專利名稱：二羥基丙酮高產(chǎn)菌的快速篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二羥基丙酮高產(chǎn)菌的快速篩選方法，屬于工業(yè)微生物 工程領(lǐng)域。(二) 背景技術(shù)二羥基丙酮，又稱為1, 3-二羥基丙酮(1, 3-Dihydroxyacetone )(以下 簡(jiǎn)稱DHA),是最單的酮糖，帶有甜味的白色粉末狀結(jié)晶，易溶于水、乙 醇、丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑。這種化學(xué)物質(zhì)的分子量為90.08。DHA用途廣泛，市場(chǎng)容量大，用生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的研 究具有重要的意義，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)DHA與化學(xué)合成法相比具有許多 優(yōu)點(diǎn)專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、底物利用率高、轉(zhuǎn)化率高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn) 單等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)外用微生物法轉(zhuǎn)化甘油為二羥基丙酮的研究己有很多專利和文獻(xiàn) 報(bào)道，所用的用于產(chǎn)生甘油脫氫酶的微生物主要是葡糖桿菌屬(G/wc,6acfer) (US 5770411 )和醋桿菌屬(JcetoZ^"w) ( US 4076589 ) 微生物，尤其是氧化葡糖桿菌(G/wc朋Wacfer orj^ara )和弱氧化醋桿菌(^ceZ)o^cter SWoxj^ws )的凈艮道居多，此外還研究過(guò)芽孢桿菌屬(Sac〃/船)的枯草桿菌(5ac/〃w"wto7^FERMP-10524) (JP 2286089)、 單孢絲菌屬(M/crawo"o^ora ) ( JP 62210994 )， 假單孢菌屬(尸化Mfifomowas )、沙雷氏菌屬(&rra"a )、克霉伯氏菌屬(K/efe/e〃a )、 區(qū)欠文藝節(jié)目氏菌屬(五rvWw/a )、曲霉屬(y45perg/〃ws )、青霉屬(尸ew/c/〃/wm )、 根霉屬(i /n'加; ^ ) ( US 4576913 )。盡管轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的微生物較多，但真正用于生產(chǎn)DHA 的高產(chǎn)菌還比較少，有關(guān)轉(zhuǎn)化甘油為二羥基丙酮的微生物的快速篩選方面 的報(bào)道更是空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種快速、方便的二羥基丙酮高產(chǎn)菌篩選方法。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是二羥基丙酮高產(chǎn)菌的篩選方法，所述方法包括如下順序步驟(1) 取待篩選菌株，接種至多孔板培養(yǎng)基中，28 37"下培養(yǎng)至長(zhǎng)出 單菌落，加入變林試劑，25 35。C下放置10 60min，單菌落周圍 顯現(xiàn)棕紅色暈斑，為陽(yáng)性菌抹；所述多孔板培養(yǎng)基組成如下 甘油20 50g/L,酵母粉2 5g/L,瓊脂18 20g/L,溶劑為水， pH5.0 7.0;(2) 另取陽(yáng)性菌株接種至斜面培養(yǎng)基，28 37。C下培養(yǎng)l 2天，獲得 陽(yáng)性菌林的斜面菌種；所述斜面培養(yǎng)基組成如下甘油 20 50g/L,酵母粉2 5g/L,瓊脂18~20g/L,溶劑為水，pH5.0 7.0;(3) 將陽(yáng)性菌株的斜面菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，28 37°C 、 100 200rpm振蕩培養(yǎng)24 60h,得到發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中DHA 含量，經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā)酵液中DHA含量高于2g/L的陽(yáng)性菌抹， 即為二羥基丙酮高產(chǎn)菌；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘油 10 50g/L,酵母粉2 20 g/L,蛋白胨1 20 g/L,NaH2P04'2H20 1 5 g/L, CaC03 1 4g/L,;容劑為水，pH4.0 7.0。本發(fā)明可直接應(yīng)用于已知菌抹的選育，也可應(yīng)用于篩選土壤中的未知 微生物。應(yīng)用于篩選土樣中微生物時(shí)，方法如下取待測(cè)土樣，粉碎，加入無(wú)菌生理鹽水，振蕩，取上清液涂布于平皿培養(yǎng)基，28 37。C培養(yǎng)1~2 天，獲得的單菌落作為待篩選菌株，按照步驟(1 ) (3 )步驟進(jìn)行篩選； 所述平皿培養(yǎng)基組成如下甘油20~50g/L,酵母粉2~5g/L,瓊脂18 20g/L， 溶劑為水，pH5.0~7.0。本發(fā)明涉及的多孔板培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基與平皿培養(yǎng)基是組成成分范 圍相同的固體培養(yǎng)基。按如下方法進(jìn)行配制加熱條件下往lOOOmL水中 加入瓊脂18 20g使之溶化，再加入甘油20 50g和酵母粉2 5g， 121。C滅 菌20min,冷卻到60。C時(shí)，在無(wú)菌環(huán)境中將培養(yǎng)基加入到多孔板的每個(gè) 小孔中，經(jīng)冷卻得到多孔板培養(yǎng)基；在無(wú)菌環(huán)境中將培養(yǎng)基倒入無(wú)菌的試 管中，經(jīng)冷卻得到斜面培養(yǎng)基;在無(wú)菌環(huán)境中將培養(yǎng)基倒入無(wú)菌的平亞中， 冷卻得到平亞培養(yǎng)基。所述發(fā)酵培養(yǎng)基按如下方法進(jìn)行配制，1000mL水中加入甘油10 50 g,酵母粉2 20g,蛋白胨l 20g， NaH2P04.2H20 1 5 g,用0.1mol/LHCl 或NaOH調(diào)pH至4.0 7.0，最后加入CaC03 1 4g, 121。C滅菌20min,冷 卻得到發(fā)酵培養(yǎng)基。變林試劑為定性實(shí)驗(yàn)用試劑，其用量不受限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根 據(jù)需要、按照常識(shí)添加，通常，在多孔板中操作時(shí)，每孔添加0.1 0.2mL 變林試劑即可。所述步驟(l)中，待測(cè)菌抹各平行接種至少2孔進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)得 到單菌落，其中至少1孔添加斐林試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的待測(cè) 菌抹對(duì)應(yīng)的未添加雯林試劑的孔中得到的單菌落用于下一步操作，這樣可 以節(jié)省操作時(shí)間，并可實(shí)現(xiàn)批量4喿作。具體的，所述方法如下(1) 取待測(cè)土樣，粉碎，加入無(wú)菌生理鹽水，振蕩，取上清液涂布于平皿培養(yǎng)基，28 37。C培養(yǎng)l 2天，獲得的單菌落，作為待篩選菌抹； 所述平j(luò)nL培養(yǎng)基組成如下甘油20 50g/L,酵母粉2 5g/L,瓊脂 18~20g/L,;容劑為水，pH5.0 7.0;(2) 無(wú)菌條件下，取待篩選菌林，平行接種至多孔板培養(yǎng)基的2孑L, 28 37。C下培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，在其中1孔中加入變林試劑 0.1 0.2mL, 25 35。C下放置10 60min，單菌落周圍顯現(xiàn)棕紅色暈斑， 為陽(yáng)性菌林，相應(yīng)未添加變林試劑的孔中得到的陽(yáng)性菌株的單菌落用于下一步^:乘作；所述的多孔板培養(yǎng)組成同平皿培養(yǎng)基；(3) 取陽(yáng)性菌抹接種至斜面培養(yǎng)基，28 37。C下培養(yǎng)1 2天，獲得陽(yáng)性 菌株的斜面菌種；所述斜面培養(yǎng)基組成同平皿培養(yǎng)基；(4) 將陽(yáng)性菌株的斜面菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，28 37°C、 100 200rpm 振蕩培養(yǎng)24 60h,得到發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中DHA含量，經(jīng)發(fā)酵 獲得的發(fā)酵液中DHA含量高于2g/L的陽(yáng)性菌抹，即為二羥基丙酮 高產(chǎn)菌；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘油10 50g/L,酵母粉2 20 g/L, 蛋白胨1~20 g/L， NaH2P04'2H20 1 5 g/L, CaC03 l 4g/L,溶劑為 水，pH4.0 7.0。優(yōu)選的，所述方法如下a) 取待測(cè)土樣，粉碎，加入無(wú)菌生理鹽水，振蕩，取上清液涂布于平 皿培養(yǎng)基，28。C培養(yǎng)l天，獲得的單菌落，作為待篩選菌株；所述 平皿培養(yǎng)基組成如下甘油20g/L,酵母粉2g/L,瓊脂18g/L，溶 劑為水，pH5.0;b) 無(wú)菌條件下，取待篩選菌抹，平行接種至多孔板培養(yǎng)基的2孔中，28。C下培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，在其中1孔中加入變林試劑O.lmL, 25。C下放置60min，單菌落周圍顯現(xiàn)棕紅色暈斑，為陽(yáng)性菌林，相 應(yīng)未添加變林試劑的孔中得到的陽(yáng)性菌抹的單菌落用于下一步操 作；所述多孔板培養(yǎng)基組成如下甘油20g/L,酵母粉2g/L,瓊脂 18g/L，溶劑為水，pH5.0;c) 取陽(yáng)性菌林接種至斜面培養(yǎng)基，28。C下培養(yǎng)l天，獲得陽(yáng)性菌林的 斜面菌種；所述斜面培養(yǎng)基的組成如下甘油20g/L,酵母粉2g/L, 瓊脂18g/L，溶劑為水，pH5.0;d) 將陽(yáng)性菌抹的斜面菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C、 200rpm振蕩培 養(yǎng)24h,得到發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中DHA含量，經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā) 酵液中DHA含量高于2g/L的陽(yáng)性菌抹，即為二羥基丙酮高產(chǎn)菌； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘油10g/L,酵母粉2 g/L,蛋白胨1 g/L, NaH2P04.2H20 1 g/L, CaC03 lg/L，溶劑為水，pH5.0。變林試劑包括A、 B兩種溶液，A溶液為質(zhì)量濃度為0.044g/mL的硫 酸銅溶液，B溶液為質(zhì)量濃度分別為0.258g/mL的酒石酸鉀鈉與 0.142g/mL的氫氧化鈉混合溶液，使用時(shí)，取等量A、 B液混合后立即使 用。所述雯林試劑可按如下方法進(jìn)行配制A液用34.6g CuS04-5H20溶于200mL水中,再加0.5mL濃H2S04，混勻后，用水稀釋到500mL; B液用173g酒石酸鉀鈉(KNaC4H406.4H20 )和71gNaOH固體溶在400mL水中，再稀釋成500mL溶液，使用時(shí)，取等量A、 B液混合后立即使用。本發(fā)明中，DHA的分析方法可采用氣相色語(yǔ)與薄層層析方法進(jìn)行DHA薄層層析方法實(shí)驗(yàn)采用G型硅膠板(20mmxl0mm ),展開劑 氯仿-曱醇一蒸餾水混合溶劑(體積比為80:19:1 ),顯色劑組成為磷鉬酸 3g，甲醇45mL,蒸餾水45mL和濃硫酸10mL。具體操作步驟將點(diǎn)樣 后的硅膠薄板以基準(zhǔn)線向下放置在裝有展開劑的層析缸中展開10 ~ 15min,直至展開劑擴(kuò)散至距離薄板頂端1 ~2cm處。取出薄板，吹干， 碘缸中熏蒸2 5min,顯色，放入烘箱中，在110。C下烘烤10min左右， 即可呈現(xiàn)DHA斑點(diǎn)，采用CAMMA的薄層掃描儀測(cè)定DHA含量。DHA氣相色譜分析方法所用的儀器瓦里安varian cp-3800氣相色 語(yǔ)儀，帶氫火焰離子化檢測(cè)器；PY-2020iD型裂解器(Frontier Laboratories Ltd. Japan )。所用試劑TMAH ( 25%水溶液)，二羥基丙酮(色譜純)，甘 油、無(wú)水曱醇(分析純)，蒸餾水。色譜條件Ultra ALLOY-5不銹鋼毛 細(xì)管柱(30 mx0.25 mmx0.25 |im);汽化溫度400。C;檢測(cè)器溫度280°C; 柱溫50。C開始以rC/min升至60°C,再以10°C/min升至280°C;分流比 30:1;載氣，氮?dú)?；柱流量lmL/min。加樣0.2)iL發(fā)酵上清夜和0.4(iL TMAH ( 25%水溶液)。本發(fā)明的原理以甘油為底物，利用微生物產(chǎn)生的甘油脫氫酶催化反 應(yīng)生產(chǎn)l， 3-二羥基丙酮，產(chǎn)物二羥基丙酮能與變林試劑發(fā)生顯色反應(yīng)， 生成棕紅色的沉淀?；谶@個(gè)顯色原理，設(shè)計(jì)了產(chǎn)二羥基丙酮微生物快速、 高通量的篩選模型。實(shí)踐表明該模型在菌種篩選的試驗(yàn)中，收到了良好的 效果。通過(guò)這個(gè)模型，篩選到了幾抹能高產(chǎn)二羥基丙酮的微生物菌株。本發(fā)明有益效果為操作簡(jiǎn)單、結(jié)果判斷直觀方便，能快速、高通量 篩選產(chǎn)二羥基丙酮的微生物菌抹，大大減少勞動(dòng)量，提高勞動(dòng)效率。 具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此 實(shí)施例1:(1) 變林試劑的制備A液用34.6gCuS04.5H20溶于200mL水中，再加0.5mL濃H2S04,混勻后， 用水稀釋到500mL,B液用173g酒石酸鉀鈉(KNaC4H406.4H20 )和71g NaOH固體溶解在 400mL水中，再稀釋成500mL溶液， 使用時(shí)候，取等量A、 B液混合后立即使用；(2) 培養(yǎng)基的制備平皿培養(yǎng)基、多孔板培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基制備所述的平皿培養(yǎng)基、多孔 板培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基是組成成分相同的固體培養(yǎng)基，其組份如下甘油 20g,酵母粉2g，瓊脂18g，水1000mL， pH值5.0。按如下方法制備加 熱條件下往lOOOmL水中加入瓊脂18g使之溶化，再加入甘油20g和酵母 粉2g, 12rC滅菌20min,冷卻到60。C時(shí)，在無(wú)菌的環(huán)境中將培養(yǎng)基加入 到無(wú)菌的96孔多孔板的每個(gè)小孔中，然后冷卻得到多孔板培養(yǎng)基，待用； 在無(wú)菌的環(huán)境中將培養(yǎng)基倒入無(wú)菌的平i中，冷卻得到平皿培養(yǎng)基，待用； 在無(wú)菌的環(huán)境中將培養(yǎng)基倒入無(wú)菌的試管，冷卻得到斜面培養(yǎng)基，待用； 發(fā)酵培養(yǎng)基制備發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘油10g,酵母粉2g,蛋白胨10g, NaH2P04'2H20 lg， CaC03 lg,水lOOOmL, pH值5.0;(3) 將要篩選的土樣研碎，加入無(wú)菌生理鹽水，充分振蕩，取上清液待用；(4) 分離培養(yǎng)將步驟(3)制備的上清夜涂布于平皿培養(yǎng)基上，在28。C培養(yǎng)1天，逐個(gè) 挑選單菌落，平行接種到2個(gè)同樣的多孔板培養(yǎng)基(多孔板X,多孔板Y)上相互對(duì)應(yīng)的小孔中，將多孔板;故置在28。C培養(yǎng)1天，小孔中將長(zhǎng)出單菌落；(5) 初步篩選將新配制的變林試劑，在多孔板X的小孔中加入變林試劑O.lmL，在25。C 下放置60min，肉目艮觀察，若在菌落周圍出現(xiàn)棕紅色的暈斑為陽(yáng)性反應(yīng)， 以二鞋基丙酮標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，然后在多孔板Y上相對(duì)應(yīng)的小孔中挑 選陽(yáng)性單菌落，接種到斜面培養(yǎng)基，28。C下培養(yǎng)l天；(6) 復(fù)篩將培養(yǎng)好的斜面菌林接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C、 200rpm的恒溫?fù)u床 上振蕩培養(yǎng)24h,測(cè)定DHA含量，DHA含量高于2g/L的作為產(chǎn)二羥基丙 酮的孩￡生物。在此次篩選過(guò)程中，篩選到2抹產(chǎn)二羥基丙酮的微生物菌抹，2005年 10月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC):葡萄牙棒孢酵母(C/av&;x ra /^/tow'"e),保藏編號(hào)為CCTCC No. M 205116;月莫醭畢赤酵母(Pz'c/h'g wem6raw/flc/m )， j呆藏編號(hào)為CCCTCC No. M 205117。實(shí)施例2:(1)變林試劑的制備A液用34.6gCuS04.5H20溶于200mL水中，再加0.5mL濃H2S04， 混勻后，用水稀釋到500mL;B液用173g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4CV4H20)和71gNaOH固體溶 在400mL水中，再稀釋成500mL溶液；使用時(shí)候，取等量A、 B液混合后立即使用；
(2) 培養(yǎng)基的制備
平皿培養(yǎng)基、多孔板培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基制備所述的平皿培養(yǎng)基、多
孔板培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基是組成成分相同的固體培養(yǎng)基，其組份如下甘 油30g,酵母4分3g,瓊脂20g,水1000mL, pH值6.0;按如下方法制備 加熱條件下往1000mL水中加入瓊脂20g使之溶化，再加入甘油30g和酵 母粉3g， 12rC滅菌20min,冷卻到60。C時(shí)，在無(wú)菌的環(huán)境中將培養(yǎng)基加 入到在無(wú)菌的96孔多孔板的每個(gè)小孔中，然后冷卻得到多孔板培養(yǎng)基，待 用；在無(wú)菌環(huán)境中將培養(yǎng)基倒入無(wú)菌的平皿中，然后冷卻得到平皿培養(yǎng)基， 待用；在無(wú)菌的環(huán)境中將培養(yǎng)基倒入無(wú)菌的試管中，然后冷卻得到斜面培 養(yǎng)基，待用；
發(fā)酵培養(yǎng)基制備發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘油50g，酵母粉20 g， 蛋白胨lg, NaH2P04.2H20: 5 g, CaC03: 4g,水1000mL， pH值5.0,
(3) 將要篩選的土樣研碎，加入無(wú)菌生理鹽水，充分振蕩，取上清液待
用；
(4) 分離培養(yǎng):
將步驟(3 )制備的上清夜涂布于平皿培養(yǎng)基上，在37。C培養(yǎng)1天，逐個(gè) 挑選單菌落，平行接種到2個(gè)同樣的多孔板培養(yǎng)基(多孔板X,多孔板Y) 上相互對(duì)應(yīng)的小孔中，將多孔板放置在37。C培養(yǎng)1天，小孔中將長(zhǎng)出單
菌落；
(5) 初步篩選
將新配制的變林試劑，在多孔板X的小孔中加入變林試劑0.2mL,在30°C 下放置30min，肉眼觀察，若在菌落周圍出現(xiàn)棕紅色的暈斑為陽(yáng)性反應(yīng)， 以二羥基丙酮標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，然后在多孔^反Y上相對(duì)應(yīng)的小孔中挑選陽(yáng)性單菌落，接種到斜面培養(yǎng)基，28。C下培養(yǎng)l天； (6)復(fù)篩
將培養(yǎng)好的斜面菌抹接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在3(TC、 200rpm的恒溫?fù)u床 上振蕩培養(yǎng)36h,測(cè)定DHA含量，DHA含量高于2g/L的作為產(chǎn)二羥基 丙酮的微生物。
在此次篩選過(guò)程中，篩選到1抹產(chǎn)二羥基丙酮的微生物菌抹，于2006年 8月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC):地衣芽孢桿 菌B-05571 (to/腸//c/髓/o謹(jǐn).s B-05571 ),保藏號(hào)CCTCC No. M 206082。
實(shí)施例3:
(1) 變林試劑的制備
A液用34.6g CuS04.5H20溶于200 mL水中，再加0.5mL濃H2S04,混勻 后，用水一希孝奪到500mL,
B液用173g酒石酸鉀鈉(KNaC4H406.4H20 )和71g NaOH固體溶解在 400mL水中，再稀釋成500mL溶液5 使用時(shí)候，取等量A、 B液混合后立即使用；
(2) 培養(yǎng)基的制備
平j(luò)m培養(yǎng)基、多孔板培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基制備所述的平皿培養(yǎng)基、多孔
板培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基是組成成分相同的固體培養(yǎng)基，其組份如下甘油 50，酵母粉5，瓊脂20，水lOOOmL, pH值7.0, 4要如下方法制備加熱 條件下往lOOOmL水中加入瓊脂20g使之溶化，再加入甘油50g和酵母粉 5g, 121。C滅菌20min,冷卻到6(TC時(shí)，
在無(wú)菌的環(huán)境中將培養(yǎng)基加入到無(wú)菌的384孔多孔板的每個(gè)小孔中，然后冷卻得到多孔板培養(yǎng)基待用；
在無(wú)菌環(huán)境中將新鮮配制的培養(yǎng)基，倒入無(wú)菌的平亞中，冷卻得到平皿培 養(yǎng)基，待用；
在無(wú)菌的環(huán)境中將新鮮配制的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌的試管，制備得到斜面培養(yǎng) 基待用。
發(fā)酵培養(yǎng)基制備發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘油50 g,酵母粉5 g,蛋白 胨20 g， NaH2P04.2H20: 1 g, CaC03: 4 g,水lOOOmL, pH值7.0， (3)
將要篩選的土樣研碎，加入無(wú)菌生理鹽水，充分振蕩，取上清液待用；
(4) 分離培養(yǎng)
將步驟(3)制備的上清夜涂布于平皿培養(yǎng)基上，在30。C培養(yǎng)2天，逐個(gè) 挑選單菌落，平行接種到2個(gè)同樣的多孔板培養(yǎng)基(多孔板X,多孔板Y) 上相互對(duì)應(yīng)的小孔中，將多孔板放置在30。C培養(yǎng)1天，小孔中將長(zhǎng)出單菌 落；
(5) 初步篩選
將新配制的變林試劑,在多孔板X的小孔中加入變林試劑0.1 mL,在35 。C 下放置20min，肉眼觀察，若在菌落周圍出現(xiàn)棕紅色的暈斑為陽(yáng)性反應(yīng)， 以二羥基丙酮標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，然后在多孔板Y上相對(duì)應(yīng)的小孔中挑 選陽(yáng)性單菌落，接種到斜面培養(yǎng)基，30。C下培養(yǎng)l天；
(6) 復(fù)篩
將培養(yǎng)好的斜面菌抹接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C、 100rpm的恒溫?fù)u床 上振蕩培養(yǎng)48h，測(cè)定DHA含量，DHA含量高于2g/L的作為產(chǎn)二羥基丙 酮的微生物。
在此次篩選過(guò)程中，篩選到1林產(chǎn)二羥基丙酮的微生物菌林氧化葡糖桿
權(quán)利要求
1.二羥基丙酮高產(chǎn)菌的快速篩選方法，所述方法包括如下順序步驟(1)取待篩選菌株，接種至多孔板培養(yǎng)基中，28～37℃下培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，加入斐林試劑，25～35℃下放置10～60min，單菌落周圍顯現(xiàn)棕紅色暈斑，為陽(yáng)性菌株；所述多孔板培養(yǎng)基組成如下甘油20～50g/L，酵母粉2～5g/L，瓊脂18～20g/L，溶劑為水，pH5.0～7.0；(2)另取陽(yáng)性菌株接種至斜面培養(yǎng)基，28～37℃下培養(yǎng)1～2天，獲得陽(yáng)性菌株的斜面菌種；所述斜面培養(yǎng)基的組成如下甘油20～50g/L，酵母粉2～5g/L，瓊脂18～20g/L，溶劑為水，pH5.0～7.0；(3)將陽(yáng)性菌株的斜面菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，28～37℃、100～200rpm振蕩培養(yǎng)24～60h，得到發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中DHA含量，經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā)酵液中DHA含量高于2g/L的陽(yáng)性菌株，即為二羥基丙酮高產(chǎn)菌；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘油10～50g/L，酵母粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O 1～5g/L，CaCO3，1～4g/L，溶劑為水，pH4.0～7.0。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法為取待測(cè)土樣，粉 碎，加入無(wú)菌生理鹽水，振蕩，取上清液涂布于平亞培養(yǎng)基，28 37°C 培養(yǎng)1 2天，獲得的單菌落作為待篩選菌抹，按照步驟(1 ) (3 )步 驟進(jìn)行篩選；所述平亞培養(yǎng)基組成如下甘油20 50g/L,酵母粉2 5g/L， 瓊脂18 20g/L,溶劑為水，pH5.0~7.0。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 取待測(cè)土樣，粉碎，加入無(wú)菌生理鹽水，振蕩，取上清液涂布于平皿培養(yǎng)基，28 37。C培養(yǎng)1~2天，獲得的單菌落，作為待篩選 菌抹；所述平亞培養(yǎng)基組成如下甘油20 50g/L,酵母粉2 5g/L, 瓊脂18 20g/L，溶劑為水，pH5.0 7.0;(2) 無(wú)菌條件下，取待篩選菌抹，平行接種至多孔板培養(yǎng)基的2孔中， 28 37。C下培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，在其中1孔中加入變林試劑 0.1 0.2mL， 25 35。C下放置10 60min,單菌落周圍顯現(xiàn)棕紅色暈 斑，為陽(yáng)性菌林，相應(yīng)未添加變林試劑的孔中得到的陽(yáng)性菌抹的 單菌落用于下一步操作；所述多孔板培養(yǎng)基組成如下甘油 20~50g/L，酵母粉2 5g/L,瓊脂18 20g/L,溶劑為水，pH5.0 7.0;(3) 取陽(yáng)性菌抹接種至斜面培養(yǎng)基，28 37。C下培養(yǎng)1 2天，獲得陽(yáng) 性菌抹的斜面菌種；所述斜面培養(yǎng)基的組成如下甘油20 50g/L, 酵母4分2 5g/L，瓊脂18 20g/L,溶劑為水，pH5.0 7.0;(4) 將陽(yáng)性菌林的斜面菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，28 37°C、 100 200rpm 振蕩培養(yǎng)24 60h，得到發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中DHA含量，經(jīng)發(fā) 酵獲得的發(fā)酵液中DHA含量高于2g/L的陽(yáng)性菌抹，即為二羥基 丙酮高產(chǎn)菌；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘油10 50g/L,酵母粉 2 20 g/L,蛋白胨1 20 g/L, NaH2P04'2H20 1 5 g/L, CaC03 l 4g/L， -容劑為水，pH4.0 7.0。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)取待測(cè)土樣，粉碎，加入無(wú)菌生理鹽水，振蕩，耳又上清液涂布于 平皿培養(yǎng)基，28。C培養(yǎng)l天，獲得的單菌落，作為待篩選菌抹； 所述平皿培養(yǎng)基組成如下甘油20g/L，酵母粉2g/L，瓊脂18g/L,溶劑為水，pH5.0;(2) 無(wú)菌條件下，取待篩選菌抹，平行接種至多孔板培養(yǎng)基的2孔中， 28。C下培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，在其中1孔中加入變林試劑O.lmL, 25。C下放置60min,單菌落周圍顯現(xiàn)棕紅色暈斑，為陽(yáng)性菌林， 相應(yīng)未添加斐林試劑的孔中得到的陽(yáng)性菌林的單菌落用于下一 步操作；所述多孔板培養(yǎng)基組成如下甘油20g/L,酵母粉2g/L, 瓊脂18g/L,溶劑為水，pH5.0;(3) 取陽(yáng)性菌株接種至斜面培養(yǎng)基，28。C下培養(yǎng)l天，獲得陽(yáng)性菌抹 的斜面菌種；所述斜面培養(yǎng)基的組成如下甘油20g/L，酵母粉 2g/L，瓊脂18g/L，溶劑為水，pH5.0;(4) 將陽(yáng)性菌抹的斜面菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C、 200rpm振蕩培 養(yǎng)24h,得到發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中DHA含量，經(jīng)發(fā)酵獲得的 發(fā)酵液中DHA含量高于2g/L的陽(yáng)性菌抹，即為二羥基丙酮高產(chǎn) 菌；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘油10g/L,酵母粉2g/L,蛋白 胨1 g/L, NaH2P04'2H20 1 g/L, CaC03 lg/L,;容劑為水，pH5.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及二羥基丙酮高產(chǎn)菌的快速篩選的方法，將待選菌落接種至多孔板培養(yǎng)基中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，加入斐林試劑進(jìn)行檢測(cè)，單菌落周圍顯現(xiàn)棕紅色暈斑，為陽(yáng)性菌株；另取陽(yáng)性菌株接種至斜面培養(yǎng)基，28～37℃下培養(yǎng)1～2天，獲得陽(yáng)性菌株的斜面菌種；斜面菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液中DHA的含量，經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā)酵液中DHA含量高于2g/L的陽(yáng)性菌株，即為二羥基丙酮高產(chǎn)菌；本發(fā)明有益效果操作簡(jiǎn)單、結(jié)果判斷直觀方便，能快速、高通量篩選或復(fù)壯產(chǎn)二羥基丙酮的微生物菌株，大大減少勞動(dòng)量，提高勞動(dòng)效率。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101225431SQ20081005951
公開日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者沈寅初, 胡忠策, 薛亞平, 鄭裕國(guó) 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)