專利名稱：Cea正調(diào)控il-15腫瘤免疫基因治療質(zhì)粒載體及應用的制作方法
CEA正調(diào)控IL-15腫瘤免疫基因治療質(zhì)粒載體鵬用
fe^領域本發(fā)明屬于基因工程領域，具微及癌鵬原(CEA)陽'啦中瘤的免疫基因治療載 體的構建和應用。
背景fe^:基因治療^十幾年來隨著現(xiàn)代M生物學技術的發(fā)展而誕生的新的生物醫(yī)學治療
技術?；蛑委焇lil特定載術每具有治療作用的基因?qū)爰毎闹委煼椒ā；蛑委熭d體包括 病毒載體和非病毒載體。質(zhì)粒載體是非病毒載體的一種，具有制備簡單，易儲存，安全的特點， fM粒載體的體內(nèi)基因,效,染效率低，靶向性差，為其缺點。
細胞因子免疫基因治療是基因治療的重要策略之一，在腫瘤治療的研究中受到廣泛重視。細 胞因子基因轉導可對腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響，比單純給予夕卜源性細胞因子治療的不良反應小，并可 以在細胞局部#^賣性敏高濃度的細胞因子，刺 增強機體的特異性拋中瘤免疫反應，{數(shù)中瘤
生長受到抑制，達至鵬瘤治療的目的。多種細胞因子，包括IL-1， IL-2， IL-3， IL4， IL-6， IL-7， IL-IO， IL-12, IL-15， IL-18, IL-21, IL-24, IL-27， IFN， TOFa等都已lS用于月中瘤治療 的臨床前實驗研究，其中IL-2， IL-12， IL-21， IFN， TOFa等己進行了臨^i式驗研究。動物 實驗結果表明多種細胞因子可以增強抗腫瘤免疫鵬而抑制腫瘤生長，但瞎床試驗中的效果還不 理想。質(zhì)粒載體體內(nèi)基因^i效率f舒瞎巴向t接的缺點是影響其臨床效果的因素之一。大多數(shù)細 胞因T^ii載術頓CMV啟動子調(diào)控目的基因的,，CMV啟動子也被認為是目fmii效率最 高的啟動子之一，但CMV啟動子在體內(nèi)易被滅活，使其效率斷氏，同時其調(diào)控的基因表達無組 織特異性，限制了應用。
癌胚抗原(carcinoembiyonicantigen^CEA)是最^l皮發(fā)現(xiàn)和鑒定的腫瘤相關抗原之一，90%左 右的消雌惡幽中瘤表現(xiàn)為CEA陽性。CEA翻中瘤細胞的敏^tf異性調(diào)辦列-CEA啟動子的 調(diào)控。CEA啟動子在某翻中瘤細胞，尤其是結飾癌細胞中具有良好的特異性，因此，艦CEA 啟動子調(diào)控目的基因在消4WII中瘤中靶向性表達成為可能，但CEA啟動子的活性較弱，其直接調(diào) 控治療基因^t以f鈔卜源性治療基因、尤其是細胞因子的^iiii到治療水平。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是劃艮現(xiàn)有技術存在的戰(zhàn)不足，掛共一種CEA正調(diào)控IL-15腫瘤免疫 基因治療質(zhì)粒載體、構建方法^i^用。實現(xiàn)細胞因子基因在CEA陽性細胞中的高效泰ii，以達到 對CEA陽'魁中瘤耙向免疫基因治療的目標。
本發(fā)明構建了一種以白細胞介素-15 (Interleukin-15， IL-15)為治療基因、CEA啟動子正調(diào)控 IL-15基因高效敏、對CEA陽倒中瘤耙向免疫基因治療的質(zhì)粒載體。
本發(fā)明Jif共的CEA正調(diào)控IL-15腫瘤免疫基因治療質(zhì)粒載體，具有序列表中序列1戶標的基
因序列?？蓱迷谌四[瘤免疫基因的治療中。用于人腫瘤免疫基因的治摘物的開發(fā)。本發(fā)明的質(zhì)粒載體為pHi2-sIL15-CEA-TAT (圖1),在OT粒中，HIV2啟動子控制IL-15基 因表逸，CEA啟動子控制HIV反式,因子TAT,， TAT皿作用于HIV啟動子，增加其效 率，從而實5艦IL-15敏的正調(diào)控。同時，顏粒中IL-15基因的信號肽被IL-2信號肽替代， 更進一步以增加IL-15皿效率。
本發(fā)明以細胞因子IL-15作為治療基因。IL-15是一個多功能的細胞因子，對天然免疫和獲得 性免疫反應i t觀的調(diào)節(jié)作用。IL-15可以艦中性禾斕胞、巨噬細胞的活性，,突狀細胞 的功f跑關鍵作用。另外，IL-15艦淋巴 鵬細胞，尤其是NK細胞、NKT細胞和CD8+T細胞 的產(chǎn)生、激活、歸巢和存活。IL-15可以抑制IL-2誘導'撒活弓胞的細胞死亡。IL-15對記憶性T細 胞的存活和增飽關鍵作用，其可以調(diào)節(jié)記憶性T細胞的穩(wěn)態(tài)增值，維持其數(shù)量。因此，IL-15被 認為是非常有潛力的可用于免疫治療的細胞因子。實驗證明應用IL-15可以^EiSM性轉移的腫瘤 特異性T細胞的存活并增弓S^腫瘤的排斥，ffiii基因工程方法敏IL-15的月中瘤細胞在體內(nèi)生長 緩廈、轉移能力下降。1新資料證明IL-15可以使處于免疫耐受狀態(tài)的CD8+T細rai 增值并恢 復免疫功能。本發(fā)明中所用正-15基因購自hvitrogen。
本發(fā)明以CEA啟動子驅(qū)動反式,因子TAT的表達，再ffil TAT增強HIV啟動子活力，從 而間接實現(xiàn)CEA啟動子對HIV啟動子所驅(qū)動的目的基因的正調(diào)控。
大多數(shù)消4ttil中瘤細胞駄CEA抗原，意據(jù)大多數(shù)消4tit腫瘤細胞中存在激活CEA啟動 子的録控制信號，所以當含有CEA啟動子的表達載體aA CEA陽'啦中瘤細胞后，腫瘤細胞內(nèi) 的ff^制信號將激活CEA啟動子，CEA啟動子所驅(qū)動的基因?qū)⒚?，因此，CEA啟動子是一 個腫瘤特異'鵬動子，il3iCEA啟動子可以將目的基因靶向駄于CEA陽'鵬中瘤，實現(xiàn)耙向治 療。但是，CEA啟動子是一個弱啟動子，其弓l導的目的基因^ii效^S低，影響了其治療效果。
在本發(fā)明中，我們jlil CEA啟動子驅(qū)動HIV反式^T錄子TAT的皿，Mil TAT正調(diào)控 HIV啟動子，從而既具有了CEA啟動子的靶向特性，又克服了其活力弱的缺點，實現(xiàn)了目的基因 的高皿。發(fā)明中所用CEA啟動子購自Invitrogen。
本發(fā)明中將IL-15基因的信號序列以IL-2的信號序列所替代，進一步增加了IL-15的就效率。 以陽離子脂質(zhì)體介導法體外轉染CEA陽性結腸癌SW480細胞和CEA陰性 L月7號MCF-7細胞，檢測轉染后48h細胞培養(yǎng)上清液中IL-15敏。結果表明IL-2SP置換IL-15SP可明顯提高IL-15 在轉染細胞的毅，CEA啟動子正調(diào)控IL-15敏質(zhì)粒pHi2-巡75-CEA-TAT在CEA陽性細胞中 高親IL-15， CEA陰性細胞中《K^iilL-15，實現(xiàn)了IL-15基因高效、靶向性鋭。


圖1是本發(fā)明所構建的質(zhì)粒載體pHi-sIL15-CEA-TAT的結構示意圖。 圖2是本發(fā)明構5lM粒載體pHI-sIL15-CEA-TAT的流程圖。
具體實M^:
下面結合實施例，對本發(fā)明的帝恪方法和性能作進一^i兌明。 實施例l 、質(zhì)粒載體p扭-sIL15"CEA-TAT的構建與鑒定。
1) 材料質(zhì)粒pORF-IL15禾口pDRIVE-hCEA購自美國Invivogen公司；pHi2-IL-2-CMV-TAT為美
國亞利桑那大學Harris^S惠贈。細li^SW480禾nMCF-7為天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室 惠贈。
2) CMV啟動子正調(diào)，粒載體的構建質(zhì)粒提取、酶切、純化、DNA片段連接、轉化均 按常鵬作。
pHi2-7L/5-CMV-TAT:參照質(zhì)粒pORF-IL15之IL-15 cDNA序列設計引物，上游 5'-CCGGCCGA47TCCGAAGGAGGGCCACCATG-3'(含I酶切位點)，下游 5'-CCGGCC4CGCGr TCAATTGCAATCAAGAAGT-3'(含Mm I酶切位點)，PCR擴增片段為 538bp。將EL-15編5^因亞克Pt^質(zhì)粒pHi2-IL2-CMV-TAT之HIV2啟動子后的相應克隆位點， 取代IL-2基因。
pHi2-:siL25"CMV-TAT: ig用定點突變十規(guī)置換(美國Stmtagen公司QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)技術，以IL-2SP基因序列(72bp)置換IL-15SP基因序列(144bp)，構，粒 pHi2陽/丄H75-CMV-TAT。參照腐立pHi2-/"5-CMV-TAT之骨架結構和pHi2-IL-2-CMV-TAT 之 IL-2 信號肽序列，設計置換之引物上游 5，-GCCTCGAGAATTCCGAAGGAGGGCCACC47UGCCC7UrGG47UG4C-3， ；下 游
55，-CAATnTnTCAAATCACrrAnACATTCACCCAGrL4C7UmU7U4CA4GrC^4G國3，。
3) CEA啟動子正調(diào)控基因^iM粒載體pHi2-s/I/5"CEA-TAT的構建
參照質(zhì)粒pDRIVE-hCEA之CEA啟動子序列設計引物，上游5'-GGCCGGL4CZ4G7GCCCTGGAGAGC-3'(含I 酶切位點)，下游 5'-CCGGCC04GC7UGGTCTCTGCTGTCTGCTC-3'(含&cl酶切位點)，PCR擴增片段452 bp。 將CEA啟動子基因克H^質(zhì)粒pHi2-IL2-CMV-TAr的相應克隆位點，取代CMV啟動子，獲得質(zhì) 粒pHi2U5《EA-TAT.
4) 所有重會頓粒均經(jīng)限制性雙酶切、PCRT增目的片ga行鑒定，并將重會服f雄至TaKaRa 公司進t于測J^鑒定。
實施例2:質(zhì)粒載體pHi-sIL15"CEA-TAT體外轉染CEA陽'I4AM腸癌細胞SW480和CEA 陰'I4A乳I^S細胞MCF-7后IL"15的,。
1) 體外細胞轉染分組包括未轉染組、S^粒組(pHi2-MCS國CMV-TAT，pHi2-MCS-CEA-TAT)、
對照質(zhì)粒組(pHi2-iZJ5-CMV-TAr,pHi2-WL75-CMV-TAT)、實驗組(pHi2-s/丄"-CEA-TAT)。運用 陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000 (美國Invitrogen公司)介導，體外轉染SW480細胞禾隨CF-7細胞， 收獲轉染后48h的細胞培養(yǎng)上清液，-S(TC凍存，備ELISA檢測。細胞轉染分別進行三次，每次實驗
針質(zhì)粒分別轉魁孑liffl胞。
2) ELISA檢測IL-15:采用美國R&D公司Human IL-15 DuoSet ELISA Development kit檢測細胞 培養(yǎng)上清液中IL-15韃。
3) 質(zhì)粒轉染CEA陽性結腸癌SW480細胞48h后IL-15皿之比較:質(zhì)粒pHi2-iL75-CMV-TAT、 pHi2"正"-CMV-TAT和pHi2-siL"-CEA-TAT轉染SW480細胞48h后IL-15皿具有統(tǒng)計^義
(F=39.808， ZM).OOO )。 經(jīng)比較，pHi2-iL"-CMV-TAT與pHi2-siL"-CMV-TAT和 pHi2"iL"-CEA-TAT之間IL-15 ^izK平差異有統(tǒng)計學意義(iM).002和0.000)后者的IL-15表 達量分別是前者的5倍，表明以IL-2SP置換IL-15SP后，可明顯提高IL-15蛋白的敏。質(zhì)粒
動子置換CMV啟動子后，IL-15的表達，別，證實CEA啟動子敘匕質(zhì)粒架構中，能實現(xiàn)在CEA陽t4l中瘤細胞中高效目的基因,。
4)質(zhì)粒轉染CEA陰性孚U7鶴MCF-7細胞48hr后IL-15^t比較:質(zhì)粒pHi2-巡"-CMV-TAr 和pHi2-^L/5-CEA-TAT轉染MCF-7細胞48h后IL-15的^i^ pHi2-^L"《EA-TAT的IL-15表達 水平顯著低于pHi2-s/L"-CMV-TAT，表明在CEA陰'啦中瘤細胞中，CEA啟動子正調(diào)頓粒的 IL-15是低魏的。
序列表
<110>天津醫(yī)科大學總醫(yī)院
<120> CEA正調(diào)控IL-15月中瘤免疫基因治療質(zhì)粒載體鵬用 <勝1
<170> Patentln Version 3. 3
<210〉 1
<211> 7442
<212> DNA
<213〉 xr序列
<220〉
<221〉 misc—feature <222>
<223〉 n -a或g或c或t <220〉
<221> Promoter <222〉 (1)…(945) <223> HIV2 promoter 〈220〉
<221〉 sig_peptide <222〉 (1307)... (1378) <223〉 IL—2 signal sequence<220〉 <221〉 CDS
<222> (1379)…(1723)
<223> hIL—15 mature sequence
<220〉
<221〉 Promoter
<222> (4292)…(4719)
<223〉 CEA promoter
<220>
<221〉 CDS
<222> (4815)... (5077)
<223〉 TAT sequence <柳〉1
3agtaagcttgatgggatgt3ttacagtgsgagaagacatagwtcttag60
ggaaaaggaagaagggataattccagattggcsgaactat3ctcstgggccsggsgtsag120
gtacccaaagttctttgggtggctatggaagct3gtscc3gtagacgtcccsc33ggtga180
agaggsccactgcttactacsccc3gc3C3tctgatgaccctcstggggai240
ascattaatgtggaggtttgaccctaggctggcctatgagtatscggctt300
cccagaagaatttgggtataagtcaggcctgagtggasgg360
agcaagaggggttaasgacaggaacagctatatttggtcagaacaggaag420
tagatgatgaaactgcagggactttccagaaggggctgtaaccsggggagggacgtgggs480
ggssccggtggggaacgccctcatacttctgtataaatgtacccgctgcttgcattgtat540
tcagtcgctctgcgg己gaggctggcsgstcgagccctgggaggttctctccagcactagc600
aggtagagcctgggtgttccctgctagactctcaccagtacttggccggtactgggcaga660
cggctccscgcttgcttgctttwt33agctgccsgttdg720
sgtgtgtgttcccstctctcctagtcgccgcctggtcattcggtgttcac780
agaccctggtctgttaggacccttcttgctttggggaaccgasgcgggsa840
agatcggcgcccgascagggacttgaaggsgsctgga3C3cggctgagtgaa_ggca_gt33900
gggcggcaggg3cgg3gtgctcctagsaaggcgcgasgctttattgcggt960
sgtttatcacagttaasttgctascgcagtcagtgcttctgacacascagtctcgaactt1020
aagctgcagtgsctctcttasggtsgccttgcagaagttggtcgtgsggcactgggcagg1080
ggtt3caagscaggttt33ggaaactgggcttgtcgagac1140
cttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcct1200
ttCtCtCC3Caggtgtccsctcccagttcaattscagctcttaaggctagagtacttaa_t1260
acgactcsctctcgsgwttccgsaggagggccaccatggccctgtggat1320
cgacaggstgC33CtCCtgtcttgcattgcactaagtcttgc3cttgtcs1380
ctgggtgastgtaataagtgatttgaaaaaCtt3ttC33tctatgcatat1440
tgstgctsctttatatacggtcaccccagttgcaasgtaa1500
gtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatga1560
aatctgatcatcctsgcaascsacagtttgtcttctsstgggaatgtssc1620
sgaatctggagtgaggssctaatttttgca1680
gagttttgtacatattgtcccaacacttcttgattgcs3ttgaacgcgtg1740
8gtacctctagagtcgacccgggcggccgcttccctttagtgagggttsatgcttcgagca1800
gacatgataatgagtttggactagastgca1860
tgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtsaccsttst33gctgc3at1920
asacaagttattgc3ttc3ttttatgtttc3ggttcagggggagstgtgg1980
gaggttttttasagcaagtaaaacctctacaaatgtggtasggstcgatc2040
cgggctggcgtsatagcgaagsggcccgcsccgatcgcccttcccaacagttgcgcsgcc2100
tgastggcgastggscgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttac2160
gcgcagcgtgsccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttccc2220
ttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttt2280
agggttccgatttagtgctttacggcacctCg3CCCC333aaacttgsttsgggtgstgg2340
ttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccac2400
gttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtcta2460
ttcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctatatgagctgat2520
tttaacgcga3ttttaaca3aatattaacgcttscaatttcctgatgcgg2580
tsttttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatscgcggatctgcgcsgcac264〇
catggcctgawtsacctctgwagsggaacttggttaggtaccttctgaggcggassga270〇
accsgctgtggsatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggca2760
gasgtatgcasagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg33agtccccsggct2820
ccccagcaggcagssgtatgcssagcatgc3tCtC33tt3gtcsgcaaccatagtcccgc2880
ccctaactccgcccatcccgccccta^actccgcccagttccgcccattctccgccccstg2940
gctgsctaatttttttt3tttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagct3ttcc3〇00
sgaagtagtgaggaggcttttttggdggcctaggcttttgcaaaaa_gcttgsttcttctg3060
acacaacagtctcgaacttaaggctsgdgccsccatgattg3acaag3tggattgcacgc3120
aggttctccggccgcttgggtggagaggct3ttcggctatgsctgggcscaacagacaat3180
cggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgt3240
casga_ccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgsggcagcgcggctatcgtg3300
gctggccscgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgscgttgtcactg3360
ggactggctgctattgggcgasgtgccggggcaggatctcctgtcatctcsccttgctcc3420
tgccgagaaagtatccatcatggctgatgcastgcggcggctgcatacgcttgatccggc3480
tacctgcccattcgaccacctcgcatcgagcgagcacgtactcggatgga3540
sgccggtcttgtcgstcaggatgstctggacgasgagcatcsiggggctcgcgccaigccga3600
sctgttcgccaggctcaaggcgcgca_tgcccgacggcgaggstctcgtcgtga_cccatgg3660
cgatgcctgcttgccgaatatc3tggtgg3aaatggccgcttttctggattcatcgactg3720
tggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgc3780
tgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcc3840
cgattcgcagcgcstcgccttctstcgccttcttgacgagttcttctga_gcggg3ctctg3900
gggttcgsaatgaccgaccaagcgacgccc33cctgcc3tcacgatggcc3960
atctttattttcattacstctgtgtgttggttttttgtgt4020
cctctagagtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgcsgstccgggcaacgtt4080
gttgccattgctgcsggcgcagasctggtaggtatggsagatctatacsttgsstcwt34140
ttggcwttagccatsttagtcattggttstatagcataaatcaatattggctattggcc4200
3ttgcatscgttgtstctstgtacatttat3ttggctcatgtccaata_tg4260
sccgccatgttgacattgattattgactagtgccctggagsgc3tggggsga_cccgggsc4320
cctgctgggtttctctgtcacaaaggaaaatwtccccctggtgtgscsgacccaaggac4380
agaggtcagcactggggasgacaggttgtcctcccaggggatgggggtcc4440
stcc3ccttgccgaaaagatttgtctgagg4500
gcagaaatga_g柳ggaggggacsgaggac3gscc3C3cc4560
catgscccacgtga_tgctgagaagtactcctgccctaggaagagactcagggcagaggga4620
ggaaggacagagtcscsgcagccttgacaaascgttcctggaactcaagc4680
tcttctccacgcsgagaccgagctcgtttsgtgaaccgtc4740agatctctag sagctgggta ccagggccgc gaggagsgcs agaastggsg cca_gtagatc gtcagcctaa aactgcttgt accaattgct tttgtttcst aacaaaagcc ttaggcatct gasgacctcc tcssggcagt cagactcatc satcccgagg ggacccgaca ggcccg3agg agacagatcc attcgattag tgaacggatc tttggacaaa ccacaactag aatgcsgtga gctsttgctt tatttgtaac cattstasgc attcaitttta tgtttcaggt tcsgggggag ctctacaaat gtggtatggc tgattatgst gtgaaaacct ctgacsc3tg cagctcccgg gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag ataggttaat gtcatgataa taatggtttc tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt cccagaaacg ctggtgaasg tsssagatgc cstcgaactg gatctca3ca gcggtaagat tccaatgatg agcactttt3 aagttctgct cgggcaagag caactcggtc gccgcataca accsgtcaca gaaaagcatc ttacggatgg cataaccstg agtgataaca ctgcggccsa gg3gct33cc gcttttttgc acsscstggg accggagctg aatgsagcca^ taccssacga ggcaacsacg ttgcgc3aac t3ttaactgg attaatagac tggatggsgg cggataaagt ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg tgcsgcsctg gggccsgatg gtasgccctc tcsggcasct atggstgasc gaaatsgacs gcsttggtaa ctgtcsgacc asgtttactc tttttaattt aaaaggatct aggtgaagst ttascgtgag ttttcgttcc actgagcgtc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg agcggtggtt tgtttgccgg atcasgagct cagcagagcg cagataccaa atactgttct casgasctct gtagcaccgc ctacatacct tgccsgtggc gatasgtcgt gtcttsccgg ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc ctscaccgaa ctgsgatscc tacsgcgtga gagaaaggcg gacsggt3tc cggt33gcgg gcttccaggg ggaascgcct ggtatcttts tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ct
tcgacstsgcagaataggcgtt3Ctcg3C34800
ctagactagsgccctggaagcatccsggsa4860
attgtaaaaagtgttgctttcattgccaag4920
cctatggcag4980
aagtttctctatcaaagcaacccscctccc5040
gaaggtggagagagagacag5100
tgataagatacattgatgag5160
ttatttgtgaastttgtgst5220
528G
gtgtgggaggttttttssagcaagtasaac5340
ccggctgcctcgcgcgtttcggtgatgacg5400
agacggtcacagcttgtctgtsagctgtct5460
gsccgtctccgggsgctgcatgtgtcagsg5520
ctcgtgstacgcctattttt5580
ttagacgtcaggtggcscttttcggggaaa5640
tcaaatatgt3tccgctcat5700
atattgaaaaaggeiageigtatgagtattcs5760
tgcggcattttgccttcctgtttttgctcs5820
ttgggtgcacgagtgggtta5880
ccttgagagttttcgccccgsagascgttt5940
atgtggcgcggtattatcccgtattgacgc6000
ctattctcagaatgacttggttgagtactc6060
catgacagtaagagaattatgcagtgctgc6120
cttacttctggaggaccgaa6180
ggatcatgtaactcgccttgstcgttgggs6240
cgsgcgtgacaccacgstgcctgtsgcaat6300
cgaactacttactctagcttcccggcaaca6360
tgcsggaccacttctgcgctcggcccttcc6420
agccggtgagcgtgggtctcgcggtatcat6480
ccgtatcgtagttstctscscgscggggag6540
gstcgctgagatsggtgcctcsctgatt336600
3t3tat3Cttt3g3ttg3tttaaascttca6660
cctttttgataatctcatgaCC3333tCCC6720
agaccccgtsaaggatcttc6780
ctgcttgcaacaccgctacc6840
accaactctttttccgaaggtaactggctt6900
tctagtgtagccgtagttaggccaccactt6960
cgctctgcts3tcctgttsccagtggctgc7020
gttgg3ctcaagacgstagttsccggstaa7080
gtgcacacagcccagcttggsgcgaacgac7140
sgcgccacgcttcccgaagg72。0
cagggtcggaacaggagagcgcacgaggga726。
tagtcctgtcgggtttcgccscctctgact7320
ggggcggagc7380
ctggccttttgctcacstggctcg3c3gat7440
744權利要求
1、一種CEA正調(diào)控IL-15腫瘤免疫基因治療質(zhì)粒載體，具有序列表中序列1所示的基因序列。
2、 如權利要求l戶脫的質(zhì)粒載體，^^寺征在于其結構是在^t亥敏載體上有HIV2啟動子， 白細胞介素-2信號肽片段，白細胞介素-15編碼序列，CEA啟動子，TAT基因。
3、 如權利要求1或2戶腐的質(zhì)粒載體，在AI中瘤免疫基因治,物開發(fā)中的自。
全文摘要
一種CEA正調(diào)控IL-15腫瘤免疫基因治療質(zhì)粒載體，具有序列表中序列1所示的基因序列。可應用在人腫瘤免疫基因的治療中。構建過程是利用基因克隆技術構建巨細胞病毒(CMV)啟動子正調(diào)控質(zhì)粒pHi2-IL15-CMV-TAT，再以IL-2信號肽(SP)置換IL-15SP構建質(zhì)粒pHi2-sIL15-CMV-TAT，然后以CEA啟動子替代CMV啟動子引導TAT表達，獲得pHi2-sIL15-CEA-TAT。本發(fā)明以細胞因子IL-15作為治療基因，以CEA啟動子驅(qū)動反式轉錄因子TAT的表達，再通過TAT增強HIV啟動子活力，從而間接實現(xiàn)CEA啟動子對HIV啟動子所驅(qū)動的目的基因的正調(diào)控。既具有了CEA啟動子的靶向特性，又克服了其活力弱的缺點，實現(xiàn)了目的基因的高效、靶向性表達。
文檔編號C12N15/79GK101586114SQ200810053549
公開日2009年11月25日 申請日期2008年6月18日 優(yōu)先權日2008年6月18日
發(fā)明者何向輝, 朱理瑋, 李衛(wèi)東 申請人:天津醫(yī)科大學總醫(yī)院