專利名稱：：堿性蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及作為配合到洗滌劑中的酶有效的堿性蛋白酶以及編碼該酶的基因。
背景技術(shù)：
：蛋白酶用于工業(yè)領(lǐng)域歷史悠久。他們用于不同的領(lǐng)域，包括例如衣料用洗滌劑的洗滌劑、織物改性劑、皮革處理劑、化妝品、浴液、食品改性劑或醫(yī)藥品。在這些用途中，洗滌劑用蛋白酶是在工業(yè)上最大量生產(chǎn)的。洗滌劑用蛋白酶的例子有Alcalase和Savinase(注冊(cè)商標(biāo)；NovozymesA/S公司)、Maxacal(注冊(cè)商標(biāo)；GenencorInternationalInc.)、BLAP(注冊(cè)商標(biāo)；HenkelKGaA)、以及KAP(花王公司)。在洗滌劑中配合蛋白酶的目的在于促進(jìn)附著于衣料上的蛋白質(zhì)類污漬分解為低分子量物質(zhì)，并用表面活性劑進(jìn)行增溶。然而，實(shí)際的污漬是復(fù)合污漬，其不僅含有蛋白質(zhì)，還含有例如有機(jī)物和無(wú)機(jī)物(例如來(lái)自皮脂的脂質(zhì)和固體顆粒)的多種成分的混合物。因此需要對(duì)這種復(fù)合污漬具有顯著去污力的洗滌劑?；谶@樣的觀點(diǎn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了數(shù)種堿性蛋白酶，這些堿性蛋白酶即使在高濃度脂肪酸存在下也可保持充分的酪蛋白的分解活性，對(duì)于不僅含有蛋白質(zhì)、還交織有皮脂等的復(fù)合污漬顯示出顯著的去污力，并且分子量約為43,000(專利文獻(xiàn)l)。這些堿性蛋白酶族在分子量、一級(jí)結(jié)構(gòu)、酶學(xué)特性、特別是顯示出極強(qiáng)的氧化劑耐性的方面，與以往公知的來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌的枯草桿菌蛋白酶為代表的絲氨酸蛋白酶不同，提議將這些堿性蛋白酶族分類到新的枯草桿菌蛋白酶亞科(非專利文獻(xiàn)O。上述堿性蛋白酶族在皮脂污漬等彼此交織的條件下具有顯著的去污力。此外，對(duì)于除了具有去污力、還具有充分的生產(chǎn)性能的堿性蛋白酶有所需求。通常酶活性以pH依賴性的方式變化，因?yàn)樵谶@種酶的活性位上具有一個(gè)氨基酸殘基，該氨基酸殘基具有一個(gè)對(duì)于表達(dá)活性必不可少的可分離的酸性基團(tuán)或可分離的堿性基團(tuán)。因此，試圖通過(guò)改變帶電氨基酸殘基來(lái)人為地改變酶活性的pH依賴性是蛋白質(zhì)工程中的一個(gè)重要目標(biāo)。例如，已報(bào)道的有取代枯草桿菌蛋白酶BPN'上的特定氨基酸殘基，通過(guò)改變酶的表面電荷，從而改變pH依賴性(非專利文獻(xiàn)24);M-蛋白酶(M-protease)是一種高耐堿蛋白酶，當(dāng)改變其表面氨基酸殘基以獲得高等電點(diǎn)以及得到離子鍵的新網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時(shí)，M-蛋白酶適應(yīng)高堿性條件(非專利文獻(xiàn)5);并且枯草桿菌蛋白酶的等電點(diǎn)和去污力之間的關(guān)系恒定(專利文獻(xiàn)2)。然而，上述任意報(bào)道均涉及來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌的絲氨酸蛋白酶，其分子量約為28,000，例如枯草桿菌蛋白酶BPN'和枯草桿菌蛋白酶309。因此，這些報(bào)道沒(méi)有提供以下有用信息具有間隙區(qū)(Gapregion)和C-末端的延伸區(qū)(Extendedregion)的絲氨酸蛋白酶，其不存在于分子量約為28,000的蛋白酶族中，其分子量約為43,000。此外，無(wú)法預(yù)測(cè)為了改善酶的去污力而改變氨基酸殘基是否會(huì)影響蛋白質(zhì)的生產(chǎn)力。因此，即使引入某些突變可以對(duì)去污力產(chǎn)生有利的改變，但是如果這樣降低了蛋白質(zhì)的生產(chǎn)力，那么實(shí)際的生產(chǎn)可能受到極大地抑制。專利文獻(xiàn)1:W099/18218專利文獻(xiàn)2:日本專利No.3343115非專禾ll文獻(xiàn)1:Saekietal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.279,pp.313-319,2000非專利文獻(xiàn)2:Nature,Vol.318,pp.375-376,1985非專利文獻(xiàn)3:J.Mol.Biol"Vol.193，pp.803-813,1987非專利文獻(xiàn)4:Nature,Vol.328,pp.496-500,1987非專利文獻(xiàn)5:ProteinEngineering,Vol.10，pp.627-634，199
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及以下發(fā)明(1)一種堿性蛋白酶，其中，序列號(hào)2(SEQIDNO:2)中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(f)245位、(g)281位、(h)313位、(i)379位和(j)427位的氨基酸殘基選自下列氨基酸殘基(a)位谷氨酰胺、(b)位谷氨酰胺、(C)位賴氨酸或精氨酸、(d)位精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺、(e)位天冬酰胺、(f)位天冬酰胺、(g)位精氨酸、(h)位天冬酰胺、(i)位賴氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、(j)位精氨酸；(2)—種堿性蛋白酶，其由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的同源性在80%以上的氨基酸序列構(gòu)成，其中，與序列號(hào)2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(g)281位和(i)379位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基選自下列氨基酸殘基(a)位谷氨酰胺、(b)位谷氨酰胺、(c)位賴氨酸或精氨酸、(d)位天冬酰胺或谷氨酰胺、(e)位天冬酰胺、(g)位:精氨酸、(i)位谷氨酸或天冬氨酸；(3)—種基因，其編碼上述堿性蛋白酶中的一種；(4)一種重組載體，其含有上述基因；以及一種轉(zhuǎn)化子，其含有所述載體；(5)—種洗漆劑組合物，其含有上述堿性蛋白酶中的一種。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及提供一種具有工業(yè)上充分的蛋白質(zhì)生產(chǎn)力和顯著的去污力的堿性蛋白酶。本發(fā)明人針對(duì)分子量約為43,000的堿性蛋白酶的性能提高進(jìn)行了多種考察。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)暴露于酶蛋白表面的氨基酸序列的特定位上的特定氨基酸殘基的存在，能夠保持或提高其在工業(yè)上充分的蛋白質(zhì)生產(chǎn)力并能改善其去污力?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明，提供一種能夠在工業(yè)上有利地生產(chǎn)并具有顯著的去污力的堿性蛋白酶。本發(fā)明的由序列號(hào)2所示的氨基酸序列所構(gòu)成的堿性蛋白酶表示蛋白酶KP43〔來(lái)自芽孢桿菌KSM-KP43(FERMBP-6532)，W099/18218，基因庫(kù)登錄號(hào)AB051423)。本發(fā)明的堿性蛋白酶的序列號(hào)2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(f)245位、(g)281位、(h)313位、(i)379位和(j)427位的氨基酸殘基選自下列氨基酸殘基(a)位谷氨酰胺、(b)位谷氨酰胺、(C)位賴氨酸或精氨酸、(d)位精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺、(e)位天冬酰胺、(f)位天冬酰胺、(g)位:精氨酸、(h)位天冬酰胺、(i)位賴氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、(j)位精氨酸；本發(fā)明的堿性蛋白酶包括野生型、野生型突變體或人工突變體。此外，本發(fā)明的堿性蛋白酶包括由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的同源性在80%以上的氨基酸序列構(gòu)成的堿性蛋白酶，其中，與序列號(hào)2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(g)281位和(0379位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基選自下列氨基酸殘基(a)位谷氨酰胺、(b)位谷氨酰胺、(C)位賴氨酸或精氨酸、(d)位天冬酰胺或谷氨酰胺、(e)位天冬酰胺、(g)位:精氨酸、(i)位谷氨酸或天冬酰胺酸；并且還可以包括野生型、野生型突變體或人工突變體。由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的同源性在80%以上的氨基酸序列構(gòu)成的堿性蛋白酶的例子包括由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的同源性在95%以上、優(yōu)選96%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選97%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選98%以上、特別優(yōu)選99%以上的氨基酸序列構(gòu)成的堿性蛋白酶。所有這些氨基酸序列都具有與序列號(hào)2所示的氨基酸序列同樣水平的功能，并且由這些氨基酸序列構(gòu)成的堿性蛋白酶與由序列號(hào)2所示的氨基酸序列構(gòu)成的堿性蛋白酶不同(也稱為"其他堿性蛋白酶")。這些其他堿性蛋白酶優(yōu)選具有下面(1)或(2)所述的特性(1)具有氧化劑耐性，并且十二垸基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)測(cè)得的分子量為43,000±2,000;(2)能在pH8以上的堿性環(huán)境下起作用，具有氧化劑耐性，在50°C、pH10的條件下處理10分鐘，殘留活性保留80%以上，受二異丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制，并且SDS-PAGE測(cè)得的分子量為43，000±2，000。如此處所使用的術(shù)語(yǔ)"具有氧化劑耐性"是指在3(TC下，靜置在含有50mM過(guò)氧化氫和5mM氯化鈣的20mM伯瑞坦-羅比森緩沖液(BrittonRobinsonbuffer)(pH10)中20分鐘后，殘留活性保持在50%以上。上述其他堿性蛋白酶的例子，包括蛋白酶KP9860〔來(lái)自芽孢桿菌KSM-KP9860(FERMBP-6534)，W099/18218，基因庫(kù)登錄號(hào)AB046403〕、蛋白酶E-1〔來(lái)自芽孢桿菌No.D-6(FERMP-1592)，特開(kāi)昭49-71191號(hào)公報(bào)，基因庫(kù)登錄號(hào)AB046402〕、蛋白酶Ya〔來(lái)自芽孢桿菌Y(FERMBP-1029)，特開(kāi)昭61-280268號(hào)公報(bào)，基因庫(kù)登錄號(hào)AB046404)、蛋白酶SD521〔來(lái)自芽孢桿菌SD521(FERMP-11162),特開(kāi)平3-191781，基因庫(kù)登錄號(hào)AB046405)、蛋白酶A-l(來(lái)自NCIB12289，WO88/01293,基因庫(kù)登錄號(hào)AB046406)、蛋白酶A-2〔來(lái)自NCIB12513，W098/56927)、蛋白酶9865〔來(lái)自芽孢桿菌KSM-9865(FERMP-18566)，基因庫(kù)登錄號(hào)AB084155〕和特開(kāi)2002-218989號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2002-306176號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2003-125783號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2004-000122號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2004-057195號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2004-305175號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2004-305176號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2006-129865號(hào)公報(bào)中所記載的突變蛋白酶。此外，不同的氨基酸序列之間的同源性根據(jù)Lipman-Pearson法(Science,Vol.227,pp.1435，(1985))計(jì)算。具體而言，通過(guò)使用由基因信息處理軟件Genetyx-Win(SoftwareDevelopmentCo.,Ltd.)開(kāi)發(fā)的同源性分析(Searchhomology)程序，并將參數(shù)UnitSizetoCompare(ktup)設(shè)置為2進(jìn)行分析。此外，至于由與上述序列號(hào)2所示的氨基酸序列的同源性在80%以上的氨基酸序列構(gòu)成的堿性蛋白酶，按照例如上述Lipman-Pearson法的公知算法，通過(guò)比較序列號(hào)2所示的氨基酸序列和其他堿性蛋白酶的氨基酸序列之間的氨基酸序列，并且，使得每個(gè)堿性蛋白酶的氨基酸序列中所存在的保守氨基酸殘基的同源性達(dá)到最大，從而能夠確定與序列號(hào)2的位(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(g)禾n(i)中的每一個(gè)對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。無(wú)論氨基酸序列中的插入和缺失，通過(guò)使用這種方法來(lái)調(diào)整蛋白酶的氨基酸序列，能夠確定每個(gè)堿性蛋白酶的氨基酸序列中的對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基的位。假定對(duì)應(yīng)的位位于三維空間的同一位置，并且位于同一位置的氨基酸殘基對(duì)目標(biāo)蛋白酶的特定功能產(chǎn)生類似的效果。具體而言，序列號(hào)2的194位的氨基酸殘基是絲氨酸殘基。通過(guò)采用上述方法，經(jīng)過(guò)氨基酸序列的調(diào)整，能夠確定對(duì)應(yīng)位的氨基酸殘基如下蛋白酶E-l中的193位為絲氨酸殘基，蛋白酶KP9860中的194位為絲氨酸殘基，以及蛋白酶Ya中的193位為絲氨酸殘基。至于上述優(yōu)選的其他堿性蛋白酶，與蛋白酶PK43(序列號(hào)2)的氨基酸序列的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(g)281位和(0379位的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的位和氨基酸殘基的具體例子在表1中顯示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>此外，只要酶特性不改變，本發(fā)明的堿性蛋白酶的(a)位(j)位等的氨基酸殘基的選擇包括從(a)位(j)位等選擇2個(gè)以上的位同時(shí)進(jìn)行取代。當(dāng)本發(fā)明的堿性蛋白酶是突變體時(shí)，突變前的堿性蛋白酶(可以稱作"親代堿性蛋白酶")對(duì)應(yīng)的是"由序列號(hào)2所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白酶"或"由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的同源性在80%以上的氨基酸序列構(gòu)成的堿性蛋白酶"。通過(guò)在該蛋白酶的目的位上引入突變，能夠得到本發(fā)明的堿性蛋白酶。例如，用其他氨基酸殘基來(lái)取代位于選自上述序列號(hào)2所示的蛋白酶KP43的氨基酸序列中的(a)位(j)位的位的氨基酸殘基，或者，取代位于選自由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的同源性在80%以上的氨基酸序列構(gòu)成的堿性蛋白酶的氨基酸序列中的上述(a)位、(b)位、(c)位、(d)位、(e)位、(g)位和(i)位的位的氨基酸殘基，從而得到本發(fā)明的堿性蛋白酶。本發(fā)明的堿性蛋白酶可以通過(guò)例如下面的方法得到。具體而言，對(duì)編碼親代堿性蛋白酶的克隆基因(序列號(hào)1)引入突變，用所得到的突變基因轉(zhuǎn)化為合適的宿主，然后培養(yǎng)前述的重組宿主，并從培養(yǎng)液中收集堿性蛋白酶。編碼親代堿性蛋白酶的基因的克隆可以通過(guò)常規(guī)的基因重組技術(shù)進(jìn)行，例如根據(jù)W099/18218和W098/56927中記載的方法進(jìn)行。為了將突變引入編碼親代堿性蛋白酶的基因，可以使用任意通常使用的定點(diǎn)突變方法。具體而言，可以使用例如Site-DirectedMutagenesisSystemMutan-SuperExpressKm試齊U盒(TakaraBioInc.)。此外，也可以使用重組PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法(PCRprotocols,AcademicPress,NewYork,1990)，用對(duì)應(yīng)于前述目的序列的其他基因的序列來(lái)取代基因的目的序列。通過(guò)使用所得到的突變基因來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白酶的方法包括，例如將所述的突變基因與可穩(wěn)定擴(kuò)增的DNA載體相連，再用載體轉(zhuǎn)化宿主菌，或?qū)⑺龅耐蛔兓驅(qū)肟杀３制浞€(wěn)定的宿主菌的染色體DNA上。上述內(nèi)容是可以采用的方法的例子。滿足上述條件的宿主包括，例如屬于芽孢桿菌、大腸桿菌、霉菌、酵母和放線菌的細(xì)菌。將這些菌株接種到含可同化碳源、氮源及其他必需營(yíng)養(yǎng)元素的培養(yǎng)基中，按照公知的方法照常培養(yǎng)。按照常規(guī)的用于一般酶的提取和純化的方法從所得到的培養(yǎng)液中收集并純化堿性蛋白酶。例如，通過(guò)分離或過(guò)濾培養(yǎng)液，在除去菌體后，再利用常規(guī)的純化方法從培養(yǎng)液的上清液中收集得到目標(biāo)酶。由上述方法所得到的酶液可以不進(jìn)行進(jìn)一步處理而使用，也可以進(jìn)一步用公知的方法進(jìn)行純化、結(jié)晶化、粉末化或顆?；１景l(fā)明的堿性蛋白酶因此具有氧化劑耐性，對(duì)酪蛋白的分解活性不受高濃度脂肪酸的抑制，SDS-PAGE測(cè)得的分子量為43，000±2，000，在堿性環(huán)境下具有活性，發(fā)揮改善的去污力，并且表現(xiàn)出在工業(yè)上的充分的生產(chǎn)力。即，在天然存在的酶的情況下，該酶具有新獲得的特性為保持90。/。以上序列號(hào)2所示的蛋白酶KP43的蛋白質(zhì)生產(chǎn)力，優(yōu)選保持95%以上，或超過(guò)蛋白酶KP43的蛋白質(zhì)生產(chǎn)力。此外，在突變體的情況下，該酶具有新獲得的特性為保持90%以上親代酶的蛋白質(zhì)生產(chǎn)力，優(yōu)選保持95%以上，更優(yōu)選獲得超過(guò)或相當(dāng)于親代堿性蛋白酶的蛋白質(zhì)生產(chǎn)力。因此，本發(fā)明的堿性蛋白酶作為配合到各種洗滌劑組合物中的酶而有效。配合到洗滌劑組合物中的本發(fā)明的蛋白酶的量，只要可以充分顯示其活性，就沒(méi)有限制。每kg洗滌劑組合物，蛋白酶的配合量為0.15000PU,從經(jīng)濟(jì)性等角度考慮優(yōu)選為500PU以下?？蓪⒈景l(fā)明的蛋白酶與各種酶一起應(yīng)用于本發(fā)明的洗滌劑組合物中。例子包括水解酶、氧化酶、還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶和合成酶。其中，優(yōu)選除本發(fā)明所使用的堿性蛋白酶以外的蛋白酶、纖維素酶、角蛋白酶、酯酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、脂肪酶、支鏈淀粉酶、果膠酶、甘露聚糖酶、葡糖苷酶、葡聚糖酶、膽固醇氧化酶、過(guò)氧化物酶、漆酶等，特別優(yōu)選蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和脂肪酶。蛋白酶的例子包括市售的Alcalase、Esperase、Savinase、Everlase和Kannase(注冊(cè)商標(biāo)；NovozymesA/S公司)、Properase禾口Purafect(注冊(cè)商標(biāo)；GenencorInternationalInc.)、以及KAP(注冊(cè)商標(biāo)；花王公司)。纖維素酶包括Cellzyme和Carezyme(注冊(cè)商標(biāo)；NovozymesA/S公司)、KAC、在特開(kāi)平10-313859號(hào)公報(bào)中記載的芽孢桿菌菌株KSM-S237所產(chǎn)生的堿性纖維素酶、特愿2002-116553號(hào)公報(bào)中記載的突變堿性纖維素酶(均為注冊(cè)商標(biāo);花王公司)等。淀粉酶包括Termamyl禾口Duramyl(注冊(cè)商標(biāo)；NovozymesA/S公司)、Purastar(注冊(cè)商標(biāo)；GenencorInternationalInc.)、以及KAM(注冊(cè)商標(biāo)；花王公司)等。脂肪酶包括Lipolase和LipolaseUltra(注冊(cè)商標(biāo)；NovozymesA/S公司)。當(dāng)將本發(fā)明所使用的蛋白酶之外的蛋白酶并用于洗滌劑組合物中時(shí)，優(yōu)選每kg洗滌劑組合物，蛋白酶的配合量為0.1500PU。當(dāng)并用纖維素酶時(shí)，基于特開(kāi)平10-313859號(hào)公報(bào)中第段中記載的測(cè)定酶活性的方法而確定的單位(KU)，優(yōu)選每kg洗滌劑組合物，纖維素酶的配合量為300~3000000KU。當(dāng)并用淀粉酶時(shí)，基于特開(kāi)平11-43690號(hào)公報(bào)第段中記載的測(cè)定淀粉酶活性的方法而確定的單位(IU)，優(yōu)選每kg洗漆劑組合物，淀粉酶的配合量為50500000IU。此外，當(dāng)并用脂肪酶時(shí)，基于特表平8-500013號(hào)公報(bào)中的實(shí)施例1中記載的測(cè)定脂肪酶活性的方法而確定的單位(LU)，優(yōu)選每kg洗滌劑組合物，脂肪酶的配合量為100001000000LU。可以向本發(fā)明的洗滌劑組合物中配合公知的洗滌劑組分，所述公知的洗滌劑組分包括如下。(1)表面活性劑表面活性劑在洗滌劑組合物中的配合量為0.560重量％特別地，對(duì)于粉末洗滌劑組合物和液體洗滌劑組合物，表面活性劑的添加量分50重量％。當(dāng)本發(fā)明的洗滌劑組合物為漂白劑或自動(dòng)洗碟機(jī)用洗漆劑時(shí)，表面活性劑的配合量通常為110重量％，優(yōu)選15重量％。本發(fā)明的洗滌劑組合物中所使用的表面活性劑的例子包括陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、兩性表面活性劑和陽(yáng)離子表面活性劑或其組合。優(yōu)選陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑。陰離子表面活性劑的例子包括具有1018個(gè)碳原子的醇硫酸鹽、具有820個(gè)碳原子的醇垸氧基化硫酸鹽、垸基苯磺酸鹽、鏈垸烴磺酸鹽、a-鏈烯烴磺酸鹽、a-磺基脂肪酸鹽、(x-磺基脂肪酸垸基酯或脂肪酸鹽。在本發(fā)明中特別優(yōu)選具有垸基鏈的直鏈垸基苯磺酸鹽，所述垸基鏈具有1014個(gè)碳原子，更優(yōu)選具有1214個(gè)碳原子。作為抗衡離子，優(yōu)選堿金屬鹽和胺、特別優(yōu)選鈉和/或鉀、單乙醇胺、二乙醇胺。非離子表面活性劑的優(yōu)選的例子包括聚氧化烯垸基(具有820個(gè)碳原子)醚、烷基聚葡糖苷、聚氧化烯垸基(具有820個(gè)碳原子)苯基醚、聚氧化烯失水山梨糖醇脂肪酸(具有822個(gè)碳原子)酉旨、聚氧化烯二醇脂肪酸(具有822個(gè)碳原子)酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物。特別優(yōu)選的非離子表面活性劑是聚氧化烯垸基醚(Griffin法計(jì)算得到的HLB值的范圍為10.515.0，優(yōu)選為11.014.5)，其中，例如環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的環(huán)氧烷烴以420摩爾的量和具有1018個(gè)碳原子的醇加成。(2)二價(jià)金屬離子捕捉劑二價(jià)金屬離子捕捉劑的配合量為0.0150重量％，優(yōu)選為540重量％。本發(fā)明的洗滌劑組合物中所用的二價(jià)金屬離子捕捉劑的例子包括縮聚磷酸鹽，例如三聚磷酸鹽、焦磷酸鹽和正磷酸鹽；鋁硅酸鹽，例如沸石；合成層狀結(jié)晶硅酸鹽；次氮基三乙酸鹽；乙二胺四乙酸鹽、檸檬酸鹽、異檸檬酸鹽、聚縮醛羧酸鹽等。其中，特別優(yōu)選結(jié)晶鋁硅酸鹽(合成沸石)，在A型、X型、P型沸石中，特別優(yōu)選A型沸石。作為合成沸石，優(yōu)選初級(jí)粒子的平均粒徑為0.110pm的合成沸石，更優(yōu)選初級(jí)粒子的平均粒徑為0.15pm的合成沸石。(3)堿劑堿劑的配合量為0.0180重量％，優(yōu)選為140重量％。用于粉末洗滌劑的堿劑的例子包括統(tǒng)稱為重質(zhì)純堿(densesodaash)和輕質(zhì)純堿(lightsodaash)的堿金屬碳酸鹽，例如碳酸鈉，以及無(wú)定形堿金屬硅酸鹽，例如JISNo.l、No,2禾卩No.3。這些無(wú)機(jī)堿劑在洗滌劑干燥時(shí)對(duì)顆粒的骨架成形起作用，因而可以提供相對(duì)硬的流動(dòng)性良好的洗滌劑。除此之外的堿劑的例子還包括倍半碳酸鈉和碳酸氫鈉。此外，磷酸鹽，例如三聚磷酸鹽也具有堿劑的活性。用于液體洗滌劑的堿劑的例子包括上述堿劑、氫氧化鈉、單乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺。它們也可以用作活化劑的抗衡離子。(4)再污染抑制劑再污染抑制劑的配合量為0.00110重量％，優(yōu)選為15重量％。用于本發(fā)明的洗滌劑組合物的再污染抑制劑的例子包括聚乙二醇、羧酸類聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。其中，羧酸類聚合物具有抑制再污染的能力、捕獲金屬離子的能力、使固體顆粒污漬從衣料分散到洗滌液中的效果。羧酸類聚合物是丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸等的均聚物或共聚物。作為共聚物，優(yōu)選由上述單體和馬來(lái)酸共聚而成，其分子量為幾千十萬(wàn)。除上述羧酸類聚合物之外，聚縮水甘油酸鹽等的聚合物、例如羥甲基纖維素的纖維素衍生物、以及例如聚天冬氨酸的氨基羧酸類聚合物由于其具有用作金屬離子捕捉劑、分散劑的能力以及具有抑制再污染的能力，因而優(yōu)選。(5)漂白劑例如過(guò)氧化氫和過(guò)碳酸鹽的漂白劑的配合量?jī)?yōu)選為110重量％。當(dāng)使用漂白劑時(shí)，可以添加0.0110重量％的漂白活化劑(活化劑)，例如四乙酰乙二胺(TAED)以及特開(kāi)平6-316700號(hào)公報(bào)中記載的漂白活化劑(活化劑)等。(6)熒光增白劑作為用于本發(fā)明的洗滌劑組合物的熒光增白劑，可以使用聯(lián)苯型熒光增白劑(例如TinopalCBS-X)和芪型熒光增白劑(例如如DM型熒光染料)。熒光增白劑的配合量?jī)?yōu)選為0.0012重量％。(7)其他組分在本發(fā)明的洗滌劑組合物中，還可以含有衣料用洗滌劑領(lǐng)域所公知的增潔劑、軟化劑、還原劑(如亞硫酸鹽)、抑泡劑(如硅酮)、香料以及其他添加劑。本發(fā)明的洗滌劑組合物可按照常規(guī)的方法通過(guò)組合使用經(jīng)上述方法獲得的本發(fā)明的蛋白酶與上述公知的洗滌劑組分而制造得到。洗滌劑的形態(tài)可根據(jù)其使用目的來(lái)選擇。例如包括液體、粉末、顆粒、糊劑和固體。由此得到的本發(fā)明的洗滌劑組合物可用作衣料洗滌劑、漂白劑、硬質(zhì)表面清潔用洗滌劑、管道洗滌劑、義齒洗滌劑、醫(yī)療器械用殺菌洗滌劑。實(shí)施例下面，結(jié)合具體例子對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1對(duì)來(lái)自芽孢桿菌KSM-KP43(序列號(hào)1)的堿性蛋白酶結(jié)構(gòu)基因的包含直到終止密碼子的大約2.0kb的區(qū)域，設(shè)計(jì)引物在成熟酶區(qū)域的(1)9位、(2)49位、(3)194位、(4)212位、(5)237位、(6)245位、(7)281位、(8)313位、(9)379位和(10)427位引入定點(diǎn)突變。使用下列引物分別進(jìn)行PCR。(1)引物l(序列號(hào)3)和引物3(序列號(hào)5)以及引物4(序列號(hào)6)和引物2(序列號(hào)4)，在9位引入谷氨酰胺；(2)引物l(序列號(hào)3)和引物5(序列號(hào)7)以及引物6(序列號(hào)8)和引物2(序列號(hào)4)，在49位引入谷氨酰胺；(3)引物l(序列號(hào)3)和引物7(序列號(hào)9)以及引物8(序列號(hào)10)和引物2(序列號(hào)4)，在194位引入賴氨酸；引物1(序列號(hào)3)和引物7(序列號(hào)9)以及引物9(序列號(hào)ll)和引物2(序列號(hào)4)，在194位引入精氨酸；(4)引物1(序列號(hào)3)和引物10(序列號(hào)12)以及引物11(序列號(hào)13)和引物2(序列號(hào)4)，在212位引入精氨酸；弓l物l(序列號(hào)3)和引物IO(序列號(hào)12)以及引物12(序列號(hào)14)和引物2(序列號(hào)4)，在212位引入天冬酰胺；引物l(序列號(hào)3)和引物IO(序列號(hào)12)以及引物13(序列號(hào)15)和引物2(序列號(hào)4)，在212位引入谷氨酰胺；(5)引物1(序列號(hào)3)和引物14(序列號(hào)16)以及引物15(序列號(hào)17)和引物2(序列號(hào)4)，在237位引入天冬酰胺；(6)引物1(序列號(hào)3)和引物14(序列號(hào)16)以及引物16(序列號(hào)18)和引物2(序列號(hào)4)，在245位引入天冬酰胺；(7)引物1(序列號(hào)3)和引物17(序列號(hào)19)以及引物18(序列號(hào)20)和引物2(序列號(hào)4)，在281位引入精氨酸；(8)引物l(序列號(hào)3)和引物19(序列號(hào)21)以及引物20(序列號(hào)22)和引物2(序列號(hào)4)，在313位引入天冬酰胺；(9)弓l物l(序列號(hào)3)和引物21(序列號(hào)23)以及引物22(序列號(hào)24)和引物2(序列號(hào)4)，在379位引入賴氨酸；引物1(序列號(hào)3)和引物21(序列號(hào)23)以及引物23(序列號(hào)25)和引物2(序列號(hào)4)，在379位引入精氨酸；弓l物l(序列號(hào)3)和引物21(序列號(hào)23)以及引物24(序列號(hào)26)和引物2(序列號(hào)4)，在379位引入天冬氨酸；引物1(序列號(hào)3)和引物21(序列號(hào)23)以及引物25(序列號(hào)27)和引物2(序列號(hào)4)，在379位引入谷氨酸；以及(10)引物l(序列號(hào)3)和引物26(序列號(hào)28)以及引物27(序列號(hào)29)和引物2(序列號(hào)4)，在427位引入精氨酸。在引物1的有意義鏈的5'端加上BamHI連接子，在引物2的反義鏈的5'端加上Xbal連接子。引物3和引物4、弓l物5和引物6、弓l物7和引物8、引物7和引物9、引物10和引物11、引物10和引物12、引物10和引物13、引物14和引物15、引物14和引物16、引物17和引物18、引物19和引物20、引物21和引物22、引物21和引物23、引物21和引物24、引物21和引物25、引物26和引物27被分別設(shè)計(jì)成在5'端具有1015-bp的序列互補(bǔ)。在PCR中，模板DNA在94'C下變性2分鐘后，使用Pyrobest(TakaraBioInc.)作為DNA聚合酶，進(jìn)行30個(gè)處理循環(huán)，每個(gè)循環(huán)是在9fC下1分鐘，在55'C下1分鐘，以及在72°。下1分鐘。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(RocheLtd.)純化擴(kuò)增的DNA片段。隨后，進(jìn)行重組PCR，其中在94'C下進(jìn)行變性2分鐘后，分別只對(duì)相應(yīng)的擴(kuò)增片段進(jìn)行30個(gè)處理循環(huán)，每個(gè)循環(huán)是在94'C下1分鐘，在55"C下1分鐘，以及在72"C下1分鐘。對(duì)于獲得的擴(kuò)增片段，采用引物1和引物4進(jìn)行PCR。在PCR中，模板DNA在94"C下變性2分鐘后，進(jìn)行30個(gè)處理循環(huán)，每個(gè)循環(huán)是在94'C下1分鐘，在55"C下1分鐘，以及在72'C下2分鐘。結(jié)果，得到引入突變的全長(zhǎng)基因。在純化擴(kuò)增片段后，用Bamffl和XbaI(RocheLtd.)裂解連接到末端的限制性內(nèi)切酶連接子。混合擴(kuò)增DNA片段和經(jīng)BamHI和Xbal處理的質(zhì)粒pHA64(日本專利No.349293，BamHI-裂解位和Xbal-裂解位包含在啟動(dòng)子64的下游區(qū)域)，然后，用LigationHigh(ToyoboCo.，Ltd.)進(jìn)行連接反應(yīng)。通過(guò)乙醇沉淀，從反應(yīng)混合物中回收質(zhì)粒，并以此轉(zhuǎn)化作為宿主菌的芽孢桿菌KSM-9865株(FERMP畫18566)。9865菌株的轉(zhuǎn)化體在含有脫脂牛奶的堿性瓊脂培養(yǎng)基(脫脂牛奶(DifcoLaboratories)1%(w/v)、細(xì)菌胰蛋白胨(bactotryptone)(DifcoLaboratories)1%、酵母提取物(DifcoLaboratories)0.5%、氯化鈉1%、瓊脂1.5%、碳酸鈉0.05%、以及四環(huán)素15ppm)中繁殖。根據(jù)暈圈形成的情況判斷是否導(dǎo)入了突變蛋白酶基因。將轉(zhuǎn)化體接種到5ml種子培養(yǎng)基中(多聚蛋白胨S(polypeptoneS)6.0%(w/v)、酵母提取物0.05%、麥芽糖1.0%、7水硫酸鎂0.02%、磷酸二氫鉀0.1%、碳酸鈉0.25%、以及四環(huán)素30ppm)后，在30。C下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。然后將種子培養(yǎng)肉湯(1%(v/v))接種到30ml的主培養(yǎng)基(多聚蛋白胨8%、酵母提取物0.3%、麥芽糖10%、7水硫酸鎂0.04%、磷酸二氫鉀0.2%、無(wú)水碳酸鈉1.5%、以及四環(huán)素30ppm)中，隨后在3(TC下振蕩培養(yǎng)3天。將所得到的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，并用蛋白分析試劑盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)測(cè)定蛋白質(zhì)的量。通過(guò)比較從帶有親代酶基因的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液的培養(yǎng)上清液獲得的測(cè)量值，其中，培養(yǎng)是在相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行的，從而評(píng)價(jià)突變蛋白酶基因的生產(chǎn)力(表2)。表3顯示了對(duì)獲得的酶液在pH10和pH10.5下的去污力評(píng)價(jià)的結(jié)果。這證明上述本發(fā)明的突變堿性蛋白酶除了改善去污力之外，還具有親代堿性蛋白酶的特性。具體而言，其具有氧化劑耐性，對(duì)酪蛋白的分解活性不受高濃度脂肪酸的抑制，SDS-PAGE測(cè)得的分子量為43,000±2,000，并且在堿性區(qū)域具有活性。測(cè)定蛋白酶活性的方法(酪蛋白法)1ml含1%(w/v)酪蛋白(Hammerstein法MerckInc.)的50mM硼酸鹽緩沖溶液(pH10.5)在3(TC下保持5分鐘后，添加O.lml的酶液引發(fā)反應(yīng)。反應(yīng)15分鐘后，加入2ml的反應(yīng)終止液(O.llM三氯乙酸/0.22醋酸鈉/0.33M醋酸)?；旌衔镌谑覝叵蚂o置30分鐘。隨后，用WhattmannNo.2號(hào)濾紙過(guò)濾沉淀物。根據(jù)Lowry等人的方法對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行定量。具體而言，向0.5ml的濾液中加入2.5ml的堿性銅溶液(羅謝爾鹽1%;5水硫酸銅1%;2。/。碳酸鈉/0.1N氫氧化鈉^:1:100)，并將該溶液在3(TC下保持10分鐘后，加入0.25ml苯酚試劑(市售的苯酚試劑(KantoChemicalCo.，Inc.)用去離子水稀釋兩倍而成的溶液)并充分?jǐn)嚢?。?(TC下靜置30分鐘后，將該溶液在660nrn下進(jìn)行吸光度測(cè)定。蛋白酶的一個(gè)單位(1PU)被定義為，在上述反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)生成相當(dāng)于1mmol酪氨酸的酸溶蛋白質(zhì)所需的酶量。相對(duì)去污率使用Terg-O-Tometer(UeshimaSeisakushoCo.,Ltd,)評(píng)價(jià)突變酶的去污力。制備市售的衣料用洗滌劑的溶液，使其達(dá)到規(guī)定的使用濃度，并根據(jù)需要加入10%(w/v)的硫酸或10N氫氧化鈉以調(diào)整pH。添加酶至最終濃度為40mPU/1。除非另有說(shuō)明，將切成6x6cm的試驗(yàn)布EMPA117(EMPATestmaterialen，血液/牛奶/碳黑)投入其中，并在20'C下以80rpm進(jìn)行洗滌。用自來(lái)水漂洗后，用色度計(jì)(KonicaMinoltaHoldings,Inc.，CM3500d)測(cè)定亮度?；谙礈烨昂蟮牧炼茸兓瘉?lái)計(jì)算去污率(以下公式)。去污率(%)=(L2-L。/(Lo-L》xl00LQ:試驗(yàn)布的原始布的亮度L1:洗滌前試驗(yàn)布的亮度L2:洗滌后試驗(yàn)布的亮度相對(duì)去污率根據(jù)以下公式計(jì)算得到。相對(duì)去污率(％)=(突變酶的去污率一沒(méi)有酶的洗滌液的去污率)/(親代酶的去污率一沒(méi)有酶的洗滌液的去污率)xlOO表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權(quán)利要求1.一種堿性蛋白酶，其特征在于，序列號(hào)2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(f)245位、(g)281位、(h)313位、(i)379位和(j)427位的氨基酸殘基選自下列氨基酸殘基(a)位谷氨酰胺、(b)位谷氨酰胺、(c)位賴氨酸或精氨酸、(d)位精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺、(e)位天冬酰胺、(f)位天冬酰胺、(g)位精氨酸、(h)位天冬酰胺、(i)位賴氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、(j)位精氨酸。2.—種堿性蛋白酶，其特征在于，由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的同源性在80%以上的氨基酸序列構(gòu)成，其中，與序列號(hào)2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(g)281位和(i)379位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基選自下列氨基酸殘基(a)位谷氨酰胺、(b)位谷氨酰胺、(c)位賴氨酸或精氨酸、(d)位天冬酰胺或谷氨酰胺、(e)位天冬酰胺、(g)位:精氨酸、(0位谷氨酸或天冬氨酸。3.—種基因，其特征在于，編碼如權(quán)利要求1或2所述的堿性蛋白酶。4.一種重組載體，其特征在于，含有如權(quán)利要求3所述的基因。5.—種轉(zhuǎn)化子，其特征在于，含有如權(quán)利要求4所述的載體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，宿主是微生物。7.—種洗滌劑組合物，其特征在于，含有如權(quán)利要求1或2所述的堿性蛋白酶。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供一種具有工業(yè)上充分的蛋白質(zhì)生產(chǎn)力和顯著的去污力的堿性蛋白酶。在所述堿性蛋白酶中，其序列號(hào)2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(f)245位、(g)281位、(h)313位、(i)379位和(j)427位的氨基酸殘基選自下列氨基酸殘基(a)位谷氨酰胺、(b)位谷氨酰胺、(c)位賴氨酸或精氨酸、(d)位精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺、(e)位天冬酰胺、(f)位天冬酰胺、(g)位精氨酸、(h)位天冬酰胺、(i)位賴氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、(j)位精氨酸。文檔編號(hào)C12N9/54GK101627119SQ20088000723公開(kāi)日2010年1月13日申請(qǐng)日期2008年3月6日優(yōu)先權(quán)日2007年3月6日發(fā)明者奧田光美申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社