專利名稱：制備葉綠素a和二氫卟酚e6的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備葉綠素a和二氫卟酚e6的方法。
背景技術(shù)：
二氫卟酚e6是一種用于癌癥光動力治療的光敏材料。 美國專利No. 5， 330， 741公開了制備二氫卟酚e6的方法。按照美國專利 No. 5，330，741的方法，用丙酮處理生物材料2 3次以提取葉綠素a，過濾 或離心生物材料，蒸干提取物，用酸處理以除去葉綠素分子中的鎂離子并水 解葉綠基酯基團(tuán)。加入甲醇以協(xié)同進(jìn)行酯化作用，用水處理該反應(yīng)物質(zhì)，脫 鎂葉綠酸a衍生物用亞甲基亞氯酸(chlorous methylene)抽提，將該提取物 中和、用水洗滌、蒸干、用氧化鋁色譜分離。脫鎂葉綠酸a甲酯從亞甲基亞 氯酸-甲醇的混合物中結(jié)晶出來，且使產(chǎn)生的脫鎂葉綠酸a衍生物在有氧條 件下在吡啶-二乙醚-正丙醇中與強(qiáng)無機(jī)堿反應(yīng)，反應(yīng)物質(zhì)用水處理。將水相 酸化至pH4，不穩(wěn)定的二氫卟酚用亞甲基亞氯酸抽提，將提取物蒸干，不穩(wěn) 定的二氫卟酚再溶解于四氫呋喃，蒸干溶液，重復(fù)本步驟直至在700nm的吸 收值停止升高，得到的紅紫素18溶解于四氫呋喃，用重氮甲垸酯化，使紅紫 素18甲酯在吡啶存在下在亞甲基亞氯酸中與賴氨酸水溶液混合，混合物在室 溫下攪拌12小時。在高真空下除去溶劑，然后獲得的粗制品用反相高效液相 色譜(HPLC)提純，冷凍干燥除去溶劑。PS溶解于磷酸鹽緩沖液以便得到用于 PDT的注射溶液，加入O. 1NNa0H溶液，用0. 1NHC1調(diào)節(jié)pH至生理值pH7. 35， 且該溶液經(jīng)由微孔濾器過濾。
但是，這個方法的缺點(diǎn)是:低重現(xiàn)性、流程復(fù)雜(利用高真空、結(jié)晶、柱 色譜法和HPLC，并且與賴氨酸的長時間反應(yīng))、使用高毒性易燃試劑(重氮甲 烷、吡啶、甲醇、四氫呋喃、二乙醚)。這些缺點(diǎn)使該方法不適合用于藥品和 食品工業(yè)。
按照韓國專利申請公開No. 2004-0025911，用丙酮處理螺旋藻屬生物材 料直至葉綠素a被完全抽提，濾出或離心生物材料，提取物用酸處理以從葉 綠素分子中除去鎂離子，中和該提取物，并濾出沉淀的脫鎂葉綠素a，然后 在鹽酸-丙酮-己烷混合物中水解脫鎂葉綠素a，每lg粗制脫鎂葉綠素a使用6 16ml丙酮、0. 6 6ml己烷和5 10ml濃鹽酸。加熱該混合物至40 60°C， 攪拌20分鐘 1小時，然后加入己烷(6 16ml)，并且有機(jī)相用丙酮和鹽酸 (2 10:1)的混合物洗滌，水相用己烷洗滌，濾出沉淀的脫鎂葉綠酸a，用水 洗滌，再從丙酮-水混合物中結(jié)晶析出，風(fēng)干至重量恒定。然后將脫鎂葉綠酸 a溶解于丙酮，加入O. 05 1.0Cm濃度的強(qiáng)無機(jī)堿水溶液，在30 6(TC攪拌5 30分鐘，再加入1 50%濃度的額外體積的強(qiáng)無機(jī)堿水溶液，在40 6(TC加 熱混合物20 90分鐘，用稀鹽酸中和，離心分離二氫卟酚e6沉淀物，用蒸 餾水洗滌至酸性反應(yīng)停止，即可獲得55 80%的二氫卟酚e6。
該方法也有一些如步驟復(fù)雜以及使用的試劑不適合用于食品和藥品領(lǐng)域 的缺點(diǎn)。
貫穿本申請，參考了一些專利和出版物，括號中提供引用出處。為了更充 分地描述本發(fā)明和本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的狀況，將這些專利和出版物公開的 內(nèi)容納入本申請。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究開發(fā)一種從屬于綠藻類的小球藻中制備二氫 卟酚e6的高產(chǎn)方法，該方法相對簡單并能大量生產(chǎn)。結(jié)果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了通 過小球藻獨(dú)特的預(yù)處理步驟制備二氫卟酚e6的高效方案。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種制備葉綠素a的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備二氫卟酚e6的方法。
結(jié)合所附權(quán)利要求書和附圖，從后續(xù)的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的其它目的 和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。
本發(fā)明的一個方面提供一種制備葉綠素a的方法，包括用有機(jī)溶劑處理 未破碎的完整小球藻的步驟。
為了有效制備二氫卟酚e6，本發(fā)明人首先打算開發(fā)一種有效制備二氫卟 酚e6的方法，并選取適合的小球藻作為原材料以達(dá)到這個目的。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，小球藻細(xì)胞首先被裂解，并使用 該細(xì)胞裂解液抽提葉綠素a。但是，不同于常規(guī)方法和手段，本發(fā)明人成功 地用未破碎的完整小球藻細(xì)胞以更高的產(chǎn)率制備二氫臥酚e6?？紤]到常規(guī)方 法，本方法能夠成功抽提葉綠素a的結(jié)果令人十分驚訝和意外。
在此使用的術(shù)語"完整小球藻"指未破碎的小球藻，與本領(lǐng)域技術(shù)人員 普遍使用的"活小球藻"具有相同的意思。在通常提取和分離細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)時，會不可避免地伴隨使用細(xì)胞破裂步驟(例如，超聲破碎)。但是，在本發(fā)明中 使用未破碎的小球藻細(xì)胞本身。
本發(fā)明使用未破碎的小球藻細(xì)胞有似乎可能(plausible)的優(yōu)點(diǎn)極好 的葉綠素a提取效率并避免了在細(xì)胞破裂步驟中引起的葉綠素a氧化作用。
本方法中可以使用的有機(jī)溶劑包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種有機(jī)溶 齊U，例如可使用(i)無水或含水的含l 4個碳原子的低級醇(甲醇、乙醇、丙 醇、丁醇等等)，(ii)低級醇和水的混合物，(iii)丙酮，(iv)乙酸乙酯，(v) 氯仿，(vi)醋酸丁酯，(vii)l，3-丁二醇，(viii)核酸和(ix)二乙醚。優(yōu)選地， 在本發(fā)明中使用的有機(jī)溶劑是甲醇或乙醇，更優(yōu)選乙醇。
在本發(fā)明中使用的小球藻可以是所有普通的小球藻，優(yōu)選地，是海水小 球藻。更優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的小球藻是橢圓小球藻(C力7ore7h e77i/ 5"c^'ofes) 、 }斂d、/j、 3E求藻 (6T JoreJZ3 /Z7i/7〃ti5"57'/ag )、 普通7j、 I求藻
C/Jore72s 5^1^msz^/ / ara、普通小球藻(C力7oreJJs raJgarj's)或蛋白核小5求 藻(OJoreWs Arre/7^Voss)，且最優(yōu)選橢圓小球藻。
本發(fā)明另一個方面提供一種制備葉綠素a的方法，包括步驟(a)用30
8oy。的乙醇處理小球藻以從小球藻中除去除了葉綠素a以外的組分；禾n(b)用
90 100%的乙醇處理小球藻以提取葉綠素a，由此獲得葉綠素a提取物。
本發(fā)明的另一個方面還提供一種制備葉綠素a的方法，包括步驟(a) 用80 100。/。的乙醇處理小球藻以提取葉綠素a;和(b)用二噁烷處理該提取物 以促使葉綠素a沉淀。
本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究開發(fā)出了一種從小球藻中高效制備葉綠素a的 方法，而葉綠素a是二氫卟酚e6的前體。因此本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了兩套能夠高產(chǎn) 率和高純度制備葉綠素a的方案。
葉綠素a-方案A
葉綠素a-方案A包括用相對低濃度的乙醇從小球藻中除去除了葉綠素a 以外的組分的步驟和用相對高濃度的乙醇提取葉綠素a的步驟。
按照一種優(yōu)選方案，在本發(fā)明中使用的小球藻是未破碎的小球藻細(xì)胞。 在本發(fā)明中，優(yōu)選使用小球藻細(xì)胞本身，即通過聲波處理的未破碎的細(xì)胞。 通常情況下用有機(jī)溶劑處理細(xì)胞裂解液提取葉綠素a。但是，按照一種優(yōu)選 方案，使用未破碎的小球藻細(xì)胞本身。本發(fā)明使用未破碎的小球藻細(xì)胞有似乎可能的優(yōu)點(diǎn)極好的葉綠素a提取效率并避免了在細(xì)胞破裂步驟中引起的 葉綠素a氧化作用。
按照一種優(yōu)選方案，在本發(fā)明中使用的小球藻是海水小球藻，更優(yōu)選橢
圓小球藻、微小小球藻、普通小球藻、/kscs、 67 A reJ7s zo/jV7gie脂's、 GW。reJJa 5"",t邵力ora、普通小球藻或蛋白核小球藻，且 最優(yōu)選橢圓小球藻。
本發(fā)明的顯著特征之一是在從小球藻中提取葉綠素a之前對小球藻實(shí)行 從小球藻中除去除了葉綠素a以外的組分的預(yù)處理步驟。這些預(yù)處理能使葉 綠素a被高純度(含量百分比)地抽提出來。
其它組分的除去步驟是通過用30 80%的乙醇處理小球藻而實(shí)施的。使 用乙醇的理由是(i)乙醇在除去其它組分時表現(xiàn)出最高的效率，和(ii)在最 終產(chǎn)品二氫卟酚e6用作食品原料時，對人類無害的乙醇被優(yōu)選應(yīng)用。在這些 步驟中使用的乙醇濃度是30 80%。如果使用的乙醇濃度小于30%，則其它組 分的除去效率會變得很低；如果乙醇濃度超過80%，則葉綠素a的提取效率 將銳減，因?yàn)槿~綠素a與其它組分一起被除去了。
優(yōu)選地，在步驟(a)中的乙醇濃度是30 68。/。，較優(yōu)選為50 65%，還更 優(yōu)選為58 62%，最優(yōu)選為大約60%。
步驟(a)進(jìn)行至少一次，優(yōu)選2 7次，更優(yōu)選3 6次，最優(yōu)選5 6次。 在步驟(a)重復(fù)實(shí)施時，通過在乙醇中懸浮小球藻細(xì)胞然后離心收集沉淀來除 去小球藻中的其它組分。
向除去其它組分的預(yù)處理后的小球藻細(xì)胞中，加入90 100%的乙醇以提 取葉綠素a。這時，乙醇濃度小于90%會使提取效率大大降低。
優(yōu)選地，在步驟(b)中的乙醇濃度為95 100%，更優(yōu)選為98 100%，最 優(yōu)選為大約100%。
通過方案A的方法的葉綠素a的收率是5 15%，優(yōu)選為6 12%，更優(yōu)選 為7 9%。收率計算為獲得的葉綠素a的重量占干重為lg的所用的小球藻的 百分比。
通過方案A的方法的葉綠素a的純度范圍為70 90%，優(yōu)選70 85%，更 優(yōu)選72 80%。
葉綠素a-方案B葉綠素a-方案B是使用高濃度的乙醇和二噁烷的方法，依據(jù)該方案，因 為在上述方案A中除去其它組分的步驟被省略，可通過簡單步驟獲得高產(chǎn)率
的葉綠素a。
在葉綠素a-方案B中使用的小球藻的詳細(xì)情況與上述方案A相同。 葉綠素a-方案B的第一步是使用80 100Q/。的乙醇從小球藻中提取葉綠素
a的步驟。這時，乙醇濃度小于80%會使提取效率大大降低。
優(yōu)選地，在步驟(a)中的乙醇濃度為90 100%，更優(yōu)選為98 100%，最
優(yōu)選大約100%。
葉綠素a-方案B的第二步是使用二噁垸沉淀葉綠素a的步驟。在這步中， 高純度固相葉綠素a可通過沉淀法獲得。1L葉綠素a提取物中使用的二噁烷 的量優(yōu)選為50 250ml，更優(yōu)選100 200ml，且最優(yōu)選120 160ml ，但并不 局限于此。在這種情況下，使用的二噁烷為100%。
按照一種優(yōu)選方案，該步驟是在加入二噁垸后加水到提取物中。1L葉綠 素a提取物中加入的水量優(yōu)選為50 250ml，更優(yōu)選100 200ml，且最優(yōu)選 120 160nil，但并不局限于此。
按照一種優(yōu)選方案，該方法進(jìn)一步包括在步驟(b)后在低于-l(TC下冷卻 步驟(b)的產(chǎn)物以促使葉綠素a更好沉淀的步驟。更優(yōu)選地，溫度范圍為 -15°C -30°C，最優(yōu)選從-18°C -25°C。
通過方案B的方法的葉綠素a的收率為3 15%，優(yōu)選為4 10%，更優(yōu)選 為4 6%。葉綠素a的純度為70 98%，優(yōu)選為75 95，更優(yōu)選為80 90%。
本發(fā)明的另一個方面提供一種制備二氫卟酚e6的方法，包括步驟(a) 將用上述方法獲得的葉綠素a用酸處理以從葉綠素a中除去Mg2+，藉此獲得 脫鎂葉綠素a;和(b)用堿處理該脫鎂葉綠素a以獲得二氫卟酚e6。
本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究開發(fā)出一種從屬于綠藻類的小球藻中高收率 制備二氫卟酚e6的方法，該方法相對簡單并能用于大量生產(chǎn)。因此，本發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)了制備二氫卟酚e6的高效方案。
本發(fā)明的制備二氫葉酚e6的方法是使用葉綠素a制備二氫卟酚e6的步 驟，而該葉綠素a是通過使用所述的制備葉綠素a的兩個方法來獲得的。
更具體地說，在使用通過葉綠素a-方案A制備的葉綠素a作為原材料的 情況下，本發(fā)明包括步驟(a)用30 68%的乙醇處理小球藻以除去小球藻中 的除了葉綠素a以外的組分；(b)用80 100%的乙醇處理小球藻以提取葉綠素a，藉此獲得葉綠素a提取物；(c)用酸處理該葉綠素a以從葉綠素a中除 去Mg2+，從而獲得脫鎂葉綠素a;禾n(d)用堿處理該脫鎂葉綠素a以獲得二氫 口卜酚e6。更具體地說，在使用通過葉綠素a-方案B制備的葉綠素a作為原材料的 情況下，本發(fā)明包括步驟(a)用80 100%的乙醇處理小球藻以提取葉綠素a; (b)向該提取物中加入二噁烷以促使葉綠素a沉淀；(c)用酸處理葉綠素a以 除去葉綠素a中的Mg2+，從而獲得脫鎂葉綠素a;禾B(d)用堿處理脫鎂葉綠素 a以獲得二氫卟酚e6。同時，該制備二氫卟酚e6的方法包括使用酸制備脫鎂葉綠素a的步驟和 使用堿制備二氫卟酚e6的步驟，更具體地說可以被分為兩種典型方案。二氫卟酚e6-方案A二氫卟酚e6-方案A的實(shí)施是在乙醇溶劑存在下從脫鎂葉綠素a制備二 氫葉酚e6。按照二氫卟酚e6-方案A，該方法用酸處理葉綠素a以除去葉綠素a中的 Mg2+，從而獲得脫鎂葉綠素a。葉綠素a和脫鎂葉綠素a通過以下分子式1和 2表TK。當(dāng)用酸處理葉綠素a時，M,從分子式1中除去，導(dǎo)致產(chǎn)生脫鎂葉綠素a。 優(yōu)選步驟(a)為通過用酸處理葉綠素a提取物以便使葉綠素a提取物的pH調(diào) 整至1 5。這時，pH高于5會使Mg2+的提取效率大大降低。更優(yōu)選地，在步 驟(a)中反應(yīng)體系的pH為1 3，最優(yōu)選2 3。在步驟(a)中使用的酸可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種酸，優(yōu)選所述酸 為無機(jī)酸，更優(yōu)選硫酸和鹽酸，且最優(yōu)選鹽酸。以下分子式3所表示的二氫卟酚e6為通過用堿處理上述步驟制備的脫鎂 葉綠素a制得的終產(chǎn)物。<formula>formula see original document page 11</formula>(3)按照一種優(yōu)選方案，步驟(b)是用堿溶液處理脫鎂葉綠素a，從而調(diào)整至 pH 11 16，更優(yōu)選pH 13 14。在步驟(b)中使用的堿可以為本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知的各種堿，優(yōu)選為無機(jī)堿，且最優(yōu)選NaOH。按照一種優(yōu)選方案，制得二氫卟酚e6的步驟(b)是在乙醇溶劑存在下進(jìn) 行的。按照一種優(yōu)選方案，通過冷藏保存促使脫鎂葉綠素a沉淀。 脫鎂葉綠素a通常以沉淀物的形式獲得。當(dāng)使用乙醇溶劑制備二氫卟酚 e6時，脫鎂葉綠素a的沉淀物不直接溶解于乙醇溶劑。因此，在乙醇溶劑中 溶解脫鎂葉綠素a沉淀之前，優(yōu)選用丙酮溶解脫鎂葉綠素a沉淀。然后，從 溶解產(chǎn)物的丙酮中除去丙酮(例如通過蒸發(fā))并向脫鎂葉綠素a中加入乙醇 以溶解脫鎂葉綠素a，接著使該溶解的脫鎂葉綠素a與堿反應(yīng)以獲得二氫卟 酚e6。按照一種優(yōu)選方案，二氫卟酚e6-方案A包括步驟(a)用酸處理通過上 述方法獲得的葉綠素a以除去葉綠素a中的Mg2+，從而獲得脫鎂葉綠素a沉 淀；(b-l)向該脫鎂葉綠素a沉淀中加入丙酮以獲得脫鎂葉綠素a溶液，然后 除去丙酮溶劑；(b-2)向殘留的脫鎂葉綠素a中加入乙醇以獲得脫鎂葉綠素a 溶液；和(b_3)用堿處理該脫鎂葉綠素a溶液以獲得二氫卟酚e6。按照一種優(yōu)選方案，該方法進(jìn)一步包括在步驟(b)后中和步驟(b)的產(chǎn)物 的步驟。這時，該產(chǎn)物可用各種堿中和(例如，HC1)。在生成二氫卟酚e6之后，可用鹽處理二氫卟酚e6以具有適合的鹽形式。 例如，通過用NaHC03或朋40)3處理二氫卟酚e6，使二氫卟酚e6的-C00H基與 鈉或銨結(jié)合，從而獲得二氫卟酚e6鹽。由二氫卟酚e6-方案A獲得的二氫卟酚e6的純度為80 99%，優(yōu)選85 99%，更優(yōu)選93 98%。在使用小球藻作為原材料時，二氫卟酚e6的收率范 圍為3 10%，優(yōu)選3 8%，更優(yōu)選4 6%。收率計算為獲得的二氫卟酚e6 重量占干重為lg的所用小球藻的百分比。二氫卟酚e6-方案B二氫卟酚e6-方案B在丙酮溶劑存在下從脫鎂葉綠素a中制備二氫卟酚e6。在二氫卟酚e6-方案B中步驟(a)的細(xì)節(jié)與上述的二氫卟酚e6-方案A相 同。此外，在二氫卟酚e6-方案B中的步驟(b)除了是在有丙酮溶劑存在下用 堿處理脫鎂葉綠素a以外，與二氫卟酚e6-方案A相同。按照二氫卟酚e6-方案B，在步驟(a)中形成的脫鎂葉綠素a沉淀溶解于丙 酮溶劑，而該脫鎂葉綠素a溶液直接用堿處理，從而制備二氫卟酚e6。按照一種優(yōu)選方案，二氫卟酚e6-方案B包括步驟(a)用酸處理通過上 述方法獲得的葉綠素a以除去葉綠素a中的Mg2+，從而獲得脫鎂葉綠素a沉 淀；(b-l)向該脫鎂葉綠素a沉淀中加入丙酮溶劑以獲得脫鎂葉綠素a溶液； 和(b-2)用堿處理該脫鎂葉綠素a溶液以獲得二氫卟酚e6。按照二氫卟酚e6-方案B，在使用NaOH作為堿的情況下，最終制得的二 氫卟酚e6具有鈉鹽形式。按照二氫卟酚e6-方案A，為了獲得二氫卟酚e6 鹽，必須進(jìn)行單獨(dú)處理，但方案B可以省略該步驟。二氫卟酚e6-方案B通過簡單的步驟制備二氫卟酚e6，相對方案A是更 為有效的方法。此外，盡管二氫卟酚e6-方案B由比方案A更簡單的步驟組 成，但最后制備的二氫卟酚e6的純度比方案A的高很多。通過二氫卟酚e6-方案B制得的二氫卟酚e6的純度為90 99. 99%，優(yōu)選 92 99. 95%,更優(yōu)選95 99. 90%，且最優(yōu)選99. 0 99. 90%。在使用小球藻作 為原材料的情況下，二氫葉酚e6的收率為2 8%，優(yōu)選3 8%，且更優(yōu)選3 5%。本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)歸納如下(i) 本發(fā)明通過使用未破碎的小球藻細(xì)胞本身提取葉綠素a，從而從該葉 綠素a提取物中制備二氫卟酚e6。(ii) 在本發(fā)明中通過對選取的小球藻細(xì)胞本身進(jìn)行預(yù)處理步驟可獲得高 含量的葉綠素a。(iii) 本方法按照相對簡單的步驟進(jìn)行，并且適合二氫卟酚e6的大規(guī)模 生產(chǎn)。


圖la lc為顯示使用破碎的小球藻制得的葉綠素a的乙醇提取結(jié)果的 HPLC(高壓液相色譜法)色譜圖。圖la lc分別顯示提取30分鐘、90分鐘和 3小時的結(jié)果。箭頭處表示葉綠素a峰。圖ld lf為顯示使用未破碎的完整小球藻制得的葉綠素a的乙醇提取結(jié) 果的HPLC色譜圖。圖ld lf分別顯示提取30分鐘、90分鐘和3小時的結(jié) 果。箭頭處表示葉綠素a峰。圖2a為分析包含在未破碎的完整小球藻中的組分的HPLC色譜圖。箭頭 處表示葉綠素a峰。圖2b 2g表示通過用60。/。的乙醇洗滌小球藻去除除了葉綠素a以外的組 分的HPLC分析結(jié)果。圖2b 2g顯示用60%的乙醇進(jìn)行1 6次重復(fù)洗滌步驟 的結(jié)果分析。HPLC分析是針對洗漆產(chǎn)生的上清液的結(jié)果。圖2h顯示用100%的乙醇提取葉綠素a的HPLC分析結(jié)果。箭頭處表示葉 綠素a峰。圖2i顯示按照使用二噁烷制備葉綠素a的方法制備的葉綠素a的HPLC 色譜圖。箭頭處表示葉綠素a峰。圖3a顯示按照本方法生成的脫鎂葉綠素a的HPLC色譜圖。箭頭處表示 脫鎂葉綠素a峰。圖3b顯示按照本方法方案A制備的二氫卟酚e6的HPLC色譜圖。箭頭處 表示二氫葉酚e6峰。圖3c顯示按照本方法方案B制備的二氫卟酚e6的HPLC色譜圖。箭頭處 表示二氫葉酚e6峰?，F(xiàn)將通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是， 這些實(shí)施例用來更加具體說明，而如所附權(quán)利要求書中顯示的本發(fā)明的范圍 不局限于或不受限于這些實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例l:適合的小球藻的選擇準(zhǔn)備用超聲處理破裂的小球藻和用超聲處理但未破碎的完整小球藻[海 水小球藻和橢圓小球藻，Chlorland co， Ltd]兩種樣本作為最后制得二氫卟 酚e6的原材料。然后，分析用超聲處理破裂的小球藻和完整小球藻的葉綠素 a及其他組分的含量。將100ml乙醇分別加進(jìn)10g用超聲處理破裂的小球藻 和海水小球藻中，接著攪拌30分鐘、90分鐘、3小時和12小時，從而過濾 獲得提取溶液。使用HPLC(高壓液相色譜法)分析提取溶液，并且HPLC使用 具有SPD-M10AVP柱的HPLC系統(tǒng)(Dong-il Shimadzu Corp.)進(jìn)行。進(jìn)樣體 積設(shè)為20n 1且流速為lml/分鐘。Fluka提供的商品化的葉綠素a作為標(biāo)準(zhǔn)。 在圖la lf中，觀察到葉綠素a峰的大概保留時間在19. 5分鐘。如圖la lf所示，在使用完整小球藻的情況下，可獲得的葉綠素a會比 使用超聲破碎的小球藻多大約20倍。因此，我們發(fā)現(xiàn)由于具有更高的葉綠素 a收率，使用完整小球藻可以比使用超聲破碎的小球藻獲更大量的二氫卟酚 e6。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)使用完整小球藻自身的乙醇提取顯示出比使用超聲 破碎的小球藻的乙醇提取更加優(yōu)異的葉綠素a提取率。鑒于此，本發(fā)明的方 法十分重要，因?yàn)樗哂兴坪蹩赡艿膬?yōu)點(diǎn):極好的葉綠素a提取效率并且避免 了在超聲破碎步驟中引起的葉綠素a氧化作用。實(shí)施例2:從葉綠素a中制備二氫卟酚e6方案^fi: AV、承嚴(yán)0餘去餘7^綠.素S以^游真g資分首先，為了除去從Chlorland co, Ltd購買的海水小球藻(橢圓小球藻) 中的鹽份，用蒸餾水洗滌小球藻后在5000rpm下離心收集沉淀。沉淀物再用 蒸餾水懸浮并再次離心。用蒸餾水洗滌五次之后取出少量，使用HPLC(高壓 液相色譜法)分析葉綠素a和其他組分的含量。HPLC是在具有SPD-M10AVP柱 的HPLC系統(tǒng)(Dong-il Shimadzu Corp.)上進(jìn)行的，且進(jìn)樣體積設(shè)為20 n 1 ， 流速為lml/分鐘。購自于Fluka的商品化的葉綠素a作為標(biāo)準(zhǔn)。HPLC結(jié)果示 于圖2a中。如圖2a所示，觀察到葉綠素a峰的保留時間大約在9.7分鐘，而其它組 分峰的保留時間在2. 5 7. 5分鐘。100g除去海水的小球藻(非裂解的完整小球藻細(xì)胞)用300ml 60%的乙醇 洗滌，然后5000rpm離心收集沉淀，從而除去保留時間在2. 5 7. 5分鐘的其 它組分。這些使用乙醇洗滌的步驟共進(jìn)行六次。圖2b 2g為乙醇洗滌中離心 產(chǎn)生的上清液的HPLC結(jié)果。如圖2b 2g所示，可看到保留時間為2. 5 7. 5分鐘的其它組分被60% 的乙醇的洗滌步驟大量除去。同時，在洗滌步驟使用的乙醇濃度超過80%的情況下，葉綠素a會被抽 提出來并且其它組分不能除去。此外，在洗滌步驟使用濃度為20%、 40%和50% 的乙醇溶液的情況下，與使用60%的乙醇相比，除去其它組分的效果都不好。因此，這些結(jié)果表明60%的乙醇為最優(yōu)選的洗滌液。即60%的乙醇作為洗 滌液有效地從小球藻細(xì)胞中抽提了除了葉綠素a以外的組分，導(dǎo)致了在洗滌 后的小球藻細(xì)胞中具有比較高的葉綠素a含量。^ U餘去某g邀分游V、朝麥屮碧欲/^綠f a在向lOOg除去其它組分的小球藻中加入1L 100%的乙醇之后，攪拌3小 時抽提葉綠素a。用于提取步驟的小球藻細(xì)胞不用聲波裂解而使用它們本身 未破碎的形式。雖然抽提葉綠素a通常用有機(jī)溶劑處理細(xì)胞裂解液，但本實(shí) 施例使用小球藻細(xì)胞本身而不是它們的裂解液。抽提結(jié)果示于圖2h中。如圖2h所示，觀察到葉綠素a峰的保留時間大約在8. 4分鐘，而圖2a 所示的被大量除去的其它組分的保留時間為2. 5 7. 5分鐘。而且，我們發(fā)現(xiàn) 在HPLC色譜圖中葉綠素a的含量(即純度)為76.92。/。。同時，方案A的葉綠 素a的收率為7.89%。方，首先，為了除去從Chlorland co， Ltd購買的海水小球藻中的鹽份，小 球藻用蒸餾水洗滌然后5000rpm離心收集沉淀。用蒸餾水再次懸浮沉淀物然 后再次離心收集。用蒸餾水洗滌五次后取出少量，用HPLC(高壓液相色譜法) 分析葉綠素a和其它組分的含量。HPLC在具有SPD-M10AVP柱的HPLC系統(tǒng) (Dong-ilShimadzu Corp.)上進(jìn)行，且進(jìn)樣體積設(shè)為20 u 1，流速lml/分鐘。 購于Fluka的商品化的葉綠素a作為標(biāo)準(zhǔn)。用500ml的100%的乙醇洗滌lOOg 除去海水的小球藻(非裂解的完整小球藻細(xì)胞)，然后5000r"pm離心沉淀，接著僅取葉綠素抽提溶液的上清液過濾。加入70ml的二噁垸和70ml的蒸餾水 到葉綠素提取物中，_201:冷藏超過5小時以促進(jìn)沉淀作用。然后，濾過沉淀 物，用水洗凈，從而獲得葉綠素a。之后，為了制備后續(xù)的二氫卟酚e6，在 100%的乙醇中溶解沉淀物。如圖2i所示，觀察到葉綠素a的主峰的保留時間大約在4. 3分鐘，而其 它的峰很少見。而且可以從HPLC色譜圖中看到葉綠素a的含量(即純度)為 84.93%。同時，方案B的葉綠素a的收率為4.26Q/0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在使用二噁垸的情況下，可通過簡單過程獲得高產(chǎn)率的 葉綠素a。實(shí)施例3:從葉綠素a制備二氫口卜酚e6 實(shí)麟.'應(yīng)斷氛素s微成在每1L實(shí)施例2的方案A中獲得的含有葉綠素a的乙醇提取物中，加入 5 10ml 1NHC1以調(diào)節(jié)提取物至pH 2 3，然后攪拌3小時除去葉綠素a中 的Mg"，從而獲得脫鎂葉綠素a(圖3a)。然后，黑色的脫鎂葉綠素A溶液在 -23X:冷藏保存3 6小時進(jìn)行沉淀，接著過濾。實(shí)蕭",二富輔W微成方,^用丙酮溶解實(shí)施例3-1的脫鎂葉綠素a沉淀之后，蒸發(fā)除去丙酮。用1L 的100%的乙醇溶解脫鎂葉綠素a，將含有脫鎂葉綠素a的過濾后溶液加入5 10ml的1NNaOH以調(diào)整至pH 13 14，攪拌12小時以便從脫鎂葉綠素a生成 二氫卟酚e6。之后，加入1N HCl到產(chǎn)物中以中和生成的二氫卟酚e6，然后 過濾，接著完全除去乙醇(圖3b)。如圖3b的曲線圖所示，觀察到二氫卟酚 e6峰的保留時間在大約4.987分鐘，且發(fā)現(xiàn)二氫卟酚e6的含量(純度)為 97. 66%。最后從100g小球藻中獲得48. 6g 二氫卟酚e6(收率4. 86%)。此外，為了制備二氫卟酚e6的鹽形式，將3當(dāng)量的船03或朋03溶解于冰水中，加入二氫卟酚e6，然后冷凍干燥除去水份獲得二氫卟酚e6的鹽形式。 方彭將實(shí)施例3-1的脫鎂葉綠素a沉淀溶解于1L丙酮中，加入5 10ml的 1NNaOH調(diào)整至pH 13 14，然后攪拌12小時由脫鎂葉綠素a生成二氫葉酚e6。過濾收集生成的二氫卟酚e6Na鹽沉淀之后，依次用丙酮和核酸洗滌，然 后溶解于少量的水中。用可溶的膜濾器過濾二氫B卜酚e6溶液后，用冷凍干燥 法獲得最終的二氫卟酚e6Na鹽(圖3c)。最終的二氫卟酚e6Na鹽為粉狀。處 理10L的小球藻(離心之后1 1. 5kg)，最終Na鹽二氫卟酚e6的收率為2. 5 3. 0%，即25 30g。此外，二氫卩卜酚e6的純度為99. 83%。按照方案B， 二氫卟酚e6Na鹽是在二氫卟酚e6生產(chǎn)步驟中用NaOH處理 直接形成的。可見該方案與方案A有很大的差異。本發(fā)明使用未破碎的小球藻細(xì)胞本身提取葉綠素a，從而從該葉綠素a 提取物中制備二氫卟酚e6。通過對本發(fā)明中選擇的小球藻細(xì)胞本身進(jìn)行預(yù)處 理可獲得高含量的葉綠素a。該方法按照相對簡單的步驟進(jìn)行，并適合二氫 卟酚e6的大規(guī)模生產(chǎn)。已描述了本發(fā)明的優(yōu)選方案，應(yīng)當(dāng)理解落入本發(fā)明構(gòu)思內(nèi)的改變和修飾 對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求 及其等同形式確定。
權(quán)利要求
1、一種制備葉綠素a的方法，其包括用有機(jī)溶劑處理未破碎的完整小球藻的步驟。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述小球藻是海水小球藻。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述有機(jī)溶劑是乙醇。
4、 一種制備葉綠素a的方法，其包括以下步驟(a) 用30 8(Fo的乙醇處理小球藻以從小球藻中除去除了葉綠素a以外的 組分；和(b) 用90 100%的乙醇處理該小球藻以提取葉綠素a，由此獲得葉綠素a 提取物。
5、 一種制備葉綠素a的方法，其包括以下步驟(a) 用80 100。/。的乙醇處理小球藻以提取葉綠素a;和(b) 用二噁烷處理該提取物以促使葉綠素a沉淀。
6、 一種制備二氫卟酚e6的方法，其包括以下步驟(a) 用酸處理按照權(quán)利要求4或5所述的方法獲得的葉綠素a以除去葉綠 素a中的Mg 由此獲得脫鎂葉綠素a;禾口(b) 用堿處理該脫鎂葉綠素a以獲得二氫卟酚e6。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，所述小球藻是未破碎的完整 細(xì)胞。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，所述小球藻是海水小球藻。
9、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，步驟(a)中的乙醇濃度是50 65%。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，步驟(a)中的乙醇濃度是58 620/0。
11、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，步驟(a)被重復(fù)進(jìn)行3 6次。
12、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，步驟(b)中的乙醇濃度是98 100%。
13、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟(a)中的乙醇濃度是90 100%。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，步驟(a)中的乙醇濃度是98 100%。
15、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟(b)是通過在加入二噁烷之 后向提取物中加水而進(jìn)行。
16、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，該方法進(jìn)一步包括在步驟(b) 后在低于-l(TC下冷卻步驟(b)的產(chǎn)物的步驟。
17、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，葉綠素a的收率是7 9%，且 葉綠素a的純度是72 80%。
18、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，葉綠素a的收率是4 6%，且 葉綠素a的純度是80 90%。
19、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，步驟(a)是通過用酸處理葉綠素 a提取物以調(diào)整該葉綠素a提取物的pH值至1 5而進(jìn)行。
20、 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，pH值是l 3。
21、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，步驟(b)是通過用堿處理脫鎂葉 綠素a以調(diào)整葉綠素a提取物的pH值至11 16而進(jìn)行。
22、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，pH值是13 14。
23、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，該方法進(jìn)一步包括在步驟(b) 之后中和步驟(b)的產(chǎn)物的步驟。
24、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，步驟(b)是在乙醇溶劑存在下進(jìn) 行的。
25、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，步驟(b)是在丙酮溶劑存在下進(jìn) 行的。
26、 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，該方法包括以下步驟(a)用 酸處理按照權(quán)利要求4或5所述的方法獲得的葉綠素a以除去葉綠素a中的 Mg2+，由此獲得脫鎂葉綠素a的沉淀物；(b-l)向該脫鎂葉綠素a的沉淀物中 加入丙酮溶劑以獲得脫鎂葉綠素a的溶液；和(b-2)用堿處理該脫鎂葉綠素a 溶液以獲得二氫卟酚e6。
27、 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，二氫卟酚e6的純度是93 98%， 且二氫卟酚e6的收率是4 6°/0。
28、根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，二氫卟酚e6的純度是95 99.9%，且二氫卟酚e6的收率是3 50/0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備葉綠素a和二氫卟酚e6的方法。本發(fā)明使用未破碎的小球藻細(xì)胞本身提取葉綠素a，從而從葉綠素a提取物中制備二氫卟酚e6。通過對本發(fā)明選取的小球藻細(xì)胞本身進(jìn)行預(yù)處理步驟可獲得高含量的葉綠素a。本方法按照相對簡單的步驟實(shí)施，并且適合二氫卟酚e6的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/12GK101595209SQ200780040924
公開日2009年12月2日 申請日期2007年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月3日
發(fā)明者樸智鏞, 金孝俊, 金容哲 申請人:光州科學(xué)技術(shù)院;Ls制藥有限公司