專利名稱：：一種具有較高免疫原性的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有較高免疫原性的融合蛋白及其應(yīng)用。技術(shù)背景表位肽研究已經(jīng)在疫苗學(xué)領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。但其免疫原性低，免疫效果差也是亟待解決的問(wèn)題。使用適當(dāng)?shù)淖魟┦亲钣行У慕鉀Q辦法。對(duì)于蛋白類佐劑效應(yīng)分子來(lái)說(shuō)，一種解決方法就是構(gòu)建表位肽-佐劑分子的融合蛋白。JaraesWH將TLR(Toll樣受體)5配體鞭毛蛋白基因(STF2)融合于0VA蛋白基因5'端在大腸桿菌中表達(dá)為STF2-0VA融合蛋白，這種新型蛋白使OVA蛋白的免疫原性得到明顯增強(qiáng)。活化相關(guān)的分泌蛋白-UASP-l)是一種來(lái)源于盤尾絲蟲(chóng)(Onchocercavolvulus)的蛋白。來(lái)自禽流感病毒H5N1的膜蛋白M2的外膜區(qū)M2e，由24個(gè)氨基酸組成，其免疫原性非常低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有較高免疫原性的融合蛋白。本發(fā)明所提供的融合蛋白，名稱為S1-M2e3，是在S1的氨基末端或羧基末端融合抗原表位肽得到的蛋白質(zhì)；所述S1是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列l(wèi)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；所述抗原表位肽(名稱為M2e3)是如下(c)或(d)的蛋白質(zhì)(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(c)衍生的蛋白質(zhì)e所述融合蛋白具體可為如下(1)或(2)的蛋白質(zhì)(1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且免疫原性高于所述抗原表位肽的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)和(1)中的蛋白便于純化，可在其N末端或C末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)和(2)中的Sl的編碼基因可通過(guò)將(a)和(I)中的蛋白編碼基因的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為了便于蛋白的分泌表達(dá)，還可在所述蛋白的氨基末端添加上信號(hào)肽序列。上述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述S1的編碼基因，具體可為如下3)或4)的基因3)其編碼序列是序列表中的序列4;4)在嚴(yán)格條件下可與3)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子。所述抗原表位肽(名稱為M2e3)的編碼基因，具體可為如下5)或6)的基因5)其編碼序列是序列表中的序列5。6)在嚴(yán)格條件下可與5)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子。所述融合蛋白的編碼基因，具體可為如下7)或8)的基因7)其編碼序列是序列表中的序列6。8)在嚴(yán)格條件下可與7)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子。含有上述任一種融合蛋白的編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體具體可為在PQE30的多克隆位點(diǎn)間插入上述任一種融合蛋白的編碼基因得到的pQE30-Sl-M2e3。所述重組菌具體可為將所述pQE30-S1-M2e3轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15得到的重組大腸桿菌。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)所述S1-M2e3的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)所述S1-M2e3的方法，是將含有所述S1-M2e3編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到所述蛋白。所述重組表達(dá)載體具體可為上述pQE30-Sl-M2e3，所述宿主細(xì)胞具體可為將所述pQE30-S1-M2e3轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15得到的重組大腸桿菌細(xì)胞。本發(fā)明還優(yōu)化了Sl-M2e3的純化方法。本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)的方法構(gòu)建了N端融合串聯(lián)有3個(gè)M2e肽的融合蛋白Sl-M2e3。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，S1-M2e3能有效地刺激針對(duì)M2e的特異性免疫應(yīng)答，僅加強(qiáng)免疫一次，IgGl/IgG2aGMT值就可達(dá)到1:100，000/1:4525。所以S1-M2e3可作為禽流感疫苗的活性成分，在禽流感的預(yù)防和治療中將發(fā)揮重要作用。圖1為pQE30-Sl的酶切鑒定圖譜圖2為pQE30空載體對(duì)照的SDS-PAGE鑒定3為Sl-M2e3的SDS-PAGE鑒定4為純化Sl-M2e3蛋白Ni-FF吸附洗脫與復(fù)性圖1.Marker2.過(guò)柱純化前原液3.lOraM咪唑緩沖液洗脫4.20mM咪唑緩沖液洗脫5.50mM咪唑緩沖液洗脫6.lOOmM咪唑緩沖液洗脫7.200mM咪唑緩沖液洗脫8.復(fù)性后圖5為加強(qiáng)免疫后第8天，各組免疫血清中抗M2e特異性IgGl產(chǎn)生情況圖6為加強(qiáng)免疫后第8天，各組免疫血清中抗M2e特異性IgG2a產(chǎn)生情況具體實(shí)施方式實(shí)施例1、融合蛋白Sl-M2e3的表達(dá)及鑒定一、融合蛋白Sl-M2e3的表達(dá)載體pQE30-Sl-M2e3的構(gòu)建1、Sl表達(dá)載體pQE30-Sl的構(gòu)建根據(jù)大腸桿菌的偏愛(ài)密碼子，人工合成序列表中序列4所示的Sl(其氨基酸序列是序列表中的序列l(wèi))的編碼基因(序列4的自5'末端第17-610位(共594個(gè)核苷酸)為Sl的編碼序列，序列1的自5'末端第11-16位為^s忍M的識(shí)別位點(diǎn)，序列1的自5'末端第611-616位為的識(shí)別位點(diǎn)。以jfeyzM和沿VMin雙酶切Sl的編碼基因，與經(jīng)相同酶切的pQE30(QIAGEN)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue(Stratagene公司)感受態(tài)細(xì)胞，挑選氨芐青霉素抗性克隆，經(jīng)菌落PCR及提取質(zhì)粒雙酶切(5孤別和歷v^ni)鑒定，將鑒定正確的該重組質(zhì)粒命名為pQE30-Sl。pQE30-Sl的酶切鑒定圖譜如圖1所示，得到3.4kb的載體帶和594bp的Sl條帶(箭頭示)。圖1中，1為pQE30-Sl，2為DLMarker2，000。2、pQE30-SI-M2e3的構(gòu)建人工合成序列表中序列5所示的M2e3(其氨基酸序列是序列表中的序列2)的編碼基因(序列5的自5'末端第15-275位(共261個(gè)核苷酸)為M2e3的編碼序列，序列5的自5'末端第9-14位為限制性內(nèi)切酶Bgin的識(shí)別位點(diǎn)，序列5的自5'末端第270-275位為限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。以BglII和BamHI雙酶切M2e3的編碼基因，回收261bp片段與BamHI單酶切的pQE30-Sl載體連接，轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和序列測(cè)定，將含有核苷酸序列是序列表中的序列6的S1-M2e3基因的重組質(zhì)粒命名為pQE30-Sl-M2e3。該S1-M2e3基因編碼氨基酸序列是序列表中的序列3的融合蛋白S1-M2e3。3、融合蛋白S1-M2e3在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和純化及復(fù)性。1)S1-M2e3的誘導(dǎo)表達(dá)將pQE30-S1-M2e3轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15(QIAGEN公司)，得到重組大腸桿菌pQE30-S1-M2e3/M15。將pQE30(空質(zhì)粒)轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15得到重組大腸桿菌pQE30/M15，作為陰性對(duì)照組。從陽(yáng)性重組質(zhì)粒表達(dá)菌(pQE30-S1-M2e3/M15)及陰性對(duì)照菌(pQE30/M15)挑取若干轉(zhuǎn)化子分別接種3mlLB培養(yǎng)基中(含100)ig/ml氨芐青霉素及50嗎/ml卡那霉素)，37"振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，將菌液以l:IOO的體積比轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，37'C震蕩培養(yǎng)3h，至OD咖在0.5-1.0之間。加入終濃度為lmM的IPTG,在37r誘導(dǎo)5小時(shí)取樣；同時(shí)設(shè)置未用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照。同時(shí)收集菌體，以超聲緩沖液懸浮后超聲破碎，以8M尿素溶解包涵體，對(duì)超聲上清及包涵體分別取樣，SDS-PAGE鑒定。2)S1-M2e3表達(dá)的SDS-PAGE鑒定取pQE30-SI-M2e3/M15的誘導(dǎo)表達(dá)菌液及未誘導(dǎo)表達(dá)菌液各1.5ml，pQE30/M15的誘導(dǎo)表達(dá)菌液及未誘導(dǎo)表達(dá)菌液各1.5ml。分別移入1.5mlEP管，12000rpm，離心lmin，棄上清，用生理鹽水洗滌后，加入IOO1XSDS上樣緩沖液，混勻，100°C煮沸IOmin，自然冷卻后，12000rpm，離心lmin，取10jil上清(約40嗎)上樣于凝膠加樣孔內(nèi)。分離膠濃度為12%，積層膠濃度為5%。按積層膠100mA及分離膠150mA的條件進(jìn)行電泳，溴酚藍(lán)移動(dòng)至膠底部終止電泳。電泳完畢后，考馬斯亮藍(lán)染色觀察。結(jié)果如圖2和圖3所示，圖2中，l泳道為pQE30/M15誘導(dǎo)表達(dá)組；2泳道為pQE30/M15未誘導(dǎo)組；3泳道為蛋白Marker。圖3中，l泳道為pQE30-S卜M2e3/M15誘導(dǎo)表達(dá)組;2泳道為pQE30-S1-M2e3/M15未誘導(dǎo)組；3泳道為蛋白Marker。表明pQE30-S1-M2e3/M15表達(dá)得到了大小為31kDa的S1-M2e3，而pQE30/M15不表達(dá)大小為31kDa的S1-M2e3。3)Sl-M2e3表達(dá)形式的鑒定A、細(xì)菌包涵體的分離和洗滌將pQE30-Sl-M2e3/M15誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于4'C以5000g離心15min后，收集菌體，將菌體用含30%蔗糖、50raraol/LTris-HC1、lmmol/LEDTApH8.0的溶液重懸，冰浴30min。然后于4。C5000rpm離心10min，沉淀用含IOOmmol/LTris-HC1、2mm。l/LEDTAp朋.0的超聲緩沖液重懸，超聲破碎儀冰浴破碎(功率100W，超聲時(shí)間8s，間歇10s，總程10rain)，4°C12000rpm離心10min，獲得超聲上清液和粗制包涵體沉淀。將分離得到的包涵體依次用包涵體洗液I(TritonX-1000.5%，EDTA10咖ol/L)，II(TritonX-10010%，EDTA10mmol/L)，III(EDTA10mmol/L，尿素2M)分別重懸，4'C12000rpm離心20min，最后剩下的沉淀進(jìn)一步進(jìn)行變性處理。將超聲上清液進(jìn)行電泳鑒定，電泳結(jié)果如圖3中4泳道所示，表明S1-M2e3不是可溶性表達(dá)，不存在于菌體超聲上清中。B、包涵體的變性將洗滌完畢的包涵體用含8M尿素的緩沖液B(每升中含NaH2P04《&015.6g，Tris堿1.2g，尿素480.5g，用NaOH調(diào)至pH8.0)重懸，磁力攪拌器攪拌2h，4°C12000rpm離心20min，保留上清，取樣處理后，電泳鑒定。包涵體的電泳結(jié)果如圖3中5泳道所示，表明S1-M2e3以包涵體形式表達(dá)。4)Sl-M2e3的純化pQE載體表達(dá)蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，利用這一特性可以采用Ni親和層析的方法進(jìn)行純化，具體操作按照Ni-FF說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，柱床體積為2ml，用緩沖液l平衡2-5個(gè)床體積，上樣，流速為lml/min，用緩沖液1再洗2-5個(gè)床體積，流速為2ral/min，再分別用含IO、20、50、100、200、300mM咪唑的緩沖液3進(jìn)行階段洗脫，流速為2ml/min，收集各階段洗脫液，用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的分子量大小和純度，最后用純水流洗5個(gè)柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個(gè)柱床體積，流速為2ral/min，柱子置于4'C環(huán)境中保存。其中，鎳親和層析緩沖液組成緩沖液l:50raMpH7.4的PBS緩沖液。配制0.5MNaH2P0419ml，0.5MNa2HP0481ral，NaCl29.3g,加適量水溶解后定容到1000ml。緩沖液2:50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制0.5MNaH2P0419ml，0.5MNa2HP0481ml，NaCl29.3g和咪唑34g，加適量水溶解后定容到1000ml。不同咪唑濃度的緩沖液3的組成如表2所示表2、緩沖液3的組成咪唑濃度緩沖液l量(ml)緩沖液2量(ml)10mM98220mM96450mM9010100mM8020200函6040300mM4060S卜M2e3蛋白經(jīng)過(guò)Ni-FF時(shí)大部分被吸附至柱上，經(jīng)過(guò)含低濃度的洗滌緩沖液洗滌(20mM，50mM)，自100mM洗脫緩沖液后即獲得較純的Sl-M2e3蛋白(圖4中的6-7泳道)。5)抗M2e兔多克隆抗血清的制備用人工合成的多肽M2e(MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD)進(jìn)行抗體制備多肽100wg/只/次，初次免疫與弗氏完全佐劑等體積混勻，充分乳化，總體積2ml，背部皮下多點(diǎn)注射免疫兔子。每l個(gè)月加強(qiáng)一次，共加強(qiáng)兩次，加強(qiáng)時(shí)換用弗氏不完全佐劑。末次免疫后2周靜脈采血，ELISA法測(cè)定血清中抗體產(chǎn)生效價(jià)。其中，以5ixg/ml的多肽M2e包被酶標(biāo)板。效價(jià)達(dá)到l:200，000以上則可采用頸動(dòng)脈放血的方式收集兔血，分離血清，-2(TC保存。6)表達(dá)蛋白的ELISA鑒定用純化的Sl-M2e3蛋白包被(5yg/ml)，用常規(guī)間接ELISA檢測(cè)抗M2e多抗血清(1:20000、1:40000和1:100000稀釋)，對(duì)照用正常兔血清，結(jié)果該重組蛋白只與M2e多抗血清反應(yīng)。7)表達(dá)蛋白S1-M2e3的復(fù)性采用透析法進(jìn)行復(fù)性配制含梯度尿素濃度(6M，4M)及5。/。甘油，0.1MTris，2mMEDTA,1%甘氨酸的復(fù)性液，進(jìn)行梯度透析；然后透析至laemmlibuffer(25raMTris，192mM甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3)，最后透析至0.OIM、pH7.4的PBS溶液中。每種濃度的透析時(shí)間6h，全部過(guò)程在4'C進(jìn)行。透析結(jié)束后，蛋白溶液12000rpm離心10min，收集上清，取樣電泳鑒定，結(jié)果如圖4中的8泳道，表明復(fù)性后獲得了高純度的S1-M2e3。包涵體一般含有50。/。以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、膜蛋白、質(zhì)粒DNA，以及磷脂、脂多糖等。可以通過(guò)洗滌等方法提高包涵體中重組蛋白的純度，從而方便后續(xù)的變復(fù)性操作，提高復(fù)性率。根據(jù)《分子克隆》及參考崔建武等提供的菌體破碎及包涵體洗漆收集方案，結(jié)合實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，對(duì)S1-M2e3表達(dá)系統(tǒng)摸索出如下的分離洗滌方案先以30%蔗糖高滲溶液對(duì)菌體預(yù)處理，在進(jìn)行超聲破碎，與直接進(jìn)行超聲破碎相比，前者的破碎效果較好。對(duì)包涵體先用含lOmMEDTA和分別含0.5°/。/10%的Triton-X-100的包涵體洗液I和II洗滌，溫和去垢劑TritonX-100洗滌能去除膜碎片和膜蛋白。再以含2M尿素的包涵體洗液III洗滌，這種方案能洗去較多雜質(zhì)，提高包涵體的純度，洗滌過(guò)程中包涵體蛋白也能保持穩(wěn)定，未見(jiàn)降解。在包涵體中，重組蛋白處于錯(cuò)誤折疊的狀態(tài)，二硫鍵大部分也是錯(cuò)搭的。要獲得正確折疊的蛋白首先是溶解包涵體，使蛋白變性。變性即破壞非共價(jià)鍵。常用5-6M的鹽酸胍或6-8的尿素。本實(shí)驗(yàn)采用8M尿素溶解包涵體，溶解性良好，無(wú)需加入還原劑等其他成分助溶。獲得較高純度的包涵體后再經(jīng)過(guò)鎳親和層析純化，得到純度〉85%的目的蛋白。在摸索純化的條件時(shí)，表達(dá)的Sl-M2e3雖然帶有His標(biāo)簽，親和能力并不強(qiáng)，經(jīng)過(guò)Ni-FF柱時(shí)吸附比例較少，用50mM洗滌緩沖液洗滌時(shí)就有部分目的蛋白連同雜蛋白被洗脫下來(lái)，因此會(huì)造成最后獲得純品的損失。最終目的蛋白在100-200mM咪唑濃度下被洗脫。變性蛋白純度越高越有利于復(fù)性，在通過(guò)上述方法獲得高純度目的蛋白后，開(kāi)始摸索復(fù)性條件。蛋白復(fù)性過(guò)程是除去變性劑及還原劑，給變性的蛋白分子提供正確的再折疊及恢復(fù)活性的環(huán)境，重新獲得天然的活性蛋白的過(guò)程。透析是實(shí)驗(yàn)室最常用的方法。透析復(fù)性最關(guān)鍵的是低濃度和平緩梯度。待復(fù)性蛋白的起始濃度一般為0.l-lmg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟(jì)，而且很多蛋白在低濃度時(shí)不穩(wěn)定；變性劑濃度(比如尿素)要平緩降低，逐步透析到正常，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。復(fù)性液的成分也很重要，一定濃度的Tris和金屬離子螯合劑EDTA，以抑制某些蛋白酶的作用減少降解，增加目的蛋白的穩(wěn)定性；一定濃度的甘油能增加黏度，減少分子碰撞機(jī)會(huì)；一定濃度的甘氨酸也有助于蛋白的復(fù)性。在摸索復(fù)性條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)雖然添加了上述多種有助于復(fù)性的成分，在尿素濃度從4M降至2M時(shí)，蛋白極易產(chǎn)生大量沉淀，復(fù)性未獲成功。將包涵體蛋白從4M尿素濃度直接透析至含有0.1%的SDS的laemrailibuffer中，再透析至PBS，在此過(guò)程中，蛋白雖然還是有沉淀析出，但上清中尚能保留較多可溶性成分。低濃度的SDS也有助于蛋白的復(fù)性，但由于SDS具有一定的毒性，而在此后的透析過(guò)程中很難被除去，因此并不推薦使用，然而這樣獲得的蛋白制品用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是可行的。實(shí)施例2、Sl-M2e3的免疫實(shí)驗(yàn)材料RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco/BRL公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG-HPR酶標(biāo)抗體購(gòu)自北京中杉公司，羊抗鼠HPR-IgGl，HPR-IgG2a(lrag/ral)酶標(biāo)抗體購(gòu)自BETHYL公司，3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine(TMB)顯色液購(gòu)自Sig腿公司。免疫用抗原肽M2e:MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD，由人工合成(北京賽百勝公司)免疫用蛋白復(fù)性的Sl-M2e3。蛋白的定量及內(nèi)毒素的檢測(cè)蛋白定量測(cè)定蛋白溶液在280nm和260nm波長(zhǎng)下的吸光度，用以下的公式計(jì)算蛋白濃度蛋白濃度(mg/ml)=1.55XA娜-0.74XA260大腸桿菌表達(dá)蛋白往往有內(nèi)毒素污染，而內(nèi)毒素(LPS)本身是有一定的免疫激活作用的，因此對(duì)每一批試驗(yàn)性Sl-M2e3必須檢測(cè)內(nèi)毒素含量范圍，確保低于一個(gè)限值，才能應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。對(duì)制備的佐劑蛋白制品采用鱟試劑法進(jìn)行了內(nèi)毒素的檢測(cè)，樣品中內(nèi)毒素含量均低于0.01EU/ng，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。內(nèi)毒素的檢測(cè)；按照鱟試劑使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下在分裝有100yl鱟試劑溶液的試管中加入100u1復(fù)性的S1-M2e3蛋白，設(shè)立陰性對(duì)照(無(wú)內(nèi)毒素水)，陽(yáng)性對(duì)照(內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品)。封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37t:的恒溫器中孵育60min，然后取出觀察結(jié)果，孵育期間嚴(yán)格避免震動(dòng)。根據(jù)是否出現(xiàn)凝膠判斷是否陽(yáng)性。結(jié)果表明當(dāng)測(cè)試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180。時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)容物呈堅(jiān)實(shí)凝膠，不變型，不從管壁滑脫；供試品(制備蛋白樣品)雖生成凝膠，但不能保持完整，并從管壁滑脫，也為陰性。陰性對(duì)照管內(nèi)容物未出現(xiàn)凝膠。根據(jù)使用的鱟試劑的靈敏度0.5EU/ml，復(fù)性的S1-M2e3蛋白濃度為5.0ug/y1，由于測(cè)試呈陰性，則最終內(nèi)毒素含量低于0.01EU/yg。具體的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下5周齡的BALB/c雌性小鼠(由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為清潔級(jí))隨機(jī)分組，每組6只，分組情況如下S1-M2e3免疫組(S卜M2e3)、M2e免疫組(M2e)。Sl-M2e3免疫組和M2e免疫組共免疫兩次，在第一次免疫后的3周，加強(qiáng)免疫一次；免疫時(shí)，以0.01M、pH7.4的PBS溶液稀釋M2e或復(fù)性的S1-M2e3至所需濃度，100n1/只，使M2e或復(fù)性的S1-M2e3的免疫劑量為25ug/只/次。分別加強(qiáng)免疫后第8天斷尾法采血，收集于EP管中，置37r溫箱放置lh，待血清析出后，4000rpra離心10min，吸出血清一2(TC凍存?zhèn)溆?。M2e用包被液(Na2C031.59g，NaHC032.93g，加水至1000ml)稀釋(5ug/ml)，4°C包被96孔板過(guò)夜，加入200iil封閉液，37°C孵育1h，加入100nl稀釋的一抗(免疫血清)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔(免疫前正常小鼠血清)和空白孔，37t:孵育lh，PBST洗四遍，加入100y11:10，000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgGl或lgG2a亞型抗體，37°C孵育1h，PBST洗四遍，加入3,3'，5，5'-tetramethylbenzidine(TMB)顯色液，37°C避光顯色，在每一孔中加入lOOu12M硫酸終止反應(yīng)。在450nra波長(zhǎng)讀取每一孔的吸光度。其中，2XELISA封閉和樣品稀釋液每1000ml含Tris.Cl(pH6.8)12g，NaCl16.5g，Tween-200.05%;臨用前稀釋一倍，并加入2%BSA。10XPBS緩沖液(pH7.2):NaH2P0420.5g，Na2HP04179.9g，用4升去離子水溶解后加入701.3gNaCl，補(bǔ)至8升。ELISA洗漆緩沖液PBST:1XPBS加入0.2%(v/v)Tween-20。結(jié)果的判斷OD，大于等于2.1倍陰性對(duì)照OD，的平均值判斷為陽(yáng)性。結(jié)果如圖5和6所示，表明Sl-M2e3加強(qiáng)免疫一次，IgGl/IgG2a幾何平均滴度(Ge匿antiter,GMT)值就可分別達(dá)到1:100，000/1:4525，S卜M2e3組免疫效果明顯高于M2e免疫組(p<0.01)。設(shè)立的M2e免疫對(duì)照組顯示，IgGl/IgG2a值多數(shù)都低于檢測(cè)水平。(圖5和6中的結(jié)果為6只小鼠的平均值。)序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所〈120〉一種具有較高免疫原性的融合蛋白及其應(yīng)用<130>PCGNA81912〈160>6<210>1〈211〉198<212>PRT<213>人工序列<220><223><400〉1LysLeuThrAlaLeuGluArgLysLyslieValGlyGinAsnAsnLys151015TyrArgSerAspLeulieAsnGlyLysLeuLysAsnArgAsnGlyThr202530TyrMetProArgGlyLysAsnMetLeuGluLeuThrTrpAspCysLys354045LeuGluSerSerAlaGinArgTrpAlaAsnGinCysliePheGlyHis505560SerProArgGinGinArgGluGlyValGlyGluAsnValTyrAlaTyr65707580TrpSerSerValSerValGluGlyLeuLysLysThrAlaGlyThrAsp859095AlaGlyLysSerTrpTrpSerLysLeuProLysLeuTyrGluAsnAsn100105110ProSerAsnAsnMetThrTrpLysValAlaGlyGinGlyValLeuHis115120125PheThrGinMetAlaTrpGlyLysThrTyrLyslieGlyCysGlyVal130135140AlaThrGinCysAspGlyGlyArgThrLeulieVallieCysHisTyr145150155160SerProGlyGlyAsnMetValGlyGluVallieTyrHisArgGlyAsn165170175ProCysLysValAspLysAspCysTyrThrLysLysCysLeuSerLys180185190SerGlyLeuCysArgLys195<210〉2<211〉87<212>PRT<213>人工序列<220><223>〈400〉2MetSerLeuLeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrpGlu1510.15CysArgCysSerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySerMetSerLeu202530LeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrpGluSerArgSer354045SerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySerMetSerLeuLeuThrGlu505560ValGluThrProThrArgAsnGluTrpGluSerArgSerSerAspSer65707580SerAspGlyGlyGlyGlySer85<210〉3〈211〉285<212〉PRT〈213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉3MetSerLeuLeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrpGlu151015CysArgCysSerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySerMetSerLeu202530LeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrpGluSerArgSer354045SerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySerMetSerLeuLeuThrGlu50556015ValGluThrProThrArgAsnGluTrpGluServArgSerSerAspSer65707580SerAspGlyGlyGlyGlySerLysLeuThrAlaLeuGluArgLysLys859095lieValGlyGinAsnAsnLysTyrArgSerAspLeulieAsnGlyLys100105110LeuLysAsnArgAsnGlyThrTyrMetProArgGlyLysAsnMetLeu115120125GluLeuThrTrpAspCysLysLeuGluSerSerAlaGinArgTrpAla130135140AsnGinCysliePheGlyHisSerProArgGinGinArgGluGlyVal145150155160GlyGluAsnValTyrAlaTyrTrpSerSerValSerValGluGlyLeu165170175LysLysThrAlaGlyThrAspAlaGlyLysSerTrpTrpSerLysLeu180185190ProLysLeuTyrGluAsnAsnProSerAsnAsnMetThrTrpLysVal195200205AlaGlyGinGlyValLeuHisPheThrGinMetAlaTrpGlyLysThr210215220TyrLyslieGlyCysGlyValAlaThrGinCysAspGlyGlyArgThr225230235240LeulieVallieCysHisTyrSerProGlyGlyAsnMetValGlyGlu245250255VallieTyrHisArgGlyAsnProCysLysValAspLysAspCysTyr260265270ThrLysLysCysLeuSerLysSerGlyLeuCysArgLys275280285〈210〉4<211〉628<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>CDS〈222>(17)..(610)<223〉〈400>2gatagcctatggatccaaacttacggccctggaacggaagaaaattgtgggt52LysLeuThrAlaLeuGluArgLysLyslieValGly1510caa,aacaataaataccgtteagacetcateaacggtaagttgaaaaat100GinAsnAsnLysTyrArgSerAspLeulieAsnGlyLysLeuLysAsn152025eggaatggtacctatatgccacgcggcaaaaacatgetcgagctgact148ArgAsnGlyThrTyrMetProArgGlyLysAsnMetLeuGluLeuThr303540tgggattgcaaactggaaageagtgcccagcgttgggcgaatcagtgt196TrpAspCysLysLeuGluSerSerAlaGinArgTrpAlaAsnGinCys45505560atetttgggcactecccgcgccaacagcgcgaaggtgtaggtgaaaat244liePheGlyHisSerProArgGinGinArgGluGlyValGlyGluAsn6.57075gtgtatgcgtattggageagtgttteagtcgaaggtctgaaaaaaacc292ValTyrAlaTyrTrpSerSerValSerValGluGlyLeuLysLysThr808590gcaggtacggatgcgggtaaategtggtggagtaaaetcccgaaactg340AlaGlyThrAspAlaGlyLysSerTrpTrpSerLysLeuProLysLeu95100105tatgagaacaacccgtctaacaacatgacctggaaagttgcggggcag388TyrGluAsnAsnProSerAsnAsnMetThrTrpLysValAlaGlyGin110115120ggagttcttcactttacgcaaatggcgtgggggaaaacctacaagatt436GlyValLeuHisPheThrGinMetAlaTrpGlyLysThrTyrLyslie125130135140ggctgcGlyCysggggtggccGlyValAla145acccagThrGintgtCysgacAspggcGly150ggtGlycgtArgaccThrcULeuatelie155gtgVal484atetgtcactacagtccgggtggtaatatggttggggaggtcatetat532lieCysHisTyrSerProGlyGlyAsnMetValGlyGluVallieTyr160165170catcgtggcaatccatgcaaagtggacaaggattgctatacgaaaaag580HisArgGlyAsnProCysLysValAspLysAspCysTyrThrLysLys175180185aaa肌gcttctagccgagacg628Lys〈210〉5〈211〉284〈212〉DNA〈213〉人工序列tgtctgageaaatecggtctgtgccgcCysLeuSerLysSerGlyLeuCysArg190195〈220〉〈221〉CDS〈222〉(15).■(275)<223〉〈400〉5gatctggaagatctatgtegMetSer1ctgctgaccgaggtcgagacccctacgcgtLeuLeuThrGluValGluThrProThrArg51050肌cg站AsnGlutggTrp15gagtgcaggGluCysArgtgctctgactecagtgacggaggtggaggaCysSerAspSerSerAspGlyGlyGlyGly202598tctatgtegctgctgaccgaggtcgagacccctacgcgtaacgagtgg146SerMetSerLeuLeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrp303540gagtecGluSer45aggtectctgacArgSerSerAsp50tecagtgacggaSerSerAspGlyggtGly55ggaGlyggaGlytctSeratgMettegSer60194ctgctgaccgaggtcgagLeuLeuThrGluValGlu65acccctacgThrProThrcgtArg70肌cAsngagGlutggTrpg&gGlutecSer75&ggArg242tectctgactecagtgacggaggtggaggatecttgagcetc284SerSerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySer8085〈210〉6<211〉855<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉〈400〉6atgtxgctgctgaccgaggtcgagacccctacgcgtaacgagtgggagtgcaggtgctct60gactccagtgacggaggtggaggatctatgtcgctgctgaccgaggtcgagacccctacg120cgtaacgagtgggagtccaggtxctctgactccagtgacggaggtggaggatctatgtcg180ctgctgaccgaggt:cgagacccctacgcgtaacgagtgggagtxcagg"tcc"tc"tgac"tcc240agtgacggaggtggaggatxcaaacttacggccc"tgga已cggaagaaa^ttgtgggtcaa300aacaataaataccgttcagacctcatcaacggtaagttgaaaaa^cggaatggtacctat360atgccacgcggcaaaaacatgctxgagctgacttgggattgcaaactggaa￡Lgcagtgcc420cagcgttgggcgaatcagtgtatctttgggcactccccgcgccaacagcgcgaaggtgta480ggtgaaaMgtgtatgcgtat"tggagcagtgtttcagtcg肌ggtxtgaaaaaaaccgca540ggtacggatgcgggtaaatcgtggtggagtaaactcccgaaactgtatgagaacaacccg600tctaacaacatgacctggaaagttgcggggcagggagttcttcactttacgcaaatggcg660tgggggaaaacctac肌gat"tggctgcggggtggccacccag"tgtgacggcggtcgtacc了20cttatcgtgatctgtcactacagtccgggtggtaatatgg"ttggggaggtcatctatcat780cgtggcaatccatgcaaagtggacaaggattgctatacgaaaaagtgtctgagcaaatxc840ggtctgtgccgcaaa85權(quán)利要求1、一種融合蛋白，是在S1的氨基末端或羧基末端融合抗原表位肽得到的蛋白質(zhì)；所述S1是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；所述抗原表位肽是如下(c)或(d)的蛋白質(zhì)(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(c)衍生的蛋白質(zhì)id="icf0001"file="A2008102268960002C1.tif"wi="1"he="2"top="89"left="125"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為如下(1)或(2)的蛋白質(zhì)(1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且免疫原性高于所述抗原表位肽的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。3、權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的編碼基因。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述S1的編碼基因?yàn)槿缦?)或4)的基因3)其編碼序列是序列表中的序列4;4)在嚴(yán)格條件下與3)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述抗原表位肽的編碼基因?yàn)槿缦?)或6)的基因5)其編碼序列是序列表中的序列5。6)在嚴(yán)格條件下與5)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或8)的基因7)其編碼序列是序列表中的序列6;8)在嚴(yán)格條件下與7)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子。7、含有權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述融合蛋白的編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。8、權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白在制備疫苗中的應(yīng)用。9、一種禽流感疫苗，它的活性成分為權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白。10、權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的制備方法，是將所述融合蛋白的編碼基因?qū)氪竽c桿菌中，得到重組大腸桿菌，培養(yǎng)該重組大腸桿菌，表達(dá)得到融合蛋白。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種具有較高免疫原性的融合蛋白及其應(yīng)用。該融合蛋白，是在S1的氨基末端或羧基末端融合抗原表位肽得到的蛋白質(zhì)；所述S1是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且免疫原性高于所述抗原表位肽的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，融合蛋白S1-M2e3能有效的刺激針對(duì)M2e的特異性免疫應(yīng)答，僅加強(qiáng)免疫一次，IgG1/IgG2aGMT值就可達(dá)到1∶100,000/1∶4525，S1-M2e3可用于制備禽流感疫苗。文檔編號(hào)C12N1/15GK101402687SQ20081022689公開(kāi)日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者虹于,何玉先,周育森,李軍鋒,潔管,肖文珺,趙光宇,陳萬(wàn)榮申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所