專利名稱：兩種異黃酮類化合物制備方法及其抗腫瘤與抗植物病菌用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用內(nèi)生真菌YT2-02生產(chǎn)兩種異酮類化合物的生產(chǎn)方法；本發(fā)明還涉及該類 化合物在制備細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術(shù)：
有關(guān)異黃酮類化合物的文獻報道較多，但是從內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)液中分離制備這類化合 物未見報道。本發(fā)明人研究得知，內(nèi)生真菌YT2-02液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后的粗提物有 很好的細胞增值抑制活性，遂對其活性成分進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)所示異黃酮類化合物具有 抗腫瘤活性和抗植物病菌作用，目前尚未見從內(nèi)生真菌中分離培養(yǎng)制備具有細胞增殖抑制活 性的異黃酮化合物的報道，抗腫瘤藥物市場上也尚未見有與此有關(guān)的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供兩種具有很強的細胞增殖抑制抗腫瘤活性與抗植物病菌的化合物的新 制備途徑。兩種化合物的結(jié)構(gòu)式分別是
8'
7'
化合物I 化合物II
本發(fā)明采用MTT法測試了化合物I 1I對HCT-8、 A549、 BEL-7402、 BGC-823和A2780細胞
株的抗腫瘤活性。實驗證實，化合物in對這兩種腫瘤細胞均有抗腫瘤作用；本發(fā)明采用碟
紙片法測得化合物抗真菌活性。化合物I II對幾種植物致病菌生長均有抑制活性。
因此本發(fā)明的化合物in可用作腫瘤細胞細胞增殖抑制劑或化合物in可用于生物農(nóng)藥。
本發(fā)明的化合物in可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)來獲取，含有該異黃酮類化合物的發(fā)酵物，經(jīng)硅膠柱層析、制備HPLC等方法分離純化得到。
本發(fā)明的下述實施例中列舉了利用內(nèi)生真菌YT2-02制備本發(fā)明式化合物I II實例及化
合物in抑制多種腫瘤細胞增殖抑制和抑制植物病菌實例。
本發(fā)明的內(nèi)生真菌采自廣西北海圍洲島海綿樣品及魚藤根中分離得到的一株代號為 YT2-02的內(nèi)生真菌，該菌株微生物具有形狀球形，豐茂的白色氣生菌絲，分生孢子梗分枝 次數(shù)為2-3次。
需要特別說明的是化合物I II結(jié)構(gòu)中含有多個手性碳，目前尚不能大規(guī)模的合成生產(chǎn)； 文獻報道化合物I在植物中含量非常低，也不適宜大量生產(chǎn)獲?。换衔颕 II具有抑制多種 腫瘤細胞增殖活性及抑制植物病菌活性。
具體實施例方式
在如下的實施例中所指的化合物I II的化學結(jié)構(gòu)分別是 實施例1 化合物I II的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制
1發(fā)酵生產(chǎn)
生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取內(nèi)生真菌YT2-02適量，接種到PDA 固體斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
取斜面培養(yǎng)3天的內(nèi)生真菌YT2-02適量，接種到裝有120mL培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/ 升)麥芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0, KH2PO40.5， MgSO40.3,酵母膏3.0， pH自 然]的500mL錐型瓶中，在28C、 120轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時，獲得內(nèi)生真菌的種 子培養(yǎng)液。按10%接種量將該種子培養(yǎng)液接種于裝有200毫升優(yōu)化后的生產(chǎn)培養(yǎng)液，培養(yǎng)基 組成(克/升)可溶性淀粉30g，蔗糖！0g，麥芽糖20g，蛋白胨6g，酵母膏2g，黃豆粉 4g，谷氨酸鈉0.5g，七水硫酸鎂0.08g，磷酸二氫鉀1.2g，裝載于28'C、 140轉(zhuǎn)/分鐘的搖床 上，進行為期IO天的生產(chǎn)發(fā)酵，獲得菌絲體和發(fā)酵液。2浸膏的獲得
用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮，所得 水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發(fā)酵液減壓濃 縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取二次，合并菌絲體和發(fā)酵液的浸膏，共48.0克。 3化合物的分離精制
浸膏(48.0克)用氯仿-甲醇(9:l)混合溶劑溶解后，力口 100克200-300目硅膠H (青島 海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以環(huán)己烷、環(huán)己院-氯仿， 氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，分為10個流份。Fr-2(12g，氯仿-甲醇50: 1洗脫物)，以 氯仿-甲醇(20: l)為溶劑進行硅膠柱層析，再經(jīng)HPLC以甲醇-水(70: 30)為溶劑得化合物 I (折算得3.6g); Fr-3 (4.8克，氯仿-甲醇15: 1洗脫物)，再經(jīng)半制備HPLC(甲醇-水65:
35)得化合物H (折算得2.1g)。
化合物I為無色絲狀晶體，m.p. 198 199°C， [a]25 D =-22°(c 0.024， C6H6)。 ESI-MS 在m/z 393、 433、 843處給出[M-H20+H]+、 [M十Na計[2M+Na]十離子峰，其核磁共振氫譜數(shù) 據(jù)和碳譜數(shù)據(jù)與tephrosin文獻一致(表1)。
化合物II為無色片狀晶體，m.p. 162 164'C,[a]25D =-228° (c 0.024， C6H6)。 ES1-MS 在m/z 394處給出[M+H]+準分子離子峰。其核磁共振氫譜數(shù)據(jù)和碳譜數(shù)據(jù)與rotencme文獻一 致(表1)。
Table 1NMR data of compound T II
position'H'3C
1212
16.56(s)6.77(s)108.6(d)108.4(d)
la//跳3(s;i107.6(s)
2//143.9(s)143.8(s)
3//151.0(s)149.4(s)
46.48( s)6.45(s)101.0(d)100.8(d)
43/ // /148.3(s) /147.3(s) /
6/ 4.50(dd, J=2.3, J=12)/ 4.56(dd,2.3'^12)/ 63.8(t)63.6(t)
4.62 ( d， J=2.3) /4.93(m) /76.8(d) /75.9(d) /
/ 7a/ //156.6(s)/ 157.9(s)
8//1U.8(S)112. 5(s)
9//]60.7(s)167.3(s)
107.72(d,J=8.7Hz)7.84 (d, J=8.3Hz)109.0(d)110.3(d)
116.47(d, ./=8.7Hz)6.51(d,^8.3Hz)128.7(d)129.6(d)
lla//111.8(s)U3.3(s)
12//191.3(s)m.9(s)
12a/4.18(d，J=12)67.4(s )45.3(d)
4,6.60(d,J,3.32, 2.95(dd,/=l 5.6, 7.8)115.4(s)3I.2(t)
5,5.24(t, J=9.2)128.5(s)87.8(s)6' / / 77.2(s) M2.9(s)
7' 1.38(s) 1.77(s) 28.2'28.5(q) 17.1(q)
8' 1.45(s) 4.9(m) / H2.9(t)
OH 4.47(br) / / /
OCH3 3.72(s), 3.82(s) 3.77(s), 3.80(s) ——5一丄8， 56.2， 55.8(q)
a 'H and l3C NMR were obtained at 600 MHz and 150 MHz in CDCl] at room temperature, respectively.
本發(fā)明采用MTT法測試了式I -II化合物對HCT陽8、 A549、 BEL-7402、 BGC-823禾li A2780
細胞株的抗腫瘤活性。實驗證實，式I -II化合物對這兩種腫瘤細胞均有抗腫瘤作用；本發(fā)
實施例2 抗腫瘤活性的測試
1實驗樣品及實驗方法
被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的純品化合物I II。準確稱 取適量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供活性測試。
細胞系及細胞的繼代培養(yǎng)活性測試采用HCT-8、 A549、 BEL-7402、 BGC-823和A2780細 胞系。各種細胞均用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37°C通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱 中繼代培養(yǎng)。
細胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)
本發(fā)明采用MTT法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性。活細胞線粒體 中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3- (4， 5-二甲基噻唑)-2， 5-二苯基四氮唑為藍紫色的 不溶于水的formazan, formazan的多少可通過酶標儀測定其吸收度求得。由于formazan的量 與活細胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)吸收度求出活細胞的數(shù)目，從而了解藥物抑制或殺傷腫瘤細 胞的能力。
活性測試時，収對數(shù)生長期的HCT-8、 A549、 BEL-7402、 BGC-823和A2780細胞，用新鮮 的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升5><104個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種 于96孔板中，在37。C下培養(yǎng)24小時后，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 72小時。然后加入20" L含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培養(yǎng)4小時，移出150u L 培養(yǎng)液后加入150uL DMS0溶解formazan，在540 r皿處測定其吸收度。按照IR%=(OD別 對照-OD H,H|)/ OD別對照X100。/。式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR%)。
2實驗結(jié)果
表1化合物I n對腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC50 (mol'L-1) Tablel IC50 values of compound I II against cancer cells (mol*L-l)
^ IC50(M) sample
_HCT-8_Bel-7402BGC-823_A549_A2780
Comp畫d I
Compound II 1.7xl0-6 2.7xl(T6 9.0xl(T5 8.7xl0-5 3.5xlO-6sunitnib 3.6xl(T0 7.6><10-b 2.4xl(T0 1.2x10—° 3.6"0-°
實施例3抗腫瘤活性的測試
本發(fā)明采用碟紙片法測得化合物抗真菌活性如表2所示，其屮魚藤酮對幾種植物致病菌 生長均有抑制活性，對葡萄白腐病菌抑制率可達61.1%。 表2純化合物對病菌菌絲生長的抑制作用
Table 2 Inhibition of compound against plant pathogen_
病菌生長抑制率(％ )
樣 品 ---------—-■-~~-
^葡萄內(nèi)腐病齒 蘋果腐爛病菌_蘋果輪紋病齒 ^^feg^Til
Compound 1 61.1 87.7 43.6 41.3
Compound II 22. 6 _13.6 81. 3 13.2
4結(jié)論
化合物I II對包括人在內(nèi)的哺乳動物來源的癌細胞具有抗腫瘤作用，化合物I對葡萄白
腐病菌，蘋果腐爛病菌，化合物n對蘋果輪紋病菌有很好的抑制作用
因此化合物I II可作為抗腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用于抗腫瘤的研究中，具有開發(fā)為抗 腫瘤藥物的潛力；也可作為生物農(nóng)藥來開發(fā)應用。
權(quán)利要求
1. 化合物I II化合物化合物I 化合物II
2. 權(quán)利要求i所述式i n化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)內(nèi)生真菌YT2-02 ，獲取含有述式I II化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出式化合物III 。
3. 權(quán)利要求2所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以環(huán)已烷、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫；其中氯仿-甲醇50: 1洗 脫部分，以氯仿-甲醇20: l為溶劑進行硅膠柱層析，再經(jīng)HPLC以甲醇-水70: 30為溶劑分離得到式I II化合物。
4. 權(quán)利要求2所述式i n化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)內(nèi)生真菌YT2-02的新型培養(yǎng)基，，每升所述新型培養(yǎng)基包括可溶性淀粉20 100g，蔗糖10 100g，麥芽糖20 100g，蛋白胨0.5-6g，酵母膏0. 3-6g, 黃豆0.2-4g，谷氨酸鈉0.5-10g，七水硫酸鎂0.01-lg，磷酸二氫鉀 0.01-2g，其余為人工海水，還提供了其制備方法。本發(fā)明的原料易得、 成本低、制備方法簡單、能顯著促進異黃酮化合物I II的產(chǎn)量，化合物I II產(chǎn)量從原始的15mg/L提高到100 mg /L,有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，對化合物in在醫(yī)藥學及生物農(nóng)藥研究具有重要意義。
5. 權(quán)利要求i所述的化合物i ， n在制備抑制腫瘤細胞增殖藥物中的用途。
6. 權(quán)利要求i所述化合物i n在制備抗腫瘤藥物中的用途。
7. 權(quán)利要求1所述化合物I II在抗植物有害病菌增殖藥物中的用途。
8. 權(quán)利要求i所述化合物i n在生物農(nóng)藥中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩種異黃酮類化合物的制備方法及其抗腫瘤與抗植物病菌用途。本發(fā)明用采自海綿及魚藤內(nèi)生真菌YT2-02次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)出兩種異酮類結(jié)構(gòu)化合物。經(jīng)生物活性試驗證實，這兩種異酮類結(jié)構(gòu)化合物可作為細胞增殖抑制劑或抗植物病菌劑。
文檔編號C12P17/18GK101423521SQ200810185190
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者捷 侯, 孫麗萍, 尹志偉, 方玉春, 朱天驕, 王長云 申請人:中國海洋大學