專利名稱：：植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：干旱缺水是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的嚴(yán)重問題，也是制約我國糧食生產(chǎn)發(fā)展的重要因素。主要糧食作物小麥的栽培需要大量的水，我國平均每生產(chǎn)1噸小麥需水量約500-700m3。全世界發(fā)展中國家至少有6000萬公頃小麥栽培在雨養(yǎng)耕地，但其產(chǎn)量水平只有灌溉條件下的10%-50%。所以，發(fā)展抗旱節(jié)水小麥品種，以提高作物的水分利用效率，既可增加產(chǎn)量，又可以緩解水資源短缺的矛盾。改良作物抗旱性對(duì)于提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力具有重大意義，受到世界各國的高度重視，近期我國啟動(dòng)的轉(zhuǎn)基因作物新品種培育重大專項(xiàng)就是最好的實(shí)證。研究植物的抗旱機(jī)理、克隆抗旱相關(guān)基因、通過基因工程改良作物抗旱性是培育抗旱作物新品種的一條有效途徑。雖然作物的抗旱性遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，克隆、轉(zhuǎn)化抗旱基因獲得抗旱性明顯提高的新品種難度較大，但經(jīng)眾多科學(xué)家的共同努力，已經(jīng)取得了一定的進(jìn)步，涌現(xiàn)了不少成功的例子，如Cheng等(ifo7ec〃2ar^reeo77^,2002，10:71-82)把小麥的LEA蛋白基因?qū)胨?，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、耐鹽性得到了明顯提高；而等(fi^Vase6"cie/2ce^/"et&,2003,48:2594-2600)將擬南芥的S-OAT基因轉(zhuǎn)入水稻中過量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸含量明顯增加，抗旱和耐鹽性明顯增強(qiáng)；Dubouzet等(尸7朋f乂2003，33:751-763)將水稻轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因fe/W^X4導(dǎo)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)了強(qiáng)抗旱、抗鹽和耐寒特性。Hu等將&y^67基因?qū)氲剿局?，轉(zhuǎn)基因后代的抗旱性得到明顯增強(qiáng)，而且不影響后代產(chǎn)量(Hu等2006，尸潔淑JJcaV〃試10:71-82)。目前，已克隆的抗旱相關(guān)基因主要包兩大類，第一類為功能基因，這類基因包括低分子可溶性糖、氨基酸和小分子蛋白質(zhì)等合成相關(guān)基因，以及保護(hù)細(xì)胞免受損害的酶類，如脯氨酸合成相關(guān)酶基因，包括吡咯啉-5-羧酸合成酶基因/^C5"及尸M5么吡咯琳-5-羧酸還原酶基因尸^7等；晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)，小麥LEA蛋白基因(Ingram等1996，^M"aJyew'e^尸2朋t尸力j^z'oJogy朋"f7朋t淑ecw7arA.o柳47:377-403)。第二類是調(diào)節(jié)基因，包括各種參與水分脅迫信號(hào)傳遞的基因，主要包括(1)參與ABA、乙烯等信號(hào)分子合成的關(guān)鍵酶類(Bray1997,7>朋&眾尸7a/f5bie/ce，2:48-54);(2)轉(zhuǎn)錄因子(Soderman等1996，尸^yt乂10:375-381),如DREB(Wang等2008，尸Ja/7t#o767:589-602;Agarwal等2007,#。7fe/"Ge/2o肌'cs277:189-198;Chen等2007,A.cip力;^Wes6bM/朋353:299-305;Maruy柳a等2004，尸7朋t/38:982-993;Dubouzet等2003，尸J朋t/'33:751-763)，NF-YB1(Yu等2008，v^/a/^CeW，20:1134-1151)，HD-ATART(Nelson等2007，尸roc7VaWJcad5bi〃a，104:16450-16455)，OsNACl(Hu等2006，尸rocyVaWJc^/5^'〃試10:71-82)等；(3)蛋白磷酸酶，如蛋白質(zhì)磷酸酶2A和2C等，它們參與ABA信號(hào)的傳遞(Kwak等2002，尸7朋tCe",14:2849-2861;Leung等1997，7°/<3/^CeW，9:759-771;Merlot等2001,尸_7威乂25:295-303;Sheen1998，尸roc^rad5bi〃M，95:975-980)。(4)蛋白磷酸激酶，植物蛋白激酶家族非常，主要包括分裂素激活蛋白激酶(MAPK)(Knetsch等19恥，/^3^CeW，8:1061-1067),鈣依賴的蛋白激酶(CDPK)(Li等1996，Z^朋tCe"，8:2359-2368;Sauer等2004，55，181-188;Sheen1996,5^'e/2ce,274:1900-1902)和蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶(SNF1(sucrosenon-fermenting)relatedproteinkinase,SnRK)，其中SnRK是近期發(fā)現(xiàn)的參與對(duì)各種逆境反應(yīng)的蛋白激酶。SnRK家族非常龐大，根據(jù)其序列相似性和結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，SnRK家族可以分為3個(gè)亞家族SnRKl，SnRK2和SnRK3，其中SnRKl廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。研究表明SnRKl主要參與生物體內(nèi)對(duì)營養(yǎng)缺乏的響應(yīng)，而SnRK2和SnRK3是植物特有的蛋白激酶。目前，人們對(duì)SnRK3亞家族的研究相對(duì)比較多，其中對(duì)SnRK3成員中的S0S2研究尤為透徹，5^5^編碼一種Na7H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白能夠調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)外鈉、鉀離子的平衡，其過量表達(dá)能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性(Gong等2002，/^a/2t尸Arw.07，130:256-264;Kelner等2004，尸7朋f尸力/w'o7，136:3255-3265)。此外，人們發(fā)現(xiàn)了4個(gè)S0S2類似蛋白激酶，分別參與對(duì)不同脅迫的反應(yīng)，如PKSll可能參與對(duì)糖的感應(yīng)(Gong等2002，/腸7C力柳，277:28340-28350),PKS6和PKS18參與ABA信號(hào)傳遞(Gong等2002，尸7朋t129:225-34)，AtC固/PKS13調(diào)節(jié)對(duì)鹽的耐受性(Kim等2007,尸7朋t乂52:473-484)。小麥SnRK3成員WPK4受光、細(xì)胞分裂素和低溫的誘導(dǎo)，而被蔗糖抑制(Ikeda等1999，尸7朋t尸/yw.。7，121，813—820;Sano等1994，尸roc^cad5""'〃a，91:2582-2586)。人們對(duì)SnRK2家族研究起步較晚，但越來越多的證據(jù)表明該家族大多成員受滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，部分成員還參與ABA信號(hào)的傳遞過程(Boudsocq等2004，/A'o7C力e/z，279:41758-41766;Boudsocq等2007，尸7a/2f#。7A'o7，63:491-503;Kobayashi等2004，尸7朋tCe"，16:1163-1177)。Boudsocq在擬南芥中克隆了10個(gè)SnRK2成員，發(fā)現(xiàn)其中的9個(gè)成員受高滲和鹽脅迫的誘導(dǎo)，5個(gè)參與對(duì)ABA的響應(yīng)，其中0ST1/SRK2.5及其直系同源基因Kz'cia/a力aAAPK參與對(duì)ABA調(diào)節(jié)的氣孔關(guān)閉的控制調(diào)節(jié)(Li等2000，5We鮮，287:300-303;Mustilli等2002，尸7朋tCeW，14:3089-99;Yoshida等2002，尸J朋tCe^尸力yw'o厶43:1473-1483)，過量表達(dá)SnRK2.8和SnRK2.3能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性(Shin等1999，尸7朋t6W,11:2393-405;Umezawa等2004，尸roc#az^力cad〃M，101:17306-17311)。Kobayashi等在水稻中分離到10個(gè)SnRK2成員，稱之為脅迫激活蛋白激酶(StressActivatedProteinKinase,SAPK)，研究表明這10個(gè)成員都參與對(duì)滲透脅迫的應(yīng)答，其中3個(gè)受ABA誘導(dǎo)(Boudsocq等2004，尸2朋fCeW，16:1163-1677)。過量表達(dá)該家族成員SAPK4能明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性(Diedhiou等2008，祝C尸7朋f腸厶8:49)。在大豆中，人們分離到4個(gè)SnRK2成員，SPK1、SPK2、SPK3和SPK4，其表達(dá)都受滲透脅迫誘導(dǎo)，其中SPK3還受外源ABA的誘導(dǎo)(Monks等2001，尸7朋tCeL，13:1205-1219;Yoon等1997，ifo76"e/fe/7ef,255:359-371)。Gomez-Cadenas等在小麥中克隆了1個(gè)SnRK2家族成員PKABA1，該基因受ABA和高滲透脅迫的誘導(dǎo)(尸roc」cad5bi〃M，1999，96:1767-1772)，而除PKABA1外，鮮有小麥SnRK2基因家族的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的植物抗逆相關(guān)蛋白，來源于普通小麥(rw'"c鵬aes"V卿L.)，為如下(a)或(b)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1的自5'端第282至3215位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述蛋白的氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、替換和/或添加，有的是由于自然發(fā)生的多態(tài)變異引起的，例如由獲得蛋白質(zhì)的生物的物種、個(gè)體等的差異導(dǎo)致；有的是由定點(diǎn)誘變、隨機(jī)誘變等人工誘變處理引起。本發(fā)明所提供的編碼基因?yàn)槿缦耹)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第55-1146位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述抗逆相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與l)或2)限定的DNA序列有90y。以上同源性且編碼所述抗逆相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件是，在6XSSC,0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。序列表中序列1由1335個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，包括54bp的5'UTR、1092bp的0RF區(qū)、173bp的3'UTR、以及16bp的多聚(A)尾巴；該基因的開放閱讀框?yàn)?092bp(序列表中序列1的自5'端第55-1146位核苷酸)，編碼363個(gè)氨基酸(序列表中序列2所示)。含有上述任一所述編碼基因的重組表達(dá)載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗逆植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗逆植物的方法，是將上述任一所述的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞中，培育得到抗逆植物?？梢圆捎贸Ｒ?guī)方法將所述編碼基因?qū)胫参镏?，例如基因槍法，高壓電穿孔法，脂質(zhì)體法，菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等。本發(fā)明中的具體操作是，先將基因?qū)胼d體中，得到重組表達(dá)載體，再將重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，得到含有本發(fā)明基因的重組農(nóng)桿菌，再通過農(nóng)桿菌將基因?qū)胫参镏?。上述抗逆植物是抗干旱?或抗高鹽的植物。本發(fā)明方法對(duì)單子葉植物或雙子葉植物均可以，單子葉植物具體可為小麥，雙子葉植物具體可為擬南芥。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明基因?qū)胫参镏?，提高了植物的抗逆性，如抗旱性?或抗鹽性，在干旱條件下，轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的植物的存活率可達(dá)94%，而未轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的野生型植物的存活率還不到70%。同時(shí)本發(fā)明基因?qū)巫尤~、雙子葉植物均適用。因此，本發(fā)明基因及其應(yīng)用對(duì)培育抗旱節(jié)水、抗鹽農(nóng)作物新品種具有重要的意義，適合于推廣應(yīng)用。圖1為7kfe7A^-4與來自不同植物SnRK2成員間的關(guān)系。圖2為7kfe7y^-4在受水分脅迫、高鹽、低溫和ABA處理后的表達(dá)情況。圖3為7k&yA^-4在不同發(fā)育時(shí)期的小麥幼嫩組織中的表達(dá)情況。圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱情況。圖5轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性(鹽脅迫后細(xì)胞損傷情況)。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、小麥中抗逆相關(guān)蛋白的編碼基因7k&7A^-4的分離一、抗逆相關(guān)蛋白的編碼基因7^&必C-4的分離1、構(gòu)建小麥的全長cDNA文庫，按照文獻(xiàn)(毛新國等，2005，用改進(jìn)的Cap-trapper法構(gòu)建擬斯卑爾脫山羊草全長cDNA文庫.遺傳學(xué)報(bào)，32(8):811-817)中所述方法進(jìn)行(1)總RNA提取及mRNA純化，用TRIZ0L提取小麥總RNA，用oligo(dT)纖維素分離純化mRNA。(2)第一鏈cDNA的合成取10ugmRNA與引物I混合，變性后加入第一鏈cDNA合成的試劑，當(dāng)溫度升到40。C時(shí)，加入反轉(zhuǎn)錄酶，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到40分鐘時(shí)加入引物II(第一鏈合成引物如下)。為得到更多全長cDNA，在第一鏈合成時(shí)向反應(yīng)體系中加入海藻糖和山犁糖醇；為限制poly(A)尾巴的長度，以便于大規(guī)模測(cè)序，用混合引物替代傳統(tǒng)的單一引物oligo(dTU。反應(yīng)結(jié)束后用CTAB-UREA法除去糖類，沉淀cDNA/腿。第一鏈cDNA合成引物PrimerldAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16RPrimer2dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16CRPrimer3dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16CCRPrimer4dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16CTRdAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16CY(3)高碘酸鈉氧化向上步反應(yīng)管中加入高碘酸鈉溶液，氧化RNA，用甘油終止反應(yīng)。(4)生物素標(biāo)記離心收集高碘酸鈉氧化的cDNA/RNA，清洗、晾干重新溶解后，加入新鮮配置的Biotin-hydrzide(請(qǐng)將其譯成中文，并提供)，23。C溫育1416h，用檸檬酸鈉終止反應(yīng)。(5)RNaseI消化經(jīng)高碘酸鈉氧化后，mRNA5，和3，端末位堿基核糖上相鄰的二醇基團(tuán)被氧化成為二醛基團(tuán)，它們都可以和生物素結(jié)合。后期利用鏈霉親和素包被的磁珠分離全長cDNA時(shí)，mRNA3'端的生物素也可以與磁珠結(jié)合。為得到5'端完整的cDNA，必須特異地將3，端標(biāo)記的生物素除去。真核生物mRNA3，端poly(A)長度一般在100250bp，在合成第一鏈cDNA時(shí)，將poly(A)的長度限制在16個(gè)堿基，因此cDNA/RNA復(fù)合體中mRNA3，端poly(A)將以單鏈的形式存在，因此可以用RNaseI將其特異除去。(6)全長cDNA的捕獲及單鏈cDNA釋放先用無DNA污染的tRNA封阻磁珠(DynalbeadM-280)，室溫下讓c腿/RNA和磁珠結(jié)合20min，用NaOH-EDTA洗脫cDNA/腿。引物I引物II(7)末端轉(zhuǎn)移酶加尾收集單鏈cDNA，變性后加入末端轉(zhuǎn)移反應(yīng)試劑，37。C反應(yīng)9分鐘，終止反應(yīng)。(8)第二鏈cDNA的合成收集單鏈cDNA，用LA-Taq合成第二鏈cDNA。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳，回收大于lkb的cDNA。(8)酶A^I屬于二類限制性內(nèi)切酶，它的酶切位點(diǎn)正好處于識(shí)別位點(diǎn)下游的第一個(gè)堿基處，而且酶切沒有堿基特異性，但對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化敏感。經(jīng)^^al酶切的DNA將產(chǎn)生4個(gè)堿基突出的黏性末端。根據(jù)這些特性，在引物設(shè)計(jì)時(shí)引入了AMl、fo^l和i^ol位點(diǎn)，其中第一鏈引物中為^幼I和化oI位點(diǎn)，第二鏈引物中為v^al和^boA"I位點(diǎn)。通過采取這些措施，僅用51^I對(duì)cDNA進(jìn)行單一酶切，就可以實(shí)現(xiàn)cDNA的定向克隆。(9)連接、包裝及插入片段檢測(cè)收集分級(jí)后的目的cDNA片段，重新溶解于ddH20中，檢測(cè)cDNA濃度，確定cDNA的濃度后，取適量的cDNA與載體UniZAPII(Stratagene)連接過夜。包裝后，侵染宿主菌XL1-Blue，檢測(cè)滴度。(10)質(zhì)粒提取及序列測(cè)定產(chǎn)量，然后重復(fù)蛋白酶K消化，酚/氯仿萃取等步文庫擴(kuò)增后，取一定量的擴(kuò)增文庫用于噬粒環(huán)驟，最后將cDNA置于乙醇中沉淀過夜。環(huán)化，檢測(cè)噬粒滴度，最后取適量環(huán)化后的噬粒侵染SOLR宿主細(xì)胞。(11)將噬粒侵染過的宿主細(xì)胞涂布平板，37"C培養(yǎng)過夜。隨即挑取陽性克隆于96孔培養(yǎng)板，提取質(zhì)粒、測(cè)序，構(gòu)建小麥全長cDNA數(shù)據(jù)庫。以水稻SAPK4(BAD18000)為源序列，搜索小麥全長cDNA數(shù)據(jù)庫，得到候選克隆，測(cè)序得到目標(biāo)克隆的全長序列，其序列為序列表中序列l(wèi)所示，序列全長為1335bp。分析序列l(wèi)所示基因的結(jié)構(gòu)，表明，其自5'末端第1-54位核苷酸為5'UTR(54bp)，第55-1146位核苷酸為開放閱讀框(1092bp)，第1147-1319位核苷酸為3，UTR(173bp)，第1320-1335位核苷酸為的多聚(A)尾巴(16bp)。該基因編碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示，由363個(gè)氨基酸殘基組成。將序列表中序列1的自5'末端第55-1146位核苷酸所示的序列與基因水稻a月W基因(GenBankNo.AB125305)的序列進(jìn)行比對(duì)，其相似性達(dá)91.7%。鑒于該基因與6^月M具有非常高的相似性，其編碼產(chǎn)物具有SnRK2基因家族成員的特點(diǎn)，故將本發(fā)明的序列表中序列l(wèi)所示的基因命名為&5>^A^-4，由其編碼的蛋白(序列表中序列2所示)命名為TaSnRK2-4。以蛋白TaSnRk2-4為源序列，搜索NCBI公共數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)庫，下載與之相似性較高的序列。用BioEdit軟件將下載序列及TaSnRk2-4組裝為單一的FASTA文件，提交到歐洲生物信息學(xué)研究所網(wǎng)站(www.ebi.ac.uk/clustalw)上進(jìn)行多重比對(duì)(multialigment)，下載phylip格式的輸出文件，用分子進(jìn)化分析軟件包PHYLIP構(gòu)建進(jìn)化樹。進(jìn)化樹結(jié)果表明，本發(fā)明蛋白TaSnRk2-4與單子葉植物水稻和玉米中的同源序列聚在一起，而來自雙子葉植物的同源序列聚在一起(圖l，At,^T3Zicfosi51t力37j'a/23(J以南芥)；Bn，^Sras57'c3/<3/〃5<油菜)Cs,Ca/se77j'asj'刀e/7SJ-s(茶)；Fs，尸a^A5y2ra^'ca(歐洲7jC青岡)；Gm，67/d'/e歷ax(大豆)；Mt，ife力'cago^ny/7C3&23(首精)；Nt，y^z.con.a/a^gZacw/ff(j:因草)；0s，6!rj^a(水稻)；Vv，K/z^sw'/^'/ei^(葡萄)；Zm，Z朋/z3j^(玉米))。二、植物抗逆相關(guān)基因7k&yA^-4的表達(dá)特征(一)植物抗逆相關(guān)基因7k&iA^-^對(duì)不同逆境脅迫的應(yīng)答情況以抗旱小麥(旱選10號(hào))為實(shí)驗(yàn)材料。挑選籽粒飽滿、大小一致的抗旱小麥種子(旱選10號(hào))，將其置于光照培養(yǎng)箱中，在2(TC、12h/d培養(yǎng)，水培至一葉一心，然后進(jìn)行逆境脅迫處理。水分脅迫除去培養(yǎng)皿中的水分，加入PEG-6000(滲透勢(shì)為-0.5MPa)水溶液；高鹽脅迫除去培養(yǎng)皿中的水分，加入250raMNaCl水溶液；低溫脅迫直接將培養(yǎng)皿移至4。C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)；外源ABA處理采用50uMABA溶液進(jìn)行噴霧直至葉片全部濕潤。分別在不同脅迫處理的0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h采集葉片，液氮速凍，-7(TC保存?zhèn)溆谩?duì)照一直采用無離子水培養(yǎng)。用TRIZOL提取小麥總RNA，以醒LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA(Invitrogen)，采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timeQuantitativePCR，qRT-PCR)的方法檢測(cè)基因7^6>^￡-樹各種逆境脅迫的響應(yīng)情況。用組成型表達(dá)的7^w"'/7基因作為內(nèi)參，設(shè)計(jì)了qRT-PCR的引物。r〃Zwh./F5'-GAGGCCTCGTGTGGTCGCTTTGT-3'R5'-GCCCAGTTGTTACCCGCACCAGA-3'7k&濃-4F5，-GGTTCATGCAAGCGGAGAGC-3，R5，—AACCAAAACCMACAGAAGCAAAC-3，按照LivakandSchmittgen提出的公式計(jì)算7k&7A^-堪因在4種處理下的表達(dá)量為對(duì)照的N倍，N=2—AACT，AA6T二(6T(t一,Timex)—6T(Tubulin,Timex))—(ct(target,Time0)—(Tubulin,Time0))o其中，CT值的含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。PCR循環(huán)在到達(dá)CT值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期)，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此CT值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的CT值是恒定的。timex代表不同的處理時(shí)間點(diǎn)；time0代表處理的零點(diǎn)；(TaTOt,TiMx)為經(jīng)過脅迫處理x時(shí)間時(shí)，小麥中7k5)^A^-堪因的表達(dá)量；ct(tubulin,Ti^)為經(jīng)過脅迫處理X時(shí)間時(shí)，小麥中n/iw"'i7基因的表達(dá)量；CT(T，u^。)為未開始脅迫處理時(shí)，小麥中7k&yA^-堪因的表達(dá)量；6T(T咖u"^。)為未開始脅迫處理時(shí)，小麥中n/力wh'/7基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)，結(jié)果如圖2所示(A為ABA處理，B為NaCl處理，C為PEG處理，D為低溫處理)。相對(duì)表達(dá)量即為N值。結(jié)果表明，7k&y￡-滲與對(duì)4種脅迫處理的響應(yīng)，其中對(duì)PEG和NaCl脅迫反應(yīng)比較敏感，對(duì)低溫處理反應(yīng)相對(duì)比較緩慢，對(duì)ABA處理反應(yīng)比較弱。(二)植物抗逆相關(guān)基因7^5>77￡-銀小麥不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量以旱選10號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料。分別以水培幼苗的根、葉，大田中正常生長小麥拔節(jié)期心葉和抽穗期的幼穗為材料，提取總RNA，用麗LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，采用qRT-PCR的方法檢測(cè)7k&7A^-遂因在不同發(fā)育時(shí)期不同幼嫩組織中的表達(dá)情況，所用的引物序列同前。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖3所示(以幼苗期葉中的表達(dá)為基準(zhǔn)，其它發(fā)育時(shí)期和其它組織較幼苗葉中的基因的表達(dá)水平為相對(duì)表達(dá)量)。結(jié)果表明，7^&7￡-4在幼苗根中和拔節(jié)期的心葉中表達(dá)量比較高，在苗期的幼葉和抽穗期的幼穗中表達(dá)量比較低。實(shí)施例2、基因7kfe7A^-銀擬南芥中的應(yīng)用一、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因7k&7A2"-^擬南芥以pPZP211為原始載體(GI:506685)(Hajdukiewicz等(1994)'尸7朋f#WA'o7，25:989-994)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)，在pPZP211的多克隆位點(diǎn)插入CaMV35S啟動(dòng)子(CaMV35S啟動(dòng)子序列為Genbanknumber為AB303068的序列中第1035—1815位核苷酸)，得到中間載體pCHF3，然后在pCHF3的I和尸stl位點(diǎn)間插入GFP(BAG13014)的開放閱讀框，最終得到雙元載體pCH3-GFP。根據(jù)基因7k&必C-4全長序列設(shè)計(jì)引物上游引物fl:gagaGGATCCGGGATGGAGAAGTACGAGGCG(Aa/zHI位點(diǎn))，下游引物rl:gag+TCGAClGATATGCGTAGCGAGCTCATGC(&71位點(diǎn))，其中下游引物3'端位于基因終止密碼子的上游。提取普通小麥(7^'Wc咖aes"ra;7L.)的mRNA，以CCAACCTACCGACCAACGAAC和AACCAAAACCAAACAGAAGCAAAC為引物，用RT-PCR的方法獲得小麥中基因7k&yA^-^的全長cDNA;以基因7k&VU-4的全長cDNA序列為模板，以上述fl和rl為引物，采用高保真酶Pfu擴(kuò)增目標(biāo)基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶5aMlI和5"WI進(jìn)行酶切，回收目標(biāo)基因片段；用限制性內(nèi)切酶I和&7I酶切雙元載體pCH3-GFP，回收目的載體片段；將回收的目標(biāo)基因片段和目的載體片段進(jìn)行連接，篩選，得到含有序列表中序列1第55-1146位核苷酸(即基因7k&必G-4的開放閱讀框)的陽性重組載體pCH3-7kSM^2-。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將基因7kfe^^-^轉(zhuǎn)到擬南芥中。用加有卡那霉素的MS培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因植株，在熒光顯微鏡下觀測(cè)擬南芥幼根中TaSnRK2-4-GFP融合蛋白的表達(dá)情況。根據(jù)熒光的強(qiáng)弱挑選融合蛋白表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因株系繁種、加代，待得到轉(zhuǎn)基因純系后，驗(yàn)證7k&必C—的功能。以未轉(zhuǎn)入任何載體的野生型擬南芥、轉(zhuǎn)入空載體pCH3-GFP的擬南芥為對(duì)照。二、轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性檢測(cè)稱等量的栽培土(蛭石和腐殖土的比例為1:1)于方形塑料缽中，澆水至飽和后，將7日齡的擬南芥幼苗(包括轉(zhuǎn)基因株系、野生型對(duì)照、轉(zhuǎn)空載體對(duì)照)移栽到塑料缽中，于22。C、12h光照/d、相對(duì)濕度70%條件下控水培養(yǎng)，待野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體的擬南芥嚴(yán)重萎蔫后復(fù)水，于復(fù)水后第3天照相、統(tǒng)計(jì)存活率。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)入基因&5>77￡-4的擬南芥的抗旱性明顯好于野生型和轉(zhuǎn)pCHF3/GFP載體擬南芥(圖4，A為復(fù)水前，B為復(fù)水后，WT代表野生型，L1L6為6個(gè)轉(zhuǎn)7kfe/A^-4基因株系，CK為轉(zhuǎn)pCHF3/GFP載體的對(duì)照)。存活率轉(zhuǎn)基因植株的存活率平均為94%，而野生型擬南芥和轉(zhuǎn)入空載體的對(duì)照存活率均不到70%。三、轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽性檢測(cè)將在MS培養(yǎng)基(無抗生素)上生長7天的擬南芥幼苗(轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗、野生型擬南芥幼苗及轉(zhuǎn)空載體的擬南芥幼苗)轉(zhuǎn)移到不銹鋼篩網(wǎng)上，用250mM的NaCl溶液處理擬南芥幼苗(將不銹鋼篩子放在塑料盒中，加入NaCl溶液，溶液量以淹沒擬南芥根部不淹沒擬南芥葉片為宜)，待野生型和轉(zhuǎn)空載體的擬南芥植株出現(xiàn)鹽脅迫癥狀時(shí)，迅速將擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到蒸餾水中清洗，然后將其放入盛有蒸餾水的離心管中(20ml)，于搖床上振蕩30min，用電導(dǎo)儀測(cè)量離心管中水的電導(dǎo)率(EC1)，然后將盛有擬南芥幼苗的離心管放在沸騰的水浴鍋中煮沸處理30min，取出離心管，待冷卻至室溫后，測(cè)量離心管中水的電導(dǎo)率(EC2)，然后計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。相對(duì)電導(dǎo)率的計(jì)算公式如下相對(duì)電導(dǎo)率二ECl/EC2X10(m。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如圖5所示(WT表示未轉(zhuǎn)入任何載體的空對(duì)照，CK表示轉(zhuǎn)入空載體的對(duì)照，L1-6表示轉(zhuǎn)入7kS"/2必^-^基因株系)，轉(zhuǎn)入7k&;^^^基因植株經(jīng)鹽脅迫后相對(duì)電導(dǎo)率明顯小于野生型擬南芥和空載體對(duì)照，說明在相同鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系比野生型和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的損傷較小，表明轉(zhuǎn)7kS)^A21-4基因能提高植物的耐鹽性。序列表<160〉2<210>1<211〉1335<212>■〈213》j、麥屬普通小麥(W"c咖廳"簡(jiǎn)L.)<400〉1tcggcscgsggcgacgcgcgaggggcggctggaggcggsggagggsgggaggggstggag60cggtgcgggacatcgggtcgggcascttcggggtggcgcggctgatgcgc1203accgcgsg3cccgcgagctcgtcgccgtcaagtgcatcgagcgcggccaccggattgac180gagaatgtctacagggsg3tC3tC33CC3CcgctcgctgcgCC3CCCC33C3tc3tccgc240ttcaaggaggtggtactgacgccaacaaatcttatgattgtcatggagttcgcagcaggt300ggggagctgtttgagcgaatctgtgatcgtgggcgcttcagtgaggatgsggcaaggtst360ttctttcagcagttgatctgtggtgtgagctsctgccatc3C3tgC333t3tgccstaga420gatttgaagctggagascgttctcttggatggcagtgcsgctccacggctcsaaatatgc480gatttcggct3ctccai3gtcatcagtattgcattcaaggcccaaatcagcsgtggggacg540ccagcst3t3ttgcaccagaggtgctatcccgccgtgsgtstgatggaasgcttgcagst600gtgtggtcttgtggggtgactctttscgtcatgcttgtgggaggctatcc660caggstgsccccaagaatat3cgcaagsccattcagcgaataa;tgtccgtgcaatatact720atscctgatcatgtccacatatccatggaatgccgscsgcttatggcccgtstctttgtt7803stgtcccatcscgstgagggccacccatggttcctgsag840sacctgccaagggagctcacsgagscggcgcaggccatgtacttcaggagggataacgcc900gtgccttctttctcggagcagagatcatgasgatcgtcc3ggaggcssgg9603CC3tgCC33agtcatccaggccaagctatggttggggcg3tgagggttcgg3cgacgag1020gaagagsagggsggccsgsagtggcggaggggstgagtsc1080gacaagagggtC33ggsggttcstgcaagcggagagctccgcatgagctcgctacgcats1140tcatgaaagtstgcggagtaagttacctgtagatagtcggcctstcgtggaacttctgcg1200ctcsgtggggtstgc33tttttgctggasgtttgcttctgtttggttttggttcctgtaa1260cataattt3catgggacaa3gggggcttgstgaatgctgt33tstttggctcttgacaga13201335<210>2<211>363<212〉Pro〈213〉小麥屬普通小麥(W"c咖aeW麗L.)〈400〉2MetGluLys1TyrGluAlaValArgAsplieGlySerGlyAsnPheGly51015ValAlaArgLeuMetArgAsnArgGluThrArgGluLeuValAlaVal202530LysCyslieGluArgGlyHisArglieAspGluAsnValTyrArgGlu354045lielieAsnHisArgSerLeuArgHisProAsnlielieArgPheLys505560GluValValLeuThrProThrAsnLeuMetlieValMetGluPheAla65707580AlaGlyGlyGluLeuPheGluArglieCysAspArgGlyArgPheSer859095GluAspGluAlaArgTyrPhePheGinGinLeulieCysGlyValSer100105110TyrCysHisHisMetGinlieCysHisArgAspLeuLysLeuGluAsn115120125ValLeuLeuAspGlySerAlaAlaProArgLeuLyslieCysAspPhe130135140GlyTyrSerLysSerSerValLeuHisSerArgProLysSerAlaVal145150155160GlyThrProAlaTyrlieAlaProGluValLeuSerArgArgGluTyr165170175AspGlyLysLeuAlaAspValTrpSerCysGlyValThrLeuTyrVal180185190MetLeuValGlyGlyTyrProPheGluAspGinAspAspProLysAsn195200205lieArgLysThrlieGinArglieMetSerValGinTyrThrliePro210215220AspHisValHislieSerMetGluCysArgGinLeuMetAlaArglie225230235240PheValAsnValProSerLysArglieThrMetArgGlulieLysSer245250255HisProTrpPheLeuLysAsnLeuProArgGluLeuThrGluThrAla260265270GinAlaMetTyrPheArgArgAspAsnAlaValProSerPheSerGlu275280285GinThrSerGluGlulieMetLyslieValGinGluAlaArgThrMet290295300ProLysSerSerArgProSerTyrGlyTrpGlyAspGluGlySerAsp305310315320AspGluGluGluLysGluGluGluGluArgProGluValAlaGluGlu325330335GluGluGluAspGluTyrAspLysArgValLysGluValHisAlaSer340345350GlyGluLeuArgMetSerSerLeuArglieSer355360權(quán)利要求1、一種蛋白，選自如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦耹)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第55-1146位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述抗逆相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與l)或2)限定的DNA序列有90。/。以上同源性且編碼所述抗逆相關(guān)蛋白的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組表達(dá)載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。5、一種培育抗逆植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞中，培育得到抗逆植物。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述編碼基因是通過權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述植物中的。7、根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述抗逆植物是抗干旱和/或耐鹽的植物。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明蛋白，選自如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明基因?qū)胫参锛?xì)胞中，可提高植物的抗逆性，如抗旱節(jié)水、抗鹽或耐寒，因此，本發(fā)明基因及其應(yīng)用對(duì)培育抗旱節(jié)水、抗鹽或耐寒新品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。文檔編號(hào)C12N15/63GK101392025SQ200810226319公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年11月12日優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日發(fā)明者張洪映,景蕊蓮,毛新國申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所