專利名稱：：一種松香基功能高分子固定化淀粉酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種松香基功能高分子固定化淀粉酶及其制備方法，更具體地說本發(fā)明是馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉,及其制備方法。
背景技術(shù)：
：酶作為一種生物催化劑，具有催化效率高、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、可生物降解不會引起環(huán)境污染等優(yōu)點；但是酶對環(huán)境影響十分敏感，各種化學(xué)、物理和生物因素(包括溫度、壓力、有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度、PH等)都可以使酶喪失生物活性。因此固定化酶的研究受到重視，固定化酶既具有催化特性，有具有能回收，反復(fù)使用等優(yōu)點，并且生產(chǎn)工藝可以連續(xù)化、自動化。自從1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶、1969年成功運用固定化?；被崴饷干a(chǎn)L一氨基酸以來，固定化酶由于其良好的理化性質(zhì)越來越廣泛深入，目前常用的固定化酶方法有四種，吸附法、包埋法、共價鍵結(jié)合法及交聯(lián)法，馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物及馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的制備方法到目前為止未見文獻(xiàn)報導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種原料易得，價格低廉、具有合適的剛性和較好的機(jī)械穩(wěn)定性，以共價鍵固定的一種馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶及其制備方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案是1.一種松香基功能高分子固定化淀粉酶，即馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，其制備方法是以馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物為載體，首先用S0Cl2將馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；玫锦；瘶渲?，再將馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；瘶渲诃h(huán)己烷和淀粉酶溶液中磁力攪拌512h，洗滌，過濾樹脂，樹脂與淀粉酶反應(yīng)得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，具體步驟如下1).用環(huán)己垸浸泡馬來松香乙二醇丙烯酸酯和丙烯酸共聚物2024h，過濾，放置在三頸瓶中，加入環(huán)己垸作溶劑，共聚物與環(huán)己烷的質(zhì)量比為1:220，用恒壓漏斗緩慢的向三頸瓶中加入S0Cl2，共聚物與S0Cl2質(zhì)量比為1:l10，攪拌，約lh滴完，加熱升溫，溫度控制在758(TC，回流58h，反應(yīng)結(jié)束后，改蒸餾裝置，蒸出多余的S0Cl2和環(huán)己烷，得到?；瘶渲?，最后用環(huán)己烷洗滌?；瘶渲?次；2).向盛放?；瘶渲娜i瓶中分別加入環(huán)己烷和淀粉酶溶液，用磁力攪拌攪動溶液5-12h，整個過程中要在干燥條件下操作。洗滌，抽濾樹脂，得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶；馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的特點1克馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物以共價鍵固定0.10.2g淀粉酶，固定化酶的活性為2030mg.g\5min—、重復(fù)使用13次后剩余活性不低于6mg.gi.5mirf、相對保留活性不低于20%。2.馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的制備方法，以馬來松香乙二醇丙烯酯-丙烯酸共聚物為載體，以淀粉酶為原料，以環(huán)已烷作溶劑，SOCl2作?；瘎?，將馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化得到?；瘶渲倥c淀粉酶反應(yīng)得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；瘶渲潭ɑ矸勖?，制備步驟如下1).用環(huán)己烷浸泡馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物2024h，過濾，放置在三頸瓶中，加入環(huán)己垸作溶劑，共聚物與環(huán)己垸的質(zhì)量比為1:220，用恒壓漏斗緩慢的向三頸瓶中加入S0Cl2,共聚物與SOCl2質(zhì)量比為1:l10，攪拌，約lh滴完，加熱升溫，溫度控制在758(TC，回流58h，反應(yīng)5結(jié)束，蒸餾裝置，蒸出多余的S0Cl2和環(huán)己垸，得到?；瘶渲?，最后用環(huán)己垸洗滌?；瘶渲?次；2).向盛放?；瘶渲娜i瓶中分別加入環(huán)己烷和淀粉酶溶液，用磁力攪拌攪動溶液5-12h，整個過程中要在干燥條件下操作。洗滌，抽濾樹脂，得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯和丙烯酸共聚物固定化淀粉酶。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有經(jīng)下優(yōu)點(1)馬來松香乙二醇丙烯酸酯含三元環(huán)菲骨架，具有合適的剛性，得到的馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物具有較好的機(jī)械穩(wěn)定性；(2)制得馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶是通過共價健固定，牢固；(3)原料易得，價格低廉，有應(yīng)用前景，本發(fā)明固定化淀粉酶可用于催化淀粉水解生成糊精和還原糖，在食品、輕工和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。圖1是馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物的紅外光譜譜圖；圖2是馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；瘶渲募t外光譜譜圖；圖3是馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的紅外光譜譜圖。具體實施例方式馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的確認(rèn)1.馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的制備1)用環(huán)己烷浸泡馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物2024h，過濾。放置在三頸瓶中，加入環(huán)己烷作溶劑。用恒壓漏斗緩慢的向三頸瓶中加入S0C12，攪拌，約lh滴完。加熱升溫，溫度控制在7580。C，回流58h。反應(yīng)結(jié)束后，改蒸餾裝置，蒸出多余的S0Cl2和環(huán)己烷。最后用環(huán)己烷洗滌?；?)向盛放酰化樹脂的三頸瓶中分別加入環(huán)己垸和淀粉酶溶液。用磁力攪拌攪動溶液5-12h，整個過程中要在干燥條件下操作。洗滌，抽濾樹脂，樹脂與淀粉酶進(jìn)行？反應(yīng)得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，備用。馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物的制備方法，于2008年6月18日由廣西民族大學(xué)申請的發(fā)明
專利名稱：為"一種松香基功能高分子及其制備方法"中公開。2.馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶活性測定(i).指示劑溶液的配制:取1.0g3，5—二硝基水楊酸(C晶編與少量蒸餾水拌和，添加20ml2mol/L的氫氧化鈉溶液后此酸便溶解。取30.0g四水酒石酸鉀鈉(C4H4KNa06.4H20)溶于此溶液，并用蒸餾水將此指示劑定容至100ml。(ii).麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線稱取100mg—水麥芽糖(C^H^Ou.H20)，用蒸餾水定容至100ml。取7支25ml刻度試管編號，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(lmg/ml)0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml，然后用吸管向各管加蒸餾水，使溶液達(dá)2ml，再各加3，5—二硝基水楊酸試劑2ml，沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，取出冷卻。用蒸餾水稀釋25ml，用分光光度計在波長520nm處進(jìn)行比色，繪制橫坐標(biāo)為麥芽糖含量，縱坐標(biāo)為吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=ll.029x-0.0028(R2=0.9979)(iii).ra值為5.6的檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液:A液:稱取檸檬酸20.01g，溶解后稀釋至1L。B液:稱取擰檬酸鈉29.41g，溶解后稀釋至1L。取A液13.7ml與B液26.3ml混勻，即為PH值為5.6的緩沖溶液。(iv).淀粉酶溶液的配制:稱取5g粗淀粉酶溶解在100ml蒸餾水中，放lh，期間要不斷攪拌。用離心機(jī)離心，取上層清液。即為實驗所用酶液。(v).淀粉酶活性測定采用3，5—二硝基水楊酸法游離酶活性測定在lmlPH值為5.6的擰檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入lml酶溶液，于40(±0.5)。C恒溫水浴中預(yù)熱15min，加入1%淀粉溶液準(zhǔn)確反應(yīng)5min后，迅速加入4ml0.4mol/LNa0H溶液，令酶反應(yīng)停止。從混合液中量取2.0ml溶液，加2.0ml3，5—二硝基水楊酸顯色液，顯色反應(yīng)后在波長520nm處比色，測定麥芽糖的生成。用麥芽糖同步作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以單位時間內(nèi)轉(zhuǎn)化麥芽糖的量表示酶的活性mg/ml.5min。固定化酶活性測定分別稱取一定質(zhì)量的固定化淀粉酶于帶過濾膜的反器中，加入檸檬酸鈉緩沖溶液，測定方法與游離酶相同，以單位質(zhì)量的固定化酶在5分鐘內(nèi)水解淀粉生成麥芽糖量表示酶活性mg/g.5min。3.馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的特點通過酶活性測定，固定化酶的活性為2030mg.g、5mirf1，重復(fù)使用13次后剩余活性不低于6mg.g—'.5min—'，相對保留活性不低于20%。4.圖1、圖2和圖3是馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物、馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；瘶渲?、馬來松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的紅外光譜譜圖。馬來松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物?；瘶渲?500cm—i吸收峰消失，這是-OH的伸展振動，說明共聚物中COOH中的OH被取代，馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的紅外光譜譜圖在3500cm—'吸收峰，說明共聚物中有新的-OH產(chǎn)生。5.馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的元素分析測定馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物、馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶和淀粉酶三種物質(zhì)中C、H、N元素的百分含量，結(jié)果見表l。表1馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶元素分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可知，樹脂中氮元素含量為0.184%，淀粉酶中氮元素的含量為4.018%，固定化淀粉酶中氮元素的含量為0.713%。據(jù)氮元素守恒，計算出l克樹脂固定O.16g酶蛋白。說明樹脂上已經(jīng)固定上了酶分子。6.馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的重復(fù)使用稱取0.2g2040目的馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，放入反應(yīng)器中加入pH=5.6，檸檬酸鹽緩沖溶液lml，1%的淀粉溶液lml。在T32t:按3，5—二硝基水楊酸法測定酶的活性，然后用蒸餾水洗滌固定化酶，再測定固定化酶的活性，以某一單位時間內(nèi)生成的最大麥芽糖量活性表示為100，用第n次單位時間內(nèi)生成的麥芽糖量與最大麥芽糖量的比值表示固定化酶的相對保留活力。表2馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的重復(fù)使用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表2可以看出，固定化酶重復(fù)使用了13次后相對保留活性還有20.81%，且在22。C、pH二5.6測得最大活性為25.57mg.g\5min—'。與其它固定化淀粉酶比較，它的重復(fù)使用次數(shù)多，酶活性較大，說明了此法制備的固定化酶，酶與載體結(jié)合較為牢固，不易脫落。7.馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的用途馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶可用于催化淀粉水解生成糊精和還原糖，在食品、輕工和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。從以下實施例將進(jìn)一步理解本發(fā)明表3本發(fā)明用儀器名稱、規(guī)格、產(chǎn)地<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表4本發(fā)明制備方法用原材料名稱、規(guī)格、產(chǎn)地<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例1稱取15g馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物，用環(huán)己烷浸泡丙烯酸基樹脂24h，過濾。放置在三頸瓶中，加入30ml環(huán)己烷。用恒壓漏斗緩慢的向三頸瓶中加入15mlS0Cl2，攪拌，約lh滴完。加熱升溫，溫度控制在758CTC，回流7h。反應(yīng)結(jié)束后，改蒸餾裝置，蒸出多余的S0Cl2和環(huán)己垸。最后每次用20ml環(huán)己烷洗滌?；瘶渲?次。得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；瘶渲?。稱取10g馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化樹脂，加入40ml環(huán)己烷和50ml3。/。的淀粉酶溶液。用磁力攪拌攪動溶液約10h，整個過程中要在干燥條件下操作。洗滌，抽濾樹脂，得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶llg。經(jīng)測定產(chǎn)品活性為25.6mg.g—、5mirf1，重復(fù)使用13次后剩余活性為5.3mg.g'.5min—、相對保留活性為20.7%。實施例2稱取40g馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物，用環(huán)己烷浸泡丙烯酸基樹脂約1天，過濾。放置在三頸瓶中，加入50ml環(huán)己垸。用恒壓漏斗緩慢的向三頸瓶中加入25mlS0Cl2，攪拌，約1.5h滴完。加熱升溫，溫度控制在7580°C，回流7h。反應(yīng)結(jié)束后，改蒸餾裝置，蒸出多余的S0Cl2和環(huán)己烷。最后每次用30ml環(huán)己烷洗滌酰化樹脂3次。得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物?；瘶渲?。稱取20g馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；瘶渲?，加入40ml環(huán)己垸和60ml4Q/。的淀粉酶溶液。用磁力攪拌攪動溶液約12h，整個過程中要在干燥條件下操作。洗滌，抽濾樹脂，得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶21.5g。經(jīng)測定產(chǎn)品活性為23.5mg.g\5min—'，重復(fù)使用13次后剩余活性為5.6mg.g—\5min—\相對保留活性為23.8%。實施例3丙烯酸酯-丙烯酸共聚物，用環(huán)己烷浸泡丙烯酸基樹脂約1天，過濾。放置在三頸瓶中，加入50ml環(huán)己烷。用恒壓漏斗緩慢的向三頸瓶中加入35mlS0Cl2，攪拌，約2h滴完。加熱升溫，溫度控制在758(TC，回流8h。反應(yīng)結(jié)束后，改蒸餾裝置，蒸出多余的S0Cl2和環(huán)己烷。最后每次用50ml環(huán)己烷洗滌?；瘶渲?次。得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；瘶渲?。稱取30g馬來松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物?；瘶渲?，加入50ml環(huán)己垸和70ml5y。的淀粉酶水溶液。用磁力攪拌攪動溶液約5h，整個過程中要在干燥條件下操作。洗滌，抽濾樹脂，得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶34g。經(jīng)測定產(chǎn)品活性為28.3mg.g、5min1，重復(fù)使用13次后剩余活性為6.7mg.g'.5min—、相對保留活性為23.7%。實施例4稱取100g馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物，用環(huán)己烷浸泡丙烯酸基樹脂約24h，過濾。放置在三頸瓶中，加入50ml環(huán)己烷。用恒壓漏斗緩慢的向三頸瓶中加入60mlS0Cl2，攪拌，約2h滴完。加熱升溫，溫度控制在758(TC，回流8h。反應(yīng)結(jié)束后，改蒸餾裝置，蒸出多余的S0Cl2和環(huán)己垸。最后每次用80ml環(huán)己烷洗滌?；瘶渲?次。得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化樹脂。稱取80g馬入120ml環(huán)己烷和100ml5y。的淀粉酶水溶液。用磁力攪拌攪動溶液約12h來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；瘶渲，整個過程中要在干燥條件下操作。洗滌，抽濾樹脂，得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物固定化淀粉酶83g。經(jīng)測定產(chǎn)品活性為26.2mg.g—\5min—、重復(fù)使用13次后剩余活性為6.9mg.g—1.5min—、相對保留活性為26.3%。權(quán)利要求1.一種松香基功能高分子固定化淀粉酶，其特征是其名稱為馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，它的制備方法是1).以馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物為載體，首先用SOCl2將馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物?；玫锦；瘶渲?，再將馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化樹脂在環(huán)己烷和20ml1％的淀粉酶溶液中磁力攪拌5～12h，洗滌，過濾樹脂，得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，具體步驟如下A)用環(huán)己烷浸泡馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物20～24h，過濾，放置在三頸瓶中，加入環(huán)己烷作溶劑，共聚物與環(huán)己烷的質(zhì)量比為1∶2～20，用恒壓漏斗緩慢的向三頸瓶中加入SOCl2，共聚物與SOCl2質(zhì)量比為1∶1～10，攪拌，約1h滴完，加熱升溫，溫度控制在75～80℃，回流5～8h，反應(yīng)結(jié)束后，改蒸餾裝置，蒸出多余的SOCl2和環(huán)己烷，得到?；瘶渲?，最后用環(huán)己烷洗滌?；瘶渲?次；B)向盛放?；瘶渲娜i瓶中分別加入環(huán)己烷和淀粉酶溶液，用磁力攪拌攪動溶液5～12h，整個過程中要在干燥條件下操作。洗滌，抽濾樹脂，得到馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶；2)固定化淀粉酶的特點1克馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物以共價鍵固定0.1～0.2g淀粉酶，固定化酶的活性為20～30mg.g-1.5min-1，重復(fù)使用13次后剩余活性不低于6mg.g-1.5min-1，相對保留活性不低于20％。全文摘要本發(fā)明公開了一種松香基功能高分子固定化淀粉酶及其制備方法。它是由馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物與淀粉酶制備的馬來松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，其活性為20～30mg.g^-1.5min^-1，重復(fù)使用13次后剩余活性不低于6mg.g^-1.5min^-1，相對保留活性不低于20％。并公開了該固定化淀粉酶的制備方法。本發(fā)明固定化淀粉酶可用于催化淀粉水解生成糊精和還原糖，在食品、輕工和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。文檔編號C12N11/08GK101319211SQ20081007362公開日2008年12月10日申請日期2008年6月18日優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日發(fā)明者劉祖廣,盧建芳,姚興東,李鵬飛,藍(lán)虹云,雷福厚申請人:廣西民族大學(xué)