專利名稱：用于rna體外擴增的試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到體外擴增RNA的試劑的設(shè)計和用于RNA特別是未知序列的RNA和RNA 混合物的體外擴增方法。
背景技術(shù)：
隨著內(nèi)源性產(chǎn)生的非編碼的小核糖核酸(non-coding small RNA)被發(fā)現(xiàn)在機體的信號傳 導(dǎo)、基因調(diào)控中的重要作用，對它們的檢測和應(yīng)用需求越來越大。但由f樣本的來源及可能 的樣品量有限，加上每個樣本中的核酸種類數(shù)量太大而每個核酸的含量有限且相對含量相差 太大，在不知道發(fā)揮作用的核酸的具體序列時，來源有限的樣本不僅使得能夠開展的實驗有 限而且也可能無法重復(fù)過去的重要實驗。因此在研究起始階段無法知道發(fā)揮作用的核酸的具 體序列時，怎樣得到大量的全真核酸樣本是一個重要的研究課題。
對于己知序列的RNA的擴增和合成技術(shù)已經(jīng)比較成熟，同樣己知序列的RNA如已知序 列的微小RNA (miRNA)的檢測也有方法介紹(C. K. Raymond, etal.， 2005, 11, 1737-1744; C, Chen, etal., iVwc/e/c ^4c油2005, 33, el79; S. Ro, etal.，腸c/z艮5—一. / 饑Com聽". 2006, 351, 756-763)，但對于未知RNA和RNA混合物沒有現(xiàn)成的方法進行全真的擴增或有效 的檢測。如果利用常規(guī)PCR的引物設(shè)計原理和方法，當(dāng)擴增對象(如miRNA、 piRNA等)的長 度較短時，如果引物不準(zhǔn)確或最終不能準(zhǔn)確切去引物必然會導(dǎo)致太多多余的或/和不確定的堿 基添加入擴增對象的核酸中，這樣的結(jié)果可能完全改變擴增對象的核酸的性質(zhì)，所以能全真 地擴增核酸的方法意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一在于提供用于RNA體外擴增的試劑。
為達到上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案用于RNA體外擴增的試劑，包括以下組 分以下N與Nc為互補堿基，d,e，f,h,k，n^0' g，j,q^l' b，i，論2的整數(shù);
A.連接物SL1:連接物SL1為3'脫氧或被封閉，5'磷酸化的RNA或DNA或DNA-RNA 雜合鏈，其通式為5，P-(^)b(N)d-3'，其中(。％為限制性內(nèi)切酶的識別序列和酶切位點； 或連接物SL1為具有莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)的RNA或DNA或DNA-RNA雜合鏈， 其通式為5'P-(iY)b (N)e N(N)fNN(N)gNNc (Nc)fNc-3'，其中込[)b為使用的限制性內(nèi)切B.C.D.
酵的識別序列和酶切位點，N(N)gN為Stem-Lo叩結(jié)構(gòu)中Loop的堿基序列； 線性連接物L(fēng)L]:為含有啟動子相關(guān)序列的RNA或DNA或DNA-RNA雜合鏈，其通 式為5'-(N)h (NNN......NNN)-3'，其中，(NNN......NNN)為所用啟動子的相關(guān)序列；
引物SLP1:是以SL1為基礎(chǔ)設(shè)計的用丁 RT和PCR的DNA序列，其3'端含有限制性 內(nèi)切酶的識別序列和內(nèi)切酶位點，其5'端是游離的羥基或被磷酸化或連接有生物素； 線性引物L(fēng)LP1:是以LLl為基礎(chǔ)設(shè)計的用T PCR的DNA序歹ij，其5，端是游離的羥 基或被磷酸化或連接有生物素；
莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)的連接物SL2:當(dāng)切割點在5，端的時，3'粘性端部分或全部 與SLP1序列一致，其通式為5' -(N)i ^^(Nc),(N)k(SLPl)-3，，其中 一)川為形成 環(huán)的堿基序列，(N乂和(Ne),為形成環(huán)后互配的部分，5'磷酸化或不磷酸化；或當(dāng)切割 點在3'端的時，5'粘性端部分或全部與SLP1序列互補，SL2的通式為5' -(cSLPl)
(N)ffl (N)n g^3(Nc)n -3'， 其中N(N)q^1為形成環(huán)的堿基序列，(N)n和(Nc)n為形成 環(huán)后互配的部分，所述cSLPI是SLP1的互補堿基序列；
F. 限制性內(nèi)切酶；
G. 啟動子和相應(yīng)的RNA聚合酶。
優(yōu)選地，所述SL1禾QLL1是DNA、 RNA或5，端為RNA的DNA-RNA雜合鏈。更優(yōu)選 地，所述SL1禾QLL1是RNA。
所述啟動子為T3、 T7、 SP6或其它啟動子，優(yōu)選地，所述啟動子為T3、 T7、 SP6啟動子。
所述RNA聚合酶為與T3、 T7、 SP6或其它啟動子配合使用的聚合酶，優(yōu)選地，T3 RNA 聚合酶、T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
所述識別序列的酶切位點在5'端時，使用的限制性內(nèi)切酶為Tsp509 I、 Fat I、 BftiC I、 DpnH、 Mbol、 Sau3AI、 BssK I 、 StyD4 I、 MaeIII、 PspGl 、 Tsp45、 Alwl、 Bbs I、 Bbv I、 Bccl、 BceAI、 BfuAI、 Bsal、 BsmAI、 BsmB I、 BsmF I、 BspMI、 BspQI、 BtgZI、 Earl、 EcoP151、 Faul、 Fokl、 Hgal、 HpyAV、 Plel、 Sapl、 SfaNI、 Nb.BtsI、 Nb.BsrDI或Nt.CviPII。
所述識別序列的酶切位點在3'端時，使用的限制性內(nèi)切酶為Tail、 MaIII、 Hpy991、 Acu I、 Bael、 Bcgl、 BciV 1、 Bmrl、 Bpml、 BpuEl、 BsaXI、 BseRI、 Bsg I、 Bsm I、 BspCN I、 Bsr I、 BsrD I、 Bts I、 EtsC I、 CspC I、 Eci I、 Hph I、 Mbo II、 Mme I、 Mnl I、 NmeAlII、 Topoisomerase I、 TspRI、 Nt.AlwI、 Nt.BstNB或Nt.BspQI。
許多的限制性內(nèi)切酶的切割位點不在識別序列的兩端而是在中間，因此對于已知序列的RNA,可以根據(jù)RNA的序列選擇合適的限制性內(nèi)切酶將RNA相應(yīng)末端的序列設(shè)計入酶的識 別序列中去，這樣使用的酶的范圍更廣。
本發(fā)明的另 一 目的是提供用于RNA體外擴增的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案 一種用于未知序列RNA體外擴增的方法， 包括以下步驟
A. 連接物SL1與去磷酸化的目標(biāo)RNA連接；
B. 步驟A得到的產(chǎn)物磷酸化后與連接物L(fēng)L1連接
C. 步驟B得到的產(chǎn)物以SLP1為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;
D. 所得cDNA以引物SLP1和引物L(fēng)LP1進行PCR擴增后，分離得到DNA的兩條單鏈；
E. 按照酶切位點在識別序列的5'端或3'端設(shè)計的連接物SL2，與步驟D中相應(yīng)的DNA 單鏈連接后通過莖環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)建了內(nèi)切酶的唯一酶切位點，經(jīng)酶切得切割產(chǎn)物；或當(dāng)已 知序列的單個RNA樣本中沒有所用的內(nèi)切酶識別序列和切割位點時，得到的PCR產(chǎn) 物直接進行酶t刀割，得切割產(chǎn)物；
F. 切割產(chǎn)物在啟動子存在下和相應(yīng)的RNA聚合酶作用下進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA序列；或 切割產(chǎn)物與包含目標(biāo)RNA的cDNA鏈互配后由外切酶除去非互配的單鏈部分，所得 產(chǎn)物在啟動子存在下和相應(yīng)的RNA聚合酶作用下進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA序列；上述RNA 序列除了 5'端多一個G和少數(shù)3'端多一個A或C外與目標(biāo)RNA序列完全一樣。
優(yōu)選地，所述歩驟D中SLP1和LLP1中有一個引物的5'端連接有生物素(或其它能夠 用于有效識別和分離的官能團元素)，PCR擴增后利用生物素和Strepavidin/Avidin的結(jié)合將 DNA的兩條鏈分離。
所述歩驟E中酶切位點在5'端時，可以利用DNA聚合酶包括但不限于大腸桿菌DNA聚 合酶的Klenow片段通過末端有限填補延長互補序列增加酶切位點的兩翼堿基對數(shù)量以便于 酶的識別和切割。
如果被切割的DNA鏈就是要轉(zhuǎn)錄的鏈，所得切割產(chǎn)物在啟動子存在下由相應(yīng)的RNA聚 合酶作用進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA序列；如果被切割的DNA鏈的互補鏈?zhǔn)且D(zhuǎn)錄的鏈，所得切割 產(chǎn)物與包含目標(biāo)RNA的cDNA鏈互配后與被切割的DNA鏈互配后用單鏈DNA外切酶除去 非互配的單鏈部分，所得產(chǎn)物在啟動子存在下由相應(yīng)的RNA聚合酶作用進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA 序列。還可以優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)錄時，使用5'生物素或熒光素等標(biāo)記的鳥嘌呤三磷酸核苷酸(GTP)或單磷酸核苷酸(GMP)作為轉(zhuǎn)錄起始核苷酸(B. Seeligand A. Jaschke,萬/ocwy'wg^e C^w. 1999， 10, 371-378)，最終形成在5'端生物素或熒光素等標(biāo)記的所需的目標(biāo)RNA。
本發(fā)明可以適用于所有的RNA的體外擴增和檢測，但特別適用于未知序列RNA和RNA 混合物的體外擴增和檢測，所得產(chǎn)物除了 5'端多了一個鳥嘌呤核苷酸(G)和少數(shù)3'端多一個 A或C外與起始的核酸是完全一樣的序列并保持其中各個核酸的相對含量一致，因此所得的 產(chǎn)物可以與原樣本一樣直接使用，而且可以有目的引入5'端生物素或熒光素等標(biāo)記的目標(biāo) RNA可能比原RNA樣本更方便使用。本發(fā)明可以應(yīng)用到各種與RNA應(yīng)用等相關(guān)的方面包括 一般性科研、醫(yī)療檢測和法醫(yī)鑒定。


圖1是本發(fā)明RNA擴增過程中連接、逆轉(zhuǎn)錄和PCR流程；
圖2是本發(fā)明中以3，端切割內(nèi)切酶Nlain設(shè)計的RNA擴增過程中連接、莖環(huán)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ) 的限制性內(nèi)切酶切割和轉(zhuǎn)錄流程；
圖3是本發(fā)明中以5'端切割內(nèi)切酶Dpn11設(shè)計的RNA擴增過程中連接、莖環(huán)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)
的限制性內(nèi)切酶切割和轉(zhuǎn)錄流程；
圖4是對應(yīng)于圖1和圖2的電泳結(jié)果
其中a) 15%， 8M尿素變性PAGE膠1:單鏈DNAmarker, 2: miR122, 3: SL1, 4: PI (top);
b) 15%， 8M尿素變性PAGE膠1:單鏈DNA marker; 2: I丄l; 3:磷酸化的P2 +未磷酸化 的Pl;4and5:P3 (top);
c) 15。/。，8M尿素變性PAGE膠1:單鏈DNA marker; 2: RT產(chǎn)物經(jīng)RNaseH消化后(top: P4; middle: SU; bo加m: SLP1); 3: P3;
d) 8%，非變性PAGE膠1:雙鏈DNAmarker; 2: P5; 3:免疫磁珠分離后(lower band: P6); 4:純化后的P6;
e) 15%， 8M尿素變性PAGE膠1:單鏈DNAmarker; 2: P6; 3: SL2; 4: P9(top);
f) 15%， 8M尿素變性PAGE膠1:單鏈DNA marker; 2: P6; 3:皿ligated P9酶切(2nd band from top: P10); 4: SL2;
g) 8%,非變性PAGE膠1:雙鏈DNAmarker; 2: P10; 3: T7啟動子；4: P10與啟動子互配; 5:Klenow催化延長(top: Pll);
h) 15%， 8M尿素變性PAGE膠1:單鏈DNA marker; 2: Pll; 3:P11轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(bottom:target RNA); 4:轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase I消化后；5: miR122; 6:啟動子；
單鏈DNA marker:自上至下96, 70, 60, 50, 40， 30, 20 nt; 雙鏈DNA marker:自上至下 滿，90, 80, 70, 60， 50, 40， 30， 20, 10 bp;
圖5是對應(yīng)于圖1和圖3的電泳結(jié)果
其中a) 15%， 8M尿素變性PAGE膠l:單鏈DNAMarker; 2: miR122; 3: SL1: 4:P1 (top);
b) 15%, 8M尿素變性PAGE膠l:單鏈DNAMarker; 2:LL1: 3: PI; 4: P2 (top);
c) 10%，非變性PAGE膠1:雙鏈DNAMarker; 2: P2的RT產(chǎn)物；
d) 15%, 8M尿素變性PAGE膠1:單鏈DNA Marker; 2: P2; 3: P4 (top, P2的RT 產(chǎn)物經(jīng)過RNase H消化后)；
e) 8%，非變性PAGE膠1:雙鏈DNAMarker; 2: PCR產(chǎn)物P5;
f) 8%，非變性PAGE膠1:雙鏈DNAMarker; 2: P5 (雙鏈DNA); 3:分離后的P7;
g) 15%， 8M尿素變性PAGE膠h單鏈DNAMarker: 2: P7: 3: P12 (P7與SL2互配)； 4: P13 (top; P7與SL2互配后用DpnlI酶切割)；5: SL2;
h) 8%，非變性PAGE膠1:雙鏈DNAMarker; 2: P13; 3: P13與P6互配產(chǎn)物；4: P14 (P13與P6互配產(chǎn)物經(jīng)過外切酶exoVII酶切后產(chǎn)物)；
i) 15%, 8M尿素變性PAGE膠1:單鏈DNAMarker; 2: P14 (轉(zhuǎn)錄前)；3: P14轉(zhuǎn) 錄后；4:目標(biāo)RNA (P14轉(zhuǎn)錄后DNasel消化后)；5: miR122。
具體實施例方式
以下設(shè)計除了具體的目的外，DNA或RNA或RNA-DNA雜合鏈的任何一條鏈的基本的 要求為(G+C)可以在0-100%范圍。N與Nc為互補堿基。以下的連接物、引物、啟動子 等編號與附圖1、附圖2和附圖3中的標(biāo)號是對應(yīng)的，且其中的編號n,r，x》0;p^l;m》2， 所有編號都為整數(shù)。
本發(fā)明發(fā)明的連接物和引物中含有與以下式(I)所示的核酸內(nèi)切酶識別序列和酶切位點 相關(guān)的序列
5，…XXXXX(N)v T(N)x…3' 3，...XXXXX(Nc)p ▲ (Nc)y ...5' (I) v，p, x,y2 0的整數(shù)。
由于內(nèi)切酶識別序列和酶切位點信息可能被使用在我們設(shè)計的弓1物和連接物中，因此它 們決定了本發(fā)明中的連接流程和連接方式及酶切切割方式。內(nèi)切酶的識別位點可以是或不是回文(palindrome)結(jié)構(gòu)。內(nèi)切酶的切割可以是缺刻酶為代表的單切割方式(切割點在T位置或 切割點在A位置)或雙切割方式的限制性內(nèi)切酶(切割點在T位置和切割點在A位置)。
1、 酶切割位點在3'端的酶選擇和發(fā)明設(shè)計原則
1) 當(dāng)x=0, v-p = y , 5，-(N)y-3，/3'-(Nc)y-5，為識別序列，切割位點在識別序列的3，端，式 (I)歸結(jié)為式(n):
5'…XXXXX(N)p (N)yT…3， 3，…XXXXX(Nc)p畢c)y...5， (II) v，p,y20的整數(shù)。
2) 當(dāng)x=0， v = p+y = r+t+y, 5'-(N》-3'/3'-(Nc)r-5，為識別序列，切割位點在識別序列之外的 3'端，式(I)歸結(jié)為式(III):
5，...XXXXX(N)r(N)t (N)J…3' 3'…XXXXX (Nc)r(Nc)t ▲ (Nc》...5 ， (III) r，t,y>0的整數(shù)。
以T位置直接與目標(biāo)RNA相應(yīng)的DNA相連時，SL2連接形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)后延伸是不可能。 代表性的酶Nt.BstNBI、 Nt.AlwI、 Nt.BspQI、 Bsm I、 BsrD I、 BtsCI、 Ecil等；在T位置單切 割(如缺刻酶Nt.BstNBI、 NtBspQI)的切割方式可行，但在A位置切割的單切割方式是不可行的。
2、 酶切割位點在5'端的酶選擇和發(fā)明設(shè)計原則
1) 當(dāng)y-O, p-v=x, 3，-(N)x-5'/5'-(Nc)x-3'為識別序列，切割位點在識別序列的5'端，式(I) 歸結(jié)為式(IV):
5'...XXXXX (N)v▼ (N)x...3' 3，...XXXXX(Nc)p-x(Nc)xA…5' (IV)
v,p,x^0的整數(shù)。
2) 當(dāng)y=0, p = v+x = w+s+x, 5，-(N)w-3，/3'-(Nc)、v-5，為識別序列，切割位點在識別序列之外 的5'端，式(I)歸結(jié)為式(V):
5'…XXXXX(N)w (N)s V(N)x…3' 3'…XXXXX(Nc)w (Nc)s (Nc)xA…5' (V) w,s,x^0的整數(shù)。
以A位置直接與目標(biāo)RNA相應(yīng)的DNA相連時，SL2連接形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)后延伸是可能的。 代表性的酶Nb.BsrD、Nb.BtsI、 Bbs I、 BsmAI、 Faul、 DPMI等;在A位置切割(Nb.BsrDI、Nb.BtsI等)的單切割方式可行，在T位置切割的單切割方式是不可行的。
有些酶特別是切割位點在識別序列內(nèi)部的酶，對于己知序列的RNA的擴增也是可行的。
下面結(jié)合附圖和實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明的目的在于發(fā)明合適的試劑并應(yīng)用這些試劑有效地對核糖核酸(RNA)進行全真的 體外擴增。為了體現(xiàn)本發(fā)明的可行性，本發(fā)明使用miR122作為目標(biāo)RNA進行體外擴增，轉(zhuǎn) 錄形成的產(chǎn)物只比目標(biāo)RNA在5'端增加一個堿基G(少數(shù)情況下3'端會多一個A或C)(J. F. Milligan， etal.，M/c/"'c ^c/血i 饑1987, 15, 8783-8798)。
雖然使用不同的酶相應(yīng)的各種連接物、引物等不一樣，在具體實施例中目標(biāo)RNA的連接、 逆轉(zhuǎn)錄(RT)和PCR流程是一樣的(見圖1)。
實施例1:
限制性內(nèi)切酶的酶切位點在識別序列的3'端的實驗流程如下(見圖l和圖2)。本實施例
5'-CATGV-3'
使用限制性內(nèi)切酶NlallP'-AGTA"'，電泳結(jié)果見圖4。
A. 合適的SL1與目標(biāo)RNA的連接，所得產(chǎn)物稱為Pl 。
為了不會發(fā)生自身連接，首先需要將目標(biāo)RNA進行5'端去磷酸化，然后在連接酶如T4 RNA連接酶的作用下使5'磷酸化的SL1(本發(fā)明的實施例中使用NlaIII，所以SL1的5'端含 有內(nèi)切酶NlaI.II的位點)與去磷酸化的目標(biāo)RNA相連。SL1可以是DNA也可以是RNA，或 者在5'端是RNA的DNA-RNA雜合鏈， 一般而言，RNA單鏈與DNA單鏈的連接效率比兩 條RNA間連接效率要低。由于SL1的3'端被封閉或處于堿基配對中，只能連接單鏈RNA或 單鏈DNA的T4 RNA連接酶不能催化發(fā)生SL1自身連接。
B. 激酶催化下使Pl的5'端發(fā)生磷酸化得產(chǎn)物P2。
為了能夠進行下一步連接，需要對Pl進行5'端磷酸化。5'端磷酸化的Pl稱為P2。
C. P2與LL1連接的產(chǎn)物P3。 P2與LL1(兩端均沒有磷酸化)被連接酶(如T4 RNA連接酶)連接形成產(chǎn)物P3。同樣由于
兩條RNA間連接效率較高，所以LL1是RNA較好。LL1中有啟動子相關(guān)的序列(本發(fā)明中 的實施例1和實施例2使用相同的序列)。
D. P3逆轉(zhuǎn)錄形成P4。
以SLP1為引物在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下形成P3的cDNA，稱為產(chǎn)物P4。E. 對P4進行PCR擴增，得到P5。
以5'端羥基或5'端磷酸化的SLP1和5'端連接有生物素的LLP1為引物對P4進行PCR 擴增，得到產(chǎn)物P5。 LLP1中有啟動子相關(guān)的序列(本發(fā)明中的實施例1和實施例2使用相同 的序列)。
引物也可以設(shè)計為SLP1 5'端為游離羥基，LLP15'端被磷酸化，這樣PCR結(jié)束后使用入 噬菌體核酸外切酶(lexo)(這種酶催化雙鏈DNA分子從5'-P末端進行逐步的水解釋放出5'-單 核苷酸，但不能降解5'-OH末端)，這樣無需經(jīng)過步驟F就可以使P6直接游離出來(Little， J. W. / 5zo/. Cfe附.1967, 2W, 679-686)。
F. 利用其中一條鏈的5'端的生物素對P5的兩條鏈分離。
生物素可以特異地與Streptavidin或Avidin結(jié)合，所以利用含有Streptavidin或Avidin的 磁珠與生物素結(jié)合后對P5的兩條鏈分離(使用Biotin-Streptavidin的參考文獻T. Hul加an， etal.， M^/e/c^c/^y if饑1989， /7, 4937-4946; N. Pourmand， etal., jVwc/e/c j"'<* W" 2002,鄧，e31; M. Uhlen,A^wre, 1989， W0， 733-734)。含有生物素的DNA鏈稱為P7，另一條稱為P6。
G. P6的5'端磷酸化得到P8
利用激酶使P6的5'端發(fā)生磷酸化以便下一步的連接實驗。如果第H步中P8與SL2很好 互配形成唯一內(nèi)切酶位點后直接用內(nèi)切酶切割，本歩驟可以省略。
H. P8與SL2互配和DNA連接酶連接形成具有唯一限制性內(nèi)切酶識別序列和酶切位點的產(chǎn) 物P9。
通過SL2的5'端與P8的3'端互補的特征使SL2與P8互配，然后利用DNA連接酶將其 連接形成了限制性內(nèi)切酶識別序列和酶切位點唯一的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)互配的堿基對數(shù)量足夠多 時，使用DNA連接酶填補缺口 (nick)的必要性不大。
I. 限制性內(nèi)切酶在唯一識別序列和酶切位點切割形成PIO。 限制性內(nèi)切酶在酶切位點的3'端進行切割形成了產(chǎn)物P10(Nla III對切割位點任一端沒有
側(cè)翼堿基時的切割能力較弱，需要較長的切割時間)，P10的5'端開始就是目標(biāo)RNA的cDNA 序列。
J.轉(zhuǎn)錄形成產(chǎn)物RNA序列。
形成的P10在T7啟動子(T7啟動子的基木序列為5'-TAATAC GAC TCA CTA TAG-3')的 存在下經(jīng)轉(zhuǎn)錄酶(T7 RNA聚合酶)的催化作用從啟動子的3'端后開始轉(zhuǎn)錄(J. F. Milligan, etal., 7Vwc/e,'c^c/^W". 1987,15,8783-8798)。為了提高轉(zhuǎn)錄效率和便于區(qū)分新產(chǎn)生的條帶，具體實 驗時先將啟動子與P10互配后再使用Klenow片段催化延長補齊后得產(chǎn)物Pll再轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄形成的產(chǎn)物只比目標(biāo)RNA在5，端增加一個堿基G (少數(shù)情況下3，端會多一個A或C)。如果 需要，可以使用5'生物素或熒光素等標(biāo)記的鳥嘌呤三磷酸核苷酸(GTP)或單磷酸核苷酸 (GMP)作為轉(zhuǎn)錄起始核苷酸(B. Seelig and A. Jaschke, Cfe附.1999， 10,
371-378)，最終形成在5'端生物素或熒光素等標(biāo)記的所需的目標(biāo)RNA。
實施例2:
限制性內(nèi)切酶的酶切位點在識別序列的5'端的實驗流程如下(見圖l和圖3)。本實施例
使用限制性內(nèi)切酶DPNII,其酶切位點為—3'-CTAGA-3 。電泳結(jié)果見圖5。
除SLI的3'端含有內(nèi)切酶DPNII的位點外，步驟A-D與實施例1步驟相同。
E. 對P4進行PCR，得至lJP5。
以5'端為游離羥基的SLP1和5'端連接有生物素的LLP1為引物或5，端連接有生物素的 SLP1和5'端游離羥基的LLP1對P4進行PCR擴增，得到產(chǎn)物P5。 LLP1中有啟動子相關(guān)的 序列。
F. 利用其中一條鏈的5'端的生物素對P5的兩條鏈分離。
生物素可以特異地與Streptavidin或Avidin結(jié)合，所以利用含有Str印tavidin或Avidin的 磁珠與生物素結(jié)合后對P5的兩條鏈分離(使用Biotin的參考文獻T. Hultman, etal., M/c/e/c 1989, 〃， 4937-4946; N. Po醒and, etal.， Jc,'A. L 2002，貝e31; M. Uhlen，
Wa加e, 1989， W0， 733-734)，含有生物素的DNA鏈稱為P7，另一條稱為P6。(如果使用的引 物為5'端連有生物素的SLP1和5，端游離羥基的LLP1，那么最后分離后得到的P6被固相結(jié) 合，P7游離于上清液中。)
G. P7與SL2互配和DNA連接酶連接形成具有唯一內(nèi)切酶識別序列和酶切位點的產(chǎn)物P12。 通過SL2的3'端與P7的5'端互補的特征使SL2與P7互配，然后利用DNA連接酶將其
連接形成了內(nèi)切酶識別序列和酶切位點唯一的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)互配的堿基對數(shù)量足夠多時，使 用DNA連接酶填補缺口 (nick)的必要性不大。
H. 限制性內(nèi)切酶在唯一識別序列和酶切位點切割形成P13。
限制性內(nèi)切酶在酶切位點的5'端對P12進行切割形成了產(chǎn)物P13， P13的3'端開始就是 目標(biāo)RNA相關(guān)的序列。
在不知道目標(biāo)RNA的具體序列或RNA混合物中各個序列的末端不一樣時，設(shè)計可以形 成限制性內(nèi)切酶的識別序列和切割位點的合適兼容的連接物比較困難，尤其對于那些需要在 其切割位點的兩側(cè)有一定數(shù)量堿基的內(nèi)切酶的連接物等的設(shè)計更難。如果在此步限制性內(nèi)切酶切割有困難時，本發(fā)明通過以粘性端為模板以3，-OH為引物進行有限的末端填補實現(xiàn)延長 從而可能增加酶切位點的兩翼堿基對數(shù)量以便于酶的識別和切割。有限的末端填補的一般方 式如下每輪填補最多只加入3種脫氧核苷酸(dNTP)，這樣第n輪至少延長n-l個堿基； 為了延長實驗后不形成第二個內(nèi)切酶的識別序列和切割位點，如本實驗中為了不形成新的 5'-GATC-3'序列，所以第一輪不加dGTP，第二輪不加dATP，第三輪不加dTTP，第四輪不加 dCTP，最終在第四輪時至少延長了三個堿基但不會產(chǎn)生新的5'-GATC-3，序列，這樣的操作既 保證長度的延長又保證沒有產(chǎn)生新的所使用的內(nèi)切酶識別序列和酶切位點。本實驗使用的 DNA聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段。
I. P6與P13進行互配，并用單鏈DNA外切酶水解形成平端DNA雙鏈P14。
形成的P13與P6互配后，鏈P6的5'端單鏈在只能切割單鏈DNA的外切酶exoVII(丄W.
Chase and C. C. Richardson / C7 e肌1974, 249, 4545~4552; J. W. Chase and C. C.
Richardson / S/o/. Cfe肌1974, 249, 4553一561)作用下水解成平端DNA雙鏈P14。
J.轉(zhuǎn)錄形成產(chǎn)物RNA序列。
形成的平端雙鏈DNA在轉(zhuǎn)錄酶(T7 RNA聚合酶)的作用下從啟動子的3'端后開始轉(zhuǎn)錄(J.
F. Milligan， etd., iVwc/e/c /4atfa 1987, 15， 8783-8798)，轉(zhuǎn)錄形成的產(chǎn)物只比目標(biāo)RNA在5，
端增加一個堿基G (少數(shù)情況下3，端會多一個A或C)。如果需要，可以使用5'生物素或熒
光素等標(biāo)記的鳥嘌呤三磷酸核苷酸(GTP)或單磷酸核苷酸(GMP)作為轉(zhuǎn)錄起始核苷酸(B.
Seelig and A. Jaschke, SZocw/Mga/e C/zem. 1999， 10, 371-378)，最終形成在5'端生物素或熒光
素等標(biāo)記的所需的目標(biāo)RNA。
權(quán)利要求
1. 一種用于RNA體外擴增的試劑，其特征在于主要包括以下組份以下N與Nc為互補堿基，d，e，f，h，k，m≥0，g，j，q≥1，b，i，n≥2的整數(shù)；A. 連接物SL1連接物SL1為3′脫氧或被封閉，5’磷酸化的RNA或DNA或DNA-RNA雜合鏈，其通式為5’P-((<u>N</u>)b(N)d-3′，其中((<u>N</u>)b為限制性內(nèi)切酶的識別序列和酶切位點；或連接物SL1為具有Stem-loop結(jié)構(gòu)的RNA或DNA或DNA-RNA雜合鏈，其通式為5’P-(<u>N</u>)b0(N)eN(N)fNN(N)gNNc(Nc)fNc-3′，其中(<u>N</u>)b為使用的限制性內(nèi)切酶的識別序列和酶切位點，N(N)gN為Stem-Loop結(jié)構(gòu)中Loop的堿基序列；B. 線性連接物L(fēng)L1為含有啟動子相關(guān)序列的RNA或DNA或DNA-RNA雜合鏈，其通式為5′-(N)h(NNN......NNN)-3′，其中，(NNN......NNN)為所用啟動子的相關(guān)序列；C. 引物SLP1是以SL1為基礎(chǔ)設(shè)計的用于RT和PCR的DNA序列，其3’端含有限制性內(nèi)切酶的識別序列和內(nèi)切酶位點，其5’端是游離的羥基或被磷酸化或連接有生物素；D. 線性引物L(fēng)LP1是以LL1為基礎(chǔ)設(shè)計的用于PCR的DNA序列，其5’端是游離的羥基或被磷酸化或連接有生物素；E. 連接物SL2為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)切割點在5’端的時，連接物SL2的3’粘性端部分或全部與SLP1序列一致，其通式為其中為形成環(huán)的堿基序列，(N)i和(Nc)i為形成環(huán)后互配的部分，5’磷酸化或不磷酸化；或連接物SL2為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)切割點在3’端的時，連接物SL2的5’粘性端部分或全部與SLP1序列互補，其通式為其中為形成環(huán)的堿基序列，(N)n和(Nc)n為形成環(huán)后互配的部分，所述cSLP1是SLP1的互補堿基序列；或當(dāng)已知序列的單個RNA樣本中沒有所用的內(nèi)切酶識別序列和切割位點時，所述連接物SL2是線性結(jié)構(gòu)，其堿基組成是或包含引物SLP1或互補于引物SLP1；F. 限制性內(nèi)切酶；G. 啟動子和相應(yīng)的RNA聚合酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于RNA體外擴增的試劑，其特征在于所述引物SLP15'端為游 離羥基或5'端被磷酸化和引物L(fēng)LP15'端連接有生物素；或引物SLP1 5'端為游離羥基和引 物L(fēng)LP1 5'端被磷酸化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于RNA體外擴增的試劑，其特征在于所述啟動子為T3、 T7 或SP6啟動子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求所述的用于RNA體外擴增的試劑，其特征在于連接物SL1和線性連接 物L(fēng)L1為RNA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于RNA體外擴增的試劑，其特征在于酶切位點在識別序列的 5'端時，使用的限制性內(nèi)切酶為Tsp5091、 Fatl、 BfuC I、 Dpn II、 Mbo I、 Sau3AI、 BssK I 、 StyD41、 MaeIII、 PspGl、 Tsp45、 Alwl、 Bbs I、 Bbv I、 Bcc I、 BceAI、 BfuAI、 Bsa I、 BsmAI、 BsmBI、 BsmF I、 BspM I、 BspQI、 BtgZ I、 Earl、 EcoP15 I、 Faul、 Fok I、 Hgal、 HpyAV、 Ple I、 Sap I、 SfaN I、 Nb.BtsI、 Nb.BsrDI或Nt.CviPII;或酶切位點在識 別序列的3，端時，使用的限制性內(nèi)切酶為Tail、 NlaIII、 Hpy991、 Acu I、 Bae I、 Bcg I、 BciVI、 Bmrl、 Bpm I、 BpuE I、 BsaX I、 BseRI、 Bsgl、 Bsm I、 BspCN I、 Bsrl、 BsrD I、 Btsl、 BtsCI、 CspCI、 Ecil、 Hphl、 Mbo II、 Mme I、 Mnl I、 NmeAIII、 Topoisomerase I、 TspRI、 Nt.AlwI、 Nt.BstNB或NtBspQI
6. —種用于RNA體外擴增的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的用于RNA體外擴 增的試劑，包括以下步驟-A. 連接物SL1與去磷酸化的目標(biāo)RNA連接；B. 步驟A得到的產(chǎn)物磷酸化后與線性連接物L(fēng)L1連接；C. 步驟B得到的產(chǎn)物以SLP1為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;D. 所得cDNA以引物SLP1和線性引物L(fēng)LP1進行PCR擴增后，分離得到DNA的兩條 單鏈；E. 按照酶切位點在識別序列的5'端或3'端設(shè)計的連接物SL2，與步驟D中相應(yīng)的DNA 單鏈連接后通過莖環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)建了內(nèi)切酶的唯一酶切位點，經(jīng)酶切得切割產(chǎn)物；或當(dāng)己 知序列的單個RNA樣本屮沒有所用的內(nèi)切酶識別序列和切割位點時，得到的PCR產(chǎn) 物直接進行酶切割，得切割產(chǎn)物；F. 切割產(chǎn)物在啟動子和相應(yīng)的RNA聚合酶作用下進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA序列；或切割產(chǎn) 物與包含目標(biāo)RNA的cDNA鏈互配后由外切酶除去非互配的單鏈部分，所得產(chǎn)物在 啟動子存在下和相應(yīng)的RNA聚合酶作用下進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需的RNA序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于RNA體外擴增的方法，其特征在于所述步驟D中引物SLP1 和引物L(fēng)LP1中至少有一個引物的5'端連接有生物素，PCR擴增后利用生物素和 Strepavidin/Avidin的結(jié)合將DNA的兩條鏈分離。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于RNA體外擴增的方法，其特征在于所述步驟D還包括將分 離得到的不含生物素的單鏈DNA的5'端磷酸化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于RNA體外擴增的方法，其特征在于所述步驟E中酶切位點 在識別序列的5'端時，利用大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段通過末端有限填補延長互補序列增加酶切位點的兩翼堿基數(shù)量以便于酶的識別和切割。
10.根據(jù)權(quán)利要求6 — 9任一項所述的用于RNA體外擴增的方法，其特征在于步驟F中， 轉(zhuǎn)錄時，使用5'生物素或熒光素標(biāo)記的鳥嘌呤二磷酸核苷酸或單磷酸核苷酸作為轉(zhuǎn)錄起 始核苷酸，最終形成在5'端生物素或熒光素等標(biāo)記的所需的RNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于RNA體外擴增的試劑及方法，包括連接物、引物、啟動子和限制性內(nèi)切酶等，達到了體外擴增RNA的目的。本發(fā)明中目標(biāo)RNA經(jīng)過與連接物連接，在引物存在下進行RT-PCR后得到擴增，再使用了莖環(huán)的結(jié)構(gòu)形成了限制性內(nèi)切酶的唯一位點，酶切所得產(chǎn)物在啟動子啟動下經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后可以得到除了5’端多一個G和少數(shù)3’端多一個A或C外與目標(biāo)RNA樣本完全一樣的序列，所得的RNA產(chǎn)物與原樣本RNA一樣可以直接使用。本發(fā)明可以應(yīng)用到各種與核糖核酸應(yīng)用等相關(guān)的方面包括一般性科研、醫(yī)療檢測和法醫(yī)鑒定。
文檔編號C12N15/10GK101445797SQ20081021976
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者萬軍庭, 周國春, 浩 成, 楊方義 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院