專利名稱：：一種應(yīng)用懸浮芯片技術(shù)檢測福氏志賀氏菌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)檢測芯片，具體涉及一種用于志賀氏菌檢測的懸浮芯片。技術(shù)背景懸浮芯片技術(shù)是將基因芯片技術(shù)與流式細(xì)胞儀技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生的一種新技術(shù)，是一種多重?cái)?shù)據(jù)獲取和分析平臺(tái)，全名為"多功能多指標(biāo)同步分析體系"(FlexibleMultipleAnalyteProfiling,xMap)，也稱為Multi曙AnalyteSuspensionArray,有機(jī)整合了熒光編碼微球、激光技術(shù)、微流體技術(shù)、快速信號處理和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，即保證了信號質(zhì)量，又提供高通量的新一代分子檢測技術(shù)平臺(tái)。懸浮芯片與傳統(tǒng)的基因芯片最大不同之處在于，傳統(tǒng)的基因芯片點(diǎn)樣在玻片或尼龍膜上，依靠坐標(biāo)定位進(jìn)行尋址，而懸浮芯片將檢測探針共價(jià)交聯(lián)到不同的色標(biāo)微球上，根據(jù)色標(biāo)微球上所帶的熒光素進(jìn)行區(qū)分。懸浮芯片系統(tǒng)主要由三部分組成1、微球直徑5.6pm左右，由聚苯乙烯構(gòu)成的，表面帶有約108個(gè)羧基位點(diǎn)，可與寡核苷酸探針和蛋白以肽鍵耦聯(lián);2、熒光素微球中標(biāo)記了紅色和橙色熒光素，每種分成10個(gè)濃度梯度，將微球分成可被識(shí)別的100種微球，當(dāng)微球被635nm激光激發(fā)后，能發(fā)射658nm和712nm的熒光；3、檢測儀因微球直徑5.6pm，并被熒光標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)原理進(jìn)行檢測。原理每一種色標(biāo)微球可通過羧基，與特定的分析物質(zhì)(寡核苷酸探針、抗原、抗體等)共價(jià)結(jié)合。將標(biāo)記生物探針的微球與待測物進(jìn)行特異性的結(jié)合，再和帶有第三種熒光素的報(bào)告分子反應(yīng)，在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可同時(shí)對一個(gè)樣本中的100種不同目的分子進(jìn)行檢測。反應(yīng)后，采用96孔板進(jìn)行進(jìn)樣。檢測儀自動(dòng)將反應(yīng)液吸起加入蠕動(dòng)泵，泵入一個(gè)微細(xì)管中，在鞘液的作用下，單排分布的微球單個(gè)通過檢測通道。檢測通道中設(shè)有兩個(gè)激光探頭，一個(gè)探頭可發(fā)射635nm波長的激光，可激發(fā)標(biāo)記微球的兩種熒光素，從而識(shí)別不同的色標(biāo)微球，進(jìn)行定性檢測；另一激光探頭可激發(fā)報(bào)告分子的熒光素，通過測定微球所帶報(bào)告分子熒光信號的強(qiáng)度，可進(jìn)行定量檢測。因此，懸浮芯片可進(jìn)行定性定量檢測目標(biāo)分子。當(dāng)樣本中含有目的分子，目的分子與特定的微球所帶的探針吸附在一起時(shí)，兩道激光所激發(fā)的熒光均可被檢測到;若樣本中不含目的分子，則僅能檢測到微球所帶的熒光。通過數(shù)字信號處理器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)軟件，分析兩道激光所激發(fā)熒光的波長和信號強(qiáng)度，從而判斷待檢樣本中幾種至數(shù)十種檢測目標(biāo)物，并通過檢測熒光信號強(qiáng)度，對檢測物進(jìn)行定量分析。自動(dòng)加樣器依次將不同樣本加入蠕動(dòng)泵中，樣本之間用一小段氣柱分隔開，這樣在連續(xù)分析過程中不但可以區(qū)分不同樣本，可還以防止樣本間的污染。與其它蛋白質(zhì)和核酸檢測方法相比較，懸浮芯片具獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)1)應(yīng)用范圍廣微球表面的羧基可與核酸探針和蛋白分子耦聯(lián)，能對目的核酸和蛋白分子進(jìn)行定性定量研究；2)敏感性高以微球作為反應(yīng)載體，增加了反應(yīng)物接觸面積；每個(gè)微球表面帶有約108個(gè)羧基位點(diǎn)，以共價(jià)鍵方式耦聯(lián)寡核苷酸探針、抗體或抗原，探針密度高，產(chǎn)生的信號強(qiáng)；使用熒光檢測，放大了反應(yīng)信號，敏感性大大提高。3)重復(fù)性好所進(jìn)行的生物反應(yīng)是在液相環(huán)境中進(jìn)行的，利于保持核酸、蛋白等生物分子天然構(gòu)象，克服了傳統(tǒng)芯片空間效應(yīng)的影響，也更利于探針和被檢物質(zhì)的反應(yīng)，提高了檢測的準(zhǔn)確性；4)信噪比低在微細(xì)管中對單個(gè)微球進(jìn)行檢測，不存在本底影響檢測的問題，無需洗脫去除本底；5)高通量可以同時(shí)對同一樣本中的多重不同目的分子進(jìn)行定性定量分析，即提高了檢測信息通量，又節(jié)約了樣本用量；6)快速高效大大提高了反應(yīng)速度和檢測速度。由于所進(jìn)行的生物反應(yīng)是在液相環(huán)境中進(jìn)行的，雜交僅需15分鐘即可完成，提高了反應(yīng)速度；在35—60分鐘內(nèi)，可對96個(gè)不同樣本分別同時(shí)進(jìn)行多達(dá)100種指標(biāo)的檢測；利用96孔板和自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，可連續(xù)進(jìn)行nX96個(gè)樣品的檢7)成本低制備過程無需特殊設(shè)備，只進(jìn)行羧基與氨基間的脫水成肽反應(yīng)即可，簡單易行；由于是液體儲(chǔ)存方式，一次制備可多次使用，平均每個(gè)指標(biāo)檢測成本僅需2.5—5.0元；8)易于標(biāo)準(zhǔn)化基于上述特點(diǎn)，使得該技術(shù)能夠做到標(biāo)準(zhǔn)化，易于試劑盒的研制和推廣。目前，懸浮芯片是美國FDA唯一批準(zhǔn)用于臨床診斷(自身免疫病檢測和人類白細(xì)胞抗原分型)的生物芯片。人類對志賀氏菌高度敏感，只需少于十個(gè)菌即可引起人的感染，因此其傳染性強(qiáng)，危害性大。據(jù)國內(nèi)相關(guān)資料顯示，志賀氏菌在我國感染性腹瀉病原菌中居首位；美國國家申報(bào)疾病監(jiān)控系統(tǒng)及公共衛(wèi)生試驗(yàn)信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)顯示，每年因志賀氏菌引起的病例高達(dá)448,240例，死亡70例；WHO年度報(bào)告指出，在亞非拉各國細(xì)菌性腹瀉病例多達(dá)1.5-2.5億人，死亡65萬。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局2002年第25號、26號令中明確規(guī)定志賀氏菌為食品中必檢項(xiàng)目。志賀氏菌具四個(gè)血清型，福氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌，不同血清型志賀氏菌發(fā)病率具明顯的地域性；在我國福氏志賀氏菌發(fā)病率占志賀氏菌發(fā)病率的80%(馬宏，2006)，是主要致病菌群。目前，在志賀氏菌的成熟檢測技術(shù)中，只能實(shí)現(xiàn)屬水平檢測，無法進(jìn)一步獲得種水平上的信息。而不同種型志賀氏菌在最少感染劑量、致病性、抗藥性等方面具較大差距，因此實(shí)現(xiàn)種水平的檢測將為臨床治療提供重要信息，同時(shí)也為食品生產(chǎn)、環(huán)境監(jiān)控提供有力技術(shù)支撐。對福氏志賀氏菌O-抗原基因簇生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，此基因簇具一段高度特異序列，此序列位于O-抗原聚合酶基因上，僅與傷寒沙門氏菌有較小的同源性，且與其它血清型志賀氏菌，也具較大差異性(Huo-ShuH.Houng,1997)。通過對此基因序列在分子生物學(xué)上的分析，可在分子水平上實(shí)現(xiàn)對福氏志賀氏菌的檢測、鑒定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在提供一種檢測福氏志賀氏菌的懸浮芯片。本發(fā)明所提供的懸浮芯片包括診斷微球和與此微球耦聯(lián)的特異性寡聚核苷酸探針，其中寡核苷酸探針序列為福氏志賀氏菌O-抗原聚合酶基因的一段序列。本發(fā)明還公開了一段寡聚核苷酸探針序列，該序列為S.frfc-Probe:5'-NH2-(CH2)12-GAACCAAATCCTCTTCCAAAC-3',如序列表中序列3所示，并在5'進(jìn)行NH2-(CH2)12修飾。此外本發(fā)明的懸浮芯片還包括一對特異性引物，上游引物為B-S.frfc-F:5'-CGGATCACGCAGTGAAGAT-3'(見序列表中序列1，進(jìn)行Biotin標(biāo)記)；下游引物為S.frfc-R:5'-CCAATAACGCCTGTTTTCTGA-3'(見序列表中序列2)。上述引物可擴(kuò)增包含上述探針序列的一段rfc基因序列。本發(fā)明的另一目的在于提供上述懸浮芯片的制備方法，該方法包括以下步常PCR反應(yīng)。發(fā)明的懸浮芯片可以對福氏志賀菌進(jìn)行鑒定和檢測，具有高特異性、高靈敏度、快速、低成本易于推廣等特點(diǎn)。圖1特異性試驗(yàn)結(jié)果；具體實(shí)施例方式為進(jìn)一步說明本發(fā)明在福氏志賀氏菌檢測中的應(yīng)用，特舉以下較佳實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的應(yīng)用并不限于實(shí)施例。實(shí)施例一引物的設(shè)計(jì)和合成1)序列獲得通過對福氏志賀氏菌O-抗原基因簇序列分析，選取特異性基因rfc作為靶序列，并從GenBank公共數(shù)據(jù)庫中獲得此基因序列，編號為L07293.1;2)設(shè)計(jì)引物采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，相關(guān)參數(shù)為Tm值55.0°C—59.0°C，GC值40.0%—60.0%，PCR產(chǎn)物大小為lOObp—500bp，引物大小22土3bp;3)引物選擇將軟件輸出的引物進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖謩?dòng)調(diào)節(jié)，增加或減少幾個(gè)堿基，然后在GenBank進(jìn)行在線Blast比對，選取特異性高的引物，并將其中的一條進(jìn)行5'末端Biotin標(biāo)記。上游引物序列為B-S.frfc-F:5'-Biotin-CGGATCACGCAGTGAAGAT-3'(序列表中序列1)，下游引物為S.frfc-R:5'-CCAATAACGCCTGTTTTCTGA-3'(序列表中序列2)，擴(kuò)增片段大小為174bp;4)引物合成上海生工合成下游引物S.frfc-R，大連TakaRa合成Biotin標(biāo)記的上游引物B-S.frfc-F。1)制備寡聚核苷酸探針；2)用純水稀釋氨基修飾的探針；3)將儲(chǔ)備的微球振蕩，然后轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；4)離心收集微球，加入MES液進(jìn)行振蕩；5)向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；6)在微球溶液中加入新配制的10mg/mlEDC，振蕩；然后進(jìn)行溫育；7)再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振蕩，然后進(jìn)行溫育；8)向微球溶液中加0.02。/。Tween-20，離心收集微球；9)用0."/。SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；10)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)，2—8。C，避光保存。應(yīng)用本發(fā)明的懸浮芯片檢測福氏志賀氏菌是通過以下方法進(jìn)行的。根據(jù)福氏志賀氏菌rfc基因設(shè)計(jì)并合成用于PCR擴(kuò)增的特異性引物，如序列表中序列1和2所示，并對其中一條引物進(jìn)行Biotin修飾；按常規(guī)方法制備待檢樣本基因組DNA作為模板，使用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)使PCR產(chǎn)物帶上Biotin修飾；將PCR產(chǎn)物與制備的懸浮芯片雜交，也就是與耦聯(lián)在微球上的探針進(jìn)行雜交，對雜交懸浮芯片進(jìn)行鏈霉親和素化藻紅蛋白標(biāo)記，然后通過流式細(xì)胞儀檢測熒光信號。本發(fā)明的另一目的提供一種克服PCR假陽性的方法。本發(fā)明采用的UNG一Taq酶體系，有效的控制了PCR假陰性產(chǎn)生。具體方法是PCR反應(yīng)體系中，將dTTP量減半，由dUTP替代，并加入0.05U的UNG(尿嘧啶DNA糖苷酶)。PCR產(chǎn)物中被摻入一定量的dUTP，UNG通過打斷核酸鏈上dUTP上的糖苷鍵，使含dUTP的核酸不能作為模板被識(shí)別。在運(yùn)行PCR程序之前先37。C溫育5min，使UNG充分消化PCR產(chǎn)物，94。C模板變性時(shí)，UNG失活，進(jìn)行正實(shí)施例二探針的設(shè)計(jì)和合成5)序列獲得在上述擴(kuò)增片段非引物區(qū)設(shè)計(jì)探針；6)設(shè)計(jì)探針采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)探針，選定HybridizationProbes命令，在Anti-sense鏈上設(shè)計(jì)探針，參數(shù)同實(shí)施例一；7)探針選擇將軟件輸出的探針進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖謩?dòng)調(diào)節(jié)，增加或減少幾個(gè)堿基，然后在GenBank進(jìn)行在線Blast比對，選取特異性高的探針，在5'末端進(jìn)行NH2-(CH2),2修飾，選定的探針序列為S.frfc-Probe:5'-NH2-(CH2)12-GAACCAAATCCTCTTCCAAAC-3'(序列表中序列3);8)探針合成大連TakaRa合成上述探針。實(shí)施例三懸浮芯片的制備方法1.用純水稀釋氨基修飾的探針到lmM(lnanomole/|il);2.將儲(chǔ)備的微球振蕩20sec;3.取200^1微球轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；4.收集微球，8000g，離心l-2min;5.棄上清，加入50(il0.1MMES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonicacid，2-(N-嗎啉代)乙磺酸)液pH4.5，振蕩20sec;6.向懸浮微球中加入2pllmM的探針，振蕩20sec;7.準(zhǔn)備新鮮的10mg/mlEDC(l-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride,l-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺)，用dH2。；8.向微球溶液中加入2.5^1新配置的lOmg/mlEDC,振蕩；9.在室溫黑暗條件下溫育30min;10.再次準(zhǔn)備新鮮的10mg/mlEDC，用dH20;11.向微球溶液中加入2.5^1新配置的10mg/mlEDC，振蕩；12.在室溫黑暗條件下溫育30min;13.向微球溶液中加l.OmL0.02%Tween-20;14.8000Xg離心l一2min，收集微球；15.棄上清，用1.0mL0.1。/oSDS重懸微球;16.8000Xg離心l一2min,收集微球；17.用100plTE，pH=8.0，懸浮微球，18.用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)19.將微球2—8"C，避光保存?zhèn)溆谩?shí)施例四懸浮芯片快速檢測福氏志賀氏菌方法1)TIANampBacteriaDNAkit試劑盒提取待檢樣本基因組DNA。2)PCR擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)條件如下-表格1PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>PCR反應(yīng)程序?yàn)?4。C變性3min;運(yùn)行35個(gè)循環(huán)94。C30sec，53°C30sec72°C40sec;最后，72°C延伸3min。3)雜交雜交液組成33.3li11.5XTMAC(tetramethylammoniumchloride,氯化四甲銨)，5ul上述PCR產(chǎn)物，加入5000個(gè)與探針耦聯(lián)的微球，1XTE將體積補(bǔ)充到50lU。將雜交液在95°C變性4min,52°C雜交15min以上。4)檢測將上述雜交后的溶液全部轉(zhuǎn)移到96孔濾板中，真空過濾收集微球，用2ug/mlS-R-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin，鏈霉親和素化藻紅蛋白)重懸微球，置52。C10min，Luminex檢測。實(shí)施例五懸浮芯片的特異性驗(yàn)證特異性試驗(yàn)用本發(fā)明的懸浮芯片對不同菌株進(jìn)行特異性驗(yàn)證，其檢測范圍包括以下三類菌株a)屬于前述的1株福氏志賀氏菌和4株非福氏志賀氏菌；b)與志賀氏菌親緣關(guān)系較近的大腸桿菌、沙門氏菌；C)其它有關(guān)菌株。菌株具體信息如下表格1_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>20肺炎克雷伯氏菌CMCC4611743綠膿桿菌ATCC902721陰溝腸桿菌CMCC4530I44單增李斯特菌本室保22產(chǎn)氣腸桿菌CMCC4510345小腸結(jié)腸炎耶爾森氏CMCC5220323枸櫞酸桿菌CMCC4801746PCRBlank針對上述菌株，按實(shí)施例四中的方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示福氏志賀氏菌呈陽性結(jié)果，其它非福氏志賀氏菌均為陰性，特異性達(dá)100%。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>—種應(yīng)用懸浮芯片技術(shù)檢測福氏志賀氏菌方法<140><141><160〉3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1CGGATCACGCAGTGAAGAT19<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2CCAATAACGCCTGTTTTCTGA21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3GAACCAAATCCTCTTCCAAAC2權(quán)利要求1.一種用于福氏志賀氏菌檢測的懸浮芯片，包括診斷微球和固定在該診斷微球上的寡聚核苷酸探針，其特征是該寡聚核苷酸探針是福氏志賀氏菌O-抗原聚合酶基因rfc上的一段序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于福氏志賀氏菌檢測的懸浮芯片，其中寡聚核苷酸探針序列如序列表中序列3所示，在其5'進(jìn)行NH2-(CH2)12修飾。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述福氏志賀氏菌檢測的懸浮芯片，其特征是該芯片可鑒定和檢測福氏志賀氏菌。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述福氏志賀氏菌檢測的懸浮芯片，其特征在于包括一對特異性引物，引物序列如序列表中序列1和2所示，并對序列1進(jìn)行5'Biotin修飾。5.權(quán)利要求1或2所述用于志賀氏菌檢測的懸浮芯片的制備方法，包括如下步驟制備寡聚核苷酸探針；用純水稀釋氨基修飾的探針；將儲(chǔ)備的微球振蕩，然后轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；離心收集微球，加入MES液進(jìn)行振蕩；向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；在微球溶液中加入新配制的EDC溶液，振蕩；然后進(jìn)行溫育；再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振蕩，然后進(jìn)行溫育；向微球溶液中加0.02。/。Tween-20，離心收集微球；用0.1%SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)，2—8'C，避光保存。6.—種檢測福氏志賀氏菌的方法，其特征包括以下步驟a)根據(jù)福氏志賀氏菌rfc基因設(shè)計(jì)并合成用于PCR擴(kuò)增的特異性引物，并對其中一條引物進(jìn)行Biotin修飾；b)按常規(guī)方法制備的待檢樣本基因組DNA，并使用步驟a)中的引物對待檢樣本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)使PCR產(chǎn)物帶上Biotin修飾；c)將步驟b)中的PCR產(chǎn)物與權(quán)利要求1中所述懸浮芯片雜交；d)對步驟c)中雜交懸浮芯片進(jìn)行鏈霉親和素化藻紅蛋白標(biāo)記，并對其檢測熒光信號。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述使用方法，其中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>PCR反應(yīng)程序?yàn)?7°C溫育5min;94°C變性3min;運(yùn)行35個(gè)循環(huán)94。C30sec，53。C30sec,72°C40sec;最后，72°C延伸3min。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述使用方法，其中雜交溫度為52"C，雜交時(shí)間為大于15min。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于福氏志賀氏菌檢測的懸浮芯片及其檢測方法，該懸浮芯片包括微球載體和固定在載體上的寡聚核苷酸探針，其中該寡聚核苷酸探針是從志賀氏菌O-抗原基因簇篩選的福氏志賀氏菌特異性基因rfc中的一段DNA序列。利用設(shè)計(jì)的引物將待檢樣品基因組DNA擴(kuò)增并標(biāo)記后，利用上述懸浮芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交熒光強(qiáng)度，可判斷待檢樣品中是否含有福氏志賀氏菌。懸浮芯片檢測靈敏度高，可達(dá)到fg級基因組DNA水平，可滿足臨床樣本和環(huán)境樣本檢測需要，并具特異性高、操作簡單、成本低等特點(diǎn)，易于推廣。并采用UNG-Taq酶PCR反應(yīng)體系，大大降低了PCR假陽性結(jié)果。文檔編號C12Q1/68GK101407839SQ200810181198公開日2009年4月15日申請日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日發(fā)明者劉艷華,琳康,王景林,趙金銀,姍高申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所