專利名稱：一種抗白色念珠菌抗菌肽的基因工程制取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗白色念珠菌抗菌肽的制取方法，尤其是一種抗白色念珠菌抗 菌肽的基因工程制取方法。
背景技術：
抗菌肽(antibacterial peptides, ABP)是由生物體基因編碼、相對分子質(zhì)量小， 具有抗菌活性的肽類物質(zhì)的總稱。它是宿主產(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的小分 子多肽，廣泛存在于昆蟲、植物、動物和人體內(nèi)，除有抗細菌、真菌和病毒等病原 體作用外，還具有抗腫瘤細胞作用。因此，抗菌肽又稱為肽抗生素(peptide antibiotics)。它是機體非特異性免疫的重要組成部分，是生物體抗感染免疫的古老 機制，所以又叫做"第二防御體系"。研究表明，抗菌肽具有抗菌活性強、廣譜抗 菌、熱穩(wěn)定性及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。同時還有高效的抗真菌和(或)抗病毒和( 或)原蟲和(或)抗腫瘤活性。在臨床感染菌對傳統(tǒng)抗生素耐藥性日益嚴重的今天， 人們希望抗菌肽成為繼傳統(tǒng)抗生素之后的又一類新型抗感染藥物。隨著分子生物學 技術的發(fā)展，抗菌肽已成為近年來分子免疫學和分子生物學的研究熱點。研究的內(nèi) 容包括抗菌肽的分離與純化，氨基酸序列的分析；蛋白質(zhì)構(gòu)型與功能的關系，抗 菌肽的作用機理；應用基因工程技術克隆和表達抗菌肽基因；改造合成抗菌肽基因 以及動植物的轉(zhuǎn)抗菌肽基因工程等，其中抗菌肽基因工程研究最受重視。
近年來，隨著抗生素的應用和濫用，耐藥菌株不斷增加，向抗感染治療提出了 嚴峻的挑戰(zhàn)。根據(jù)美國《新聞周刊》報道，早在1992年全美國就有13300名患者死 于抗生素耐藥性細菌感染?，F(xiàn)在已有抗所有抗生素的耐藥菌株出現(xiàn)。為了解決這一 問題，人們一方面對傳統(tǒng)抗生素進行結(jié)構(gòu)改造以對付細菌的耐藥性，另一方面，人 們研究和開發(fā)新型的藥物?？咕呐c傳統(tǒng)抗生素相比，其不同點在于抗菌肽的作用 靶位點是病原體細胞膜，因此不易產(chǎn)生耐藥性，尤其是抗菌肽能特異性的抑制腫瘤 細胞，而對正常細胞沒有毒害作用，這給抗癌藥物的開發(fā)帶來了新的希望。美國、 英國皇家醫(yī)學會將抗菌肽列為21世紀抗癌首選藥物。另外，抗真菌肽的發(fā)現(xiàn)，對人 們棘手的真菌病治療提供了新的思路。
目前，將抗菌肽開發(fā)成藥物己成共識，但天然抗菌肽的產(chǎn)量非常有限，合成肽 價格非常昂貴，這將成為開發(fā)新藥的一個瓶頸，利用基因工程技術重組表達外源基 因成為獲取抗菌肽最有效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗白色念珠菌抗菌肽的 基因工程制取方法。
5本發(fā)明的特征在于由以下方法來實現(xiàn)；
綿羊生殖道抗菌肽的核酸序列如序列表<210>1所示，
綿羊生殖道抗菌肽的氨基酸序列如序列表<210>2所示，
天然抗菌肽序列人工合成酵母偏愛密碼子序列如序列表<210>3所示，
上游弓1物序列如序列表<210〉4所示，
下游引物序列如序列表<210>5所示，
下游弓1物序列如序列表<210>6所示，
上游弓I物序列如序列表<210>7所示，
下游弓1物序列如序列表<210>8所示，
弓I物濃度為0.0009mmol/L,
一、 綿羊生殖道抗菌肽cDNA克隆；
首先，禾U用3 5 ug總RNA(核糖核酸)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板進 行巢式PCR(巢式聚合酶鏈反應)，第一次PCR擴增反應體系為25uL，其中含2 2. 5 u L 10 X Ex Taq Buffer (Taq聚合酶緩沖液含Mg2, 、 1U TaKaRa Ex Taq，(Taq聚合 酶)、上游引物如序列表<210>4和下游引物如序列表<210>5，各0.5 luL、 2 5 u L cDNA模板、1 xcDNA dilution buffer(cDNA緩沖液)3 4 u L、 14 16 u L滅菌的三 蒸水，擴增條件為94 95t:2 3min變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C 30 45 S， 54 56°C 30 45S， 72。Cl 2min， 30 35個循環(huán)后71 73。C延伸7 10min， 第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板，引物用上游引物如序列表<210>4和下游引物 如序列表<210>6，其他與第一次PCR相同，擴增結(jié)束后取3 5 yLPCR產(chǎn)物用濃度 為1.5 2%瓊脂糖凝膠(質(zhì)量百分比)電泳檢測，陽性和陰性對照與以上描述的相同；
采用回收試劑盒回收PCR擴增目的產(chǎn)物250 bp，純化后，直接與pMD18-T載體 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(五.Co/fDHsa)，經(jīng)藍白斑篩選，提取質(zhì)粒，PCR鑒定后，選取3 個陽性克隆測序，測序結(jié)果顯示，得到的產(chǎn)物為目的基因如圖l;
二、 綿羊抗菌肽密碼子優(yōu)化及真核表達載體的構(gòu)件 第一步綿羊抗菌肽密碼子優(yōu)化，并克隆于PUC57-T載體上， 密碼子序列如序列表<210>3;
第二步重組表達載體的構(gòu)建；
將PUC57-T-ORTAP40與pPIC3.5K質(zhì)粒分別用EcoRI、 BamHI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳純化、回收，得到目的片段，將其中的pPIC3.5K大片段與DNA片段于16 18'CT4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(E.a^DH5a)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)藍白斑篩選，PCR 和雙酶切鑒定后，測定序列，驗證其讀碼框的正確性如圖2、圖3;
三、 綿羊生殖道抗菌肽的重組酵母轉(zhuǎn)化子鑒定與誘導表達 重組酵母轉(zhuǎn)化子的表型篩選與PCR鑒定將重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)儀器,在1996
62000v時電轉(zhuǎn)入工程菌GS115中，并用遺傳酶素G418進行篩選，將高濃度抗生素下的 酵母菌落分別對應在MM和MD兩平板上，同時在28 3(TC培養(yǎng)2 3天，在MM平板 上生長緩慢，而在MD平板上正常生長的菌落，為甲醇利用緩慢型(Muts)，在MM和 MD平板上生長均正常的菌落，為甲醇利用野生型(Mut+);
重組酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定首先提取酵母基因組DNA，即在濕重2 5g的酵 母菌中加入2 6單位的融細胞酶，28 32t:培養(yǎng)10 30min,然后置放于零下70 80 °C30 40min，最后用玻璃珠破碎，破碎后用10000 12000r/min離心，2 5min，取 上清，上清內(nèi)含有酵母基因組，以酵母基因組DNA為模板，上游引物如序列表<210 >7和下游引物如序列表<210>8，進行PCR擴增，反應體系50ul，其中含10xPCR Buffer4 6ul、 MgCl2(25mmol/L)3 5 ul、體積濃度為2 2.5mmol/LdNTP1.5 2.5ul、 上游引物如序列表<210>7和下游引物如序列表<210>8，各1.5 2.5ul、 Taq酶0.25 0.35ul、模板3 6ul、 ddH2O27 30ul; PCR反應條件94 95 。C 2 3 min，變性后進 入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為92-95°C 0.5 lmin， 54 56°C 0.5 lmin， 71-73°C l 2min，共30 35個循環(huán)，最后在71-73t:延伸7 10min;如圖4
挑取甲醇利用野生型(Mut+)轉(zhuǎn)化子單菌落接種于25 100mlBMGY培養(yǎng)基28 30 °C200 250r/min振蕩培養(yǎng)至OD280-600達至IJ2,0 6.0時，0 10°C 5000 10000r/min 離心收集菌體，將菌體用100 200mlBMMY培養(yǎng)基重懸，使OD280-600達到1.0， 27 30°C 200 300r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔18 26h補加一次甲醇至終體積濃度為0. 5% v/v，同時每隔22-26h取一次培養(yǎng)液，經(jīng)0 10。C 5000 10000r/min離心5 10min ，收集菌體沉淀，用玻璃珠法裂解菌體，結(jié)果表明所表達的巨的產(chǎn)物具有很強的 抗菌活性；
三、 重組抗菌肽初級分離；
用凝膠過濾色譜方法進行初級分離在室溫下將48 53.08交聯(lián)葡聚糖凝膠0-50(SephadexG-50)，溶解于480.0-530.0 mL去離子水中澎脹20-26 h，采用真空泵脫除 凝膠中氣體后，進行裝柱使其成4) lcmx 15 100cm柱，先用0.15 0.25N氫氧化鈉 清洗液沖洗2 4h，再用濃度為0.1 0.05mol/L ， pH值為5 7乙酸銨洗脫液平衡柱 子，將樣品重懸在上述洗脫液中，以9000 12000r/min離心10 20min，取上清上 樣,洗脫流速18 20mL/h，收集目的峰，整個洗脫過程在0 1(TC環(huán)境中進行，用 吸光值200 300nm檢測洗脫峰，收集后冷凍干燥，重新溶解在濃度為0.01 0.05% 乙酸中，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性，進行活性實驗，如圖5;
四、 重組抗菌肽精分離
用反相高效液相色譜方法進行精分離將凝膠過濾色譜有抗菌部分進行第二步
分離純化，將樣品重懸在濃度為0.01 0.05%乙酸洗脫液中，在0 10。C時以9000 12000 r/min離心10 20min，取上清上樣于反相高效液相色譜柱(Hypersil BDS C18
7RP-HPLC column),柱長為0.2 0.5c m X 20 100 cm ，用含濃度為0.08 0.11%三 氟乙酸的水和含濃度為0.08 0.11%三氟乙酸的乙腈按990 999:1 10的體積比構(gòu)成 的洗脫液進行梯度洗脫，吸光值200 300nm檢測洗脫峰，收集冷凍干燥，測定蛋白 濃度、檢測抗菌活性如圖6。
五、 重組抗菌肽純度鑒定
重組表達得到純品采用HPLC鑒定，將重組抗菌肽溶解在濃度為0.08 0.11%三 氟乙酸水溶液中，在0 ^C時以卯00 U000r/min，離心10 S0min，取上清10 15ul上樣于C18柱，用含有濃度為0.08 0.11%的三氟乙酸的水和含有濃度為0.08 0.11%的乙腈按990-999:1-10體積比構(gòu)成的洗脫液，反復沖洗柱子，保證柱子中的 雜質(zhì)及吸附的蛋白質(zhì)被徹底的清洗，并以18 20mL/h進行洗脫分離，得到的抗菌肽 純品如圖7;
六、 重組抗菌肽抑菌活性測定
采用薄層瓊脂糖孔穴擴散法；以金黃色葡萄球菌(ATCC2592)、白色念珠菌 (ATCC2002)、大腸桿菌(ATCC25922)、鏈球菌(ATCC55121)為實驗菌株，將 上述細菌培養(yǎng)至OD280-600達到0.5 0.6時，取60ul均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基表面， 將經(jīng)過滅菌處理的直徑為0.5cm的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加10 15ul待測抗菌肽 純品，于37'C過夜培養(yǎng)12 16h,觀察抑菌圈形成與否，有抑菌圈形成表明有抗菌活
性。(本發(fā)明除特殊說明外所述的濃度均為體積濃度) 上述的吸光值最好為215 285nm。
上述的反相高效液相色譜柱，柱長最好為0.4 0.5c m X 20 50 cm 。 本發(fā)明制取的抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高，耐受蛋白酶水解的能力，可有效抑制革
蘭氏陽性、陰性和真菌的生長，且具有分離提純工藝快速、高效，回收率高等特
點，可廣泛用于獸藥、防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品等領域。


圖1綿羊生殖道抗菌肽PCR電泳圖
圖2綿羊生殖道抗菌肽重組表達載體構(gòu)建
圖3綿羊生殖道抗菌肽重組表達載體PCR鑒定電泳圖
圖4綿羊生殖道抗菌肽酵母重組轉(zhuǎn)化子PCR鑒定電泳圖
圖5綿羊生殖道抗菌肽重組表達蛋白SephadexG-50純化
圖6綿羊生殖道抗菌肽重組表達蛋白反相液相色譜純化
圖7綿羊生殖道抗菌肽重組表達蛋白反相液相色譜純度鑒定
附圖1中，從1 4分別是Mark,陰性對照，陽性對照，ORTAP40。附圖3中1 6分別是合成序列雙酶切、質(zhì)粒PCR圖，重組質(zhì)粒pPIC3.5k-ORTAP40PCR，空 質(zhì)粒pPIC3.5kPCR圖，空白對照，Mark。附圖4中1 6分別是空質(zhì)粒pPIC3.5kPCR，重組質(zhì)粒pPIC3.5k-ORTAP40 PCR，酵母基因組(mut+) 、 (muts)PCR，空白對照，Mark。
附圖5中X軸表示試管號，即在洗脫交聯(lián)葡聚糖凝膠色譜柱時，接收從該過濾柱中流出的溶液的試管的編號，每個試管接收1.5ml; Y軸表示吸光值，即在280nm的
波長下試管中溶液的吸光值。
附圖6、 7中X軸表示洗脫時間，Y軸表示吸光值，即在215nm的波長下試管中溶
液的吸光值。
具體實施例方式
實施例l:
綿羊生殖道抗菌肽的核酸序列如序列表<210>1所示，
綿羊生殖道抗菌肽的氨基酸序列如序列表<210>2所示，
天然抗菌肽序列人工合成酵母偏愛密碼子序列如序列表<210〉3所示，
上游引物序列如序列表<210>4所示，
下游引物序列如序列表<210>5所示，
下游引物序列如序列表<210〉6所示，
上游引物序列如序列表<210>7所示，
下游引物序列如序列表<210>8所示，
弓I物濃度0.0009mmol/L,
一、 綿羊生殖道抗菌肽cDNA克隆；
首先，禾U用3wg總RNA(核糖核酸)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板進行巢式PCR(巢式聚合酶鏈反應)，第一次PCR擴增反應體系為25yL，其中含2uL10xEx Taq Buffer (Taq聚合酶緩沖液含Mg" 、 1U TaKaRa Ex Taq"^(Taq聚合酶)、上游引物如序列表<210>4和下游引物如序列表<210>5，各0.5uL、 2pLcDNA模板、lxcDNA dilution buffer(cDNA緩沖液)3 u L、 16.85 w L滅菌的三蒸水，擴增條件為94。C2min變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C30S， 54。C30S， 72°C lmin， 30個循環(huán)后7rc延伸7min，第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板，引物用上游引物如序列表<210>4和下游引物如序列表<210>6，其他與第一次PCR相同，擴增結(jié)束后取3 5u LPCR產(chǎn)物用濃度為1.5^瓊脂糖凝膠(質(zhì)量百分比)電泳檢測，陽性和陰性對照與以上描述的相同；
采用回收試劑盒回收PCR擴增目的產(chǎn)物250 bp，純化后，直接與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(￡.0^'011^)，經(jīng)藍白斑篩選，提取質(zhì)粒，PCR鑒定后，選取3
個陽性克隆測序，測序結(jié)果顯示，得到的產(chǎn)物為目的基因如圖l;
二、 綿羊抗菌肽密碼子優(yōu)化及真核表達載體的構(gòu)件第一步綿羊抗菌肽密碼子優(yōu)化，并克隆于PUC57-T載體上，密碼子序列如序列表<210>3;第二步重組表達載體的構(gòu)建；
將PUC57-T-ORTAP40與pPIC3.5K質(zhì)粒分別用EcoRI、 Bamffl雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化、回收，得到目的片段，將其中的pPIC3.5K大片段與DNA片段于16 X:T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(^C^DH5a)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)藍白斑篩選，PCR和雙酶切鑒定后，測定序列，驗證其讀碼框的正確性；
三、綿羊生殖道抗菌肽的重組酵母轉(zhuǎn)化子鑒定與誘導表達
重組酵母轉(zhuǎn)化子的表型篩選與PCR鑒定將重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)儀器,在1996v時電轉(zhuǎn)入工程菌GS115中，并用遺傳酶素G418進行篩選，將高濃度抗生素下的酵母菌落分別對應在MM和MD兩平板上，同時在28°(:培養(yǎng)2天，在MM平板上生長緩慢，而在MD平板上正常生長的菌落，為甲醇利用緩慢型(Muts)，在MM和MD平板上生長均正常的菌落，為甲醇利用野生型(Mut+);
重組酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定首先提取酵母基因組DNA，即在濕重2g的酵母菌中加入2單位的融細胞酶，28'C培養(yǎng)10 30min，然后置放于零下70 8(TC30 40min，最后用玻璃珠破碎，破碎后用100000r/min離心，2min，取上清，上清內(nèi)含有酵母基因組，以酵母基因組DNA為模板，上游引物如序列表<210>7和下游引物如序列表<210>8，進行PCR擴增，反應體系50ul，其中含10xPCRBuffer4ul、 MgCk(25mmol/L)3ul、體積濃度為2mmol/LdNTPl.Sul、上游引物和下游引物，各1.5ul、 Taq酶(U5ul、模板3ul、 ddH20 35.25ul; PCR反應條件94 °C 2 min，變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為92°C lmin， 54°C 0.5min， 71°C lmin，共30個循環(huán)，最后在7rc延伸7min;
挑取甲醇利用野生型(Mut+)轉(zhuǎn)化子單菌落接種于25mlBMGY培養(yǎng)基28T:200r/min振蕩培養(yǎng)至OD280達到2.0時，0 。C 5000r/min離心收集菌體，將菌體用100mlBMMY培養(yǎng)基重懸，使OD280達到1.0， 27°C 200r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔18h補加一次甲醇至終體積濃度為0.5% v/v，同時每隔24h取一次培養(yǎng)液，經(jīng)(TC 5000r/min離心5min，收集菌體沉淀，用玻璃珠法裂解菌體，結(jié)果表明所表達的目的產(chǎn)物具有很強的抗菌活性；
三、重組抗菌肽初級分離；
用凝膠過濾色譜方法進行初級分離在室溫下將48g交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50(SephadexG-50)，溶解于480.0 mL去離子水中澎脹20h，采用真空泵脫除凝膠中氣體后，進行裝柱使其成4) lcmx 15cm柱，先用0.15N氫氧化鈉清洗液沖洗2h，再用濃度為0.1mol/L， pH值為5的乙酸銨洗脫液平衡柱子，將樣品重懸在上述洗脫液中，以9000r/min離心10min，取上清上樣,洗脫流速18 mL/h，收集目的峰，整個洗脫過程在(TC環(huán)境中進行，用吸光值200nm檢測洗脫峰，收集后冷凍干燥，重新溶解在濃
10度為0.01%乙酸中，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性，進行活性實驗，如圖5;
四、 重組抗菌肽精分離
用反相高效液相色譜方法進行精分離將凝膠過濾色譜有抗菌部分進行第二步
分離純化，將樣品重懸在濃度為0.01%乙酸洗脫液中，在0。C時以卯00r/min離心10min，取上清上樣于反相高效液相色譜柱(HypersilBDSC18RP-HPLC column),柱長為0.2cm X 20 cm ，用含濃度為0.08%三氟乙酸的水和含濃度為0.08%三氟乙酸的乙腈按990:10的體積比構(gòu)成的洗脫液進行梯度洗脫，吸光值200nm檢測洗脫峰，收集冷凍干燥，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性如圖6。
五、 重組抗菌肽純度鑒定
重組表達得到純品采用HPLC鑒定，將重組抗菌肽溶解在濃度為0.08%三氟乙酸水溶液中，在0。C時以卯OOr/min，離心10min，取上清10ul上樣于C18柱，用含有濃度為0.08%的三氟乙酸的水和含有濃度為0.08%的乙腈按990:10體積比構(gòu)成的洗脫液，反復沖洗柱子，保證柱子中的雜質(zhì)及吸附的蛋白質(zhì)被徹底的清洗，并以18mL/h進行洗脫分離，得到的抗菌肽純品如圖7;
六、 重組抗菌肽抑菌活性測定
采用薄層瓊脂糖孔穴擴散法；以金黃色葡萄球菌(ATCC2592)、白色念珠菌(ATCC2002)、大腸桿菌(ATCC25922)、鏈球菌(ATCC55121)為實驗菌株，將上述細菌培養(yǎng)至OD280達到0.5時，取60u購勻涂布于固體LB培養(yǎng)基表面，將經(jīng)過滅菌處理的直徑為0.5cm的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加10ul待測抗菌肽純品，于37'C過夜培養(yǎng)12 16h,觀察抑菌圈形成與否，有抑菌圈形成表明有抗菌活性。
實施例2:
綿羊生殖道抗菌肽的核酸序列如序列表<210>1所示，
綿羊生殖道抗菌肽的氨基酸序列如序列表<210>2所示，
天然抗菌肽序列人工合成酵母偏愛密碼子序列如序列表<210>3所示，
上游弓I物序列如序列表<210>4所示，
下游弓I物序列如序列表<210>5所示，
下游引物序列如序列表<210>6所示，
上游弓I物序列如序列表〈10>7所示，
下游引物序列如序列表<210>8所示，
引物濃度0.0009mmol/L，
一、綿羊生殖道抗菌肽cDNA克??；
首先，禾擁5 yg總RNA很糖核酸)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板進行巢式PCR(巢式聚合酶鏈反應)，第一次PCR擴增反應體系為25uL，其中含2.5uL10X Ex Taq Buffer (Taq聚合酶緩沖液含Mg, 、 1U TaKaRa Ex Taq，(Taq聚合酶)、上游引物如序列表<210>4和下游引物如序列表<210>5，各luL、 5uLcDNA模板、1X cDNA dilution buffer(cDNA緩沖液)4 u L、 11.35 u L滅菌的三蒸水，擴增條件為95°C 3min變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94'C45S， 56°C 45S， 72'C2min， 35個循環(huán)后73'C延伸10min，第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板，用上游引物如序列表<210>4和下游引物如序列表<210>6，其他與第一次PCR相同，擴增結(jié)束后取5uLPCR產(chǎn)物用濃度為2^瓊脂糖凝膠(質(zhì)量百分比)電泳檢測，陽性和陰性對照與以上描述的相同；
采用回收試劑盒回收PCR擴增目的產(chǎn)物250bp，純化后，直接與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(ACo/z'DH50，經(jīng)藍白斑篩選，提取質(zhì)粒，PCR鑒定后，選取3個陽性克隆測序，測序結(jié)果顯示，得到的產(chǎn)物為目的基因如圖l;
二、 綿羊抗菌肽密碼子優(yōu)化及真核表達載體的構(gòu)建第一步綿羊抗菌肽密碼子優(yōu)化，并克隆于PUC57-T載體上，密碼子序列如序列表<210>3;
第二步重組表達載體的構(gòu)建；
將PUC57-T-ORTAP40與pPIC3.5K質(zhì)粒分別用EcoRI、 BamHI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化、回收，得到目的片段，將其中的pPIC3.5K大片段與DNA片段于16 18'CT4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(E.Co/z'Dfta)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)藍白斑篩選，PCR和雙酶切鑒定后，測定序列，驗證其讀碼框的正確性如圖2、圖3;
三、 綿羊生殖道抗菌肽的重組酵母轉(zhuǎn)化子鑒定與誘導表達重組酵母轉(zhuǎn)化子的表型篩選與PCR鑒定將重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)儀器,在2000v時電
轉(zhuǎn)入工程菌GS115中，并用遺傳酶素G418進行篩選，將高濃度抗生素下的酵母菌落分別對應在MM和MD兩平板上，同時在3(TC培養(yǎng)3天，在MM平板上生長緩慢，而在MD平板上正常生長的菌落，為甲醇利用緩慢型(Muts)，在MM和MD平板上生長均正常的菌落，為甲醇利用野生型(Mut+);
重組酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定首先提取酵母基因組DNA，即在濕重5g的酵母菌中加入6單位的融細胞酶，3rc培養(yǎng)30min,然后置放于零下8(TC40min，最后用玻璃珠破碎，破碎后用12000r/min離心，5min，取上清，上清內(nèi)含有酵母基因組，以酵母基因組DNA為模板，上游引物如序列表<210>7和下游引物如序列表<210>8，進行PCR擴增，反應體系50ul，其中含10xPCRBuffer6ul、 MgCl2(25mmol/L)5 ul、體積濃度為15mmol/LdNTP2.5ul、上游引物和下游引物，各2.5ul、 Taq酶0,35ul、模板6ul、 ddH2025.15ul; PCR反應條件95 。C 3 min，變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95。C lmin， 56°C lmin， 73°C 2min，共35個循環(huán)，最后在73。C延伸10min;
挑取甲醇利用野生型(Mut+)轉(zhuǎn)化子單菌落接種于100mlBMGY培養(yǎng)基3(TC 250r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達到6.0時，10 。C 10000r/min離心收集菌體，將菌體用
12200mlBMMY培養(yǎng)基重懸，使OD600達到1.0， 30°C 300r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔2611補加一次甲醇至終體積濃度為0.5% v/v，同時每隔24h取一次培養(yǎng)液，經(jīng)1(TC 10000r/min離心10min，收集菌體沉淀，用玻璃珠法裂解菌體，結(jié)果表明所表達的目的產(chǎn)物具有很強的抗菌活性；
三、 重組抗菌肽初級分離；
用凝膠過濾色譜方法進行初級分離在室溫下將53.0g交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50(SephadexG-50)，溶解于530.0 mL去離子水中澎脹26 h，采用真空泵脫除凝膠中氣體后，進行裝柱使其成* lcmx 100cm柱，先用0.25N氫氧化鈉清洗液沖洗4h，再用濃度為0.05mol/L ， pH值為7乙酸銨洗脫液平衡柱子，將樣品重懸在上述洗脫液中，以12000 r/min離心20min，取上清上樣，洗脫流速20 mL/h，收集目的峰，整個洗脫過程在10'C環(huán)境中進行，用吸光值300nm檢測洗脫峰，收集后冷凍干燥，重新溶解在濃度為0.05%乙酸中，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性，進行活性實驗，如圖
四、 重組抗菌肽精分離-
用反相高效液相色譜方法進行精分離將凝膠過濾色譜有抗菌部分進行第二步分離純化，將樣品重懸在濃度為0.05%乙酸洗脫液中，在l(TC時以12000r/min離心20min，取上清上樣于反相高效液相色譜柱(HypersilBDSC18RP-HPLC column),柱長為0.5cmx 100cm，用含濃度為O.ll %三氟乙酸的水和含濃度為0.11 %三氟乙酸的乙腈按999:1的體積比構(gòu)成的洗脫液進行梯度洗脫，吸光值300nm檢測洗脫峰，收集冷凍干燥，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性如圖6。
五、 重組抗菌肽純度鑒定
重組表達得到純品采用HPLC鑒定，將重組抗菌肽溶解在濃度為O.ll%三氟乙酸水溶液中，在4t時以12000 r/min，離心10 20min，取上清15 ul上樣于C18柱，用含有濃度為0.11%的三氟乙酸的水和含有濃度為0.11%的乙腈按999:1體積比構(gòu)成的
洗脫液，反復沖洗柱子，保證柱子中的雜質(zhì)及吸附的蛋白質(zhì)被徹底的清洗，并以20mL/h進行洗脫分離，得到的抗菌肽純品如圖7;
六、 重組抗菌肽抑菌活性測定
采用薄層瓊脂糖孔穴擴散法；以金黃色葡萄球菌(ATCC2592)、白色念珠菌(ATCC2002)、大腸桿菌(ATCC25922)、鏈球菌(ATCC55121)為實驗菌株，將上述細菌培養(yǎng)至OD600達到0.6時，取60ul均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基表面，將經(jīng)過滅菌處理的直徑為0.5cm的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加15ul待測抗菌肽純品，于37'C過夜培養(yǎng)16h,觀察抑菌圈形成與否，有抑菌圈形成表明有抗菌活性。
本發(fā)明制取的抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高，耐受蛋白酶水解的能力，可有效抑制革蘭氏陽性、陰性和真菌的生長，且具有分離提純工藝快速、高效，回收率高等特點，可廣泛用于獸藥、防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品等領域。
13序列表
新疆農(nóng)墾科學院<120> —種抗菌肽的基因工程制取方法<160> 8<210> 1<211>200<212> DNA
<213>綿羊'(Ovisaries)<220>
<221> mat_peptide<400> 3
GAAAATTCAAAAAAAAAAAA
Ala Tyr Val Leu Asp Glu Pro Lys Pro lie Lys Asp Leu Glu Lys Ser1 5 10 15
Leu Gin His Asn Leu Val Tyr Cys Arg Arg Leu Val Leu Glu Tyr Phe20 25 30
TTA AAA AGT ATT TTT GAA TAC CAT 120Leu Lys Ser lie Phe Glu Tyr His35 40
<210>2
<211>40
<212>PRT
<213>綿羊(Ovisaries)<400> 2
Ala Tyr Val Leu Asp Glu Pro Lys Pro lie Lys Asp Leu Glu Lys Ser1 5 10 15
Ixu Gin His Asn Leu Val Tyr Cys Arg Arg Leu Val Leu Glu Tyr Phe20 25 30
TTA AAA AGT ATT TTT GAA TAC CAT Leu Lys Ser lie Phe Glu Tyr His 35 40
<210>3 <211> 138 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221> mat_peptide
<223>根據(jù)酵母偏好性而設計， 一促進更高效的表達目的蛋白 <400> 1
GAGTACCATTAAGAATTC 138
<210>4 ■<211>27 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<221> misc—feature <223>引物 <400> 4
GCNTAYGTNYTNGAYGARCCNAARCCN
<210>5 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221> misc—feature <223>引物 <400> 5
TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT <210>6<211>32 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221> misc—feature <223>引物 <400> 6
CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
<210>7 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221> misc—feature <223>引物 <400> 7
GACTGGTTCCAATTGACAAGC
<210> 8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc一feature <223>引物 <400> 8
GCAAATGGCATTCTGACATCC
1權利要求
1、一種抗白色念珠菌抗菌肽的基因工程制取方法，其特征在于由以下方法來實現(xiàn)；綿羊生殖道抗菌肽的核酸序列如序列表<210>1所示，綿羊生殖道抗菌肽的氨基酸序列如序列表<210>2所示，天然抗菌肽序列人工合成酵母偏愛密碼子序列如序列表<210>3所示，上游引物序列如序列表<210>4所示，下游引物序列如序列表<210>5所示，下游引物序列如序列表<210>6所示，上游引物序列如序列表<210>7所示，下游引物序列如序列表<210>8所示，引物濃度為0. 0009mmol/L，綿羊生殖道抗菌肽cDNA克??；首先，利用3～5μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板進行巢式PCR(巢式聚合酶鏈反應)，第一次PCR擴增反應體系為25μL，其中含2～2.5μL10×Ex Taq Buffer、1U TaKaRa Ex TaqTM、上游引物如序列表<210>4和下游引物如序列表<210>5，各0.5～1μL、2～5μL cDNA模板、1×cDNA dilution buffer3～4μL、14～16μL滅菌的三蒸水，擴增條件為94～95℃2～3min變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94℃30～45S，54～56℃30～45S，72℃1～2min，30～35個循環(huán)后71～73℃延伸7～10min，第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板，引物用上游引物如序列表<210>4和下游引物如序列表<210>6，其它與第一次PCR相同，擴增結(jié)束后取3～5μL PCR產(chǎn)物用濃度為1.5～2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性和陰性對照與以上描述的相同；采用回收試劑盒回收PCR擴增目的產(chǎn)物250bp，純化后，直接與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)藍白斑篩選，提取質(zhì)粒，PCR鑒定后，選取3個陽性克隆測序，測序結(jié)果顯示，得到的產(chǎn)物為目的基因；綿羊抗菌肽密碼子優(yōu)化及真核表達載體的構(gòu)件第一步綿羊抗菌肽密碼子優(yōu)化，并克隆于PUC57-T載體上，密碼子序列如序列表<210>3第二步重組表達載體的構(gòu)建；將PUC57-T-ORTAP40與pPIC3.5K質(zhì)粒分別用EcoRI、BamHI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化、回收，得到目的片段，將其中的pPIC3.5K大片段與DNA片段于16～18℃T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)藍白斑篩選，PCR和雙酶切鑒定后，測定序列，驗證其讀碼框的正確性；綿羊生殖道抗菌肽的重組酵母轉(zhuǎn)化子鑒定與誘導表達重組酵母轉(zhuǎn)化子的表型篩選與PCR鑒定將重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)儀器，在1996～2000v時電轉(zhuǎn)入工程菌GS115中，并用遺傳酶素G418進行篩選，將高濃度抗生素下的酵母菌落分別對應在MM和MD兩平板上，同時在28～30℃培養(yǎng)2～3天，在MM平板上生長緩慢，而在MD平板上正常生長的菌落，為甲醇利用緩慢型，在MM和MD平板上生長均正常的菌落，為甲醇利用野生型(Mut+)；重組酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定首先提取酵母基因組DNA，即在濕重2～5g的酵母菌中加入2～6單位的融細胞酶，28～32℃培養(yǎng)10～30min，然后置放于零下70～80℃30～40min，最后用玻璃珠破碎，破碎后用10000～12000r/min離心，2～5min，取上清，上清內(nèi)含有酵母基因組，以酵母基因組DNA為模板，上游引物如序列表<210>7和下游引物如序列表<210>8，進行PCR擴增，反應體系50ul，其中含10×PCRBuffer4-6ul、體積濃度為25mmol/LMgCl23～5ul、體積濃度為2～2.5mmol/LdNTP1.5～2.5ul、上游引物如序列表<210>7和下游引物如序列表<210>8，各1.5～2.5ul、Taq酶0.25～0.35ul、模板3～6ul、ddH2O27～30ul；PCR反應條件94～95℃2～3min，變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為92-95℃0.5～1min，54～56℃0.5～1min，71-73℃1～2min，共30～35個循環(huán)，最后在72℃延伸7～10min；挑取甲醇利用野生型(Mut+)轉(zhuǎn)化子單菌落接種于25～100mlBMGY培養(yǎng)基28～30℃200～250r/min振蕩培養(yǎng)至OD280～600達到2.0～6.0時，0～10℃5000～10000r/min離心收集菌體，將菌體用100～200mlBMMY培養(yǎng)基重懸，使OD280-600達到1.0，27～30℃200～300r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔18～26h補加一次甲醇至終體積濃度為0.5％v/v，同時每隔22-26h取一次培養(yǎng)液，經(jīng)0～10℃5000～10000r/min離心5～10min，收集菌體沉淀，用玻璃珠法裂解菌體，結(jié)果表明所表達的目的產(chǎn)物具有很強的抗菌活性；重組抗菌肽初級分離；用凝膠過濾色譜方法進行初級分離在室溫下將48～53.0g交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50，溶解于480.0～530.0mL去離子水中澎脹20～26h，采用真空泵脫除凝膠中氣體后，進行裝柱使其成φ1cm×15～100cm柱，先用0.15～0.25N氫氧化鈉清洗液沖洗2～4h，再用濃度為0.1～0.05mol/L，pH值為5～7乙酸銨洗脫液平衡柱子，將樣品重懸在上述洗脫液中，以9000～12000r/min離心10～20min，取上清上樣，洗脫流速18～20mL/h，收集目的峰，整個洗脫過程在0～10℃環(huán)境中進行，用吸光值200～300nm檢測洗脫峰，收集后冷凍干燥，重新溶解在濃度為0.01～0.05％乙酸中，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性，進行活性實驗；重組抗菌肽精分離用反相高效液相色譜方法進行精分離將凝膠過濾色譜有抗菌部分進行第二步分離純化，將樣品重懸在濃度為0.01～0.05％乙酸洗脫液中，在0～10℃時以9000～12000r/min離心10～20min，取上清上樣于反相高效液相色譜柱，柱長為0.2～0.5cm×20～100cm，用含濃度為0.08～0.11％三氟乙酸的水和含濃度為0.08～0.11％三氟乙酸的乙腈按990～999∶1～10的體積比構(gòu)成的洗脫液進行梯度洗脫，吸光值200～300nm檢測洗脫峰，收集冷凍干燥，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性。
2、 如權利要求l所說的一種抗白色念珠菌抗菌肽的基因工程制取方法，其特 征在于上述的吸光值為215 285nm。
3、 如權利要求1或2所說的一種抗白色念珠菌抗菌肽的基因工程制取方法，其 特征在于上述的反相高效液相色譜柱，柱長為0.4 0.5cm X 20 50cm 。
全文摘要
一種抗白色念珠菌抗菌肽的基因工程制取方法，本發(fā)明利用基因工程的方法提供了一種綿羊抗菌肽的編碼基因、利用重組DNA技術構(gòu)建真核表達載體，構(gòu)建、在于重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主工程菌GS115，構(gòu)建表達工程菌、進行甲醇誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)凝膠過濾色譜、反相液相色譜得到重組綿羊生殖道抗菌肽。本發(fā)明制取的抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高，耐受蛋白酶水解的能力，可有效抑制革蘭氏陽性、陰性和真菌的生長，且具有分離提純工藝快速、高效，回收率高等特點，可廣泛用于獸藥、防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品等領域。
文檔編號C12N15/12GK101481690SQ20081007303
公開日2009年7月15日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者庫朝鋒, 薄新文, 琛 陳 申請人:新疆農(nóng)墾科學院