專利名稱：：采用發(fā)酵法制備核糖醇的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種核糖醇的制備工藝，具體涉及一種采用發(fā)酵法制備核糖醇的制備工藝。屬于生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：核糖醇是制備高價(jià)值非天然糖的重要起始原料，它可以經(jīng)微生物酶^Jl直接轉(zhuǎn)化制得L一亥糖或通過微生物脫氪制備成L-核酮糖后再異構(gòu)化成L-核糖。而近年來非天然的L-型糖和它們的改性核苷類似物因其潛在的生物學(xué)活性和^^4生已經(jīng)開始備受很多研究者的關(guān)注，如稀有L-;^t(L4t糖、L-木糖等)已用于制備具有抗HIV病毒作用的核甘類似物，目前多個(gè)L-核糖的核甘類似物已經(jīng)處于n期或者ni臨床?？梢灶A(yù)見，隨著L-核糖等的核甘類似物作為新型抗病毒藥物的M，核糖醇亦必將具有廣闊的市場(chǎng)前景。目前，核糖醇的制備通常是采用化學(xué)方法將D-核糖還原得到。然而，D-核糖在醫(yī)藥工業(yè)中本身即可以作為藥物直接用于疾病治療，又可以作為前體物質(zhì)合成其他藥物，因而D-核糖價(jià)格相對(duì)較高。另一方面，在核凈唐醇的化學(xué)制備過程中D-核糖的氬化需要高溫高壓，且有才;i^媒又給后處理和環(huán)保帶來了麻煩而且花費(fèi)昂貴。因此，為適應(yīng)市場(chǎng)、綠色工藝等多方面的需求，發(fā)展生物技術(shù)直《^#廉價(jià)的可再生資源如葡萄糖轉(zhuǎn)化成核糖醇具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。1998年日本專利(JP10210994)公布了菌種Trichosporonoides搖瓶發(fā)酵廉價(jià)糖生產(chǎn)核糖醇的方法。其工藝特4^于用葡萄糖一步發(fā)酵制得核糖醇。其中不可避免產(chǎn)生大量赤蘚糖醇和甘油等副產(chǎn)物。1999年日本專利(JP11137285)進(jìn)一步公布了以葡萄糖為原料，采用菌種TrichosporonoidesoedocephalisATCC16958發(fā)酵生產(chǎn)核糖醇的方法，其主要工藝特征是利用高濃度葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)核糖醇，產(chǎn)物分離采用鋁型、錳等強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂對(duì)核糖醇進(jìn)行分離，此工藝特征同樣不可避免的產(chǎn)生甘油等副產(chǎn)物，同時(shí)分離成4^目對(duì)較高。同年，日本專利(JP11004699)公布了核糖醇的分離和回收工藝，其工藝特征在于將菌體細(xì)胞除去后，在發(fā)酵清液中添加熟石M過濾，后加曱醇等小分子醇到濾液中將核糖醇沉淀，此工藝過程產(chǎn)生大量二IUt^，分離過程醇用量較大，產(chǎn)品純度較離子交換樹月旨分離得到的產(chǎn)品低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，1999年日本專利(JP11215981)還公布了生產(chǎn)核糖醇的培養(yǎng)基，主要工藝特征在于利用魚肉萃取物、大豆粉、脫脂大豆粉、或棉沖予蛋白等作為氮源來生產(chǎn)核糖醇。到目前為止，除上述專利外，國內(nèi)外尚未見有其它以葡萄糖為原料，采用發(fā)酵法制備核糖醇制備工藝的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種制備工藝比較筒單，制成品質(zhì)量穩(wěn)定，制備成本比較低，基本無三廢排放的釆用發(fā)酵法制備核糖醇的制備工藝。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的的總體構(gòu)想是，以可再生的價(jià)糾的葡萄糖為原料，選用高滲酵母J求頭三型孑包菌(Tricnosporonoidesoedocephalis)為出發(fā)菌林，依次按照菌種制備，種子培養(yǎng)和發(fā)酵三個(gè)步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。而在其發(fā)酵培養(yǎng)過程中，釆取分段攪拌措施，控制其發(fā)酵過程的溶氧量；同時(shí)采取分段補(bǔ)料措施，通過分段攪拌和分段補(bǔ)料，營造符合菌種微生物的培養(yǎng)、繁殖和有利于發(fā)酵制備核糖醇的條件，聯(lián):合調(diào)M酵液中的核糖醇和副產(chǎn)品甘油的濃度；且通it^酵液的提純，制取高品質(zhì)、高純度白色結(jié)晶核糖醇。有鑒于上述構(gòu)想，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的的技術(shù)方案是一種采用發(fā)酵法制備核糖醇的制備工藝，以葡萄糖為原料，以高滲酵母球頭三型孢菌為出發(fā)菌抹，依次按照菌種制備，種子培養(yǎng)和發(fā)酵三個(gè)步驟進(jìn)行，其創(chuàng)新點(diǎn)在于a、所述發(fā)酵步驟，是將步驟2所制備的種子液與含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基按1~10%^積比，接種于已滅菌的裝有所ii^酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)，實(shí)施攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，制取發(fā)酵液；b、所*酵培養(yǎng)^_在罐壓為0~lMpa,溫度為25~40°C,溶解氧為5~95%，PH為47的工藝條件下進(jìn)行的；發(fā)酵培養(yǎng)過程的時(shí)間為80~160h,至其葡萄糖的殘?zhí)橇俊?.3%時(shí)發(fā)酵結(jié)束；c、所述發(fā)酵過程的攪拌為分段攪拌；前30h的攪拌4ti4控制在200~600rpm范圍內(nèi)，溶解M制在65~95%范圍內(nèi)；30h后的攪拌轉(zhuǎn)速控制在100~300rpm范圍內(nèi)，溶解氧控制在5~65%范圍內(nèi)。上述技術(shù)方案所涉及的菌種制備，可采用通常的方式，即將其所述菌株接種斜面，在2535。C恒溫條件下，培養(yǎng)90-100h后，在14。C溫度^下寸M待用。而所述的種子培養(yǎng)，同樣可以采用通常的方式，即將所制備的斜面，接種于^Mt子培養(yǎng)基中；培養(yǎng)溫度控制在2535。C范圍內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速控制在100~250rpm范圍內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間為45~50h。而其所述培養(yǎng)基的組#各組份的重量襯，本發(fā)明所推薦的是葡萄糖15O-250g/L，酵母浸粉510g/L,MgS04.71120為0.2~0.88/1，NaCl為0.2~0.8g/L,用純水配制。而所ii^發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基的組^^各組份的重量^t,與已有含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基基本相同，本發(fā)明所推薦的是葡萄糖為50~250g/L,酵母浸粉為15~25g/L，MgS04.7H20為0.2~0.8g/L,NaCl為0.2—0.8g/L,消泡劑(泡敵)為2~5mL/L,用純水配制。且所述葡萄糖的重量含量，可在整個(gè)發(fā)酵過程中實(shí)施分段調(diào)控。本發(fā)明按照上述技術(shù)方案實(shí)施,可見其原料路線和工藝流程都比較簡(jiǎn)單，發(fā)酵培養(yǎng)過程控制簡(jiǎn)便，能源消耗較低，制備成^^f氐，無三廢排放。從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明還主張，所tt酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，是在發(fā)酵培養(yǎng)過程中分段加入所ii^酵罐內(nèi)的；在發(fā)酵前期0~30h時(shí)間范圍內(nèi)，控制葡萄糖濃度在5~15%范圍內(nèi)；在30h后補(bǔ)加葡萄糖和KH2PO4,且控制葡萄糖濃度在5~25%范圍內(nèi)，所述KH2PO4的加入量控制在0.11.5g/L范圍內(nèi)。之所以要實(shí)施與分段攪拌相應(yīng)對(duì)的分段補(bǔ)料，其目的在于營造更加適合菌種微生物培養(yǎng)、繁殖和有利于發(fā)酵制備核糖醇的條件,以有效降低所用發(fā)酵培養(yǎng)基物料的消耗，降低制備成本；且由此可以通過分段攪拌和分段補(bǔ)料，聯(lián)合調(diào)控發(fā)酵液中的核糖醇和副產(chǎn)品甘油的濃度(含量)。本發(fā)明還主張，在發(fā)酵步驟后，還包括提純步驟；所述提純步驟，是將通過步驟3制取的發(fā)酵液，經(jīng)離心分離去除菌體，活性i^JC色，減壓蒸餾濃縮，色i普分離樹月旨層析,層析液濃縮和有才;i^媒重結(jié)晶,而得高純度白色結(jié)晶的核糖醇產(chǎn)品。本發(fā)明推薦的所述提純的具體步驟是將葡萄糖殘?zhí)橇?lt;0.3%的發(fā)酵液，經(jīng)5000g/10min離心分離去除菌體；再經(jīng)活性炭脫色；減壓蒸餾濃縮至核糖醇濃度為40~90%;然后經(jīng)色鐠分離樹脂層析；收集含核糖醇洗脫液,濃縮后再經(jīng)有積il:媒乙醇重結(jié)晶，得含量>99%的高純度白色結(jié)晶核糖醇制品。且所i^析分離過程的洗脫液為純水；分離柱高徑比為10~40，最佳為15~35;-^^4為1~25mL/min，最佳為2~15mL/min。本發(fā)明所主張的所述色譜分離樹脂為Ca型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。而本發(fā)明所4條的是英國產(chǎn)PUROLITEPCR642鈣型離子交換樹脂，或者是國產(chǎn)001x7型和D001型強(qiáng)酸性陽子交換樹脂，經(jīng)0.5mol/L的Cach轉(zhuǎn)型的Ca型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。上述技術(shù)方案得以實(shí)施后，本發(fā)明通過分段攪拌控制發(fā)酵過程的溶氧量和分段補(bǔ)料方式，聯(lián)合調(diào)控核糖醇產(chǎn)物濃度，減小副產(chǎn)物甘油含量，而所具有的工藝簡(jiǎn)單，核糖醇產(chǎn)率高，耗用原料少，甘油等副產(chǎn)物含量低，產(chǎn)品質(zhì)彭t、定，制備成本低，和無三廢排放等特點(diǎn)，是顯而易見的。與已有技目比，本發(fā)明具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步。圖l是本發(fā)明一種具體實(shí)施方式的工藝流程圖；圖2是本發(fā)明另一種具體實(shí)施方式的工藝流程圖；圖3是本發(fā)明提純步驟工藝流程圖；圖4是本發(fā)明一種具體實(shí)施方式的核糖醇發(fā)酵液液相色譜圖；圖5是本發(fā)明另一種具體實(shí)施方式分段控制溶氧和補(bǔ)料的核糖醇發(fā)酵液液相色i普?qǐng)D；圖6是本發(fā)明制品核糖醇產(chǎn)品的紅外i普?qǐng)D。具體實(shí)施方式以下通過具體實(shí)施方式的描述，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:如附圖1所示。其工藝步驟是(1)菌抹選用。選用高滲酵母球頭三型孢菌(Trichosporonoidesoedoc印halisATCC16958)(2)培養(yǎng)基制備。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)菌種制備。將所述菌林接種斜面，經(jīng)30。C土rC溫培養(yǎng)4M，置于rc冰箱中待用。(4)種子培養(yǎng)。將步驟3斜面培養(yǎng)4天后的菌種接入種子培養(yǎng)液中。種子培養(yǎng)采用有氧培養(yǎng)，使用500ttiL三角搖瓶，裝液量為100mL,培養(yǎng)溫度為30t，搖床壽鍵為170rpm，培養(yǎng)時(shí)間為45h。(5)發(fā)酵培養(yǎng)。a、發(fā)酵培養(yǎng)采用50L發(fā)酵罐，裝液量為30L,罐壓為0.5MPa,培養(yǎng)溫度為30"C，pH為5.0;b、發(fā)酵方式將步驟4制備的種子培養(yǎng)液以5%的體積比接^_酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵整個(gè)過程的通氣量控制為1vvm，溶解氧控制在65%左右，分段攪拌的轉(zhuǎn)速均為350rpm。c、發(fā)酵結(jié)果如下發(fā)酵共進(jìn)行120小時(shí)，葡萄糖濃完全轉(zhuǎn)化，如附圖4所示高效液相色i普面積歸一化分析，發(fā)酵液中含甘油21g/L，赤蘚糖醇8.5g/L,核糖醇45g/L,核糖醇生產(chǎn)過程葡萄糖轉(zhuǎn)化率為22.5%。實(shí)施例2:如附圖1所示。其工藝步驟是(1)菌種選用。同實(shí)施例l。(2)培養(yǎng)基制備。同實(shí)施例1。(3)菌種制備。同實(shí)施例l。(4)種子培養(yǎng)。同實(shí)施l。(5)發(fā)酵培養(yǎng)。a、發(fā)酵培養(yǎng)采用50L發(fā)酵罐，裝液量為30L，罐壓為0.5MPa，培養(yǎng)溫度為30°C,pH為5.0;b、發(fā)酵方式將步驟4制備的種子培養(yǎng)液以5%的體積比接^酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵整個(gè)過程的通氣量控制為1vvm,發(fā)酵前30小時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm，溶解氧控制在65~95%范圍內(nèi)，30小時(shí)后將攪拌艦降至100200rpm,使溶IU空制在5%~30%,即采用本發(fā)明的分段攪拌發(fā)酵法。(6)發(fā)酵共進(jìn)行120小時(shí)，葡萄糖完全轉(zhuǎn)化，高效液相色語分析酵液中含甘油15g/L，赤蘚糖醇7.6g/L，核糖醇65g/L，核糖醇生產(chǎn)過程葡萄糖轉(zhuǎn)化率為32.5%。實(shí)施例3:如附圖1所示。其工藝步驟是(1)菌種選用。同實(shí)施例l。(2)培養(yǎng)基制備。同實(shí)施例1。(3)菌種制備。同實(shí)施例1。(4)種子培養(yǎng)。同實(shí)施l。(5)發(fā)酵培養(yǎng)。a、將種子培養(yǎng)液以5%的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵的整個(gè)過程中通氣量控制為1vvm，發(fā)酵前30小時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm,30小時(shí)后將發(fā)酵轉(zhuǎn)速P爭(zhēng)至100200rpm,使溶氧控制在5%~30%,即采用本發(fā)明的分段攪拌發(fā)酵法。同時(shí)發(fā)酵過程中葡萄糖總量在20%的前提下，在前30小時(shí)控制葡萄糖濃度為5%~10%，30小時(shí)后將剩余葡萄糖補(bǔ)加到發(fā)酵罐中，同時(shí)補(bǔ)加1.0g/L的KH氛b、發(fā)酵共進(jìn)行110小時(shí)，葡萄糖完全轉(zhuǎn)化，如附圖5所示高效液相色語面積歸一分析發(fā)酵液中含甘油2.5g/L，赤蘚糖醇17g/L，核糖醇86g/L,核糖醇生產(chǎn)過程葡萄糖轉(zhuǎn)化率為43%。實(shí)施例4:如附圖2所示。其工藝步驟是(1)菌種選用。同實(shí)施例l。(2)培養(yǎng)基制備。同實(shí)施例1。(3)菌種制備。同實(shí)施例l。(4)種子培養(yǎng)。同實(shí)施l。(5)發(fā)酵培養(yǎng)。同實(shí)施例3。(6)發(fā)酵液提純。將步驟5所得發(fā)酵液(其中核糖醇的濃度為86g/L)。依次4姿照以下步驟進(jìn)行提純(如附圖3):a、將發(fā)酵液在離心力為5000g^f牛下離心10min除去菌體。b、離心所得清液添加千分U的活性炭，在5080。C溫度^f牛下攪拌30min進(jìn)行脫色，然后抽濾除去活性炭。c、在減壓和60。C溫度條件下，將脫色后的料液濃縮至核糖醇含量為60%以上。d、將上述步驟c濃縮后的濃縮液置于Ca型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱中進(jìn)分離(PUROLITEPCR642鈣型離子交換樹脂)；其樹脂柱長(zhǎng)為IOOO隱，柱內(nèi)徑為45咖，發(fā)酵液上樣完畢后用去離子水洗脫。e、將d步驟制備的含核糖醇的洗脫液接收合并，在減壓條件下蒸干，處理溫度控制在65。C以下。f、將步驟e所得制品，在熔媒乙醇中進(jìn)行重結(jié)晶，真空干燥后，所得產(chǎn)品純度為99%,收率在95%以上。產(chǎn)品經(jīng)液相色鐠和紅外光語檢測(cè)予以確認(rèn)(如附圖6)。其中波數(shù)在3400左右的為羥基峰，波凄t在2900左右的為亞曱基，波數(shù)1050和1100則說明有伯醇和仲醇基團(tuán)存在。產(chǎn)品紅外圖譜完全符合核糖醇結(jié)構(gòu)。本發(fā)明小試效果顯示，實(shí)現(xiàn)了其發(fā)明的初衷。權(quán)利要求1、一種采用發(fā)酵法制備核糖醇的制備工藝，以葡萄糖為原料，以高滲酵母球頭三型孢菌為出發(fā)菌株，依次按照菌種制備，種子培養(yǎng)和發(fā)酵三個(gè)步驟進(jìn)行，其特征在于a、所述發(fā)酵步驟，是將步驟2所制備的種子液與含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基按1～10％體積比，接種于已滅菌的裝有所述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)，實(shí)施攪拌發(fā)酵培養(yǎng)；b、所述發(fā)酵培養(yǎng)是在罐壓為0～1Mpa，溫度為25～40℃，溶解氧為5～95％，PH為4～7的工藝條件下進(jìn)行的；發(fā)酵培養(yǎng)過程的時(shí)間為80～160h，至其葡萄糖的殘?zhí)橇俊?.3％時(shí)發(fā)酵結(jié)束；c、所述發(fā)酵過程的攪拌為分段攪拌；前30h的攪拌轉(zhuǎn)速控制在200～600rpm范圍內(nèi)，溶解氧控制在65～95％范圍內(nèi)；30h后的攪拌轉(zhuǎn)速控制在100～300rpm范圍內(nèi)，溶解氧控制在5～65％范圍內(nèi)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用發(fā)酵法制備核糖醇的制備工藝，其特站于，所^JL酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，是在發(fā)酵培養(yǎng)過程中分對(duì)口入所tt酵罐內(nèi)的；在發(fā)酵前期030h時(shí)間范圍內(nèi)，控制葡萄糖濃度在5~15%范圍內(nèi)；在30h后補(bǔ)加葡萄糖和KH2P04,且控制葡萄糖濃度在5~25%范圍內(nèi)，所述KH2P04的加入量控制在0.1~1.5g/L范圍內(nèi)。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的采用發(fā)酵法制備核糖醇的制備工藝，其特征在于，在發(fā)酵步驟后，還包括提純步驟；所述提純步驟，是將通過步驟3制取的發(fā)酵液，經(jīng)離心分離去除菌體，活性皿色，減壓蒸餾濃縮,色譜分離樹月旨層析，層析液j^和有4;Ui^某重結(jié)晶，而得高純度白色結(jié)晶的核糖醇產(chǎn)口Po4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的采用發(fā)酵法制備核糖醇的制備工藝，其特4i^于，所述色i普分離樹脂為Ca型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。全文摘要本發(fā)明的公開的是一種采用發(fā)酵法制備核糖醇的制備工藝，以葡萄糖為原料，以高滲酵母球頭三型孢菌為出發(fā)菌株，依次按照菌種制備，種子培養(yǎng)和發(fā)酵三個(gè)步驟進(jìn)行，以其種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基按1～10％體積比接種，在發(fā)酵罐內(nèi)攪拌發(fā)酵培養(yǎng)；所述發(fā)酵培養(yǎng)是在罐壓為0～1MPa，溫度為25～40℃，溶解氧為5～95％，pH為4～7的工藝條件下進(jìn)行的；發(fā)酵培養(yǎng)過程的時(shí)間為80～160h；所述發(fā)酵過程的攪拌為分段攪拌；通過分段控制攪拌轉(zhuǎn)速，分段控制溶氧量為主要特征。且實(shí)施分段補(bǔ)料和提純。具有工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，耗用原料少，甘油等副產(chǎn)物含量低，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，制備成本低和無三廢排放等特點(diǎn)。文檔編號(hào)C12P7/18GK101260414SQ20081002359公開日2008年9月10日申請(qǐng)日期2008年4月11日優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日發(fā)明者萬屹東,元英進(jìn),吉尤,李良智,偉王,芮新生申請(qǐng)人:常茂生物化學(xué)工程股份有限公司