內(nèi)源性血漿樣品組分的能力。比較了利用 甲基_叔丁基醚的LLE，利用Oasis和Empore的SPE和乙腈(ACN)蛋白質(zhì)沉淀樣品制備方 法。這些研究人員發(fā)現(xiàn)ACN蛋白質(zhì)沉淀樣品顯示最大離子抑制作用，而LLE提取物顯示最低 的阻遏作用。此外，發(fā)現(xiàn)離子抑制作用是分析物依賴性的，并且與極性最強的分析物有關。 對于所有分析物，在用LLE和SPE處理的樣品中觀察到離子抑制作用最低。作者得出結(jié)論， 很可能有多種內(nèi)源性組分離子抑制作用，這些效應可維持到注射入HPLC系統(tǒng)后，從而導致 收集到無效數(shù)據(jù)。有人試圖用附加的過濾步驟來提供更干凈的樣品以供分析。(Bonfiglio， R.等，(1999) Rapid Comm. Mass. Spectr. 13， 1175)。然而，采用多個樣品制備步驟耗時耗力， 還提高了分析成本。 最近，嘗試了從樣品中除去磷脂的新方法。例如，Johanson報道了利用強陽離子交 換柱除去脂質(zhì)提取物中的陽離子性脂質(zhì)，包括磷脂酰膽堿，從而易于檢測在粗提物中被完 全掩蓋的峰。(Johanson， R. A.等，(2007)Anal. Biochem. 362， 155)。美國專利申請公布號 20050054077 (Bennett等)描述了除去生物學樣品中脂質(zhì)的裝置和方法，包括利用偶聯(lián)于 支持體的磷脂向性(phospholipotropic)多價陽離子。據(jù)報道，這種陽離子包括過渡金屬、 鑭系元素或錒系元素，優(yōu)選鈰。Van Horne等進一步描述了這些磷脂向性多價陽離子吸附 劑的應用，其描述了該吸附劑對磷脂分子上磷酸基團具有高親氧性(oxophilicity)。 (Van Horne， K. C.等，"利用新型吸附劑除去生物學樣品的磷脂來防止基團效應"(Preventing Matrix Effects By Using New Sorbents toRemove Phospholipids from Biological Samples), (2003)，見藥物禾斗學家大會美國協(xié)會簡報(Proceedings of the American Association of PharmaceuticalScientists Conference))。作者手艮道其目的是米用不會
除去所需藥物分析物的提取化學方法方便地除去生物學樣品和提取物中的磷脂。據(jù)報道， 評估了許多不同的機制，包括反相(非極性)及陰離子和陽離子交換。通過單用提取吸附
劑或與蛋白質(zhì)沉淀、液液提取(LLE)或固相提取(SPE)組合以進行磷脂提取。具體地說，據(jù) 報道，單用鑭系元素吸附劑將甲醇重建的提取物的磷脂含量降低最多94-96%。據(jù)報道，采 用鑭系元素提取吸附劑除去甲醇重建的蛋白質(zhì)沉淀樣品中的磷脂能除去約92%-98%的 磷脂并增強了出峰分析物的檢測。然而，該方法需要在離心后進行溶劑蒸發(fā)和重建，耗時耗 力且增加分析成本。據(jù)報道，甲基-叔丁基醚LLE后利用鑭系元素提取吸附劑除去樣品中 的磷脂能除去約95% _97%的磷脂，但未顯著改善出峰分析物的檢測。作者得出結(jié)論，固定 的鑭系金屬核心是通過結(jié)合磷酸基團而高度選擇性地結(jié)合磷脂提取物的實質(zhì)性元素。
Shen等試圖評估三類不同的離子交換固相提取介質(zhì)來測定該介質(zhì)除去分析物溶 液中磷脂的能力。作者報道說，混合方式相滿足保留分析物和不同代謝物的要求，而測定到 反相保留機制能去除后期洗脫磷脂所致的離子抑制作用，并建議單用離子交換機制而非混 合方式提取相。(Shen，J.X.等，(2005) J. Pharm. Biomed. Anal. 37， 359)。
Krupey的美國專利號5， 885， 921描述了可用疏水性二氧化硅吸附劑除去樣品中 脂質(zhì)，其作為在進一步純化前預處理樣品的脂質(zhì)吸附劑和澄清劑以商品名Cleanascite 出售。將吸附劑加入樣品，然后離心樣品以除去含有結(jié)合的雜質(zhì)的吸附劑。然而，該過程需 要兩步，即加入吸附劑和除去它，并且有除去樣品中分析物的危險。
Hilt皿en的美國專利號5， 759， 549描述了可采用超臨界流體提取分離脂質(zhì)混合 物中的脂質(zhì)。然而，該過程需要專門的設備并增加了除去樣品中脂質(zhì)的花費和成本。
Little等描述了"源內(nèi)多反應監(jiān)測(in source multiple reactio翻nitoring)，， 方法來監(jiān)測藥物分析的方法開發(fā)，試圖測定是否有導致感興趣分析物的離子抑制作用的 共-洗脫基質(zhì)成分。然而，這些方法不除去導致離子抑制作用的基質(zhì)成分，只是試圖避 開該問題，并且每次分析后要從柱上洗脫疏水性最強的脂質(zhì)。(Little, J丄.等，(2006) J. Chromatog. 833,219)。 因此，有許多方法可用于除去生物學樣品中的脂質(zhì)污染物，但是這些方法耗時耗 力。此外，樣品還含有污染性蛋白質(zhì)，也必須除去。然而，利用變性溶劑來實現(xiàn)沉淀會提取 出更多脂質(zhì)污染物，并且存在分析物的明顯離子抑制作用。因此，如果研究人員希望其設備 維持良好的運轉(zhuǎn)狀態(tài)并獲得可靠而精確的生物分析物定量結(jié)果，至少需要兩步來制備用于 分析的生物分析樣品。當處理小體積樣品時，或當需要多次測試時，這種多樣品制備方法可 能減少樣品從而不能維持測試所需的充足量。此外，多個樣品制備步驟造成研究時間和精 力損失，并提高分析測試實驗的成本。 因此，需要在進行分析過程之前從生物分析樣品中除去導致基質(zhì)效應的磷脂和其
它物質(zhì)以及蛋白質(zhì)的快速方法。 發(fā)明概述 因此，本發(fā)明的主要目的是提供在生物分析樣品中降低基質(zhì)效應的方法。 本發(fā)明的另一目的是提供可快速實施從而能在進行分析過程前從生物分析樣品
除去磷脂、表面活性劑和蛋白質(zhì)的方法。 本發(fā)明還有一目的是提供降低基質(zhì)效應的方法，該方法可以在樣品制備的常規(guī)流 程中實施并且無需額外步驟或昂貴設備。 因此，本發(fā)明提供了用于在蛋白質(zhì)沉淀生物分析樣品中降低基質(zhì)效應的裝置，其 包含支持體和與支持體相連并能結(jié)合生物分析樣品中存在的基質(zhì)干擾劑的吸附劑，其中 該裝置還包含除去沉淀的蛋白質(zhì)顆粒的過濾器件。過濾器件的特征是用于除去樣品中存在 的沉淀蛋白質(zhì)顆粒的孔直徑為約0. 05 m-約0. 5 m。在優(yōu)選的實施方式中，過濾器件的孔 直徑為約0. 1 ii m-約0. 2 ii m，在具體的實施方式中，過濾器件的孔直徑為0. 2_0. 45 y m。過 濾器件宜選自最大孔徑小于或等于要從樣品中除去的顆粒直徑的尺寸排阻濾器或聚合性 或無機整體(monolith)，并且可與吸附劑整合或相連。當過濾器件與吸附劑整合時，過濾器 件優(yōu)選具有大孔的多孔無機整體，該大孔的直徑足夠小從而能從樣品中排除顆粒，吸附劑 是與多孔無機整體結(jié)合的反相或極性修飾的反相。優(yōu)選的是，過濾器件能有效提供蛋白質(zhì) 沉淀生物分析樣品的光學透明度(例如，524nm的％ T > 95% )。 吸附劑的特征是在基質(zhì)干擾劑和感興趣分析物之間有足夠的選擇性，從而能保留 基質(zhì)干擾劑，同時能洗脫感興趣的分析物。較佳地，吸附劑的特征在于，對于基質(zhì)干擾劑和 感興趣分析物，它的選擇性大于l，在某些實施方式中，該選擇性至少是1. l，在其它實施方 式中，該選擇性是至少1.2，在還有其它實施方式中，該選擇性是至少1.3，在其它實施方式 中，該選擇性是至少1. 4，在某些特別優(yōu)選的實施方式中，該選擇性是至少1. 5。吸附劑優(yōu)選 包含反相或極性修飾反相，在具體的實施方式中，極性修飾反相是酰胺修飾的反相。針對基 質(zhì)干擾劑和感興趣分析物的吸附劑選擇性是當生物分析樣品包含至少50% (v/v)變性有
6機溶劑時，該吸附劑能保留基質(zhì)干擾劑而不保留感興趣分析物。優(yōu)選的是，吸附劑結(jié)合生物 分析樣品中存在的至少50%基質(zhì)干擾劑，而從裝置輸出的溶劑中回收至少75%分析物，更 優(yōu)選的是，吸附劑能回收至少90%的分析物。在優(yōu)選的實施方式中，吸附劑結(jié)合至少70%， 或更優(yōu)選至少85 % ，或更好至少90 % ，甚至更優(yōu)選至少95 % ，最優(yōu)選至少99 %的基質(zhì)干擾 劑。 典型的基質(zhì)干擾劑包括表面活性劑、脂質(zhì)、賦形劑或劑量給藥劑(dosingagent)。 所述裝置的典型實施方式適合用作多次或單次使用的呂埃注射式過濾器(luer syringe filters)、單過濾筒、多孔板、移液管吸頭或串聯(lián)柱(inlinecolumn)。在其它實施方式中，支 持體還包含用于在裝置內(nèi)進行蛋白質(zhì)沉淀的儲存器件。 本發(fā)明還提供制備包含基質(zhì)干擾劑和待分析蛋白質(zhì)的樣品的方法。典型的分析包 括色譜法、分光光度法、質(zhì)譜法等，以及它們的組合。例如，生物分析領域中測定藥物分析 物的示范性分析方法是LC/MS-MS。因此，本發(fā)明提供了在生物分析樣品中降低基質(zhì)效應并 除去其中的蛋白質(zhì)沉淀物的方法，所述方法包括a)提供包含支持體和與該支持體相連的 吸附劑的裝置，其中所述吸附劑的特征在于相比于生物分析樣品中存在的感興趣分析物， 所述吸附劑對基質(zhì)干擾劑的選擇性大于l，所述裝置還包含除去樣品中蛋白質(zhì)沉淀物的過 濾器件；b)使生物分析樣品與吸附劑接觸；和c)從吸附劑上洗脫分析物，而保留基質(zhì)干擾 劑和沉淀的蛋白質(zhì)，其中得到的處理樣品中基質(zhì)干擾劑和蛋白質(zhì)的含量降低。在某些實施 方式中，該方法還包括在生物分析樣品與吸附劑接觸的步驟之前或同時在裝置中沉淀生物 分析樣品中的蛋白質(zhì)。步驟c)最好采用真空、離心力或正壓進行，以使得樣品流過吸附劑 和過濾器件，從而除去基質(zhì)干擾劑和沉淀的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，過濾器件的特征在于孔直徑 在約0. 05 ii m-約0. 5 ii m以除去樣品中存在的沉淀蛋白質(zhì)顆粒，在某些實施方式中，過濾 器件的孔徑為約0. 1 ii m-約0. 2 ii m。在具體的實施方式中，過濾器件的孔徑為0. 1、0. 2和 0.45iim?；|(zhì)干擾劑優(yōu)選是表面活性劑、脂質(zhì)、賦形劑或劑量給藥劑，在優(yōu)選的實施方式 中，脂質(zhì)是磷脂，表面活性劑選自陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑。表面活性劑優(yōu)選 包含烴鏈從而宜用本文所述吸附劑保留。優(yōu)選地，吸附劑的特征在于在基質(zhì)干擾劑和感興 趣分析物之間具有足夠的選擇性，從而能保留基質(zhì)干擾劑，而洗脫感興趣的分析物。在某些 實施方式中，吸附劑包含反相或極性修飾的反相。某些實施方式提供了在包含基質(zhì)干擾劑 和感興趣分析物的蛋白質(zhì)沉淀生物分析樣品中降低基質(zhì)效應并除去其中的沉淀蛋白質(zhì)的 方法，該方法包括使該樣品流過本文所述的裝置。 其它實施方式提供了在包含基質(zhì)干擾劑和感興趣分析物的蛋白質(zhì)沉淀生物分析 樣品中降低基質(zhì)效應的方法，該方法包括a)提供包含支持體和與該支持體相連的吸附劑 的裝置，其中所述吸附劑的特征在于相比于生物分析樣品中存在的感興趣分析物，所述吸 附劑對基質(zhì)干擾劑的選擇性大于1 ;b)使生物分析樣品與吸附劑接觸；和c)從吸附劑上洗 脫分析物，而保留基質(zhì)干擾劑，其中得到的處理樣品中基質(zhì)干擾劑的含量降低。該裝置還可 包含過濾器件以除去沉淀的蛋白質(zhì)顆粒。在優(yōu)選的實施方式中，當生物分析樣品包含至少 50% (v/v)變性有機溶劑時，吸附劑保留基質(zhì)干擾劑，而不保留感興趣的分析物。在其它實 施方式中，吸附劑甚至在66%、75%或甚至90% (v/v)有機溶劑中，或者有pH調(diào)節(jié)物(例 如，酸、堿)存在下保留基質(zhì)干擾劑，而不保留感興趣的分析物。吸附劑優(yōu)選結(jié)合生物分析 樣品中至少50%的基質(zhì)干擾劑，同時在裝置的溶劑輸出液中回收至少90%分析物，吸附劑
7更優(yōu)選結(jié)合樣品中存在的至少70 % ，或更優(yōu)選85 % ，或更優(yōu)選90 % ，或甚至更優(yōu)選95 % ，和 最優(yōu)選99%的基質(zhì)干擾劑。 在某些實施方式中，所述裝置可以組合過濾固相提取方式(SPE)使用。例如，所述 方法還可包括任選地先用至少一種調(diào)節(jié)溶劑(conditioning solvent)或溶劑混合物來清 洗吸附劑而對吸附劑進行調(diào)節(jié)(conditioning)，再使生物分析樣品與吸附劑接觸。所述方 法還可包括任選地用清洗溶劑或溶劑混合物來清洗含吸附的分析物和基質(zhì)干擾劑的吸附 劑以除去未結(jié)合的組分。按照其它SPE應用，所述方法還可包括用溶劑強度順序增加的洗 脫溶劑從吸附劑上洗脫分析物以除去更多非極性分析物，而吸附的基質(zhì)干擾劑不會污染分 析物。 其它實施方式提供了在包含至少50% (v/v)蛋白質(zhì)變性有機溶劑的生物分析樣 品中降低基質(zhì)效應的方法，所述方法包括a)提供能結(jié)合生物分析樣品中的基質(zhì)干擾劑的 吸附劑；b)使該生物分析樣品與該吸附劑接觸至少10秒；和c)分開溶液與吸附劑，其中得 到的處理樣品中基質(zhì)干擾劑的含量降低。所述接觸優(yōu)選進行約10秒-約10分鐘，吸附劑 優(yōu)選結(jié)合該生物分析樣品中存在的至少50%基質(zhì)干擾劑，同時從裝置的溶劑輸出液中回收 至少90%分析物。該方法還包括使生物分析樣品與過濾器件接觸以除去沉淀的蛋白質(zhì)顆 粒。與過濾器件和與吸附劑的接觸優(yōu)選在同一步驟中進行。 其它實施方式提供了制備在生物分析樣品中降低基質(zhì)效應的裝置的方法，包括以 下步驟a)提供能包含一定量的吸附劑和過濾器件的支持體；和b)提供一定數(shù)量的有效保 留基質(zhì)干擾劑的吸附劑和有效除去樣品中存在的沉淀蛋白質(zhì)的過濾器件；和c)將該過濾 器件和吸附劑組裝在該支持體中。 本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點和新型特征見說明書的以下部分，本領域技術人員在研 究以下部分后可以明白，或者可以通過實施本發(fā)明來學習這些目的、優(yōu)點和新型特征。
附圖簡述

圖1說明了本發(fā)明的幾種實施方式。 圖2所示的LC-MS/MS曲線顯示在稀釋血漿的50次注射期間HPLC柱上磷脂(磷 脂酰膽堿)逐漸增加。
,，用吸附劑處理的樣品的色譜圖。 ,，用吸附劑處理過的樣品的色譜圖。 ,，用吸附劑處理過的樣品 ,，用吸附劑處理過的樣品 ,，用吸附劑處理過的樣品 ,，用吸附劑處理過的樣品 ,，用吸附劑處理過的樣品 S，用吸附劑處理過的樣f S，用吸附劑處理過的樣f S，用吸附劑處理過的樣f S，用吸附劑處理過的樣f S，用吸附劑處理過的樣f ,，用吸附劑處理過的樣品i











圖3顯示相對于未處理的樣品 圖4顯示相對于未處理的樣品 圖5顯示相對于未處理的樣品 圖6顯示相對于未處理的樣品 圖7顯示相對于未處理的樣品 圖8顯示相對于未處理的樣品 圖9顯示相對于未處理的樣品 圖10顯示相對于未處理的樣f 圖ll顯示相對于未處理的樣f 圖12顯示相對于未處理的樣f 圖13顯示相對于未處理的樣f 圖14顯示相對于未處理的樣f 圖15顯示相對于未處理的樣品，
,的色譜圖。 ,的色譜圖。 ,的色譜圖。 ,的色譜圖。 ,的色譜圖。 Pn的色譜圖, Pn的色譜圖, Pn的色譜圖, Pn的色譜圖, Pn的色譜圖, t的色譜圖,
圖16顯示相對于未處理的樣品，用吸附劑處理過的樣品的色譜圖。
圖17顯示相對于未處理的樣品，用吸附劑處理過的樣品的色譜圖。 圖18顯示反相吸附劑上分析物和基質(zhì)干擾劑的色譜圖。 圖19顯示極性修飾的反相吸附劑上分析物和基質(zhì)干擾劑的色譜圖。 圖20顯示極性修飾的反相吸附劑上分析物和基質(zhì)干擾劑的色譜圖。 圖21顯示極性修飾的反相吸附劑上分析物和基質(zhì)干擾劑的色譜圖。 圖22顯示經(jīng)各種孔徑的濾器過濾的蛋白質(zhì)沉淀樣品濁度的柱狀圖。 圖23顯示通過兩種吸附劑除去蛋白質(zhì)沉淀血漿樣品中磷脂酰膽堿的時間依賴性。 圖24顯示通過兩種吸附劑除去蛋白質(zhì)沉淀血漿樣品中吐溫80的時間依賴性。
發(fā)明詳述
I.定義和概述 在詳細描述本發(fā)明之前，應該理解，除非另有指明，本發(fā)明不限于具體的分析物、 色譜方法、過濾和純化結(jié)構(gòu)等，因為這些可以改變。還應理解，本文所用的術語只是出于描 述具體實施方式
的目的，并非要限制本發(fā)明的范圍。 必須注意，本文和權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式"一個"、"一種"和"該"包括復數(shù) 形式，除非另外明確指出。因此，例如，述及"一種分析物"包括兩種或更多種分析物；述及 "一種磷脂"包括兩種或更多種磷脂，等等。 提供數(shù)值的范圍時，應理解，在該范圍的上下端點之間的各插入值(除非文中另 有明確表述，至下端點單位的十分之一)以及所述范圍中的其它任何表述的或插入的數(shù)值 均包含在本發(fā)明之內(nèi)。在所述范圍內(nèi)專門排除端點的條件下，這些較小范圍的上下端點可 獨立包括在所述較小范圍內(nèi)，也包括在本發(fā)明內(nèi)。如果所述范圍包括一個或兩個端點，不包 括那些所包括端點中的一個或兩個的范圍也包含在本發(fā)明內(nèi)。
本文所用的術語"選擇性"指以不同保留時間洗脫的分析物的校正保留時間O;)
之間的比率。通過下式計算校正Tr:i;-T。，其中T。是未保留物質(zhì)的通過時間(transit time)。本發(fā)明所用的吸附劑在基質(zhì)干擾劑和感興趣分析物之間提供選擇性，即基質(zhì)干擾劑 的校正Tr與分析物的校正Tr之比大于1。 本文所用的術語"分析物"或"感興趣分析物"表示在生物、有機、合成、天然或無 機來源樣品中有待表征、鑒定或者定量測定的任何分子。例如，候選的治療性化合物或其代 謝物可以是分析物，并可以存在于例如血漿樣品、唾液、尿、飲用水、合成或天然產(chǎn)物的混合 物、或環(huán)境樣品中。分析物可顯示從非極性到極性的任何極性。 本文所用的術語"大孔"通常指直徑大于約0. 05 ii m的孔；在允許液體流過整體式 過濾器或吸附劑的意義上，這些孔可視作"貫穿孔(throughpore)"。術語"中孔"指直徑介 于約2nm-50nm之間的孔；術語"微孔"指直徑小于約2. Onm的孔。 術語"反相"指包含烷基或芳族部分來提供疏水表面，用于吸附非極性化合物的非 極性固定相。常見的反相固定相是用RMe2SiCl處理過的二氧化硅，其中R是直鏈烷基，例 如C18H37或C8H17。另一反相固定相由聚苯乙烯_ 二乙烯苯構(gòu)成。 術語"極性修飾的反相"指包含烷基或芳族部分來提供疏水表面，用于吸附非極 性化合物的的非極性固定相，其中該固定相業(yè)已被進一步修飾而包含(或進一步包含)極性部分，例如酰胺、醚、氨基、羧基、氨磺酰等。極性修飾反相固定相的非限制性例子見授予 Li的美國專利號7， 125，488，授予Kallury的7， 056， 858，和Shah的美國專利申請公布號 20060247361和20060247362。 本文所用的術語"強極性"表示依據(jù)辛醇-水分配系數(shù)log P，分子的Log P值 為-1. 0—0. 5。 本文所用的術語"中等極性"表示依據(jù)辛醇_水分配系數(shù)log P，分子的log P值 為0. 5-1. 5。 本文所用的術語"非極性"表示依據(jù)辛醇_水分配系數(shù)log P，分子的log P值大 于或等于2.0。 本文所用的吸附劑極性官能團包括但不限于以下-NRC (0) _ (酰胺)、-C (0) NR-(氨基甲酰基)、-0C (0) NR-(氨基甲酸酯)、-0C (0) R (烷氧基)、-NRC (0) 0-(氨基甲酸乙 酯)、-NRC (0) NR-(尿素或脲)、-NCO (異氰酸酯)、-CHOHCHOH- ( 二醇)、CH20CHCH20_ (環(huán)氧 丙氧基)、_ (CH2CH20) s-(乙氧基)、-(CH2CH2CH20) s-(丙氧基)、_C (0)-(羰基)、_C (0) 0-(羧 基)、-CH2C (0) CH2-(丙酮基)、-S-(硫代)、-SS-(聯(lián)硫基)、-CHOH-、 _0_ (醚)、-SO-(亞硫 ?；?、_S02-(磺?；?、-S03-(磺酸)、_0S03 (硫酸酯)、-S02NR-(磺酰胺)、-NRq-、(胺) 和_NRq+-，其中R不是H (季胺)、-CN (腈)、-NC (異腈)、-CHOCH-(環(huán)氧)、-NHC (NH) NH-(胍 基)、_N02 (硝基)、-NO (亞硝基)、-0P03-(磷酸酯)、-OH (羥基)，和s是1-12 。
本文所用的術語"基質(zhì)效應"指樣品中存在能干擾分析物定量的任何物質(zhì)。在常規(guī) 色譜應用中，基質(zhì)效應可表現(xiàn)在污染性基質(zhì)成分與感興趣分析物的共同洗脫，從而干擾了， 例如分光光度定量測定方法?；|(zhì)效應通常在質(zhì)譜應用中觀察到，此時觀察到分析物的離 子抑制作用。 本文所用的術語"基質(zhì)干擾劑"指生物學樣品中以高濃度存在(通常至少lmg/ml) 并導致基質(zhì)效應，即干擾分析物定量的任何物質(zhì)。對于質(zhì)譜分析，基質(zhì)干擾劑通常抑制電噴 霧電離過程中樣品中存在的特定分析物的電離。由于基質(zhì)效應，會少算和/或低估或多算 分析物的相對豐度從而偏離其在樣品中的真實豐度。 本發(fā)明涉及新型樣品制備裝置和制備及使用這些裝置的方法，例如用于LC/MS的
樣品制備的裝置、固相提取裝置，等等。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，單一裝置能在一步中提
供除去沉淀蛋白質(zhì)和基質(zhì)干擾性的雙重功能，從而具有優(yōu)秀的分析容量以及速度和性能。
雖然對于樣品制備等等，技術人員已廣泛利用了相似的裝置和方法，但就發(fā)明人目前的知
識而言，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)過濾器與吸附劑官能團的組合能除去沉淀的蛋白質(zhì)(和其它)
顆粒物和吸附基質(zhì)干擾劑，同時選擇性洗脫感興趣分析物，并首次利用這些功能產(chǎn)生具有
優(yōu)秀性能、省時、便于使用和制造的產(chǎn)物。過濾器件、吸附劑和溶劑的組合能獲得除去沉淀
蛋白質(zhì)和基質(zhì)干擾劑，特別是血漿脂質(zhì)的一步提純方法，從而不僅提高了便利性，還能得到
比以前所能得到的更干凈的分析樣品，這是出乎意料且令人吃驚的結(jié)果。 因此，本發(fā)明提供了在蛋白質(zhì)沉淀生物分析樣品中降低基質(zhì)效應的裝置，其包含
支持體和與該支持體相連的吸附劑，所述吸附劑能結(jié)合所述生物分析樣品中的基質(zhì)干擾
劑，其中所述裝置還包括除去沉淀的蛋白質(zhì)顆粒的過濾器件。本發(fā)明還提供降低基質(zhì)效應
并除去生物分析樣品中的蛋白質(zhì)沉淀物的方法，所述方法包括a)提供包含支持體和與該
支持體相連的吸附劑的裝置，其中所述吸附劑的特征在于相比于生物分析樣品中存在的感
10興趣分析物，對基質(zhì)干擾劑的選擇性大于l，還包含除去樣品中存在的蛋白質(zhì)沉淀物的過濾 器件；b)使生物分析樣品與吸附劑接觸；和c)從吸附劑上洗脫分析物，而保留基質(zhì)干擾劑 和沉淀的蛋白質(zhì)，其中得到的處理樣品中基質(zhì)干擾劑和蛋白質(zhì)的含量降低。
下文將更詳細地描述本發(fā)明的各方面和實施方式。
II.裝置 本發(fā)明裝置包含適合從蛋白質(zhì)沉淀的樣品中除去基質(zhì)干擾劑(例如，表面活性 劑、磷脂、賦形劑、劑量給藥劑)的吸附劑，以及適合于除去沉淀蛋白質(zhì)或其它不想要的固 體物質(zhì)的顆粒物過濾器件。在某些實施方式中，顆粒物過濾器功能和吸附劑組合在一個組 件中。在其它實施方式中，顆粒物過濾器是與吸附劑組件不同的組件。在某些實施方式中， 如果蛋白質(zhì)顆粒物或其它物質(zhì)不干擾儀器性能或者已用其它器件除去了 ，則不包括顆粒物 過濾器。 圖l顯示了所述裝置的幾種不同實施方式。典型的裝置包括筒(例如，串聯(lián)筒 (inline cartridge)、單濾器筒)、移液管吸頭(含或不含蛋白質(zhì)沉淀濾器)、各類多孔板、 注射器式濾器和串聯(lián)柱等等。實施例10和11描述了示范性實施方式，其證明利用本發(fā)明 的裝置可能極大改善樣品制備過程。 這些裝置可包括顆粒物多孔或無孔吸附劑、整體式吸附劑、吸附劑浸漬的網(wǎng)狀物、 纖維或濾器，或者具有合適選擇性的其它多孔介質(zhì)。吸附劑可以是聚合的或基于二氧化硅 的，下文將進一步討論。這些裝置通常包括過濾器件，例如尺寸排阻濾器或提供吸附和過濾 功能的雙重功能的吸附劑。過濾器件的配置通常不關鍵，可視需要安排以適應特定的應用。 然而，如果顆粒不存在或者已被其它器件除去，則該裝置可省略過濾器件。
A.支持體 本文所用的術語"支持體"表示多孔或非多孔水不溶性材料。支持體或支持方式可 以是許多構(gòu)造中的任一種，例如條帶、平板、碟、棒、圓筒、井、圓錐體等等。支持體或支持方 式可以是疏水性、親水性或能賦予其親水性，并且可包含無機粉末，例如二氧化硅、氧化鋯 或氧化鋁；天然聚合材料、合成或經(jīng)修飾的天然形成的聚合物，例如硝酸纖維素、醋酸纖維 素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、 聚甲基丙烯酸酯、聚(對苯二甲酸乙二酯)、尼龍、聚(丁酸乙烯酯)、聚四氟乙烯(PTFE或 Teflon )，等等；可使用這些物質(zhì)本身或組合使用，可與諸如玻璃、陶瓷、金屬等其它物
質(zhì)聯(lián)用。可用適合支持和分配液體的任何材料構(gòu)建支持體，通常是聚合物，例如聚烯烴、氟 化聚合物、聚砜、聚醚砜、醋酸纖維素、聚苯乙烯、聚苯乙烯/丙烯腈共聚物、PVDF，等等。優(yōu) 選聚烯烴材料，例如聚丙烯、聚乙烯、聚(四氟乙烯)或它們的共聚物。對于非水性液體，可 用不溶于或不會將污染物浸瀝入非水性液體中的材料構(gòu)建試管。最好用超潔凈的聚合物， 優(yōu)選聚丙烯構(gòu)建這些裝置。 支持體可以是任何尺寸或形狀以適應任何特定應用所需。例如，對于樣品預處理 應用，支持體可以是如圖1所示的單濾器筒或多孔板、呂埃注射式過濾器、移液管吸頭的形 式，等等。在一個實施方式中，支持體可以是多孔過濾或固相提取設備，例如授予Roberts 的美國專利號6，491，873所述。對于色譜串聯(lián)使用，支持體可以是多次或等次使用的串聯(lián) 柱等形式。 在某些實施方式中，支持體提供足夠的容積以在裝置(例如，包括儲器的裝置)中直接沉淀蛋白質(zhì)，從而無需在一個容器中進行沉淀，隨后將樣品轉(zhuǎn)移至除去基質(zhì)干擾劑和
沉淀蛋白質(zhì)的裝置。例如，為了能用變性有機溶劑以3 : l或4 : i比例稀釋水性生物分
析樣品來進行蛋白質(zhì)沉淀，該裝置應包括容積最多是原始樣品體積5倍的儲器。 對于固相提取應用，支持體可以是注射器筒、移液管吸頭等形式。在理論上，對尺
寸和形狀沒有限制，并且可完全由實際應用的約束條件決定裝置的尺寸。對于一些應用，例
如制備規(guī)模的應用，可利用大很多的裝置。還考慮了用于顯微制造裝置的較小的結(jié)構(gòu)。可
采用本發(fā)明制備任何相關大小范圍的零件，只需要材料和處理設備的尺寸足以操作待處理零件。 B.吸附劑 減輕生物分析樣品中基質(zhì)效應的裝置包括選擇性保留基質(zhì)干擾劑的吸附劑。所述 吸附劑優(yōu)選包含反相或極性修飾的反相。所述吸附劑能結(jié)合生物分析樣品中存在的分析物 和導致基質(zhì)效應的物質(zhì)。所述吸附劑顯示能選擇性結(jié)合分析物和基質(zhì)干擾劑，意味著在本 文所用的溶劑條件下，所述吸附劑保留基質(zhì)干擾劑而不保留分析物，甚至相對非極性的分 析物，例如泊沙康唑(log P = 5. 66)。所述吸附劑優(yōu)選結(jié)合生物分析樣品中至少50%的基 質(zhì)干擾劑，而在該裝置的溶劑流出液中回收至少75%的分析物。在更優(yōu)選的實施方式中，所 述吸附劑結(jié)合至少70 % 、或更優(yōu)選85 % 、或更優(yōu)選90 % 、或者甚至更優(yōu)選95 % 、或者最優(yōu)選 99%的基質(zhì)干擾劑。 測試樣品中導致基質(zhì)效應的典型物質(zhì)包括表面活性劑和脂質(zhì)，但是導致基質(zhì)效應 的任何物質(zhì)也都涵蓋在本發(fā)明中，只要能采用本文所述裝置和方法就能減少或除去該物 質(zhì)。 用于典型血漿樣品所需的吸附劑的用量取決于該吸附劑的結(jié)合容量。典型血漿樣 品的體積介于50 ii 1-200 yl之間，因此對于該樣品大小，20-30mg Polaris (10 y m孔徑) C18-A是合適的吸附劑用量。當吸附劑是含包埋顆粒的整體式玻璃纖維，例如加利福尼亞州 帕洛阿爾托凡利安公司(Varian， Inc. ， Palo Alto，CA)的Spec⑧碟時，4_8個碟可提供足夠 量的吸附劑。本領域技術人員不難測定具體應用的所需用量。例如，不同動物種類或喂食 不同飲食的動物的血漿中磷脂含量不同。對于樣品中存在高濃度的磷脂，為盡可能多地除 去基質(zhì)干擾性磷脂，需要較大量的吸附劑。 優(yōu)選地，所述吸附劑的特征是，在所用溶劑體系中，吸附劑對于基質(zhì)干擾劑和感興 趣分析物之間有足夠的選擇性，從而能分離該干擾劑與分析物。在一個實施方式中，所述 吸附劑顯示在磷脂酰膽堿和分析物之間的選擇性至少為1.0。取決于具體的吸附劑、溶劑 條件、基質(zhì)干擾劑和感興趣分析物，提供的選擇性至少為1. 1、更優(yōu)選1. 2、更優(yōu)選1. 3、更優(yōu) 選1. 4、或者甚至更優(yōu)選1. 5。如實施例6所述，利用極性(酰胺)修飾的反相吸附劑能最 佳保留基質(zhì)干擾劑并降低基質(zhì)效應，同時能盡可能多地回收在基質(zhì)干擾劑之前洗脫的分析 物。因此，優(yōu)選的吸附劑是酰胺修飾的反相。 利用pH修飾劑能進一步控制基質(zhì)干擾劑和感興趣分析物之間的選擇性?？赏ㄟ^ 酸化沉淀溶劑溶液來選擇性洗脫(例如，不為吸附劑所保留)非極性堿性分析物。堿的質(zhì) 子化作用提供極性更大的分子，因此被吸附劑提供的非極性固定相保留的可能性更低。類 似地，堿化含酸性分析物的溶液導致保留更少，因此增大了基質(zhì)干擾劑和感興趣的酸性分 析物之間的分離和選擇性。實施例4和表10和11進一步說明了本發(fā)明裝置和方法的這種
12操作原理。 在原則上，本領域已知的任何吸附劑可用于本文所述的裝置和方法。吸附劑可包 括聚合性吸附劑、無機吸附劑、雜合有機-無機吸附劑、鍵合相(bondedphase)和它們的組合。 在一個實施方式中，所述吸附劑包含經(jīng)修飾產(chǎn)生鍵合相的整體式或顆粒狀無機基 材，所述鍵合相具有至少一種下式所示硅烷
R、-Qa-(CH2)eSiR2yX3—Y 式中R1是氫、C「Q。。取代或未取代的烴基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；其中 所述取代基選自烴基、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、硝基、磺基和羰基；a是0或1 ; |3 是0-30 ; Y是0、1或2 ; S是0-3 ;R2是C「Q。。取代或未取代的烴基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳 基或雜芳基；其中所述取代基選自烴基、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、硝基、磺基和羰 基； Q獨立選 自_NHC(0)_、 -C(0)NH-、 -0C(0)NH-、 -NHC(0)0-、 -NHC(O) NH-、 -NCO、 -CHOHCHOH-、 CH2OCHCH20_、 _ (CH2CH20) n_、 _ (CH2CH2CH20) n_、 -C(O)-、 _C (0) 0- 、 -OC (0) - 、 CH3C (0) CH2- 、 -S- 、 -SS- 、 -CHOH- 、 -0- 、 -SO- 、 _S02- 、 _S03- 、 _0S03- 、 _S02NH_ 、 _S02N Me-、 -NH-、 -NMe-、 -NMe2+-、 _N [ (CH2) n] 2+-、 -CN、 -NC、 -CHOCH-、 -NHC (NH) NH-、 _N02 、 -NO、 _0P03-， 其中n是1-30 ;X是離去基團，如授予Li的美國專利號7， 125， 488所述。
無機基材優(yōu)選包含金屬氧化物或非金屬氧化物，例如二氧化硅、氧化鋁、沸石、莫 來石、氧化鋯、氧化釩(vanadia)或二氧化鈦，或者它們的混合物或復合物，包括能與烷氧 基硅烷、氨基硅烷、羥基硅烷或卣代硅烷反應的反應活性金屬氧化物。無機基材可采取的形 式有直徑為約0. 001mm到lOmrn，優(yōu)選0. 005到0. 04mm的珠或規(guī)則或不規(guī)則顆粒，任何尺 寸的纖維(中空的或不是中空的)、膜、厚度為，例如約0. 1mm到約10mm的平坦表面，海綿樣 材料，例如具有直徑為0. 05微米到數(shù)毫米的孔的玻璃料或整體。用硅烷修飾無機基材表面 后，硅烷通過氧連接鍵與無機基材共價相連，從而產(chǎn)生鍵合相。 在某些實施方式中，修飾的無機基材是鍵合的烷基相，例如C8或C18(其中a是 O)，其可用于反相吸附和色譜應用。在某些優(yōu)選的實施方式中，a是l，修飾的無機基材 是鍵合的極性包埋反相，適合于在至少50% (v/v)有機溶劑的溶劑條件下增強基質(zhì)干擾 劑的保留作用而不保留非極性分析物。在特別優(yōu)選的實施方式中，修飾的無機基材包含具 有極性包埋酰胺官能團的C18鍵合相，例如購自加利福尼亞州帕洛阿爾托凡利安公司的 Polaris C-18 A。在另一特別優(yōu)選的實施方式中，修飾的無機基材包含C18鍵合相，其中 保留的硅烷醇基與酰胺功能化封端試劑進一步反應，例如購自加利福尼亞州帕洛阿爾托凡 利安公司的Polaris⑧C-18酰胺。在其它實施方式中，修飾的無機基材包含C8鍵合相，或者 醚官能團，例如加利福尼亞州帕洛阿爾托凡利安公司的Polaris⑧C18-醚或Polaris⑧C8-醚。普通技術人員應知道授予Li的美國專利號7， 125， 488所述組成各異的任何鍵合相可 用于本文所述的創(chuàng)造性裝置和方法中。 在其它實施方式中，所述裝置包含授予Kallury的美國專利號7， 056， 858和 6， 926， 823所述的聚合性吸附劑。該吸附劑包含(i)適合形成至少一種偶極相互作用和疏 水性相互作用的聚合性骨架；和(ii)與骨架相連的酰胺官能團，其適合發(fā)生質(zhì)子接受和質(zhì) 子供給相互作用。酰胺官能團優(yōu)選通過共價鍵與骨架相連。本發(fā)明的聚合性吸附劑還包含與聚合性骨架相連的酰胺官能團，其適合發(fā)生一種或多種選自以下的相互作用質(zhì)子接受、 質(zhì)子供給和偶極相互作用，例如與分析物的官能團發(fā)生相互作用。代表性酰胺官能團包括 乙酰胺、N-烷基酰胺、N-芳基-酰胺和N-雜芳基酰胺。 適合形成至少一種偶極相互作用和疏水性相互作用的任何聚合物可用作該實施 方式中的聚合性骨架。聚合性骨架可包含，例如聚(苯乙烯二乙烯基苯)、苯乙烯或二乙 烯基苯與攜帶諸如鹵素、烷氧基、酷基或硝基等取代基的官能化苯乙烯或雜環(huán)的共聚物；或
例如(但不限于)聚苯乙烯-聚丙烯酰胺和聚苯乙烯-聚丙烯酸酯的共聚物。因此，可用 作吸附劑中聚合性骨架的聚合物的代表性(但不限于)清單包括但不限于聚(苯乙烯二 乙烯基苯)、包含苯乙烯或二乙烯基苯和甲基丙烯酸甲酯、鹵化的或硝化的或胺化了的或羥 基化的苯乙烯、官能化異氰脲酸酯、氨基甲酸酯、丙烯酰胺或丙烯腈和功能化雜環(huán)體系，例 如乙烯基/烯丙基吡啶的共聚物。在一個實施方式中，聚合性骨架包含聚(二乙烯基苯)。 在某些實施方式中，聚合性骨架優(yōu)選包含直徑介于約0. 001mm-約10mm、優(yōu)選約0. 005-約 0. 04mm的球形或非球形顆粒。 在其它實施方式中，聚合性吸附劑可使用聚合物修飾的多孔基材形式，例如在整 體(monolith)、燒結(jié)顆粒、或編織或無紡纖維(例如，玻璃或聚合物纖維)形式的多孔基材 上形成。優(yōu)選的是，聚合物修飾的多孔基材包含多孔基材和在其上形成的聚合性整體，其中 所述聚合性整體具有下式，其嵌段或其組合
m L !> A A
p 式中A選自任選地被_L-Qp-Rq取代的C5—1Q單環(huán)或雙環(huán)芳基或雜芳基；q是 0_3 ;p是0_5 ;Q是-NRC(0)-、 -C(0)NR-、 -0C(0)NR-、 -0C(0)R、 -NRC(0)0-、 -NRC(O) NR-、 -NCO、 -CHOHCHOH-、 CH20CHCH20_、 _(CH2CH20)s-禾P - (CH2CH2CH20) s-、 -C(O)-、 -C(O) 0-、 -CH2C (0) CH2-、 -S-、 -SS-、 -CHOH-、 _0_、 _S0_、 _S02-、 _S03-、 _0S03、 _S02NR-、 _NRq-和-NR q+-，其中R不是H、 -CN、 -NC、 -CHOCH-、 -NHC (NH) NH-、 _N02、 _N0、 _0P03-、 _0H，其中s是1-12 ; 和 R是氫、C5—1Q單環(huán)或雙環(huán)芳基或雜芳基、(V12支鏈、直鏈或環(huán)狀的烴基；
P是 I 禾口L是鍵或C卜12支鏈、直鏈或環(huán)狀烴基；并且式中[_CH2-CR-L-A-P]和[_CH2-CR-L_A]
的次序是隨機的，如Shah提交的美國專利申請
發(fā)明者D·C·瓊斯 申請人:凡利安股份有限公司