專利名稱：：一種吸水鏈霉菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物及其應(yīng)用，尤其涉及一種吸水鏈霉菌及其在制備西羅莫司中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：免疫抑制劑在器官移植中用于防治排斥反應(yīng)，即干擾受體對(duì)外來抗原的識(shí)別和非自身細(xì)胞的清除。1954年，人類第一例同卵雙生子間腎臟移植的手術(shù)取得成功以后，至今40多年來醫(yī)學(xué)科學(xué)在器官移植方面的研究有了很多重大的突破。1978年環(huán)孢菌素A(cyclosporineA)的臨床使用為器官移植開辟了新紀(jì)元。大多數(shù)患者腎移植2年存活率己超過80%，而患者生存率也有所提高。西羅莫司(Sirolimus)是吸水鏈霉菌(5yre;to/^cas/^gmycp/cw"的代謝產(chǎn)物，是一種新型強(qiáng)效免疫抑制劑，為一親脂性35元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，結(jié)構(gòu)式中含有很特殊的由a，P—二酮己哌啶酸胺分子掩蓋的半宿酮，并有一個(gè)三烯片斷。它抑制細(xì)胞從Gl期進(jìn)入S期，阻斷IL-2與其受體的結(jié)合，使Tc、Td細(xì)胞不能成為具有免疫應(yīng)答作用的致敏T細(xì)胞，發(fā)揮其免疫抑制作用。西羅莫司主要應(yīng)用于防治腎、肝等移植排異反應(yīng)，尤適用于并發(fā)腎功能不良、震顫、高血壓的患者，還能治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、牛皮癬等疾病，現(xiàn)在作為防治冠狀動(dòng)脈再狹窄的涂層支架、基因治療和抗腫瘤藥物等具有廣闊的市場前景。西羅莫司1999年10月20日在美國上市，為口服液劑型。此后采用伊蘭(Elan)公司的納米晶體(NanoCrystal)技術(shù)制備的lmg片劑也已在美國上市，獲準(zhǔn)與環(huán)孢菌素A、類固醇聯(lián)合用于腎移植病人的抗排異。2000年3月西羅莫司在英國、德國、丹麥等國上市，此外西羅莫司還在英國以口服混懸劑的方式銷售。西羅莫司為胞內(nèi)產(chǎn)物，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液過濾的菌體后經(jīng)甲醇萃取濃縮后，再通過一系列純化工藝如色譜層析、萃取、結(jié)晶等獲得西羅莫司純品。一般的西羅莫司產(chǎn)生菌，發(fā)酵單位只有200ug/ml左右，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，導(dǎo)致后序的提取時(shí)層析分離比較困難，工作較為復(fù)雜，產(chǎn)品收率低于20%。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問題，提供一種高單位的西羅莫司產(chǎn)生菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該該菌種在制備西羅莫司中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的一種吸水鏈霉菌ZJQ60115(6Yre/z^7(rces力/grocA'c〃sZJQ60115)，已保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC),保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200。保藏日期為2007年12月14日。所述的保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200菌株來自四川橫斷山脈土壤樣品中分離所得。所述的保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200菌株的菌落特征菌落形態(tài)在燕麥片瓊脂培養(yǎng)基上，菌落圓形，直徑46mm，高起。氣絲灰色，培養(yǎng)10天以后出現(xiàn)黑色吸水斑。菌絲形態(tài)以高氏-天冬素瓊脂或燕麥片瓊脂為培養(yǎng)基，接入菌株FC904，斜插無菌蓋玻片，在2530'C培養(yǎng)，分別于7天、14天、20天取出蓋玻片觀察。在光學(xué)顯微鏡下觀察，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株基絲發(fā)育良好，細(xì)長，分枝。氣絲發(fā)育貧乏至中等。孢子絲著生在氣生菌絲體上，為35圈的緊密螺旋形。在電子顯微鏡下觀察，孢子圓形或卵圓形，0.50.6X0.60.8um，孢子表面疣狀。綜上所述，根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)及國外相關(guān)資料的描述，結(jié)合保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200菌株的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，將保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200菌株初步定為5^eptomycas/^gmscp/cw系的一個(gè)變種即浙e/7tom少c&s/^msc//cwsZJQ60115。所述的保藏號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株可應(yīng)用于發(fā)酵制備西羅莫司。該制備方法包括下列步驟a.發(fā)酵菌株采用保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株；b.將發(fā)酵菌株接種在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15~20天，收集菌株的孢子制成孢子甘油管，按搖瓶種子培養(yǎng)基體積的0.5~1%的接種量接入種子培養(yǎng)基，200240rpm，培養(yǎng)3648小時(shí)，得搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積1~2%的接種量接種于種子罐培養(yǎng)基，150250rpm，發(fā)酵培養(yǎng)48~54h，得罐種子；將罐種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積5~10%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，150250rpm,發(fā)酵培養(yǎng)120~168小時(shí)，收集發(fā)酵液；其中培養(yǎng)溫度均為25~30°C。所述的制備方法，其中所述的固體培養(yǎng)基為燕麥片瓊脂斜面；5所述的搖瓶種子培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源0.52g，氮源0.53g，無機(jī)鹽00.5g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源0.5~2g，氮源l3g，無機(jī)鹽0.10.5g，其余為水；發(fā)酵培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源412g，氮源l4g，無機(jī)鹽0.1lg，氨基酸0.05~0.5g，其余為水。其中優(yōu)選，搖瓶種子培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源0.51.5g，氮源l2.5g，無機(jī)鹽00.3g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源0.5~1.5g，氮源l2.5g，無機(jī)鹽0.10.3g，其余為水；發(fā)酵培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源610g，氮源1.53g，無機(jī)鹽0.30.8g，氨基酸0.10.4g,其余為水。其中所述的碳源選自面粉、甘油、淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、土豆汁、麥芽汁、土豆浸出粉、燕麥片中的一種或幾種；所述的氮源選自玉米漿、蛋白胨、魚胨、蠶蛹水解液、尿素、硫酸銨、酵母粉、酵母浸膏、黃豆粉、棉子粉、氨水、硝酸鹽中的幾種，無機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉中的一種或幾種；氨基酸為L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸中的一種或幾種。優(yōu)選碳源為面粉、燕麥片、甘油、葡萄糖中的一種或幾種；氮源為黃豆粉、酵母粉、蛋白胨中的幾種；無機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀中的一種或幾種氨基酸為L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸中的一種或幾種。發(fā)酵過程是西羅莫司生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，其發(fā)酵水平與工藝優(yōu)劣直接相關(guān)，本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)過搖瓶和10噸、50噸發(fā)酵罐進(jìn)行試驗(yàn)，其生產(chǎn)能力穩(wěn)定。經(jīng)檢測，用本發(fā)明提供的菌種及發(fā)酵培養(yǎng)方法制備的西羅莫司單位可高達(dá)60(Hig/ml以上，從而為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明所述的保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株是目前分離到的一種天然高單位的西羅莫司產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良。本發(fā)明的西羅莫司產(chǎn)生菌發(fā)酵單位達(dá)到600ng/ml以上，發(fā)酵副產(chǎn)物相對(duì)較少，降低了后提取的難度，產(chǎn)品收率可達(dá)30%以上，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)。菌株保藏情況保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200，分類命名為吸水鏈霉菌ZJQ60115(5"帥tchygroscpicusZJQ60115)。保藏日期為2007年12月14日。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但不能將方案中所涉及的方法及技術(shù)參數(shù)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1:保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株的培養(yǎng)特征采用國際鏈霉菌計(jì)劃推薦的培養(yǎng)基及Waksman推薦的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)特征描述。保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株在253(TC分別培養(yǎng)7、14、28天觀察結(jié)果。顏色的描述采用科學(xué)出版社1957年出版的《色譜》。保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株的氣絲生長貧乏-中等，白-中灰(IX44')，在培養(yǎng)23周后有黑色吸水斑出現(xiàn)?；z發(fā)育良好，在無機(jī)培養(yǎng)基上為無色-淺駝色(Ic34')，在有機(jī)培養(yǎng)基上為淺芒果黃-淺龜背灰(Ia33'-Ic54')。僅在甘油-蘋果酸鈣瓊脂上有淺駝色的可溶性色素。保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基生長氣絲基絲可溶性色素甘油-天冬素瓊源OSP5)灰白背面激它色(Ic34')無鄉(xiāng)虛-淀臓旨卄稀薄，灰白色背面娜色(Id43，)無酵母-新瓊』旨asp2)化無嫩背總(Ic54，)無smrj旨asP3)liI中總0X44，)賠果黃色(Ia33')她，脈黑斑)無MM旨(ISP7)+白色勉她(I脇，)觀鵬(IIb66，)實(shí)施例2:生理生化特征生理生化性質(zhì)采用鏈霉菌分類中的標(biāo)準(zhǔn)方法。7保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株能利用纖維素，水解淀粉，液化明膠，凍化、凝固牛奶，還原硝酸鹽，不產(chǎn)生H2S;生長pH59，生長溫度15~40。C。實(shí)施例3:碳源利用碳源利用試驗(yàn)以無碳源的査氏及高氏1號(hào)瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入各種碳源2%，接入保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株，253(TC培養(yǎng)10、20天觀察結(jié)果。保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株能利用葡萄糖、甘露糖、果糖、蔗糖、甘油、棉籽糖、淀粉等大多數(shù)碳源，不利用山梨糖、鼠李糖等碳源。實(shí)施例4:發(fā)酵培養(yǎng)制備西羅莫司采用保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207200的菌株1.種子菌種培養(yǎng)及保存孢子培養(yǎng)基燕麥片瓊脂(ISP3)斜面，燕麥片20g，瓊脂20g，加水定容至1000ml，pH7.0孢子培養(yǎng)沙土保存孢子接種于ISP3瓊脂斜面，253(TC培養(yǎng)15~20天，斜面表面菌苔出現(xiàn)吸水黑斑，存4"C備用。孢子懸液的制備將滅菌好的20%(Wv)甘油水溶液加入生長好的瓊脂斜面，用刮刀輕輕將孢子刮下，制成孢子懸浮液，然后分裝至小試管中(5m1/支)，制備好的孢子懸液放置-2(TC冷藏備用。2.搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基可溶性淀粉20g，酵母粉12g，蛋白胨15g，加水定容至2000ml，pH7.0裝量500ml三角瓶裝80ml培養(yǎng)基接種量0.5%(v/v)的孢子懸液培養(yǎng)溫度27°C培養(yǎng)時(shí)間44h搖床轉(zhuǎn)速220rpm3.種子罐種子培養(yǎng)基培養(yǎng)基葡萄糖葡萄2kg，豆粉2kg，酵母粉lkg，MgS04'7H200.02kg，氯化鈉0.4kg，加水至200L，pH自然裝量300L種子罐裝200L種子培養(yǎng)基接種量2L搖瓶種子液工藝控制罐壓0.04~0.05MPa攪拌速度180rpm通氣量1:0.5(V/V)溫度26°C周期50h4.發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基面粉36kg，燕麥片36kg，甘油18kg，葡萄糖72kg，黃豆粉9kg，酵母粉10.8kg，蛋白胨3.6kg，L-賴氨酸2.52kg，NaCl1.8kg，加水至1.8噸，，pH自然。裝量2.5噸發(fā)酵罐裝1.8噸發(fā)酵培養(yǎng)基接種量180L的種子液工藝控制罐壓0.020.03MPa攪拌速度200rpm通氣量1:1(V/V)溫度28°C周期144小時(shí)5.10噸、50噸發(fā)酵罐按照上述發(fā)酵條件和工藝，IO噸發(fā)酵罐、50噸發(fā)酵罐各進(jìn)行3批發(fā)酵，發(fā)酵單位為600-660pg/ml，均在600昭/ml以上。將所得發(fā)酵液過濾菌體，經(jīng)甲醇萃取濃縮后，再通過色譜層析、萃取、結(jié)晶等純化工藝獲得西羅莫司純品。產(chǎn)品收率在30-35%，均在30%以上。具體發(fā)酵單位及提取收率見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例5:發(fā)酵培養(yǎng)制備西羅莫司采用保藏編號(hào)為CCTCCNO.M207200的菌株1.搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基土豆浸出粉20g，魚胨24g，酵母浸膏16g，K2HPO4'3H2O20g，加水至4000ml，pH7.0。500ml三角瓶裝100ml培養(yǎng)基，接種P/。(v/v)的孢子懸液，200rpm搖床25'C培養(yǎng)48小時(shí)，得搖瓶種子液。2.種子罐種子培養(yǎng)基培養(yǎng)基面粉lkg，酵母粉lkg，蛋白胨lkg，MgS047H200.2kg，K2HP043H2O0.1kg，加水至200L，pH7.0。300L種子罐裝200L種子培養(yǎng)基，接種量4L搖瓶種子液，240rpm，29"C培養(yǎng)36h得種子液。3.發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按5000L培養(yǎng)基計(jì)，面粉200kg，葡萄糖350kg，黃豆粉50kg，酵母浸膏25kg，蛋白胨10kg，L-酪氨酸4kg，NaC140kg。種子接種量7%(v/v)，140rpm，26。C培養(yǎng)168小時(shí)。放罐所得發(fā)酵液離心得菌絲，甲醇浸泡后浸泡液HPLC檢測效價(jià)為630ug/ml。將所得的發(fā)酵液過濾菌體，經(jīng)甲醇萃取濃縮后，再通過色譜層析、萃取、結(jié)晶等純化工藝獲得西羅莫司純品，產(chǎn)品收率為31.2%，實(shí)施例6:發(fā)酵培養(yǎng)制備西羅莫司采用保藏編號(hào)為CCTCCNO.M207200的菌株1.搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基甘油15g，蔗糖30g，玉米漿30g，蛋白胨45g，Na2HP04*3H206g，MgS047H203g，加水定容至3000ml，pH7.0。500ml三角瓶裝100ml培養(yǎng)基，接種0.5%(v/v)的孢子懸液，240rpm搖床3(TC培養(yǎng)36小時(shí)，得搖瓶種子液；2.種子罐種子培養(yǎng)基培養(yǎng)基可溶性淀粉3kg，酵母浸膏3kg，黃豆粉2kg，MgSO4'7H2O0.2kg，K2HP043H200.3kg，加水至200L，pH7.0。300L種子罐裝200L種子培養(yǎng)基，接種量3L搖瓶種子液，230rpm，25"C培養(yǎng)48h得種子液。3.發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)基以5000L培養(yǎng)基計(jì)，燕麥片200kg，黃豆粉50kg，酵母粉50kg，蛋白胨90kg，L-賴氨酸25kg，NaCl15kg，其余水。種子接種量5%(v/v)，250rpm，29。C培養(yǎng)125小時(shí)。10放罐所得發(fā)酵液離心得菌絲，甲醇浸泡后浸泡液HPLC檢測效價(jià)為650ug/ml。將所得的發(fā)酵液過濾菌體，經(jīng)甲醇萃取濃縮后，再通過色譜層析、萃取、結(jié)晶等純化工藝獲得西羅莫司純品，產(chǎn)品收率為33.4°/。。權(quán)利要求1.一種吸水鏈霉菌ZJQ60115(StreptomyceshygroscpicusZJQ60115)，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNO.M207200，保藏日期為2007年12月14日。2.如權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CCTCCNO.M207200的菌株在發(fā)酵制備西羅莫司中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求2所述的保藏號(hào)為CCTCCNO.M207200的菌株在發(fā)酵制備西羅莫司中的應(yīng)用，其特征在于該制備方法包括下列步驟a.發(fā)酵菌株采用保藏編號(hào)為CCTCCNO.M207200的菌株；b.將發(fā)酵菌株接種在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1520天，收集菌株的孢子制成孢子甘油管，按搖瓶種子培養(yǎng)基體積的0.51%的接種量接入種子培養(yǎng)基，200240rpm，培養(yǎng)3648小時(shí)，得搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積12%的接種量接種于種子罐培養(yǎng)基，150250rpm，發(fā)酵培養(yǎng)48~54h，得罐種子；將罐種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積510%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，150250rpm，發(fā)酵培養(yǎng)120~168小時(shí)，收集發(fā)酵液；其中培養(yǎng)溫度均為2530°C。4.如權(quán)利要求書3所述的保藏號(hào)為CCTCCNO.M207200的菌株在發(fā)酵制備西羅莫司中的應(yīng)用，其特征是，所述的固體培養(yǎng)基為燕麥片瓊脂斜面；搖瓶種子培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源0.52g，氮源0.53g，無機(jī)鹽00.5g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源0.52g，氮源l3g，無機(jī)鹽0.10.5g，其余為水；發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源4~12g，氮源l4g，無機(jī)鹽0.1lg，氨基酸0.05~0.5g，其余為水。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的保藏號(hào)為CCTCCNO.M207200的菌株在發(fā)酵制備西羅莫司中的應(yīng)用，其特征為，搖瓶種子培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源0.51.5g，氮源l2.5g，無機(jī)鹽00.3g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每100ml培養(yǎng)基中，碳源0.5~1.5g，氮源l2.5g，無機(jī)鹽0.10.3g，其余為水；發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為每1OOml培養(yǎng)基中，碳源6~10g，氮源1.53g，無機(jī)鹽0.30.8g，氨基酸0.10.4g，其余為水。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征是所述的碳源選自面粉、甘油、淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、土豆汁、麥芽汁、土豆浸出粉、燕麥片中的一種或幾種；所述的氮源選自玉米漿、蛋白胨、魚胨、蠶蛹水解液、尿素、硫酸銨、酵母粉、酵母浸膏、黃豆粉、棉子粉、氨水、硝酸鹽中的幾種，無機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉中的一種或幾種；氨基酸為L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸中的一種或幾種。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是所述的碳源為面粉、燕麥片、甘油、葡萄糖中的一種或幾種；氮源為黃豆粉、酵母粉、蛋白胨中的幾種;無機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀中的一種或幾種氨基酸為L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸中的一種或幾種。全文摘要本發(fā)明公開了一種吸水鏈霉菌及其應(yīng)用，該菌株由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNO.M207200，保藏日期為2007年12月14日。本發(fā)明所述的保藏編號(hào)為CCTCCNO.M207200的菌株是目前分離到的一種天然高單位的西羅莫司產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良。本發(fā)明的西羅莫司產(chǎn)生菌發(fā)酵單位達(dá)到600ug/ml以上，發(fā)酵副產(chǎn)物相對(duì)較少，降低了后提取的難度，產(chǎn)品收率可達(dá)30％以上，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12N1/20GK101486976SQ20081001920公開日2009年7月22日申請日期2008年1月16日優(yōu)先權(quán)日2008年1月16日發(fā)明者卿亞麗,健朱,陳曉霞申請人:杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)生物工程研究所有限公司