專利名稱：一種用于植物源蛋白的益生菌發(fā)酵劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其是關(guān)于一種用于發(fā)酵豆粕、 棉籽粕和花生粕等植物蛋白原料的益生菌發(fā)酵劑的制備方法。
背景技術(shù)：
益生菌(Probiotic)被定義為含有足夠數(shù)量活菌、組成明確的微生 物制劑或產(chǎn)品，能通過(guò)定殖作用改變宿主某一部位菌群組成、從而有 利于宿主的健康作用。除了定殖作用外，益生菌的代謝產(chǎn)物從簡(jiǎn)單的 短鏈脂肪酸到一些人體必需，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機(jī)酸如葉酸、乳清酸等， 這些化合物能使消化道的pH值降低，形成一種酸性環(huán)境，并且對(duì)宿主 的一系列生理過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)。益生菌在腸腔內(nèi)釋放的各種酶可以對(duì)消 化過(guò)程起協(xié)同作用，減緩部分腸道吸收不良的癥狀。此外，益生菌產(chǎn) 生的細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)能提高益生菌在體內(nèi)的抗菌作用，增加了其作 為生物治療方法的應(yīng)用潛力。益生菌的保健作用主要體現(xiàn)在以下方面-①抑制腸道致病菌，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，防治多種類型腹瀉；②刺激 腸道蠕動(dòng)、防止便秘和胃腸脹氣；③促進(jìn)生長(zhǎng)，控制感染與增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng) 素的消化率；④促進(jìn)鈣、鎂、鐵、鋅和維生素D的吸收；⑤減輕乳糖 不耐受癥狀；⑥降血壓作用；⑦抗腫瘤作用等。目前用作益生菌的微 生物均是來(lái)源于人或動(dòng)物，人們研究和應(yīng)用比較多的是乳酸桿菌和雙 歧桿菌這些可以產(chǎn)生乳酸的腸道菌，因此益生菌制品也經(jīng)常使用這兩 個(gè)屬的細(xì)菌，如植物乳桿菌，噬酸乳桿菌，長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿 菌等。大豆肽是大豆蛋白經(jīng)水解后，由3~6個(gè)氨基酸組成的低肽混合物， 分子量為1000Da左右。大豆肽的氨基酸組成雖與大豆蛋白十分相似, 但卻具大豆蛋白所沒(méi)有的許多獨(dú)特的理化作用，如良好的溶解性、低 粘度、抗凝膠形成性，而且在體內(nèi)具有良好的消化吸收性。近年來(lái)的 營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)的研究證明，蛋白質(zhì)在胃和小腸中基本上水解成肽，小肽 作為蛋白質(zhì)的主要消化產(chǎn)物，在氨基酸消化、吸收及營(yíng)養(yǎng)代謝中起著 重要作用。許多小分子量的肽在經(jīng)人體消化道時(shí)不被水解，而是直接 被人體吸收利用，而且吸收速度和吸收率均比大分子蛋白(如大豆蛋 白、酪蛋白)和小分子氨基酸高，且不存在游離氨基酸之間的競(jìng)爭(zhēng)性抑 制問(wèn)題[5]。同時(shí)，除了易消化吸收外，與大分子蛋白相比，大豆肽還具有大豆 蛋白所不具備的多種生物活性，如促進(jìn)能量代謝以及減肥作用，消除 疲勞效果，增強(qiáng)肌肉作用，低抗原性，降膽固醇作用，抗氧化作用， 降血壓效果，調(diào)節(jié)胰島素等。此外，大豆肽對(duì)一些微生物如乳酸菌、 雙歧桿菌，以及酵母等的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)效果，可以調(diào)節(jié)人和動(dòng)物體 腸道內(nèi)微生態(tài)平衡。正因?yàn)榇蠖闺牟粌H能提供人體生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還具有防病、治病、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的功效，可以作 為食品添加劑或強(qiáng)化劑，添加到食品或飲料中。例如制成嬰幼兒特制 多肽奶粉，孕婦、中老年保健多肽粉劑、沖劑、片劑，多肽護(hù)肝、保 腎、抗癌、減肥、抗血栓、防動(dòng)脈硬化、防糖尿病食品，多肽補(bǔ)鈣、 鋅、鐵等微量元素食品等。近年來(lái)，大豆肽的保健及醫(yī)療作用日益引 起世界各國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和食品科學(xué)家的普遍關(guān)注，將大豆肽分離、純化， 以提高生物活性、推動(dòng)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用已成為生物活性肽研究的熱門 課題。多肽的生產(chǎn)方法有化學(xué)法、酶解法、微生物發(fā)酵法等。其中，以 微生物發(fā)酵法最有前途，它在產(chǎn)生多肽的同時(shí)，還能修飾肽中的苦味 因子，增加發(fā)酵產(chǎn)物中還原型異黃酮等生理活性物質(zhì)的含量。但目前 微生物發(fā)酵生產(chǎn)多肽采用的菌種多為黑曲霉、米曲霉等真菌菌種，產(chǎn) 品本身不具有益生價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)已有制備含乳酸菌多肽產(chǎn)品的技術(shù)，如申請(qǐng)?zhí)枮?2156830. 8 二次發(fā)酵大豆降解酸奶的專利，采用兩步液體 發(fā)酵的方法，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，操作條件要求嚴(yán)格，生產(chǎn)成本較高。因 此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單有效的用于固態(tài)發(fā)酵植物蛋白原料的益生菌發(fā)酵劑， 其發(fā)酵產(chǎn)品富含多肽和益生菌的產(chǎn)品，使多肽的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和益生菌的 益生作用相結(jié)合，從而顯著增強(qiáng)植物蛋白原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，將會(huì)產(chǎn)生 巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)菌種篩選，分離純化得到在植物蛋 白原料中具有較強(qiáng)生長(zhǎng)和產(chǎn)酸性能的益生菌菌株，菌種經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、濃 縮、干燥得到益生菌干粉，再與適量的蛋白酶混合，建立一種密閉靜 止厭氧固態(tài)發(fā)酵的方式，使豆粕、花生粕等植物蛋白原料中大分子蛋 白降解為小肽，得到的用于發(fā)酵植物蛋白制造活性肽的益生菌發(fā)酵劑。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的 一種用于發(fā)酵植物源 蛋白制造活性肽的益生菌發(fā)酵劑制備方法，包括以下步驟1)、 菌種活化所采用的菌株為植物乳桿菌(Za"o&"7/w ; /fl"tan/m ) LP8，將保藏的菌種接入MRS培養(yǎng)基斜面，37。C培養(yǎng)至 出現(xiàn)菌落，然后再?gòu)男泵嫔咸羧【尤肓硪粋€(gè)斜面，出現(xiàn)菌落后重 復(fù)以上操作，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，即得活化菌種；上述所用的MRS培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L;酵母提取物5 g/L; 檸檬酸二銨2g/L;葡萄糖20g/L;牛肉膏10g/L;吐溫80 1 mL/L; K2HP042 g/L; MgS04 7H20 0.58 g/L; MnS04 4H20 0.25 g/L，瓊脂 15—20g/L， pH 6.2—6.5， 121'C滅菌15分鐘;2) 、種子培養(yǎng)將步驟1)中所得到的乳酸菌活化菌種，接種于 乳酸菌三角瓶液體培養(yǎng)基(w/v)中，于37。C培養(yǎng)18—20小時(shí)，得到 乳酸菌發(fā)酵種子；上述所用的培養(yǎng)基(w/v)組成為大豆蛋白胨10g/L;乳糖5g/L; 牛肉膏5 g/L;酵母膏3g/L;NaCl 4 g/L;溴甲酚紫3 g/L;吐溫一80 lmL; L-HC1半胱氨酸lg/L; pH值7.0, 121'C滅菌15分鐘；3) 、發(fā)酵罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子以5%的接種量接種到發(fā)酵培 養(yǎng)基中，于35—38。C培養(yǎng)24-48小時(shí)，攪拌速度為150—200 r/min， 通風(fēng)量為lvvm，待pH值下降到5.0左右時(shí)，停止發(fā)酵;4) 、濃縮將上述培養(yǎng)物經(jīng)轉(zhuǎn)速4000—5000 r/min、離心濃縮20 一30min，得到活性植物乳桿菌的濃縮物；5) 、干燥添加20%的含1.5%甘油+ 10%脫脂乳的水溶液做保 護(hù)劑，與菌體沉淀物均勻混合制成懸浮液，將菌懸液置于一4(TC的冰 箱中冷凍3 — 5小時(shí)后，取出放入冷凍干燥機(jī)中，調(diào)冷阱溫度至一59 °C，干燥24—36小時(shí)后取出，得到含活性益生菌數(shù)為10"CFU/g左右 的菌粉；6) 混合將步驟5)得到的益生菌菌粉，與植物蛋白原料的酸性 蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、e—葡聚糖酶中的一種或幾種相混 合，制成含活性菌101(}CFU/g，酸性蛋白酶含量10 — 50%，中性蛋白 酶10—20%,纖維素酶5 — 10%、 葡聚糖酶10—20%的發(fā)酵劑。本發(fā)明所用的植物蛋白原料為大豆餅粕、花生餅粕、芝麻餅粕、 菜籽餅粕、向日葵餅粕、玉米蛋白粉及小麥蛋白粉及其相應(yīng)蛋白中的 一種或幾種。采用本發(fā)明的發(fā)酵劑在發(fā)酵豆粕、花生粕等植物源蛋白后，可使發(fā)酵產(chǎn)品的益生菌活菌數(shù)達(dá)108CFU/g,粗蛋白含量增加3%—5%，蛋 白質(zhì)水解度達(dá)到12% —15%， pH值降低到3.8—4.0，乳酸含量5%—6 %。本發(fā)明中所得的發(fā)酵劑發(fā)酵原料所得產(chǎn)物經(jīng)測(cè)定表明，益生菌活 菌數(shù)達(dá)108CFU/g以上。發(fā)酵后提高干物質(zhì)中的粗蛋白含量4一5%， 蛋白水解度達(dá)15%以上，畜禽發(fā)病率降低10—15%。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:1)菌種活化所采用的菌株為植物乳桿菌(丄"cto6ac/〃w / /awtor, ) LP8， 該菌株已在Journal of animal feed science and technology發(fā)表，將保藏的菌種接入MRS培養(yǎng)基斜面，37匸培養(yǎng)至出 現(xiàn)菌落，然后再?gòu)男泵嫔咸羧【尤肓硪粋€(gè)斜面，出現(xiàn)菌落后重復(fù) 以上操作，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，即得活化菌種。所用的MRS培養(yǎng)基組成為 蛋白胨10g/L;酵母提取物5g/L;檸檬酸二銨2g/L;葡萄糖20 g/L;牛肉膏10 g/L;吐溫80 1 mL/L; K2HP042 g/L; MgS04 '71120 0.58 g/L; MnS04 4H20 0.25 g/L,瓊脂15—20g/L， pH 6.2—6.5， 121。C滅菌15 分鐘。2)、種子培養(yǎng)將步驟1)中所得到的乳酸菌活化菌種，接種于 乳酸菌三角瓶液體培養(yǎng)基中，于37t:培養(yǎng)18—20小時(shí)，得到乳酸菌發(fā)酵種子。所用的培養(yǎng)基組成為(W/V):大豆蛋白胨10g/L;乳糖5g/L;牛肉膏5g/L;酵母膏3g/L;NaC14g/L;溴甲酚紫3g/L;吐溫一80 lmL; L-HC1半胱氨酸lg/L; pH值7.0， 12rC滅菌15分鐘。3) 、發(fā)酵罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子以5%的接種量接種到發(fā)酵培 養(yǎng)基中，于35—38。C培養(yǎng)24-48小時(shí)，攪拌速度為150—200 r/min， 通風(fēng)量為lvvm，待pH值下降到5.0左右時(shí)，停止發(fā)酵。4) 、濃縮將上述培養(yǎng)物經(jīng)轉(zhuǎn)速4000—5000 r/min離心濃縮20— 30min，得到活性植物乳桿菌的濃縮物。5) 、干燥添加20%的含1.5%甘油+ 10%脫脂乳的水溶液做保 護(hù)劑，與菌體沉淀物均勻混合制成懸浮液，將菌懸液置于一40'C的冰 箱中冷凍3—5小時(shí)后，取出放入冷凍干燥機(jī)中，調(diào)冷阱溫度至一59 'C，干燥24—36小時(shí)后取出，得到含活性益生菌數(shù)為10"CFU/g左右 的菌粉。6) 、混合將步驟5)得到的益生菌菌粉，與酸性蛋白酶、中性 蛋白酶、纖維素酶，P—葡聚糖酶，按重量比10:50:25:10:5相混合， 制成含活性菌101QCFU/g的發(fā)酵劑。實(shí)施例2:步驟1到5同實(shí)施例1，將益生菌粉與酸性蛋白酶、P —葡聚糖酶按 重量比10:80:10相混合，制成發(fā)酵劑。采用本發(fā)酵劑發(fā)酵植物蛋白原料，既可使原料中大分子的蛋白降 解為小肽，消除原料中的胰蛋白酶抑制因子、脹氣因子等對(duì)健康不利 的成分，使產(chǎn)品更有利于消化吸收。同時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中含多種有機(jī)酸、 酯類等風(fēng)味物質(zhì)和細(xì)菌素，分解原料中的異黃酮和酚類等生理活性物 質(zhì)。利用本發(fā)酵劑所得的富含益生菌的植物蛋白多肽可用于人類保健和營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)品，各種家畜日糧，魚(yú)蝦日糧或其它養(yǎng)殖動(dòng)物日糧。本發(fā) 明發(fā)酵劑中添加酶的種類和數(shù)量，可根據(jù)生產(chǎn)中所發(fā)酵的植物蛋白原 料的營(yíng)養(yǎng)成分的不同而進(jìn)行調(diào)節(jié)。
權(quán)利要求
1、一種用于發(fā)酵植物源蛋白制造活性肽的益生菌發(fā)酵劑制備方法，包括以下步驟1)、菌種活化所采用的菌株為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)LP8，將保藏的菌種接入MRS培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，然后再?gòu)男泵嫔咸羧【尤肓硪粋€(gè)斜面，出現(xiàn)菌落后重復(fù)以上操作，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，即得活化菌種；2)、種子培養(yǎng)將步驟1)中所得到的乳酸菌活化菌種，接種于乳酸菌三角瓶液體培養(yǎng)基(w/v)中，于37℃培養(yǎng)18-20小時(shí)，得到乳酸菌發(fā)酵種子；3)、發(fā)酵罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子以5％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35-38℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，攪拌速度為150-200r/min，通風(fēng)量為1vvm，待pH值下降到5.0左右時(shí)，停止發(fā)酵；4)、濃縮將上述培養(yǎng)物經(jīng)轉(zhuǎn)速4000-5000r/min、離心濃縮20-30min，得到活性植物乳桿菌的濃縮物；5)、干燥添加20％的含1.5％甘油+10％脫脂乳的水溶液做保護(hù)劑，與菌體沉淀物均勻混合制成懸浮液，將菌懸液置于-40℃的冰箱中冷凍3-5小時(shí)后，取出放入冷凍干燥機(jī)中，調(diào)冷阱溫度至-59℃，干燥24-36小時(shí)后取出，得到含活性益生菌數(shù)為1011CFU/g左右的菌粉；6)混合將步驟5)得到的益生菌菌粉，與植物蛋白原料的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶中的一種或幾種相混合，制成含活性菌1010CFU/g，酸性蛋白酶含量10-50％，中性蛋白酶10-20％，纖維素酶5-10％、β-葡聚糖酶10-20％的發(fā)酵劑。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于發(fā)酵植物源蛋白制造活性肽的 益生菌發(fā)酵劑制備方法，其特征在于所述的步驟l)中的MRS培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L;酵母提取物5g/L;檸檬酸二銨2 g/L;葡萄糖20 g/L;牛肉膏10 g/L;吐溫80 1 mL/L; K2HP042 g/L; MgS04 '71120 0.58 g/L; MnS04 4H20 0.25 g/L，瓊脂15—20g/L， pH 6.2—6.5， 121t:滅菌i5分鐘。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于發(fā)酵植物源蛋白制造活性肽的 益生菌發(fā)酵劑制備方法，其特征在于所述的步驟2)上述所用的培養(yǎng)基組成為(W/V):大豆蛋白胨10g/L;乳糖5g/L;牛肉膏5g/L;酵母膏3g/L; NaC14g/L;溴甲酚紫3g/L;吐溫一80 lmL; L-HC1半 胱氨酸lg/L; pH值7.0， 121'C滅菌15分鐘。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于發(fā)酵植物源蛋白制造活性肽的 益生菌發(fā)酵劑制備方法，其特征在于所述的步驟6)中的植物蛋白 原料包括大豆餅粕、花生餅粕、芝麻餅粕、菜籽餅粕、向日葵餅粕、 玉米蛋白粉及小麥蛋白粉及其相應(yīng)蛋白中的一種或幾種。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于發(fā)酵植物源蛋白制造活性肽的 益生菌發(fā)酵劑制備方法，其特征在于所述的步驟6)中的發(fā)酵劑是得到的益生菌菌粉，與酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶，3—葡聚糖酶，按重量比10:50:25:10:5相混合，制成發(fā)酵劑。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于發(fā)酵植物源蛋白制造活性肽的 益生菌發(fā)酵劑制備方法，其特征在于所述的步驟6)中的發(fā)酵劑是 得到的益生菌粉與酸性蛋白酶、e—葡聚糖酶按重量比10:80:10相混 合，制成發(fā)酵劑。
全文摘要
一種用于植物源蛋白的益生菌發(fā)酵劑的制備方法，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明的工藝步驟為菌種篩選、活化、培養(yǎng)、離心濃縮、干燥和與酶復(fù)配，制成含活性益生菌和酶的復(fù)合發(fā)酵劑。采用本發(fā)酵劑發(fā)酵植物蛋白原料，可使原料中大分子的蛋白降解為小肽，發(fā)酵產(chǎn)品的益生菌活菌數(shù)達(dá)10⁸CFU/g，粗蛋白含量增加3％-5％，蛋白質(zhì)水解度達(dá)到12％-15％，pH值降低到3.8-4.0，乳酸含量5％-6％。發(fā)酵產(chǎn)品可用于人類保健和營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)品，各種家畜日糧，魚(yú)蝦日糧或其它養(yǎng)殖動(dòng)物日糧等。
文檔編號(hào)C12N9/42GK101240255SQ20081001982
公開(kāi)日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2008年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月18日
發(fā)明者李春陽(yáng), 征 閆, 陳玉良 申請(qǐng)人:江蘇云海辰龍生物科技有限公司;江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所