專利名稱：一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種自養(yǎng)菌的篩選方法。
技術(shù)背景生物脫硫工藝因去除率高、無需投加化學(xué)藥劑、可生成單質(zhì)硫回收等優(yōu)點而日益受到關(guān)注，其中硫桿菌屬(77^6mz7/w)是一類具有除硫脫氮功能的微 生物，他們可以通過氧化硫化合物獲得能量，同時還可以將硝酸鹽作為電子受 體將其還原為氮氣，整個除硫脫氮過程中不需要外加有機碳源，且可通過控制 適宜的生態(tài)條件，得到最大化的單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率，實現(xiàn)單質(zhì)硫的回收，是一類有 重要意義的工程菌。目前，分離除硫脫氮自養(yǎng)菌菌株都是采用平板劃線法，但由于除硫脫氮自 養(yǎng)菌的生長非常緩慢，時代時間較長，較難在培養(yǎng)基上獲得生長好的單菌落， 且采用平板劃線法時，培養(yǎng)基的存放條件需要保持厭氧條件，這樣也使得在分 離純菌的過程變得更加復(fù)雜，增加了獲得純培養(yǎng)的難度。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有分離除硫脫氮自養(yǎng)菌的方法復(fù)雜、所得單菌落 生長不好的問題，而提供一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法。一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法按以下步驟實現(xiàn) 一、取樣品菌懸液接種于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中，在26 3(TC、 140 180r/min的條件下進行 分離擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)期為14d; 二、取分離擴大培養(yǎng)后的菌懸液接種于固體分 離培養(yǎng)基上，澆蓋培養(yǎng)基制成厭氧夾層培養(yǎng)基，在26 3(TC的條件下恒溫培 養(yǎng)至培養(yǎng)基夾層中出現(xiàn)氣泡；三、挑取氣泡內(nèi)的單菌落，轉(zhuǎn)接于除硫脫氮自養(yǎng) 菌液體培養(yǎng)基中，在26 3(TC的條件下恒溫擴大培養(yǎng)至培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁；四、 挑取培養(yǎng)基中的菌液接種于固體分離培養(yǎng)基上，在26 3(TC的條件下恒溫培 養(yǎng)至有單菌落長成，然后挑取單菌落轉(zhuǎn)接于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中；五、 重復(fù)步驟二、三和四至分離出單菌落，即為除硫脫氮自養(yǎng)菌；其中步驟一、三 和四中所用除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基相同，每升除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基均是由5.0g的Na2S203'5H20、 l.Og的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的 MgSO4'7H2O、3.0g的NaHC03、3.5g的KNO3、0.5mg的EDTA、22.0ug的ZnS04、 55.0ug的CaCl2、 50.6ug的MnCl2.4H20、 ll.Oug的(NH4)6Mo024'4H20、 15.7ug 的CuS04*5H20、 16.1ug的CoCl2，6H20、 lmL的維生素液和余量的蒸餾水組成， 除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基pH值為7.0;步驟二和四中所用固體分離培養(yǎng)基 相同，每升除硫脫氮自養(yǎng)菌固體體培養(yǎng)基均是由5.0g的Na2S203*5H20、 l.Og 的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的MgS04.7H20、 3.0g的NaHCO3、 3.5g的 KNO3、0.5mg的EDTA、22.0ug的ZnSO4、55.0ug的CaCl2、50.6ug的MnCl2'4H20、 ll.Oug的(NH4)6Mo024'4H20、 15.7ug的CuS04.5H20、 16.1ug的CoCl2.6H20、 lmL的維生素液、20g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng) 基pH值為7.0。本發(fā)明采用厭氧夾層法篩選除硫脫氮自養(yǎng)菌，厭氧夾層可以保持微量氧的 缺氧狀態(tài)，這樣更適合除硫脫氮自養(yǎng)菌在培養(yǎng)基上更快更好的長出單菌落，厭 氧夾層法不需要在嚴格厭氧條件下存放，放到室內(nèi)環(huán)境即可，這樣也簡化了實 驗操作程序，增加了分離方法的適用性，在夾層培養(yǎng)基上還可以看到菌落的產(chǎn) 氣情況，因此可以判斷哪些單菌落是需要分離的除硫脫氮自養(yǎng)菌落，同時也提 高了菌種篩選的效率。


圖1是具體實施方式
五中篩選所得除硫脫氮自養(yǎng)菌的透射電鏡圖。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法按以下步驟 實現(xiàn) 一、取樣品菌懸液接種于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中，在26 3(TC、 140 180r/min的條件下進行分離擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)期為14d; 二、取分離擴大 培養(yǎng)后的菌懸液接種于固體分離培養(yǎng)基上，澆蓋培養(yǎng)基制成厭氧夾層培養(yǎng)基， 在26 30。C的條件下恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)基夾層中出現(xiàn)氣泡；三、挑取氣泡內(nèi)的 單菌落，轉(zhuǎn)接于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中，在26 3(TC的條件下恒溫擴 大培養(yǎng)至培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁；四、挑取培養(yǎng)基中的菌液接種于固體分離培養(yǎng)基上， 在26 3(TC的條件下恒溫培養(yǎng)至有單菌落長成，然后挑取單菌落轉(zhuǎn)接于除硫 脫氮自養(yǎng) 菌液體培養(yǎng)基中；五、重復(fù)步驟二、三和四至分離出單菌落，即為除硫脫氮自養(yǎng)菌；其中步驟一、三和四中所用除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基相同， 每升除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基均是由5.0g的Na2S2Oy5H20、 l.Og的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的lv[gS04'7H20、 3.0g的NaHC03、 3.5g的KN03、 0.5mg 的EDTA、 22.0ug的ZnS04、 55.0ug的CaCl2、 50.6ug的MnCl2.4H20、 ll.Oug 的(NH4)6Mo024'4H20、 15.7ug的CuS(V5H20、 16.1ug的CoCl2'6H20、 lmL的 維生素液和余量的蒸餾水組成，除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基pH值為7.0;步驟二和四中所用固體分離培養(yǎng)基相同，每升除硫脫氮自養(yǎng)菌固體體培養(yǎng)基均是由5.0g的Na2S203.5H20、 1 .Og的NH4Cl、2.Og的Na2HP04、0.8g的MgS04.7H20、 3.0g的NaHC03、 3.5g的KN03、 0.5mg的EDTA、 22.0ug的ZnS04、 55.0ug 的CaCl2、 50.6ug的MnCl2,4H20、 ll.Oug的(NH4)6Mo024.4H20、 15.7ug的 CuS(V5H20、 16.1ug的CoCl2*6H20、 lmL的維生素液、20g的瓊脂和余量的 蒸餾水組成，除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基pH值為7.0。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中樣品菌 懸液制備將采集菌膠團或土壤顆粒放入滅菌的錐形瓶中，加入無菌水稀釋， 加入玻璃珠20 25個，以220r/min振蕩24h。其它步驟及參數(shù)與具體實施方 式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中在28 °C、 160r/min的條件下進行分離擴大培養(yǎng)。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一 相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中澆蓋溫 度為45 5(TC。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法按以下步驟 實現(xiàn) 一、取樣品菌懸液接種于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中，在28°C、 160r/min的條件下進行分離擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)期為14d; 二、取分離擴大培養(yǎng)后 的菌懸液接種于固體分離培養(yǎng)基上，澆蓋培養(yǎng)基制成厭氧夾層培養(yǎng)基，在28T: 的條件下恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)基夾層中出現(xiàn)氣泡；三、挑取氣泡內(nèi)的單菌落，轉(zhuǎn)接 于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中，在28'C的條件下恒溫擴大培養(yǎng)至培養(yǎng)基出 現(xiàn)混濁；四、挑取培養(yǎng)基中的菌液接種于固體分離培養(yǎng)基上，在28t的條件 下恒溫培養(yǎng)至有單菌落長成，然后挑取單菌落轉(zhuǎn)接于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中；五、重復(fù)步驟二、三和四至分離出單菌落，即為除硫脫氮自養(yǎng)菌；其中 步驟一、三和四中所用除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基相同，每升除硫脫氮自養(yǎng)菌 液體培養(yǎng)基均是由5.0g的Na2S203'5H20、 l.Og的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的MgS04,7H20、 3.0g的NaHC03、 3.5g的KN03、 0.5mg的EDTA、 22.0ug 的ZnSO4、55.0ug的CaCl2、50.6ug的MnCl2.4H20、 ll.Oug的(1^)6]^0024'4 120、 15.7ug的CuS04'5H20、 16.1ug的CoCl2'6H20、 ImL的維生素液和余量的蒸餾 水組成，除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基pH值為7.0;步驟二和四中所用固體分 離培養(yǎng)基相同，每升除硫脫氮自養(yǎng)菌固體體培養(yǎng)基均是由5.0g的 Na2S203'5H20、 LOg的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的MgS04.7H20、 3.0g 的NaHC03、 3.5g的KN03、 0.5mg的EDTA、 22.0ug的ZnS04、 55.0ug的CaCl2、 50.6ug的MnCl2.4H20、 ll.Oug的(NH4)6Mo024.4H20、 15.7ug的CuS04.5H20、 16.1ug的CoCl2《H20、 lmL的維生素液、20g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，除 硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基pH值為7.0。本實施方式篩選得到的除硫脫氮自養(yǎng)菌，革蘭氏染色陰性，菌株的形態(tài)由 圖1所示，細胞呈桿狀，單個、成對或短鏈狀排列，具有單根極生鞭毛，無芽 孢，菌體大小為(0.3 0.5pm)x(10 15Mm)，對其進行的生理生化特性及其除硫 脫氮能力的鑒定，確定篩選得到的菌株是除硫脫氮自養(yǎng)菌。
權(quán)利要求
1、一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法，其特征在于除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法按以下步驟實現(xiàn)一、取樣品菌懸液接種于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中，在26～30℃、140～180r/min的條件下進行分離擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)期為14d；二、取分離擴大培養(yǎng)后的菌懸液接種于固體分離培養(yǎng)基上，澆蓋培養(yǎng)基制成厭氧夾層培養(yǎng)基，在26～30℃的條件下恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)基夾層中出現(xiàn)氣泡；三、挑取氣泡內(nèi)的單菌落，轉(zhuǎn)接于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中，在26～30℃的條件下恒溫擴大培養(yǎng)至培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁；四、挑取培養(yǎng)基中的菌液接種于固體分離培養(yǎng)基上，在26～30℃的條件下恒溫培養(yǎng)至有單菌落長成，然后挑取單菌落轉(zhuǎn)接于除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基中；五、重復(fù)步驟二、三和四至分離出單菌落，即為除硫脫氮自養(yǎng)菌；其中步驟一、三和四中所用除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基相同，每升除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基均是由5.0g的Na2S2O3·5H2O、1.0g的NH4Cl、2.0g的Na2HPO4、0.8g的MgSO4·7H2O、3.0g的NaHCO3、3.5g的KNO3、0.5mg的EDTA、22.0ug的ZnSO4、55.0ug的CaCl2、50.6ug的MnCl2·4H2O、11.0ug的(NH4)6MoO24·4H2O、15.7ug的CuSO4·5H2O、16.1ug的CoCl2·6H2O、1mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基pH值為7.0；步驟二和四中所用固體分離培養(yǎng)基相同，每升除硫脫氮自養(yǎng)菌固體體培養(yǎng)基均是由5.0g的Na2S2O3·5H2O、1.0g的NH4Cl、2.0g的Na2HPO4、0.8g的MgSO4·7H2O、3.0g的NaHCO3、3.5g的KNO3、0.5mg的EDTA、22.0ug的ZnSO4、55.0ug的CaCl2、50.6ug的MnCl2·4H2O、11.0ug的(NH4)6MoO24·4H2O、15.7ug的CuSO4·5H2O、16.1ug的CoCl2·6H2O、1mL的維生素液、20g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，除硫脫氮自養(yǎng)菌液體培養(yǎng)基pH值為7.0。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法，其特征在于 步驟一中樣品菌懸液制備將采集的菌膠團或土壤顆粒放入滅菌的錐形瓶中， 加入無菌水稀釋，加入玻璃珠20 25個，以220r/min振蕩24h。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法，其特征在于 步驟一中在28°C、 160r/min的條件下進行分離擴大培養(yǎng)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法，其特征在于 步驟二中澆蓋溫度為45 50°C。
全文摘要
一種除硫脫氮自養(yǎng)菌的篩選方法，它涉及一種自養(yǎng)菌的篩選方法。它解決了現(xiàn)有分離除硫脫氮自養(yǎng)菌的方法復(fù)雜、所得單菌落生長不好的問題。方法1.取樣品菌懸液，進行分離擴大培養(yǎng)；2.厭氧夾層培養(yǎng)出單菌落；3.挑取單菌落，進行擴大培養(yǎng)；4.挑取擴大培養(yǎng)后菌液，接種于固體分離培養(yǎng)至有單菌落長成，然后挑取單菌落轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基中；5.重復(fù)步驟二、三和四至分離出單菌落，即為除硫脫氮自養(yǎng)菌。本發(fā)明分離除硫脫氮自養(yǎng)菌的方法簡單、單菌落生長好。
文檔編號C12N1/20GK101307353SQ200810064468
公開日2008年11月19日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者萬春黎, 劉春爽, 旭 周, 丹 孫, 杜大仲, 王愛杰, 闞洪晶, 川 陳, 高靈芳 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)