專利名稱：：苯酚降解調(diào)控基因及其作用的啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及苯酚降解調(diào)控基因及其作用的啟動子。具體涉及一種苯酚降解調(diào)控蛋白的核苷酸編碼序列和其作用的苯酚羥化酶啟動子的核苷酸編碼序列。本發(fā)明還涉及所述兩個核苷酸編碼序列在苯酚生物降解和酚類污染物的生物治理和監(jiān)控中的應用。
背景技術(shù)：
：苯酚等酚類化合物常發(fā)現(xiàn)于工業(yè)污水中，給環(huán)境造成巨大的直接和潛在危害。生物降解是非常環(huán)保的處理苯酚等污染物的技術(shù)。中國專利021488142《苯酚羥化酶基因及其用途》篩選分離到有降解苯酚能力的醋酸鈣不動桿菌"cz'"eto6ac^"oi/coflc^c^)PHEA-2。該菌株能將苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，鄰苯二酚進一步開環(huán)裂解可以轉(zhuǎn)化成C02和H20，完全消除了廢水中苯酚的污染。該專利還公開了構(gòu)建菌株基因文庫的方法，克隆了將苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚的苯酚羥化酶(phenolhydroxylase)的編碼基因。將該基因轉(zhuǎn)入醋酸韓不動桿菌PHEA-2中，可以增強原菌降解苯酚的能力；轉(zhuǎn)入甲苯降解菌/^/0拊0^^.A5中可以使重組菌獲得原菌不具備的苯酚降解能力?？傊瑢＠?21488142的研究重點是苯酚降解功能基因(結(jié)構(gòu)基因)的克隆，未涉及苯酚降解調(diào)控基因的克隆和調(diào)控機制的研究。生物降解調(diào)控系統(tǒng)的研究非常重要，它對于深入探討重要生命現(xiàn)象的內(nèi)在本質(zhì)，闡述細胞降解行為的分子機理，揭示降解過程中基因表達的時間和空間特異性及其網(wǎng)絡體系，均具有重要意義。自然環(huán)境中某些微生物可以降解苯酚污染物是因為生物體內(nèi)具有遺傳基因編碼的相應降解酶。降解酶的表達一般受到調(diào)控蛋白的調(diào)控，當細胞生活在苯酚富集的生境時，調(diào)控蛋白識別苯酚分子信號并開啟降解酶的表達，使細胞可以利用苯酚作為碳源生長，同時苯酚被轉(zhuǎn)化成對環(huán)境無害的物質(zhì)。目前發(fā)現(xiàn)的苯酚降解調(diào)控蛋白都屬于NtrC/XylR型調(diào)控蛋白家族，這類調(diào)控蛋白作用的啟動子是依賴c^RNA聚合酶的啟動子，被稱為(^4型啟動子(EduardoDiazandMariaAPrieto，2000)。cj54型啟動子具有-24(TGGCy-12(TTGC)保守堿基，因此又被稱為-24M2啟動子。(EduardoDiazandMariaAPrieto，2000)。NtrC/XylR型調(diào)控蛋白結(jié)合于054型啟動子上游兩個反向重復序列(IR)組成的上游激活序列(UAS)啟動a"型啟動子的表達。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是得到一種苯酚降解調(diào)控蛋白的核苷酸編碼序列和其作用的苯酚羥化酶啟動子的核苷酸編碼序列。本發(fā)明的進一步目的是將所述兩個核苷酸編碼序列用于苯酚生物降解和酚類污染物的生物治理和監(jiān)控。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并克隆了苯酚降解調(diào)控基因，命名為w/^及。該基因的DNA序列如SEQIDNO:l所示。該DNA序列編碼的苯酚降解調(diào)控蛋白的氨基酸序列，如SEQIDNO:3所示。所述苯酚降解調(diào)控基因wp/2及發(fā)現(xiàn)于醋酸鈣不動桿菌PHEA-2的苯酚羥化酶基因的上游。通過反向PCR方法克隆到苯酚羥化酶上游的約3kb片段。核苷酸序列測定結(jié)果表明，SEQIDNO:l序列中包含了一段長1671bp的閱讀框，編碼全長為556個氨基酸的SEQIDNO:3序列。經(jīng)序列比較分析(見圖l)，顯示該蛋白屬于NtrC/XylR調(diào)控蛋白家族。當醋酸鈣不動桿菌PHEA-2中SEQIDNO:l序列缺失突變后，該菌株失去降解苯酚和激活苯酚羥化酶啟動子表達的能力。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了所述苯酚降解調(diào)控基因作用的苯酚羥化酶啟動子，其序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明進一步發(fā)現(xiàn)在SEQIDNO:2序列中，170230位是啟動子上的上游激活序列(UAS)。實驗證實當170到230位堿基缺失后，調(diào)控蛋白不能結(jié)合于SEQIDNO:2序列上，使得SEQIDNO:2序列失去啟動子的功能。因此，本發(fā)明還確定了SEQIDNO:3蛋白與SEQIDNO:2序列有功能的結(jié)合位點是SEQIDNO:2的170230位的兩個反向重復序列上。本發(fā)明檢測了所述調(diào)控蛋白可以識別的酚類化合物。當有酚類化合物存在時，該苯酚降解調(diào)控蛋白SEQIDNO:3可以作用于SEQIDNO:2所示的所述苯酚羥化酶基因的啟動子，啟動苯酚羥化酶的表達，以降解苯酚，鄰苯二酚，鄰甲酚和2-氯酚等酚類化合物。本發(fā)明還構(gòu)建了可以利用生物信號檢測工業(yè)污染物的大腸桿菌菌株。構(gòu)建了包含SEQIDN0:1序列的原核表達重組載體和包含SEQIDNO:2序列的苯酚羥化酶啟動子測試表達重組載體。可用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，這些宿主包括原核細胞，也包括真核細胞。常用的原核宿主細胞包括DH5a，常用的真核宿主細胞包括酵母細胞和其它植物細胞。在本發(fā)明舉出的應用實例中，宿主細胞是大腸桿菌DH5a。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將SEQIDNO:l和SEQIDNO:2同時轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，得到共轉(zhuǎn)化大腸桿菌PEMRP-14，以研究苯酚降解調(diào)控系統(tǒng)的特點和構(gòu)建全細胞生物感應器，其步驟如下(1)將SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示序列可操作地連于相應載體上，形成重組載體；(2)將步驟(l)中的兩個重組載體同時轉(zhuǎn)入大腸桿菌細胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細胞。本發(fā)明提供了檢測苯酚降解調(diào)控蛋白和苯酚羥化酶啟動子活性的方法。通過測定苯酚誘導下SEQIDNO:l編碼蛋白的活性，發(fā)現(xiàn)只有在苯酚誘導時，苯酚降解調(diào)控蛋白有活性，可以激活苯酚羥化酶啟動子啟動的/acZ基因表達。無苯酚誘導時，調(diào)控蛋白沒有活性，tocZ基因不表達(見圖2)。通過測定28種酚類化合物發(fā)現(xiàn)除了苯酚，SEQIDNO:l編碼蛋白還可以識別苯酚的結(jié)構(gòu)類似物鄰苯二酚，鄰甲酚和2-氯酚(見圖3)。本發(fā)明確定了SEQIDNO:l編碼蛋白和SEQIDNO:2序列發(fā)生結(jié)合作用以啟動苯酚羥化酶啟動子的表達。SEQIDNO:l編碼蛋白結(jié)合于SEQIDNO:2序列上的位置是苯酚羥化酶起始密碼子ATG上游-130到-190位的序列。凝膠阻滯實驗證明了SEQIDNO:1編碼蛋白和SEQIDNO:2序列的結(jié)合(見圖4)。本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有SEQIDNO:l蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其步驟如下(l)將SEQIDNO:l可操作地連于表達調(diào)控序列，形成SEQIDNO:l蛋白表達載體；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成重組細胞；(3)在適合表達SEQIDNO:l蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有SEQIDNO:l蛋白活性的基本純的多肽，序列為SEQIDNO:3，大小為63kDa(見圖5)。上述"可操作地連于"表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。上述載體可選用本領(lǐng)域己知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在本發(fā)明中，SEQIDNO:3蛋白或多肽指具有SEQIDNO:l編碼的蛋白活性多肽。該術(shù)語還包括具有與天然SEQIDNO:3的相同功能的變異形式。這些變異形式包括但并不限于若干個(通常為1-50個，較佳地l-30個，更佳地l-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括SEQIDNO:3蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的SEQIDNO:3多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與SEQIDNO:l雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用SEQIDNO:3多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含SEQIDNO.，3多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括SEQIDNO:3多肽的可溶性片段。通常，該片段具有SEQIDNO:3多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。在本發(fā)明中，"SEQIDNO:3保守性變異多肽"指與SEQIDNO:3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。表1氨基酸替換表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>發(fā)明還包括SEQIDNO:3蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然SEQIDNO:3多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、7-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。此外，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選SEQIDNO:l或SEQIDNO:3同源基因或同源蛋白。圖1是SEQIDNO:l序列編碼的蛋白與已報道的NtrC/XylR家族成員的同源關(guān)系樹圖。圖2是P-半乳糖苷酶酶活圖。表示共轉(zhuǎn)化菌PEMRP-14在苯酚誘導和無苯酚誘導下，苯酚羥化酶啟動子測試表達載體上/flcZ基因表達的P-半乳糖苷酶酶活情況。圖中縱坐標表示(3-半乳糖苷酶酶活量，橫坐標代表構(gòu)建的基因工程菌PEMRP-14和對照菌株P(guān)EMRP-0?；疑頉]有苯酚誘導時的酶活，黑色柱代表有苯酚誘導時的酶活。圖3是P-半乳糖苷酶酶活圖。圖中縱坐標表示P-半乳糖苷酶酶活量，橫坐標代表28種不同的酚類化合物，從左到右為4-甲氧基酚，對甲酚，間甲酚，鄰甲酚，對氯酚，對苯二酚，2-甲氧基酚，2，4,6-三[(二甲氨基)甲基]苯酚，2-萘酚，2,5-二硝基酚，3-硝基酚，3-氯酚，4-氨基酚，2-氨基酚，2，3-二甲基酚，2，4-二氯酚，間苯三酚，l-萘酚，4-硝基酚，間苯二酚，2,6-二硝基酚，鄰氯苯酚，鄰硝基酚，鄰苯二酚，對甲氨基酚，3-氨基酚，二甲基亞砜，苯酚，對照樣品。圖中可看出，除苯酚外，SEQIDNO:l編碼蛋白還可以識別苯酚結(jié)構(gòu)類似物，包括鄰苯二酚，鄰甲酚和2-氯酚等酚類化合物。圖4是SDS-PAGE蛋白電泳圖。圖中顯示了SEQIDNO:l序列的蛋白表達情況。1和3道是作為對照的原核表達空載體，2，4道是連有SEQIDNO:l序列的原核表達載體。表達出的蛋白大小約為63kDa。圖5是凝膠阻滯試驗證明SEQIDN0:1編碼蛋白可以和SEQIDN0:2序列結(jié)合。l道是加入SEQIDNO:3表達蛋白多肽，2道無蛋白?？梢钥闯?道出現(xiàn)明顯阻滯帶，說明SEQIDNO:3蛋白和SEQIDNO:2序列發(fā)生結(jié)合。圖6是在SEQIDNO:2序列上逐段截短啟動子的示意圖。1-357序列所示是SEQIDNO:2序歹iJ。Pl，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10三角圖標所指堿基代表逐段截短啟動子的起始堿基。圖7是P-半乳糖苷酶酶活圖。圖中縱坐標表示P-半乳糖苷酶酶活量，橫坐標代表大腸桿菌內(nèi)截短的啟動子序列P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，它們序列的起始位置如圖6所示。CK代表沒有啟動子序列的對照菌?；疑頉]有苯酚誘導時的酶活，黑色柱代表有苯酚誘導時的酶活。圖8、圖9是凝膠阻滯實驗檢測啟動子序列與SEQIDNO:l編碼蛋白的結(jié)合效率。P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10代表用于凝膠阻滯檢測的啟動子序列，它們序列的起始位置如圖6所示。CK代表一段與啟動子無關(guān)的序列和SEQIDNO:l編碼蛋白結(jié)合作為對照。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，而不用于限制本發(fā)明的范圍。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1醋酸鈣不動桿菌PHEA-2中SEQIDNO:l核苷酸序列的克隆和序列分析。本發(fā)明用反向PCR方法克隆到位于苯酚羥化酶基因上游的SEQIDNO:l序列，具體過程如下。用&oRI(Takala公司)酶切消化5ug醋酸鈣不動桿菌PHEA-2染色體DNA，酶切產(chǎn)物T4DNA連接酶(NEB公司)l(TC過夜自連，根據(jù)已克隆的苯酚羥化酶基因序列設計反向引物，以自連產(chǎn)物為模板擴增出一條3kb的片段，將其回收連入T載體(Takala公司)。測序發(fā)現(xiàn)克隆的序列使已知苯酚羥化酶基因序列向上游延伸了1961bp，包含一個完整的開放閱讀框1671bp，編碼556個氨基酸。通過序列比對發(fā)現(xiàn)序列SEQIDN0:1編碼的蛋白SEQIDN0:3是NtrC/XylR家族調(diào)控蛋白(見圖1)。實施例2在大腸桿菌中表達SEQIDNO:3多肽和全細胞生物感應器的構(gòu)建。(一)構(gòu)建SEQIDNO:l的原核表達載體。將SEQIDNO:l序列兩端通過PCR方法導入MM和S"/I酶切位點，將擴增所得序列用iV&I和5WI(Takala公司)酶切后與相同酶切的表達載體pET28a(NEB公司)連接得到重組表達載體pEMR。(二)構(gòu)建SEQIDNO:2的測試表達載體。將SEQIDNO:2序列兩端通過PCR方法導入^7wl和尸Wl酶切位點。將擴增所得序列用Zzol和PWI(Takala公司)酶切后連入用相同酶消化的啟動子檢測載體pPR9Tt(PedroMiguelSantos，2001)無啟動子的/acZ基因上游，構(gòu)建得到苯酚羥化酶啟動子測試表達載體pPR9P。(三)全細胞苯酚生物感應器的構(gòu)建。將含有SEQIDNO:l序列的原核表達載體pEMR和含有SEQIDNO:2的測試表達載體pPR9P共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a(Takala公司)，在含有Km，Ap和Cm的抗性板上篩選同時含有這兩個載體的重組子，命名為pEMRP—14。分別在2mM苯酚誘導和無苯酚誘導條件下測定重組子的P-半乳糖苷酶活性，測定方法參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)。轉(zhuǎn)入原核表達空載體的共轉(zhuǎn)化菌(pEMRP—0)作為對照菌株。從圖2上可以看出有苯酚比無苯酚誘導時，PEMRP-14P-半乳糖苷酶酶活高約20倍，這說明序列SEQIDNO:l編碼蛋白只有在苯酚誘導時才有活性。PEMRP-0是沒有連入SEQIDNO:l序列的對照菌株，可以看出沒有SEQIDNO:l序列時無論有沒有苯酚誘導，P-半乳糖苷酶酶活只有本底表達(詳見圖2)。這說明SEQIDNO:2序列的表達依賴SEQIDNO:l序列和苯酚誘導物的同時存在。該共轉(zhuǎn)化菌可以用作苯酚生物信號感應菌快速檢測廢水中是否有苯酚污染物存在。實施例3共轉(zhuǎn)化菌PEMRP—14感應酚類化合物的范圍。用28種不同的酚類化合物分別作為誘導物誘導PEMRP—14菌，測定卩-半乳糖苷酶活性發(fā)現(xiàn)苯酚，鄰苯二酚，鄰甲酚和2-氯酚可以被SEQIDNO:l編碼蛋白識別(圖3)。具體方法如下，挑取新鮮培養(yǎng)的菌落，過夜37度搖菌，次日以P/。接種量接入29根LB培養(yǎng)基的試管中，搖到OD600達到0.6左右，每管接入不同的酚類化合物，終濃度0.3mM，繼續(xù)培養(yǎng)2個小時，取出29種不同樣品測l3-半乳糖苷酶酶活，測定方法參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)。測定結(jié)果顯示MphR可以識別苯酚，鄰苯二酚，鄰甲酚和2-氯酚四種化合物，酶活分別為300U，112U，132U,120U。實施例4SEQIDNO:1編碼蛋白的表達。將表達載體pEMR轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Promega公司)。將轉(zhuǎn)化子先在LB+Kmr培養(yǎng)基中37°C，200rpm培養(yǎng)至OD600值約0.5，加入IPTG(Sigma公司)(終濃度為0.75mmol/L)后轉(zhuǎn)入15t:誘導蛋白表達，SDS-PAGE電泳檢測。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，含有pEMR的大腸桿菌BL21(DE3)(Promega公司)在15'C經(jīng)IPTG誘導10小時后表達出的目的蛋白多數(shù)為可溶性蛋白；大小約63kDa，與預測值相符(見圖4)。實施例5SEQIDNO:l編碼蛋白結(jié)合于SEQIDNO:2序列上。本發(fā)明用凝膠阻滯試驗驗證了SEQIDNO:l編碼蛋白和SEQIDNO:2序列的結(jié)合。將100ngSEQIDNO:2序列用digoxigenin-ll-ddUTP(DIG)(Roche公司)標記，和lug純化的SEQIDNO:l編碼蛋白反應，對照樣品不加入蛋白。DNA序列的標記，DNA序列和蛋白的結(jié)合反應，非變性PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜，雜交，顯影過程均按照地高辛標記凝膠阻滯試劑盒(DIGgelshiftkit;Roche，MannheimGermany)說明書操作。加入蛋白的樣品DNA條帶遷移速度明顯滯后于無蛋白的DNA樣品(l道)，這說明SEQIDNO:l編碼蛋白可以和SEQIDNO:2序列結(jié)合(見圖5)。實施例6SEQIDNO:l編碼蛋白在SEQIDNO:2序列上的具體結(jié)合位置及其功能。分析SEQIDNO:2序列特征，根據(jù)NtrC/XylR家族調(diào)控蛋白結(jié)合于啟動子上游lOObp以上的兩個反向重復序列(IR)上的特征，推測SEQIDNO:l編碼蛋白在SEQIDNO:2序列上的結(jié)合位置大約在160到240位處。在啟動子上設計引物擴增出不同長度的七個片段P1，P2，P3，P4，P5,P6，P7，起始位點如圖6所示，終止位點是一樣的，即這七個序列的起始位置不一樣。按照實施例2所述方法構(gòu)建共轉(zhuǎn)化菌，并在苯酚誘導和沒有苯酚誘導時測定菌株的P-半乳糖苷酶酶活，結(jié)果如圖7所示，當啟動子截到P6時P-半乳糖苷酶酶活迅速降低，到P7時幾乎沒有P-半乳糖苷酶酶活。而P6和P7已經(jīng)截到反向重復序列(IR)內(nèi)部，這說明SEQIDNO:l編碼蛋白結(jié)合區(qū)域的完整性對SEQIDNO:2序列啟動子活性影響很大。圖8和圖9檢測逐段截短的SEQIDNO:2序列是否能和SEQIDNO:l編碼蛋白結(jié)合，將P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10序列分別和SEQIDNO:l編碼蛋白進行凝膠阻滯實驗，具體方法如實施例5所述，從圖8、圖9中可以看出當反向重復序列逐段截短后SEQIDNO:l編碼蛋白和序列的結(jié)合能力逐漸降低，P9和SEQIDNO:l編碼蛋白完全不結(jié)合。這說明兩個反向重復序列(IR1和IR2，170230)是SEQIDNO:l編碼蛋白在SEQIDNO:2序列上的結(jié)合位點，當IR1和IR2(170230)缺失后SEQIDNO:2序列和SEQIDNO:l編碼蛋白失去結(jié)合能力。SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所<120>苯酚降解調(diào)控基因及其作用的啟動子<130>08-01<160>3<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1671<212>DNA<213>醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)PHEA-2<400>1atggctcgagtaaaatacgatacaacgggacgatacgcagatcatccgcaagaaattcac60gatttgctgtctaaattgtactttgatactgcccacggccaaatctggtttgatgaatat120cggatgctgcttttacacaccagcattatgggatatttgcgtaaagacttagcgcacatg180attgggcttgaacggaccaagcgtttttttattcgtttaggttatcaagctgggttaaaa240gatgcagaagttactacaaaaatgcgtcccgatttaaatgaacacgatgcttttatggcg300ggtccacaaatgcacgccattcgtggaatggtgcaagtacaggccaaccagctcaattta360agccatgataaaaaacagttttatgccgatttaaattggctcaattcttttgaagccgat420gtgcatttagagcattttggcccaagtgatgaacctgcgtgctggatgcttctgggttat480gcgtgcggctacagtagttttgcgacgggcatgaccattatttatcaagaaatagagtgt540aaagcttgcggcgatgagcattgccgtattattggtaagcctttagaagagtgggaaaat600gctgatgaactgattcagttcatgtctcccgaacccatggaaaaagaactgattgcgttg660caggctgaactttttgaacttaaaaaatcaatttatagcgacagtgaagccgattaccaa720ttatttagttctgtgggtaagtcagcatcttataaacaggtctgtgcattattaacaaaa780gcagcaggttcgaaagtttctattttgctacaaggtgaaaccggcgttggtaaagaagct840tttgctcgaggagttcatgcaaatagccaaagaaaagaccaaccttttattgcagtaaac900tgtgcagcgattccaccagagttaattgagtctgaattattcggggtagaaaaaggtgct960tatacaggagcgcatcaatctcgcttggggaagtttgaacgagccaatggtggtacgatt1020■agatgaagtgattgagctttctcctcgtgcacaagcagcactattacgcattttg1080caggaaggtgaatttgagcgagtaggagattcacaaacccgtattttagatgtccgtgta1140attacagcaaccaatgaagatcttgagcaggctgtaaaaacagggcgatttcgggcagat1200ttatattatcgcttaaatattttcccagtacagatcccgcctttgcgagagcgccgtgaa1260gatattcctttattggttgagcactttcttcatcgctttgaaaaaatgtacggcaaaacc1320attcagggtgtaagtgaaaagaccaaagtttttatgcagcaatatgaatggccgggaaat1380attcgtgagttggaaaatttattagaaagggcggttttattaacggatgatcagcaactg1440attaagttaaatgccattttcccacagatcaagcatgacccagagcaggctgtagttgtt1500gaaaccgactttgagcaattgttgcaggcagagtttaatttagaagaacacgagaagcag1560ttaattttaacggctttaaaaaaggcaaatcataatgtgtctgaagcggcacgtttattg1620gggctaactcgggcagcactggattatcgaattaaaaaatttcagctttga1671<210>2<211>357<212>DNA<213>醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)PHEA-2<400>2gagtgatctgttttaatccattaaacacatttgggttttatctcatcttatcgaagaacc60agataaatgtcctagtatcttaaagacataacttcatactaaaaaagtatttctaaatct120ctccatttaaagcctcaaacaatctaaaaagaaatttttacgaccctattcatcaaatca180tgaatatctctatttcaccattcaaaaaaattcatgaaatagtgaattttaaaaatacct240tactttccataaaaattttaattaattgtttttaataataaaaataaagttggcatagct300tttgtaaagcttatagcgagagcaaggagcattcatcaatttcaagaccatgtcttg357<210>3<211>556<212>PRT<213>醋酸l丐不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)PHEA-2<400>3MetAlaArgValLysTyrAspThrThrGlyArgTyrAaAspHisPro151015GinGlulieHisAspLeuLeuSerLysLeuTyrPheAspThrAlaHis202530GlyGinHeTrpPheAspGluTyrArgMetLeuLeuLeuHisThrSer354045lieMetGlyTyrLeuArgLysAspLeuAlaHisMetlieGlyLeuGlu505560ArgThrLysArgPhePhelieArgLeuGlyTyrGinAlaGlyLeuLys65707580AspAlaGluValThrThrLysMetArgProAspLeuAsnGluHisAsp859095AlaPheMetAlaGlyProGinMetHisAlalieArgGlyMetValGin100105110ValGinAlaAsnGinLeuAsnLeuSerHisAspLysLysGinPheTyr115120125AlaAspLeuAsnTrpLeuAsnSerPheGluAlaAspValHisLeuGlu130135140HisPheGlyProSerAspGluProAlaCysTrpMetLeuLeuGlyTyr145150155160AlaCysGlyTyrSerSerPheAlaThrGlyMetThrlielieTyrGin165170175GlulieGluCysLysAlaCysGlyAspGluHisCysArglielieGly180185190LysProLeuGluGluTrpGluAsnAlaAspGluLeulieGinPheMet195200205SerProGluProMetGluLysGluLeulieAlaLeuGinAlaGluLeu210215220PheGluLeuLysLysSerlieTyrSerAspSerGluAlaAspTyrGin225230235240LeuPheSerSerValGlyLysSerAlaSerTyrLysGinValCysAla245250255LeuLeuThrLysAlaAlaGlySerLysValSerHeLeuLeuGinGly260265270GluThrGlyValGlyLysGluAlaPheAlaArgGlyValHisAlaAsn275280285SerGinArgLysAspGinProPhelieAlaValAsnCysAlaAlalie290295300ProProGluLeuHeGluSerGluLeuPheGlyValGluLysGlyAla305310315320TyrThrGlyAlaHisGinSerArgLeuGlyLysPheGluArgAlaAsn325330335GlyGlyThrliePheLeuAspGluVallieGluLeuSerProArgAla340345350GinAlaAlaLeuLeuArglieLeuGinGluGlyGluPheGluArgVal355360365GlyAspSerGinThrArglieLeuAspValArgVallieThrAlaThr370375380AsnGluAspLeuGluGinAlaValLysThrGlyArgPheArgAlaAsp385390395400200810101802.6說明書第19/20頁LeuTyrTyrArgLeuAsnHePheProValGinHeProProLeuArg405410415GluArgArgGluAsplieProLeuLeuValGluHisPheLeuHisArg420425430PheGluLysMetTyrGlyLysThrHeGinGlyValSerGluLysThr435440445LysValPheMetGinGinTyrGluTrpProGlyAsnlieArgGluLeu450455460GluAsnLeuLeuGluArgAlaValLeuLeuThrAspAspGinGinLeu465470475480HeLysLeuAsnAlaliePheProGinlieLysHisAspProGluGin485490495AlaValValValGluThrAspPheGluGinLeuLeuGinAlaGluPhe500505510AsnLeuGluGluHisGluLysGinLeuHeLeuThrAlaLeuLysLys515520525AlaAsnHisAsnValSerGluAlaAlaArgLeuLeuGlyLeuThrArg530535540AlaAlaLeuAspTyrArglieLysLysPheGinLeu54555055權(quán)利要求1.一種調(diào)控苯酚降解的DNA序列，如SEQIDNO1所示。2.—種苯酚降解調(diào)控蛋白，由權(quán)利要求1所述DNA序列編碼，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。3.權(quán)利要求1所述的DNA序列或權(quán)利要求2所述的氨基酸序列在識別酚類化合物方面的應用。4.一種苯酚羥化酶基因啟動子的DNA序列，如SEQIDNO:2所示。5.—種苯酚羥化酶基因啟動子的DNA序列，其序列為SEQIDNO:2序列中的第170230位。6.權(quán)利要求4或5所述的DNA序列在酚類化合物的生物治理和監(jiān)控方面的應用。7.權(quán)利要求4所述的DNA序列在酚類化合物的生物治理和監(jiān)控方面的應用，其特征為所述DNA序列中的第170230位與SEQIDNO:3的氨基酸序列有功能的結(jié)合。8.包含SEQIDNO:l所述的DNA和/或包含SEQIDNO:4所述的DNA序列的重組載體。9.用權(quán)利要求8所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。10.權(quán)利要求8所述重組載體在構(gòu)建全細胞酚類化合物生物感應器的應用。全文摘要本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種苯酚降解調(diào)控蛋白以及編碼該蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了所述苯酚降解調(diào)控蛋白作用的苯酚羥化酶啟動子，并進一步發(fā)現(xiàn)所述啟動子序列中與苯酚降解調(diào)控蛋白的功能結(jié)合位點。本發(fā)明構(gòu)建了包含上述基因的重組載體和苯酚羥化酶啟動子測試表達載體，并將這兩個載體共轉(zhuǎn)入大腸桿菌。實驗證實，本發(fā)明將所述調(diào)控基因在大腸桿菌中表達后，可以激活苯酚羥化酶啟動子表達，作為全細胞生物感應器檢測苯酚，鄰苯二酚，鄰甲酚和2-氯酚等酚類化合物。文檔編號C12Q1/04GK101532021SQ20081010180公開日2009年9月16日申請日期2008年3月12日優(yōu)先權(quán)日2008年3月12日發(fā)明者維張,彭子欣,敏林,明陳申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所