專利名稱：：酯解毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了猴丁酰膽堿酯酶(RhBchE)的分離的DNA分子；人丁酰膽堿酯酶(HuBchE)突變體的分離的DNA分子；以HuBchE和RhBchE為特征的突變庫；含有RhBchE和修飾的HuBchE的DNA分子的表達(dá)載體；基于腺病毒(AD)的丁酰膽堿酯酶(BchE)的高水平表達(dá)系統(tǒng)；模擬OP神經(jīng)毒劑結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷酸酯(OP)模型化合物；以及OP模型化合物在獲得用于陣列式生物探測器的抗體中的用途。本發(fā)明提供了對(duì)包括有機(jī)磷酸酯神經(jīng)毒劑在內(nèi)的無機(jī)酯或有機(jī)酯進(jìn)行解毒的一般方法，以及在生物樣本和環(huán)境樣本中檢測OP制劑的診斷方法。
背景技術(shù)：
：藥物濫用是主要的公共健康問題之一。超過3百萬的美國人是可卡因的重度使用者，且有同等數(shù)量的美國人為可卡因的輕度濫用者。每年約有100,000例與可卡因相關(guān)的急診。對(duì)于可卡因過量服用的心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見并發(fā)癥(可導(dǎo)致心血管急癥和全身性癲癇)，目前還沒有有效的治療方法?？煽ㄒ蚴强捎刹捎梅肿舆M(jìn)化方法演化的酯酶以治療方式進(jìn)行解毒的有機(jī)酯的一個(gè)7示例?？梢砸灾委煼绞竭M(jìn)行解毒的無機(jī)酯的一個(gè)示例為有機(jī)磷酸酯(OP)神經(jīng)毒女,lA:\山女,l々7、主Al罝齊^_AAAE1.4tJj蟲*ll4"^Rl力；文jt匕^p人VI'J力、—,rjoi.干；;工"tgr乂rj母》jt伊，j-人"jj~w/x-。人'i!、乂v:7C/主，i^J/Vlb口物能夠阻斷多種重要的酶。特別地，絲氨酸酯酶和蛋白酶可被OP神經(jīng)毒劑快速和不可逆地抑制。BchE是絲氨酸酯酶家族的一種可溶性血清糖蛋白酶。該酶的生理功能尚不清楚。但，數(shù)十年來人們已知BchE可清除低劑量的OP和氨基甲酸酯殺蟲劑并保護(hù)人們免受這些有毒物的毒性作用。BchE還可作為OP中毒的早期檢測標(biāo)記，因?yàn)楸┞队贠P可降低該血清酶的活性。BchE還是可卡因和人體內(nèi)的其它酯的代謝和解毒的主要酶。BchE可將可卡因代謝成為無藥理活性化合物，例如芽子堿曱酯和安息香酸。該酶在可卡因解毒和OP中毒處理中具有極大的潛力。理論上，BchE代表了酶補(bǔ)充療法的理想的酶它不需要輔因子，可溶，并在血漿的pH下具有高效作用；并且它的水解產(chǎn)物無毒。純化的BchE具有數(shù)年的穩(wěn)定性，并在外源性施用后具有相對(duì)較長的半衰期。HuBchE的PEG化顯著提高了它的穩(wěn)定性和半衰期。更重要的是，純化的HuBchE在歐洲已數(shù)十年被安全地用于治療琥珀酰膽堿-誘導(dǎo)的呼吸暫停和OP中毒的患者。不考慮其理論上的潛力，HuBchE對(duì)OP或可卡因水解均不是非常有效的酶。酶與OP的不可逆結(jié)合將該酶的作用限定為清除劑，而非催化劑。該酶對(duì)天然(-)-可卡因的水解比對(duì)(+)-可卡因的水解慢2000倍。通過蛋白質(zhì)工程得到的合理設(shè)計(jì)的突變體顯示該酶可以被轉(zhuǎn)化為OP水解酶(Millard等人，1995以及Millard等人，1998，描述的G117H和G117H/E197Q突變體)，以及可卡因水解酶(Pancook等人，2003以及Gao等人，2005，描述的8A328W/Y332M/S287G/F227A突變體)。盡管突變研究提示提高該酶的水解活性是可行的，到目前為止所報(bào)道的突變體親和力較低且轉(zhuǎn)換(turnover)較慢，A'、,JJ*0甘，丄丄曰古TT，，DaLT7A/乂t4i3、、工1J>A4艮t卄OD3—"^T》ffl乂逸乂1/頭乂旦》及"Jk乂々反直君:^i^疋同。丄iuunuj/wy'i'(t'j^j尺/t7'j工/;/^^T^jww丄/「jrq|，ilj效率提供了廣闊的空間。然而，為了顯著提高OP和/或可卡因水解活性，可能需要對(duì)接近和/或遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的多個(gè)殘基的HuBchE突變進(jìn)行組合。由于伴隨OP酶相互作用的復(fù)雜的多步驟催化活動(dòng)以及對(duì)(-)-可卡因水解的嚴(yán)重立體位阻，不容易通過分子結(jié)構(gòu)分析來預(yù)測該些突變的組合。將分子進(jìn)化技術(shù)用于BchE,對(duì)于提高針對(duì)OP神經(jīng)毒劑和可卡因的催化活性將獲得令人期待的結(jié)果。目前對(duì)于急性O(shè)P神經(jīng)毒劑中毒的治療通常包括聯(lián)合施用膽堿酯酶復(fù)活劑(坊)，毒蕈堿的受體拮抗劑(阿托品)以及抗驚厥劑(地西泮)。這些治療僅以竟?fàn)幏绞疆a(chǎn)生作用，其作用不夠充分，因?yàn)椴荒茴A(yù)防神經(jīng)元性腦損傷和失能。在軍隊(duì)中引入了化學(xué)預(yù)防性治療，包括單獨(dú)用溴化吡啶斯的明、吡啶斯的明聯(lián)合抗膽堿性藥物、以及經(jīng)皮膚施用HI-6(Bajgar，2004)。由于這些治療可卡因毒性和OP中毒的方法目的在于治療癥狀而非病因(即，神經(jīng)毒劑和可卡因)，一種具有吸引力的替代治療方法為在損傷發(fā)生前采用催化劑或清除劑直接去除神經(jīng)毒劑或可卡因。該治療的根本之處在于診斷存在的神經(jīng)毒劑或OP的數(shù)量和種類。用高度靈敏和低價(jià)的方法來檢測OP神經(jīng)毒劑暴露的生物標(biāo)記便顯得至關(guān)重要，從而可以聯(lián)合藥物保護(hù)來對(duì)抗化學(xué)損傷和其它OP危害。由于在損傷發(fā)生前在動(dòng)物體內(nèi)檢測神經(jīng)毒劑生物標(biāo)記的現(xiàn)有方法較為昂貴和繁瑣，因此現(xiàn)在的挑戰(zhàn)是開發(fā)可以在現(xiàn)場進(jìn)行并且有力的系統(tǒng)。本發(fā)明通過提供選擇性方法來檢測OP神經(jīng)毒劑的生物標(biāo)記解決了這一問題，該方法可通過使用便攜式自動(dòng)化多分析陣列式生物探測器得以便捷地和廉價(jià)地開展。陣列形式可提供眾多優(yōu)點(diǎn)，例如可以在一個(gè)樣本上同時(shí)分析多個(gè)靶點(diǎn)。此外，它能夠在每個(gè)探測表面包含陽性和陰性對(duì)照，這比在單獨(dú)的探測表面上平行設(shè)置對(duì)照更為可靠。DNA陣列技術(shù)已將這種努力帶入實(shí)驗(yàn)室儀器并帶來兩種新型的采用光波導(dǎo)的系統(tǒng)，包括由Zeptosens(Pawlak等人，2002)和Illumina(EpsteinandWalt，2003)投入市場的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可容納數(shù)千個(gè)捕獲分子，并具有高度的敏感性。然而，它們的設(shè)計(jì)僅針對(duì)受過高級(jí)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室人員的使用，且不能自動(dòng)運(yùn)行或用于現(xiàn)場的應(yīng)用。本發(fā)明描述的陣列式生物探測器結(jié)合了光波導(dǎo)技術(shù)和同時(shí)檢測多個(gè)樣本的能力，從而可以針對(duì)多個(gè)把點(diǎn)，并具有便攜性和自動(dòng)化。該生物探測器基于平面波導(dǎo)，且具有充分的表面面積，可以容納多個(gè)小型(mm、探測區(qū)域。該波導(dǎo)是一種改良的顯微鏡玻片，它通過635nm二極管激光和線發(fā)生器進(jìn)行照射，光線投射在近端。該玻片的前三分之二提供了模式混合區(qū)，由此光線可相對(duì)均勻地分布在接近遠(yuǎn)端的2.4cm2探測區(qū)域(Feldstein等人，1999)。在常規(guī)條件下，在探測區(qū)域內(nèi)可實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射并形成漸逝場。漸逝光激發(fā)探測區(qū)域中結(jié)合的熒光團(tuán)，并采用Peltier-cooledCCD相機(jī)在90°測量發(fā)射的熒光(Wadkins等人，1997;Golden等人，2003)。陣列中波導(dǎo)表面的熒光位置揭示了所檢測耙標(biāo)的類別。該系統(tǒng)已經(jīng)投入市場。為了從樣本捕獲耙標(biāo)，可在點(diǎn)陣列中波導(dǎo)表面固定可以結(jié)合靶標(biāo)的抗體或其它分子(Rowe等人，1999;Delehanty等人，2002)。在陣列中可同時(shí)包含陽性和陰性對(duì)照以防止假陽性或假陰性響應(yīng)(Ligler等人，2003)。此外，多通道和探測點(diǎn)陣列的聯(lián)合使用可支持同時(shí)分析多個(gè)樣本?？梢詷?gòu)建檢測方法來檢測大分子和微生物(夾心檢測)或者小分子(竟?fàn)幮詸z測，置換檢測)(Sapsford10的干擾，從而無需在分析前將靶標(biāo)從復(fù)雜的樣本中分離(Sapsford等人，2001;Taitt等人，2004)。與量靈敏性探測器(例如表面等離子共振(SPR)、共振鏡或干涉系統(tǒng)(Homola等人，2002;Kinning和Edwards,2002;Campbell和McCloskey，2002，Barzen等人，2002))不同，基于焚光的陣列式生物探測器需要熒光團(tuán)標(biāo)記的分子進(jìn)行信號(hào)生成。這使得該檢測相對(duì)地不受自樣本組分的非特異性吸附干擾(Ligler等人，2003;Rowe等人，1999;Sapsford等人，2001;Taitt等人，2004)。陣列式生物探測器能在復(fù)雜樣本中檢測生物標(biāo)記，而需要很少或是不需要樣本分離，這已通過采用非自動(dòng)化樣品設(shè)備得到了體現(xiàn)。本發(fā)明在此采用這種自動(dòng)化系統(tǒng)來確定該系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場檢測神經(jīng)毒劑相關(guān)的或其它生物標(biāo)記的有效程度。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了恒河猴丁酰膽堿酯酶(RhBchE)(獼猴)的分離的DNA分子。另一方面，本發(fā)明提供了人丁酰膽堿酯酶(HuBchE)及其突變體的分離的DNA分子。另一方面，本發(fā)明提供了以HuBchE和RhBchE為特征的突變庫，以及在載體中制作BchE突變庫的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了通過將BchE突變庫包裝進(jìn)入載體顆粒，以該載4本感染細(xì)胞的方法。在另一方面，本方面提供了包含RhBchE和修飾的HuBchE的DNA分子ii的表達(dá)載體；以及基于腺病毒(AD)的BchE的高水平表達(dá)系統(tǒng)。在另一方面，本發(fā)明提供了模擬例如VX、塔崩、GF、梭曼和沙林等OP神經(jīng)氣體結(jié)構(gòu)的外消旋和對(duì)映體純OP模型化合物。另一方面，本發(fā)明提供了在基于細(xì)胞的功能篩選檢測中使用OP模型化合物，來鑒定由BchE突變庫表達(dá)的耐OP和/或催化性BchE變體的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了使用OP模型化合物獲取可用于陣列式生物探測器的抗體的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了在生物樣本中檢測OP物質(zhì)的診斷方法。在另一方面，本發(fā)明提供了針對(duì)BchE活性的篩選OP模型化合物的方法，該方法通過將BchE與該化合物孵育，并進(jìn)一步檢測BchE的抑制作為該化合物活性的指示。在另一方面，本發(fā)明提供了在被感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測BchE表達(dá)的方法。另一方面，本發(fā)明^是供了通過原核或真核細(xì)胞在OP化合物或神經(jīng)毒劑的存在下表達(dá)BchE來檢測BchE的方法。另一方面，本發(fā)明提供了基于陣列的方法，該方法選擇性地檢測神經(jīng)毒劑和其它OP。附圖簡述圖1A顯示RhBchE轉(zhuǎn)染。將CHO細(xì)胞在6孔板中接種過夜。參照生產(chǎn)商描述通過Lipofectamine將含有背景載體(N.C.)、pRC-CMV-HuBchE(hBchE)、pGS-RhBchE(GSl和GS2)以及pRC-CMV-RhBchE(RC1和RC2)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和48小時(shí)采集培養(yǎng)基，并采用以1mMBchl為底物的Ellman檢測方法進(jìn)行BchE活性測定。圖IB顯示了RhBchE的western印跡分析結(jié)果。BchE單位定義為每分鐘水解l(imol底物的酶的量。采用針對(duì)HuBchE(B)形成的多克隆抗體，以western印跡法分析轉(zhuǎn)染后48小時(shí)獲得的樣本。圖2A顯示RhBchE的純化。通過考馬斯藍(lán)對(duì)純化的RhBchE的SDS-PAGE進(jìn)行檢測。圖2B顯示通過抗HuBchE抗體檢測純化的RhBchE的SDS-PAGE。圖3A顯示具有指示濃度的乙膦疏膽堿(ETP)對(duì)RhBchE的抑制。圖3B顯示具有指示濃度的乙膦辟J旦i威對(duì)HuBchE的抑制。數(shù)據(jù)通過Prism擬合至一級(jí)方程。由斜率可得到特定ETP濃度的k卿(miif1)。通過對(duì)k卿(min")和用于ETP初始抑制孵育的ETP濃度進(jìn)行重新作圖可得到表5中報(bào)告的數(shù)據(jù)。圖4A顯示特定濃度的化合物1對(duì)HuBchE的抑制。圖4B顯示特定濃度的化合物2對(duì)HuBchE的抑制。圖4C顯示特定濃度的化合物3對(duì)HuBchE的抑制。圖4D顯示特定濃度的ETP對(duì)HuBchE的抑制。數(shù)據(jù)通過Prism擬合至一級(jí)方程。由斜率可得到特定OP濃度的k卿(min")。圖4E顯示對(duì)k卿(min")和用于化合物1初始抑制孵育的OP濃度進(jìn)行作圖。由斜率可得到kinac/Ki=4.1xl03M"min"。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙倒數(shù)作圖可得到表7中所報(bào)道的數(shù)據(jù)。圖5顯示基因4本外重組(geneshuffledrecombinant)的BchE的8個(gè)隨機(jī)選擇的代表性克隆。圖6A顯示碘化丁酰硫代膽堿(BchI)水解活性。將COS細(xì)胞預(yù)接種于6孔板中過夜。然后通過模擬感染(對(duì)照)或以每孔lxl08pfu和4xl08pfuHuBchE-AD在時(shí)間0感染細(xì)胞。在感染后指定的時(shí)間檢查培養(yǎng)基中的Bchl水解活性。BchE單元定義為水解lpM/minBchl底物所需的酶。圖6B顯示腺病毒(AD)表達(dá)載體介導(dǎo)的BchE表達(dá)的Western印跡結(jié)果。在SDS-PAGE上分13析感染后指定時(shí)間采集的培養(yǎng)基樣本。0、1和2分別代表被模擬感染(對(duì)照)或lxl08pfu和4xl08pfuHuBchE-AD感染的細(xì)胞。培養(yǎng)基中的HuBchE可通過western印跡分析進(jìn)行檢測。圖7顯示以Pad線性表示的重組AD轉(zhuǎn)染的293A細(xì)胞的BchE活性。在轉(zhuǎn)染后指定時(shí)間采集的培養(yǎng)基中的BchE活性通過Ellman法進(jìn)行分析。圖8A顯示在0-3小時(shí)內(nèi)采用不同固體基質(zhì)進(jìn)行的固相檢測中，基于細(xì)胞的HuBchE表達(dá)介導(dǎo)的Bchl水解。圖8B顯示在3.5-7.3小時(shí)孵育后與圖8A中相同的固相檢測中的Bchl水解。穩(wěn)定表達(dá)WTHuBchE的CHO-Kl細(xì)胞被接種于24孔板過夜。該細(xì)胞參照文中所述進(jìn)行處理。通過平板讀取器隨時(shí)間記錄各孔在405nm處的吸收。圖例表示用于覆蓋細(xì)胞(第1層)和底物涂覆(第2層)的固相材料。圖9A顯示HuBchE表達(dá)細(xì)胞的定位。參照文中所述，接種了穩(wěn)定表達(dá)WTHuBchE的CH0-K1細(xì)胞的平板通過具有Bchl底物的Ellman混合物顯影。圖9B顯示平板A的倒像。圖IO顯示病毒分離過程中，從鑒定的黃斑中分離的特定填料的圖例。用連續(xù)稀釋的HuBchE感染6孔板中的293A細(xì)胞，并如文中所述染色檢測BchE的活性。從平板中挖出所示的陽性填料、陰性填料、樣本填料以及背景填料，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中進(jìn)行病毒提取。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了恒河猴丁酰膽堿酯酶(RhBchE)(獼猴)的分離的DNA分子。通過RACE試劑盒和RT-PCR由RNA克隆得到該RhBchE。全長RhBchE被克隆到pRC-CMV的Hindlll/Apal位點(diǎn)。將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，通過測定培養(yǎng)基中的Bchl水解監(jiān)測活性BchE酶的表達(dá)。本發(fā)明還提供了HuBchE及其突變體的分離的DNA分子。本發(fā)明提供了以HuBchE和RhBchE為特征的突變庫、在載體中制作BchE突變庫的方法，以及通過將BchE突變庫包裝進(jìn)入載體顆粒以載體感染細(xì)胞的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含RhBchE和修飾的HuBchE的DNA分子的表達(dá)載體，以及基于腺病毒(AD)的丁酰膽堿酯酶的高水平表達(dá)系統(tǒng)。在本發(fā)明的方法中，所述載體可以是任何適用于該目的的載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體為pENTRA載體或腺病毒載體。細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。為了創(chuàng)建BchE庫，可采用點(diǎn)飽和突變技術(shù)。該突變可在任意選擇的特定位置(例如，HuBchE庫的G117和E197位置)進(jìn)行。點(diǎn)飽和突變的目的在于整合NNK隨機(jī)突變密碼子(N二A、T、C或G，以及K=G或T)以通過兩步PCR替換HuBchE的特定位置。然后可通過KpnI/XhoI位點(diǎn)將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆進(jìn)pENTRA1載體。來自匯集的pENTRA-HuBchE克隆的質(zhì)粒DNA可用于與pAD/CMV/V5/DEST載體重組。可以用Pacl酶消化pAD-HuBchE突變庫池的質(zhì)粒，然后采用Lipofectamine2000將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293A細(xì)胞中進(jìn)行AD包裝?？蓮募?xì)胞上清液收集重組AD-HuBchE病毒庫。然后可同時(shí)以初級(jí)高通量固相功能篩選和二級(jí)液相活性篩選對(duì)該庫進(jìn)行篩選(實(shí)施例4)。具有通過定點(diǎn)突變或其它方法實(shí)現(xiàn)的表1中列舉的一種或所有RhBchE氨基酸變化的RhBchE或HuBchE的突變體的使用應(yīng)能提供具有更大水解活性的酶。這些殘基可單獨(dú)或聯(lián)合導(dǎo)致純化的天然酶中所見的更高底物結(jié)合親和性和速度。不同的殘基可改變蛋白的折疊和/或蛋白的翻譯后修飾(即，N-糖基化、磷酸化)，從而改變了可卡因或其它酯對(duì)該酶的結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別和進(jìn)入、可卡因的實(shí)際水解、或水解產(chǎn)物的釋放。蛋白質(zhì)的C末端部分中存在多種不同的殘基可能會(huì)改變?cè)摰鞍椎亩刍蛩木刍瑥亩淖兠傅姆€(wěn)定性。因此，基于由RhBchE獲得的信息的HuBchE突變可生成具有高水解活性的酶。RhBchE初級(jí)序列中的變化可能會(huì)對(duì)猴提供一些選擇性優(yōu)勢(shì)。采用RhBchE中存在的氨基酸變化以及隨機(jī)或選擇性引入的突變進(jìn)行HuBchE分子進(jìn)化，可提供高度選擇性和有效的催化劑，以從血流中去除潛在的毒性酯(或其化學(xué)同族體)。此處提供的功能篩選系統(tǒng)已被充分的驗(yàn)證，確保該種產(chǎn)物的成功分子進(jìn)化。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在被感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測BchE表達(dá)的方法。該細(xì)胞培養(yǎng)物可以是適于本發(fā)明方法的任何細(xì)胞培養(yǎng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。BchE的表達(dá)系統(tǒng)可以是適于該目的的任意表達(dá)系統(tǒng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)系統(tǒng)為能整合突變庫表達(dá)并適于高通量形式功能篩選的基于腺病毒(AD)的高水平表達(dá)系統(tǒng)。AD可以感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并允許各種蛋白在不同的分裂和非分裂細(xì)胞系中表達(dá)(實(shí)施例10)。本發(fā)明提供了模擬如VX、GF、塔崩、梭曼和沙林等OP神經(jīng)毒劑結(jié)構(gòu)的OP模型化合物。在本發(fā)明的方法中，所述化合物的使用濃度為0.01至20mM，優(yōu)選的使用濃度為0.1至10mM。在具體的實(shí)施方案中，所述化合物的濃度為0.5mM。所述化合物的合成具體描述于實(shí)施例12和13。本發(fā)明提供了針對(duì)BchE活性的OP模型化合物的篩選方法，該方法通過將BchE與所述化合物孵育，并進(jìn)一步檢測BchE的抑制以作為所述化合物活性的指示。在OP化合物或神經(jīng)毒劑存在下表達(dá)BchE的細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。16本發(fā)明提供了在生物樣本中檢測OP物質(zhì)的診斷方法。由于OP化合物的急性毒性作用與它們抑制AChE(OP物質(zhì)通過與必需的絲氨酸羥基反應(yīng)形成相對(duì)穩(wěn)定的磷酸絲氨酸酯鍵來抑制AChE)的能力密切相關(guān)，所述OP-ChE結(jié)合物可作為OP暴露的靈敏的選擇性標(biāo)記。同樣的，磷酸酯化白蛋白(即，Tyr411)可用作OP或殺蟲劑暴露的選擇性標(biāo)記?；谔囟∣P化合物所帶來的精確修飾，通過采用選擇性抗體來特異性識(shí)別單獨(dú)的OP-ChE或OP-白蛋白結(jié)合物，可得到能在暴露中或暴露后確定OP相對(duì)毒性潛力的具有重大診斷價(jià)值的工具。本發(fā)明進(jìn)一步提供了采用OP模型化合物獲取用于陣列式生物探測器的抗體的方法，其中所迷生物探測器采用基于陣列的方法來選擇性檢測神經(jīng)毒劑和其它OP。這是一種三管齊下的方法。首先，合成的化學(xué)試劑被用于獲得抗體；其次，獲取抗體并將其整合到生物探測器中并以不同方式檢測，以確定用于靈敏檢測的最佳配置，并同時(shí)針對(duì)靈敏性和快速檢測進(jìn)行優(yōu)化；第三，在緩沖液、穿刺獲得的生理液體、并最終在動(dòng)物的血液、血液成分或腦組織(所述動(dòng)物在生理相關(guān)濃度下被處理)顯示這樣的選擇性后，再對(duì)所述抗體進(jìn)行靈敏性和選擇性檢測。最終的產(chǎn)品為可現(xiàn)場使用的陣列式生物探測器，其用于檢測環(huán)境樣本或生物樣本(來自于暴露于低劑量神經(jīng)毒劑或其它OP的動(dòng)物)中的OP(實(shí)施例14)。本發(fā)明的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了臨床檢測的重組HuBchE(和/或該酶更具活性的催化變體)，作為有效的生物清除劑(和/或酶催化劑)用于在損傷發(fā)生前于體內(nèi)去除神經(jīng)毒劑、可卡因、殺蟲劑、其它濫用藥物。本發(fā)明代表一種有望保護(hù)軍事人員、第一急救者和平民免受OP暴露威脅的方法，并提供了對(duì)可卡因或其它過量服用藥劑的急救治療。本產(chǎn)品還可用于保護(hù)潛在暴露于殺蟲劑的人員。除了人類臨床使用外，該產(chǎn)品還可作為解毒設(shè)備，例如神經(jīng)毒劑解毒吸收海綿，其可將皮膚或其它表面的神經(jīng)毒劑吸收并解毒；用于檢測設(shè)備，例如用于測試條以提供對(duì)神經(jīng)毒劑的快速和靈敏的檢測；以及作為神經(jīng)毒劑破壞和廢棄的凈化劑。除了最終的產(chǎn)品外，本發(fā)明4是供的OP類似物和OP水解檢測方法可簡單地應(yīng)用于其它酶，例如對(duì)氧磷酶、羧化酶和催化性抗體；所述多樣化的庫可用于篩選其它商用的活力生物治療劑(例如，可卡因水解)和工業(yè)酶。本發(fā)明通過如下非限制性實(shí)施例得到進(jìn)一步的描述。實(shí)施例l:RhBchE的克隆、表達(dá)和純化RhBchE全長表達(dá)載體的構(gòu)建。RhBchE的5'序列可采用RACE試劑盒參照生產(chǎn)商的步驟由恒河猴(獼猴)RNA直接克隆得到。具體而言，由包含三個(gè)恒河猴肝臟的樣本制備總RNA。對(duì)短mRNA去磷酸化后，去除全長mRNA的帽狀結(jié)構(gòu)，并將RNARACE寡聚物連接到全長mRNA上。然后通過RT-PCR和克隆得到RhBchE的5'序列。3'RhBchE序列通過最近輸入的序列(NCBIBV211040)得到確認(rèn)并披露于2006年6月7日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/811,370(在此全文引用作為參考)?；谒玫男蛄性O(shè)計(jì)得到引物。全長RhBchE(包括RhBchE信號(hào)肽區(qū)和成熟BchE)可通過PCR擴(kuò)增并克隆到pRC-CMV和pGS載體的HindlII/Apal位點(diǎn)。除了pRC-CMV中的G418選擇標(biāo)記被大鼠谷氨酰胺合成酶替換外，pGS載體與pRC-CMV載體基本相同?？寺≠|(zhì)粒的序列得到了確認(rèn)。功能性重組RhBchE的表達(dá)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞，通過以Ellman反應(yīng)測定培養(yǎng)基中的BcM水解監(jiān)測活性BchE酶的表達(dá)。BchE蛋白的表達(dá)還18通過采用兔抗-HuBchE多克隆抗體的western印跡分析進(jìn)行確認(rèn)。穩(wěn)定的細(xì)胞系的選擇。為了制備提供重組RhBchE高水平表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，用pGS-RhBchE載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將該細(xì)胞胰蛋白酶化，并在置于15cm平皿之前稀釋10倍和20倍。所用的選擇培養(yǎng)基為不含L-谷氨酰胺、含有25pM蛋氨酸亞砜酰亞胺(MSX)的無血清培養(yǎng)基。MSX是內(nèi)部表達(dá)的谷氨酰胺合成酶的特異性抑制劑。因此只有攜帶pGS-RhBchE載體的細(xì)胞可以在這種選擇性條件下分裂生長。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中維持2周以允許集落形成。隨機(jī)選擇與其它集落分離的二十四個(gè)單獨(dú)集落。從培養(yǎng)平板中去除培養(yǎng)基。將浸泡了胰蛋白酶的小濾紙覆蓋在所選的集落上并在室溫下孵育2分鐘。然后將濾紙轉(zhuǎn)移至具有上述選擇性培養(yǎng)基的24孔板的單獨(dú)微孔中。細(xì)胞生長至匯合。測定各微孔中培養(yǎng)基的BchE活性，以鑒別#是供高水平表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。親和樹脂的制備。為了純化RhBchE，參照(Gmnwald等人，1997)所述步驟略加調(diào)整，制備結(jié)合了普魯卡因酰胺的瓊脂糖4B柱。用1mMHC1徹底沖洗CNBr-激活的瓊脂糖4B快流速柱(以1體積洗滌15次)，以去除攜帶的糖。然后將該樹脂重懸浮于含0.4MNaCl并調(diào)節(jié)至pH9.0的0.2MNaC03偶合緩沖液。除去偶合緩沖液之后，添加0.5體積含O.lM氨基己酸的偶合緩沖液，并使反應(yīng)物在4t:下旋轉(zhuǎn)過夜(約20小時(shí))。用H20洗滌培養(yǎng)基5次，并將樹脂重懸浮于O.lMl-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙差J友二亞胺鹽酸化物，并以HC1調(diào)節(jié)pH至4.5，然后去除液體。然后將樹脂重懸浮于0.5體積的包含濃度為100mol/ml樹脂的普魯卡因酰胺的0.1Ml-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸化物中2.5小時(shí)，并添加lMHC1以維持pH為4.5。在反應(yīng)中，每5分鐘調(diào)節(jié)一次pH，且pH的范圍介于約pH4.45至4.65。然后將反應(yīng)在室溫過夜完成(約20小時(shí))。然后將樹脂包裝在柱中，以H20徹底沖洗，并在UV280下監(jiān)測以完全去除未反應(yīng)的普魯卡因酰胺。收集所有的流出液以檢測未偶合的普魯卡因酰胺。從培養(yǎng)基中純化重組RhBchE。為了制備純化的重組蛋白，在T1柳燒瓶中培養(yǎng)表達(dá)RhBchE的穩(wěn)定細(xì)胞，并允許細(xì)胞生長三層。在分泌的RhBchE積累兩周后從燒瓶收集培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基與普魯卡因酰胺樹脂在4°C下勻速旋轉(zhuǎn)孵育過夜。通過2000xg離心5分鐘沉積該樹脂。小心去除包含未結(jié)合物質(zhì)的上清液，并將樹脂重懸浮于50mM磷酸鉀pH7.2，1mMEDTA(緩沖液A)中，并裝填到柱中。在以含0.2MNaCl的緩沖液A充分洗滌之后，用含0.05至0.5M普魯卡因酰胺的緩沖液A梯度溶液洗脫結(jié)合在柱上的RhBchE。采用Bchl底物通過Ellman測定鑒定洗脫液中的活性洗脫組分。匯集所述活性洗脫組分，并以截?cái)喾肿恿繛?0kD的Centricon(Millipore)濃縮。從獼猴血清中純化天然BchE。將獼猴血清流過結(jié)合了普魯卡因酰胺的瓊脂糖柱。用含0.2MNaCl的20mM磷酸鉀pH7.0，1mMEDTA徹底洗滌該柱。用0.1M普魯卡因酰胺洗脫結(jié)合在柱上的RhBchE。酶的洗脫組分的活性通過BchI水解確定。將活性洗脫組分匯集在一起，并以20mMTrispH8.0,1mMEDTA的瓊脂糖4B凝膠過濾層析進(jìn)一步純化。基于Bchl水解活性，將活性洗脫組分匯集在一起并加載至DEAE瓊脂糖柱。用20mMTrispH8.0，1mMEDTA徹底洗滌該柱，并以含0.1M、0.15M、0.2M、0.25M和0.3MNaCl的20mMTrispH8.0,1mMEDTA不連續(xù)梯度洗脫結(jié)合在柱上的蛋白?；钚悦复嬖谟?.2MNaCl洗脫液中。蛋白濃度以BCA法測定。對(duì)各洗脫組分中的蛋白通過SDS-PAGE、隨后考馬斯藍(lán)染色并western印跡進(jìn)行分析。實(shí)施例2.RhBchE和HuBchE的底物特異性和抑制動(dòng)力學(xué)的評(píng)估。20Bchl水解?？赏ㄟ^Ellman法分析酶洗脫組分的Bchl水解。簡單而言，在10mM5,5'-二疏代雙(2-硝基安息香酸)(DTNB)的存在下將5mMBcM與血清在50mM磷酸鉀pH7.4中于25。C下進(jìn)行孵育。用UV-Vis分光光度計(jì)在412nm下連續(xù)監(jiān)測Bchl的水解?；钚钥捎赡栂庀禂?shù)13,600M_lcm"計(jì)算得到。于Km測定，檢測方法分別包含了25、33.3、50、100和200|iM的Bchl,酶儲(chǔ)液，以及含200pMDTNB的50mM磷酸鉀pH7.2緩沖液。該測定在25。C下進(jìn)行。Km值可通過Lineweaver-Burk分析測定，而Keat值可通過由乙膦疏膽堿(ETP)滴定測定的功能性酶濃度得到確定。(+)-可卡因、(-)-可卡因及其部分代謝產(chǎn)物的竟?fàn)幮砸种瞥?shù)Kj的測定可通過在一定的濃度范圍的(+)-可卡因、(-)-可卡因、(-)-去甲可卡因存在下檢測Bchl的水解進(jìn)行?？煽ㄒ蛩鈾z測?？煽ㄒ蛩饪赏ㄟ^以質(zhì)譜(MS)定量特定的芽子堿甲酯(EME)生成加以表征。將高度純化的RhBchE或HuBchE與可卡因(10mM磷酸鉀緩沖液pH7.4中終濃度為1、2、4、10和40(iM)在37t:下孵育。在20、40和60分鐘的間隔，將等份反應(yīng)物與6NHC1混合以終止反應(yīng)，并穩(wěn)定化反應(yīng)產(chǎn)物。同時(shí)進(jìn)行不添加酶的背景反應(yīng)。在各時(shí)間點(diǎn)生成的EME的量可通過將等份反應(yīng)物直接流動(dòng)注射到AgilentMSD型MS確定，并通過選擇性離子監(jiān)測對(duì)m/z199.9-200.9(EME)的離子進(jìn)行定量。將反應(yīng)混合物中的EME量與通過已知濃度(125-1000nM)的EME溶液生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。可在減去相應(yīng)背景速度后得到每個(gè)可卡因濃度下的具體的酶催化速度。Km和Vmax值可通過Lineweaver-Burk分析測定，而K。at值可通過由乙膦疏膽i咸(ETP)滴定測定的功能性酶濃度得到確定。OP化合物對(duì)RhBchE和HuBchE的抑制動(dòng)力學(xué)。在50mM磷酸鉀緩沖液pH7.2中于25。C下研究了模型OP化合物和ETP對(duì)純化的RhBchE和HuBchE的時(shí)間依賴性抑制的動(dòng)力學(xué)。RhBchE和HuBchE的抑制可在將高度純化的RhBchE和HuBchE與各種量的ETP混合后啟動(dòng)。在指定的時(shí)間，將含有1mMBchl和0.2mMDTNB的反應(yīng)混合物添加至酶-化合物混合物并檢測Bchl的水解以確定殘留的BchE活性。該測定中采用了七個(gè)抑制劑濃度，并對(duì)每個(gè)抑制劑濃度設(shè)置了五個(gè)時(shí)間點(diǎn)。實(shí)施例3.HuBchE與新OP化合物相互作用的表征。OP類似物對(duì)WT和G117H/E197QHuBchE的抑制。將WT或G117H/E197QHuBchE與0.5mM的化合物1、2、3(或4-13,參見實(shí)施例12)或ETP在4°C下孵育48小時(shí)。然后在對(duì)起始的酶-化合物孵育混合物進(jìn)行100倍稀釋后，使用標(biāo)準(zhǔn)底物BcM(lmM)通過Ellman法測定殘留酶活的百分比。模型OP化合物抑制HuBchE的抑制速率常數(shù)的測定。在50mM磷酸鉀緩沖液pH7.2中于25。C下研究了模型OP化合物對(duì)純化的HuBchE的時(shí)間依賴性抑制的動(dòng)力學(xué)。HuBchE的抑制可通過將15nM高度純化的HuBchE與不同量的化合物l、2、3(或4-13，參見實(shí)施例12)或ETP混合后啟動(dòng)。在指定的時(shí)間，將含有1mMBchl和0.2mMDTNB的反應(yīng)混合物添加至酶-化合物混合物并檢測Bchl的水解以確定殘留的HuBchE活性。該測定中采用了七個(gè)抑制劑濃度，并對(duì)每個(gè)抑制劑濃度設(shè)置了五個(gè)酶活時(shí)間點(diǎn)。實(shí)施例4.人BchE突變體表達(dá)庫構(gòu)建。HuBchE突變庫的構(gòu)建。點(diǎn)飽和突變技術(shù)被用于在位置G117和E197創(chuàng)建HuBchE庫。點(diǎn)飽和突變的目的在于整合NNK隨機(jī)突變密碼子(N二A、T、C或G，以及K=G或T)通過兩步PCR替換HuBchE的位置G117和E197。該P(yáng)CR產(chǎn)物可通過KpnI/XhoI位點(diǎn)被克隆到該pENTRA1載體。來自匯集的pENTRA-HuBchE克隆的質(zhì)粒DNA被用于與pAD/CMV/V5/DEST載體重組。22用Pacl酶消化pAD-HuBchE突變庫池的質(zhì)粒以暴露左和右病毒ITR，然后采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染到293A細(xì)胞以進(jìn)行AD包裝。重組的AD-huBuChE病毒庫由轉(zhuǎn)染后5日的細(xì)胞上清液采集得到。然后可同時(shí)以初級(jí)高通量固相功能篩選和二級(jí)液相活性篩選對(duì)該庫進(jìn)行篩選。作為示例，該功能篩選平臺(tái)可通過上述雙位置(G117和E197)點(diǎn)飽和突變生成的庫進(jìn)行驗(yàn)證。該庫重組病毒被用于感染293A細(xì)胞，細(xì)胞在感染后24小時(shí)用含1%瓊脂的MEM糖進(jìn)行涂覆，然后向涂覆的細(xì)胞添加0.4mM的化合物4-13(即，化合物5、沙林類似物，參見實(shí)施例13)，從而與表達(dá)的重組HuBchE變體相互作用。在感染后的第4天，以Bchl作為底物在DTNB的存在下對(duì)涂覆細(xì)胞染色。在3小時(shí)中監(jiān)測平板上黃斑的出現(xiàn)，這意味著OP-水解酶的存在。從平板中挖出黃色瓊脂糖斑點(diǎn)，并在無血清培養(yǎng)基中在單獨(dú)的管中孵育。取等分從培養(yǎng)基中釋放的重組病毒加入預(yù)接種了293A細(xì)胞的平板。在感染后將96孔培養(yǎng)平板孵育3天。該時(shí)間可允許病毒的增殖以及編碼的huBuChE變體的表達(dá)。在第3天，測定來自96孔板的培養(yǎng)基的OP抑制耐受/水解活性?；谒猩鲜鰷y定的結(jié)果，選擇顯示了提高的OP水解活性的樣本以供基因鑒定。將重組病毒中編碼的HuBchE基因通過來自培養(yǎng)基的病毒載體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR產(chǎn)物測序，并鑒定HuBchE基因中的突變。AD-介導(dǎo)的HuBchE表達(dá)。包含HuBchE的變體(A328Y/Y332A)的重組AD的儲(chǔ)液滴度為2.45xl01Qpfu/ml。為提高可卡因的水解設(shè)計(jì)了該雙突變體。兩種不同濃度(lx108pfu和4x108pfu(即，分別為200感染復(fù)數(shù)(moi)和800moi))的病毒被用于感染在6孔板上預(yù)接種過夜的CHO細(xì)胞和COS細(xì)胞。培養(yǎng)基中的BchE活性可在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)以1mMBchl為底物通過標(biāo)準(zhǔn)Ellman23反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測。WT和G117H/E197QHuBchE的AD表達(dá)載體的制備。Invitrogen的ViralPowerAD表達(dá)系統(tǒng)被用于克隆HuBchE酶。該系統(tǒng)涉及在進(jìn)入載體(entryvector)中克隆耙標(biāo)基因。耙標(biāo)基因可采用Gateway技術(shù)如生產(chǎn)商所述經(jīng)體外重組轉(zhuǎn)移至pAD/CMV/V5/DEST。為了將HuBchE基因克隆到pENTRAl進(jìn)入載體(其提供了腺病毒載體構(gòu)建所需的重組信號(hào))，可使用TurboPfu將從起始質(zhì)粒制備PCR-擴(kuò)增的WT和G117H/E197QHuBchE以結(jié)合限制性克隆位點(diǎn)KpnI和Xhol。所述PCR產(chǎn)物被克隆在pENTRAl的Kpnl和Xhol位點(diǎn)。對(duì)選擇克隆的插入進(jìn)行測序以確認(rèn)PCR步驟未導(dǎo)入突變。然后將超螺旋質(zhì)粒與pAD/CMV/V5/DEST進(jìn)行孵育，該AD表達(dá)載體包含用于進(jìn)行高水平目標(biāo)蛋白表達(dá)的CMV啟動(dòng)子和陰性選擇性ccdB基因。轉(zhuǎn)化后，僅重組質(zhì)粒能夠在選擇性平板上生長。通過限制性消化和測序分析對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行分析，以確定HuBchE基因在pAD載體中的正確插入。HuBchE-AD的生成以及通過AD表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證重組的WT和G117H/E197QHuBchE的表達(dá)。為了生成重組的WT-和G117H/E197Q-hBchE-AD，可通過Pacl酶消化將質(zhì)粒pAD-WT-hBchE和pAD-G117H/E197Q-hBchE線性化，然后通過Lipofectamine轉(zhuǎn)染到293A細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中維持三天以檢查HuBchE活性，然后轉(zhuǎn)移至含血清的培養(yǎng)基以幫助維持細(xì)胞活性。平行使用對(duì)照載體pAD-lacZ。在感染后12天收集含有包裝的重組病毒的培養(yǎng)基，離心去除細(xì)胞碎片并貯存于-80°C。為了監(jiān)測感染后重組BchE的表達(dá)，向培養(yǎng)COS細(xì)胞的培養(yǎng)基添加重組病毒。在初始感染后不同的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測培養(yǎng)基的Bchl水解活性。RhBchE和HuBchE嵌合體突變庫的構(gòu)建。用DNA體外重組技術(shù)(DNA24shuffling)創(chuàng)建嵌合體庫。將HuBchE和RhBchE的全長片段從相應(yīng)克隆中通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)HuBchE和RhBchE的PCR片段進(jìn)行凝膠純化并以1:1的比例合并。對(duì)合并的PCR片段進(jìn)行有限的DNA酶I消化。純化100-200bp片段，并不用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以裝配成更長的片段。所述更長的片段最終以末端引物進(jìn)行擴(kuò)增以獲得全長重組產(chǎn)物。這些體外重組的DNA片段被連到質(zhì)粒pCR2.1-TOPO。實(shí)施例5.功能篩選檢測方法的開發(fā)和^E。建立固相膽堿酯酶活性檢測方法。將穩(wěn)定表達(dá)HuBchEWT或G117H/E197QHuBchE的CHO-K1細(xì)胞接種于培養(yǎng)平板。接種后24小時(shí)，去除培養(yǎng)基并以Ultraculture無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次。然后以含1%瓊脂或10/o瓊脂糖的無色MEM覆蓋細(xì)胞。培養(yǎng)基凝固后，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱過夜。在含1%瓊脂(或1。/。瓊脂糖)的無色MEM中制備含有底物(lmMBchl或1mMETP)和/或0.1mMDTNB的Ellman反應(yīng)混合物。將該反應(yīng)混合物覆蓋于上述制備的細(xì)胞培養(yǎng)平板上，并在室溫下孵育。通過肉眼觀察監(jiān)測平板上黃斑的出現(xiàn)，同時(shí)以平板讀取器測定OD405吸收。HuBchE活性的局部檢測。連續(xù)稀釋穩(wěn)定表達(dá)WTHuBchE的CH0-K1細(xì)胞并以不同的密度(即，4、20和100細(xì)胞/平板)接種至10cm培養(yǎng)平皿。使細(xì)胞生長1周以形成含約20細(xì)胞/集落的小型集落。以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，然后以含1%瓊脂糖的MEM涂覆。孵育過夜后，以在1%瓊脂糖的無色MEM中制備的含底物(lmMBchl和0.1mMDTNB)的Ellman試劑混合物使該平板顯色。用固相BchE活性檢測方法檢測AD-BchE重組病毒。用連續(xù)稀釋的HuBchE-AD病毒感染預(yù)接種在6孔板上的293A細(xì)胞。感染后1小時(shí)將瓊脂糖-MEM混合物覆蓋在細(xì)胞上。將培養(yǎng)平板放回培養(yǎng)箱。重復(fù)制備多個(gè)平板，這樣在感染后的每一天均可取出一塊平板并以含1mMBchl和200pMDTNB的瓊脂糖-MEM混合物進(jìn)行覆蓋?？赏ㄟ^肉眼觀察平板上黃色的出現(xiàn)。為了從識(shí)別的黃斑分離病毒，可從瓊脂糖培養(yǎng)平板挖出該填料。將分離的填料轉(zhuǎn)移至含有0.5ml培養(yǎng)基的管中，并在4。C下孵育過夜。然后用與填料孵育的培養(yǎng)基感染預(yù)接種在24孔板上的293A細(xì)胞。在感染后24和48小時(shí)測定培養(yǎng)基中的BchE活性。為了從分離的重組病毒回收BchE基因，以l(il與填料特育的培養(yǎng)基為模板，并以AD載體特異性引物T7和pAD-V5R進(jìn)行擴(kuò)增。測定該P(yáng)CR產(chǎn)物的序列。實(shí)施例6.獼猴ChE的活性分析。為了鑒定具有更大可卡因水解活性或OP活性的新BchE,對(duì)來自3種猴子獼猴(Macacamulatta)、豚尾猴(Macacanemestrina)和食蟹猴(Macacafascicularis)的血漿進(jìn)行Bchl和可卡因水解活性篩選。研究顯示盡管在所有的血漿中Bchl的水解非常相似，(-)-可卡因的水解卻具有明顯差異，獼猴血清具有最大的水解活性。因此，對(duì)獼猴的BchE基因進(jìn)行克隆以進(jìn)一步鑒定該酶。RhBchE的cDNA序列分析。采用RT-PCR由獼猴肝臟組織克隆RhBchE的cDNA。RhBchE的完整cDNA序列(SEQIDNO:l)以及相應(yīng)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)如下。mhskvfticiRt^&i"wf^乙3uchh:e《k沒hte01雄C^W5CAAACTCM^TOVf驟^ATCAGATOCTCt雷體TTCT，SCTCTC0A累TTOT《WWfCM^。！Vi戮TKhok科1L14GfVT孰st^《1，i幼CATOS纖TT0CAAC^MVT06WW微<^^TOTOT織織TCT卞G0Tramc婦織C^3CCTTTCTm術(shù)oocAGc潔ctcr腦imftcrrc幼ttcm^wxcmmtctot艦omt編tctgatatttowrococMSCY0NI1>QSFPGrMGS￡MWW爐MTDLSS0cmAATTCTTGCTATCAQv5C^fAGftTCft^AGTTTTCC^X，1"CXATGGATCAGAGW1WXCAAftCAC，GACCT^MS26tt戟TATeiM為窗戮TO鍵0AairGsnpAGCCATCCATTOTOKCAGCTCftOftCATATTA仁TTfiAACTGAPGr$Ksggtgctcctg譜to^caaVWftSSK1uP戮vNytK為GTCCAAAT<JGGAATATTGACTKL^AQQCwkAgf特狡《L*GGTCTCTAATCCOSDWf繊CWWV腦OCT臘微緒漁WOS縱濕T醫(yī)GOTWm戮GKFV1vv^襯.共VSTGGCWGITTCTOTTCC^GTTWTOM^mTTUTAGTGTOy%TWATi^CatOGaPSAPGMMG!F"000WVQTCXTGAGGCT仁OWC3AACATGGQTtMTimTCW^VGXTOXTTC^CiOTGCCTITCVTAUUW微^ctocttoSWOTiX^qmcctttacccT織TTTCCTAltOSGSS投AYEAAGCOVTTCFACAMGTGGATCCTCTAATG仁TCCTTGGGCAGTA^CATCTCTTTATGAAGCgottot窗濃MMmmAf側(cè)隱cimAivmoTowTo^cramaaagatotgto仁citmacrcrcr雷avatmftcttcottcc^為omOTOT0rorrf憶T^iACAATTTAWUiAMXCAGAl*ATTOTrGGGTGTTAATAi^mTfiAAGGC^AGCTTT3dMdsJIT共NEf0EGL拔irfPAOATAftC腦T爽CmTCATAA爽TTTCAGGA^ISGTTOW^aTJWnTTC!Ctr錢？t。wvda^夢(mèng)監(jiān)AtcOTTTtovrw^oc:tasa^Qvr諷tc^gacctoawcticcgtgaggcgttCPALEFTKKg"S￡Wgis^AfPYATGCCCTGCCTTOT^竹mCCARGWMOTCTCAGAATiSaOSAAMWTGCCTTTTTCTii'W襯GVM.￡F^fGL夢(mèng)ctaxc^cmTCramot讚oca纖ctww^ttc^rriroeTttccctovccI^K^狄炎WfA^TGAGWATTTTTOmWT(XAf廢艦AC僞TOGGCA.^fTTTOm^MmTOKWWPVFKST￡QKYLTLNT￡SSRMGOCOfGTC1tcaaaa織C1WVCm^齢AfCTAACCTTO^W^G膽CAtCAmS共P輛T經(jīng)S"r$KVlEfr*tJE義CaSMrtCtGCAO^tc^t,ttteCWtCTTOmAT^為OWW^為fX:TGAAO:W8賴Y襯^0wk科0r*3dytsKStECTGOAGOWmCWOATOGACTM^WTQWTWiC纏TAC^taGCAftdAAAOft0&RhBchE的最長開放閱讀框編碼574個(gè)氨基酸的多肽，該多肽與HuBchE(gi:4557351)(SEQIDNO:3)具有95%序列一致性(96%序列相似度)、與兔BchE(gi:116354)(SEQIDNO:4)具有91%序列一致性(94%相似度)、與馬BchE(gi:7381418)(SEQIDNO:6)具有91%序列一致性(95%相似度)、與貓BchE(gi:2981243)(SEQIDNO:5)具有88%序列一致性(92%相似度)、與小鼠BchE(gi:6857761)(SEQIDNO:7)具有81%序列一致性(89%相似度)。SEQIDNOS:3-7的多肽序列顯示如下。27HuBchE(SEQIDNO:3)的多肽序列MHSKVT工ICISEXFWFLliCMLIGBSHTEDDIIIM"iCNGKVRSMNI-TVFGSTVTAFLGIPYAOePLGRLRFtCKPQSLTKBSDIWSATKYANSCCQNIDQSFiPGFHGSEMWMPItTD3LSEDGFTLALPGNPEAPGNMGLFDQOLALOWVQKNIAArcGNPKSVTLrcESAGAASVSLHLLSP兔BchE(SEQIDNO:4)的多肽序列mvtrsshtedviittkn(3ri脇nlpv腦tvtm"lgiGFLALPCEAPGNMGLFDQQLALOWVQKNI雄FGG蹄i(SVfUGESAG雄SVSLHliSPYG艮PGFSKD訓(xùn)11TRKEFQEG面ETPGVSEre郎SILPHTTDWVDEQRPENYREAJLDDWGOYMFICWy-ErrKKPSEWGN艦FFYYFEHRSSiaSWE鵬gvmhgyereFVFGJLPLERRVNYTKAEEILSRSIMKRWANFAKYGNPNGTGNNSTRWPVFKSTEGKYLTLNTESPRIYTKLRAQGCRFWTLFFPKVl^MTGNIDEAEQEWKAGFHRWNNYMMAWKNHFNDYTSKKERCAGF貓BchE(SEQIDNO:5)的多肽序列QSKGT11SGKSHTEEOIIITT鄉(xiāng)(3KVRGM亂PV3UDGTVmFW31CLYLMVWSFTPKPKNATVIWIYGGGFQTCTSSLPVYdgkflarvervIVVSMNYRVGALGFLAliPGNP￡IPGNMG:LfDQQIj肌QWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESAGAGSVSMI丄SPILLNS:LJLWPSOTX;LSVMrGWTCE)FI/rDMSPDT"Q:LGQfRKTQILVGV,DEGTAFLV馬BchE(SEQIDNO:6)的多肽序列CJLYLNVWreAPKPKNAirVMIWireGGFQTG'rSSILPVyDGKFIARVERV'IWSMWYIWGALGFLALSENPE膽G,G;LPOQQIAL價(jià)VQ應(yīng)IAAreGNPRSVTLFGESAGAASVSLHIXSPRSQPLFTRMLQSGSSNAPWAVTSLYEAR柳TLTLAKRMGC幼測ETEMi:KCLRC(K,EIHNEVFWP"yDT:LLSV!aFGPTVDGOPl/rDMPDTI^OW5QFKRTGIlLVGV鄉(xiāng)CiECTAF^Vygapgfskdnnsiitrkef(2eg認(rèn)iffprvssfg腿s1uhymdwldd(2ra雄yrealddrbvwtkae;jei:lsrsimkrw朋fakyotp,tqsnstrwpvfkste:qkyi-tmte:spkvySDF小鼠BchE(SEQIDNO:7)的多肽序列28MQTQHTKVTQTtiFXLWiniXMPFGKSHTEEDFICTTKTGRVRGLSMFVMGTVmFLGIPyAQETLGSLRF認(rèn)PQ腦KWPlDI腿ATQ狄NSCYQNIDQAETGFQGSE,NP置NLSEtJGF1AFPG,DA:PG鄉(xiāng)GLFDQQ1ALQWVQRNIAAFGGNPK31TIPGESAG艦SVSLHL3LCPQSYPLFTRAI薦SSSMAP艦VKHPEEMl腿1"LTLAKFTGC;S認(rèn)能M腿KCJL薦肪SPQE1la呢RFVLPSDSIIiSINFGPTVDGDFLTD附HTli眼GKVKKAQlJLVGV鄉(xiāng)DEGTAFLV餘VNYTRASEIPS德IMICTWA置AKTCH.PNGTQGNST柳PVFTSraOICYM:LNTEKSia:Y'r肌本發(fā)明還提供了本發(fā)明的RhBchE序列(SEQIDNO:8)與M62777(部分RhBchE)(SEQIDNO:9)和HuBchE(NCBINM000055)(SEQIDNO:IO)的比對(duì)。編碼RhBchE的多聚核普酸序列(SEQIDNO:8)顯示如下。AACAGTTGATTGCTACATTC腦T池CaCTG腦"TCTCAGTOCAGTCCA編碼部分RhBchE(BV211040)序列的多聚核苷酸序列(SEQIDNO:9):雄CATA微TOyAGTTTTCCAGGCTTCCATGGATClyGAGATGTCG腿CCCAAACACTGACCTCAGTG跳GACTGTTTATMCTAAMtSmTGGATTCCGGCACCTAAACCAAAAAMGCraCTGTM"TGATATGGMTTATGGTGGTGGTTTTCAGACTGGAACATCATCTTTAC層GTTTATGATGGCAAGTTTCTGGCTCGAGTTGAAAGAGTTATTGTAGTGTCAATGAACTATAGGGTGGGTGCCCTTGGATTCTTAGCTTTGCCAGGAAATCCTGAGGCTCCAGGGAACATGGGTTTATTTGATC腿CAGTTGGCTCTTCAGTGGGTTCmAiyuyyvrATAGCAGCCTTTGGTGGAAATCCTiyiAAGTgTAfiCTCTCTTTGGAGAAAGTGOlGGAG_____*"ffCAGCTTCAGTTAGCCTGCATTTG！編碼HuBchE(SEQIDNO:10)的多聚核苷酸序列31AGT她CAGTTGATTGTTACA"rTCAGTAACACTG威TGTCA(3TGCAGTCCAATTTACAGGCTCGAGCAGCAGCTGCATCCTGCATTTCCCCGAAGTATTACJVTGATTTTCACTCCTTGCSAAOTTTGCCATCTTTGTTGCmGAGAATCGGJIARTCAAmTGCATAGCMACTCACAATCATATCCATCAiSATTTCTCTTTTGGTTTCTTTTGCTCTGCATGCTmTTGGG腿G;tc:ACATACTG緣GATGACATCATAATTGCAACAIUlGimTGGAAimGTCAGAGGGftTGAACTTGACAGtttttggtggcacggt雄cagcctttcttoc3雖ttccctatgciicm5ccacctcttcctagacttcgattcaaiyyigccm:賜tctctcacc織g;tggtctgatmttgg跳tgccacftaaatatgcmattcttgctgtcagaacatagatcaaagttttccaggcttccatggatcag腦atgtggaacccaaacm;tgacctcagtgaagactgttmratc.taaatgtatggattccagcacct皿accaaaaaatgccactgtattgatm"ggatttatggtggtggttttcaftaACCJyyyyyVTGCCACTGTMTGAmTGGATTTATGGTGGTGGTTTTCAAACTGGAACATCATCTTraCATGTTmTGMGGCAAGTTTCTGGCTCGGGTTC3AAAGAC3TTATTGTAGTGTCAATGAAC狄TOGGGTGGGTGCCCTAC5GATTCTTAGCTttgccaggaaatCCTCAGGCTCCAGGGAACATGGGTTTATTTGATCAACAGTTCGCTCTTCAGTGGGTTCMyyyy^ATATAGCAGCCTTTGGTGGAIIATCCTAAAAGTGTAACTCTCTTTGGAGAAAGTGCAGGMJCAGCTTCagttagcctgcatttgctttctcctggaagccattcattgttcaccagagCCATTCTGCAAAGTGGATCCTTTAATGCTCCTTGGGCGGTAACATCTCTTTATGAAGCmGGAACAG総CGTTG艦CTTAGCTAAATTGACTGGTTGCTCTAGAGAGAATGAGACT3AAM腿TC雄GTGTCTTAGiyU^1"Aiyi微TCCCC^agaaattcttctgaatgaagcatttgttgtcccctmgggactcctttgtcagtaaactttggtccgaccgtg腿tggtgmtttctcactgacmtgccagacatattacttgaacttggacaatttiyy\aaaacccagmtttggt(3ggtgtt緣tawmmtg腿a5gacagcttttttagtctatggtgctcctcgcttcagcaaagataacaatagtatcat腿ctagajyyysaatttcaggaaggtttaaajwrattttttccm3gagtgagtc船ttt(3gaaaggaatccatcctttttcattacacagactgc3g狄gatgatcagagacctc5aaaactaccctgaggccttgggtgatgttgttggggattataatttcatatgccctgccttggagttcmxmag皿gttctcag腿tggggaaataatgcctttttcmctattttg腿caccgatcctccmacttccgtggcca(saatc3gatc3ggagtgatgcatggc:tatgaamtcaatttgtctttggtttacctctggaaagaagagat艦ttacacaaaagccgaggaaattttgagtagmccat脇tgaaacggtgggcaaatt'TTGCMAATATOGGAATCCAAATGACmCTCmGAAGAATGAATACAGAGTCAACAAG腿T腿TGACGAAACTACGTGCTC腿C驗(yàn)TGTCGATTCTGGACATCATTTTTTCCMyW3TCTTGGA腦tgac賜(3AftATATTgatcaagcagaatgggagtggaaagcaggattccatcgctggaacaattaCATGATGGACTGGAAARATCAATTT敲CGATTACACTAGC腿GAjyySAAAGTTGTGTGGGTCTCTAATTAAT恥ATTTACCCTTTATAGiiyiCAmT—ttTCCTTTA微TCAAGGCAAAAATATCAGGAGCTTTTTTACACMXTACT艦CCTCAeMCTTT—AACTTAGTATTTTACCTAGCATTTCAAAACCCAAATGGCTAGAftCGTGTTT腿TmAATTTCAC雄狄TAAAGTTCTACAGTTAATT下文表1顯示了在不同物種間對(duì)感興趣的RhBchE殘基進(jìn)行比較。表l.感興趣的RhBchE殘基與來自其它物種的酶比較。32RhBchE中與HuBchE不同的殘基W(F),(1》,L21Y66(C),'Mi!0P215(S),S227《F),T245魄D255(E》,V261(I),H2，}),L2gS(P>,M294{V%E301(D),D342(N),N348(K),D390(G)，1398(F),V454(D》sQ4$2(E)H484(Q》,K4粉(S),SS08(T》,LSI1(M),和」S5S!(N)...........RhBchE中與HuBchE不同但保守的殘基L-17(F),VS(I),JL2i(F》，Y《6(C),Ml10似1245CN),K255(E》,V261(1),H20(Q〉,L285(P》，隨與《V),E301(D),i效g(F〗，H4W(Q),S5彼(T)，LSURhBchE中與HuBchE不具保守性但與其它動(dòng)物的BchE具有保守性的殘基P2i5(S》，S227(F),D342(N),'D3鄰(G),V賴(D),G縱(E),IC鄉(xiāng)(S'RhBchE中不與任何其它物種具有保守性的殘基翻寧)一R'hBchE與HuBchE之間保守但與其它物種沒有保守性的殘基A7(T),TW(P),C5212《K/Q),E3鷯(Q》,L5i豕OO,S324《L》與HuBchE的序列相比，RhBchE包含了25個(gè)具有不同氨基酸的殘基。在這25個(gè)不同的殘基中，17個(gè)氨基酸為保守的類似氨基酸。與來自不同動(dòng)物物種(包括人、兔、貓、馬和小鼠)的BchE酶氨基酸序列進(jìn)行比較，RhBchE和HuBchE具有最大的相似度。在HuBchE和RhBchE之間具有六個(gè)在彼此之間保守、但與其它物種沒有保守性的殘基。然而，RhBchE與HuBchE相比的8個(gè)非保守氨基酸中的7個(gè)(P215、S227、D342、D390、V454、G482和K489)實(shí)際上與其它動(dòng)物酶具有保守性。RhBchE唯一特異性的氨基酸殘基為N348，而來自所有其它物種的酶在該位置上為Lys。實(shí)施例7.功能性重組RhBchE的表達(dá)。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中檢測重組RhBchE的表達(dá)。通過Ellman反應(yīng)分析培養(yǎng)基中的Bchl水解來監(jiān)測表達(dá)的重組BchE酶的活性。BchE蛋白的表達(dá)也可通過western印跡分析進(jìn)行確認(rèn)，顯示重組RhBchE被抗-HuBchE多克隆抗體識(shí)別并與重組HuBchE共同遷移(圖1)。從獼猴血清純化RhBchE。在三步層析后，根據(jù)SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色可見RhBchE被純化至約70%的純度(圖2A)。以抗-HuBchE多克隆抗體進(jìn)行的western印跡分析顯示該抗體非常有效地識(shí)別RhBchE,且免疫反應(yīng)條帶與純化的HuBchE共同遷移(圖2B)。可對(duì)BchE進(jìn)行聚乙二醇修飾或其它衍33生以提高此處所述的本發(fā)明中鑒定的任意蛋白的穩(wěn)定性。RhBchE的底物特異性。采用Ellman法對(duì)實(shí)施例1所述純化的酶組分進(jìn)行Bchl水解測定分析(表2)。表2顯示了純化的RhBchE和HuBchE在50mM磷酸鉀，pH7.4中30°C下對(duì)丁酰疏代膽堿和(-)-可卡因的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。表2.純化的RhBchE和HuBchE的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。碘化丁跣疏代膽堿灰激mirT*RhBchE71.1±8.45d03±O35xfd3幽BehE26*1土5214.05x103±2.19xl03如表2-4所示，RhBchE在底物特異性上顯示了與HuBchE的明顯差異。盡管與HuBchE相比，RhBchE與Bchl的結(jié)合親和性低2.7倍(Km71.1|iM),但RhBchE與(-)-可卡因的親和性卻高2.9倍(Ki=4.7jiM)(HuBchE，Kj=13.6闊。對(duì)RhBchE的底物特異性進(jìn)行了檢測，并以可卡因水解產(chǎn)物作為酶活性抑制劑，測定了與可卡因化學(xué)相關(guān)的不同化合物的Kj值，如表3所示(在50mM磷酸鉀，pH7.4中，25。C下的Bchl水解抑制)。表3.可卡因和相關(guān)化合物對(duì)Bchl水解抑制的&值。猴BchE;人BchE(-)-可卡因4.7nM13.6(+)-可卡因15.3一8.0|iM(-)-去甲可卡因U9pM43nM如表3所示，RhBchE的(+)-可卡因和(-)-去甲可卡因比HuBchE高約2倍，而RhBchE的(-)-可卡因Ki比HuBchE低約3倍，提示RhBchE對(duì)(-)-可卡因比其它底物更具結(jié)構(gòu)選擇性。(-)-芽子堿甲酯在所測試的濃度(O-lOOiiM)下不抑制Bchl水解。34表4顯示了RhBchE和HuBchE對(duì)(-)可卡因的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Xie等人，1999;Mets等人，1998)，并顯示了RhBchE相比已報(bào)道的可卡因水解催化劑和HuBchE突變體具有更高的kcat/Km。表4.RhBchE和HuBchE對(duì)(-)可卡因的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。天然BchEX獼,猴22.33.33.人—?jiǎng)t0,23幽hE'3,9W仏2教A微YWBdhE，9U3A32霧PMtehES.240.242,32200.0，RhBchE的可卡因水解催化系數(shù)(kca/Km)為人類BchE的10倍以上。在比較RhBchE和HuBchE與OP的相互作用時(shí)，ETP對(duì)RhBchE和HuBchE的抑制為一級(jí)抑制(圖3)。通過對(duì)k柳一級(jí)速率常數(shù)(抑制)和ETP濃度的重新作圖可得到RhBchE和HuBchE與ETP的反應(yīng)的抑制常數(shù)。表5顯示了RhBchE和HuBchE之間的敏感性差異(對(duì)ETP的抑制速率常數(shù)可在以圖3所示的ETP濃度進(jìn)行kapp(min")的雙倒數(shù)作圖后得到)。表5.對(duì)ETP的抑制速率常數(shù)。HBhERhBchE》1,860±OS稱,4±40,5.............—....................實(shí)施例8.OP類似物合成及對(duì)HuBchE的抑制。分別模擬沙林、梭曼和VX的結(jié)構(gòu)的OP類似物如實(shí)施例12和13所述被成功合成。對(duì)所述OP類似物與HuBchE和G117H/E197QHuBchE的相互作用進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示于表6(HuBchE和G117H/E197QHuBchE與0.5mM所示化合物或?qū)φ站彌_液在4"C下孵育48小時(shí))。35表6.對(duì)WT和G117H/E197QHuBchE的OP抑制?！鯳T化合物174.30%1.23%—...化,會(huì)撒2——化.合物30.恥％乙膦疏膽堿0.02%緩沖k100.00%艦00%如表6所示，WTHuBchE被所有三種化合物抑制，其殘留活性小于2%。殘留的酶活性用1mMBchl以Ellman反應(yīng)檢測。然而，G117H〃E197QHuBchE變體對(duì)所有三種化合物仍保留了超過50%的活性。該發(fā)現(xiàn)與早期對(duì)G117H/E197Q酶變體耐受OP抑制的報(bào)道非常一致，顯示所合成的三種OP類似物與HuBchE酶的相互作用類似于之前檢查的其它OP化合物。此外，當(dāng)我們?cè)诟L的時(shí)間段內(nèi)檢查Bchl水解時(shí)，在與化合物1和2孵育后的WT殘留活性較為明顯，但在與化合物3或乙膦硫膽堿孵育時(shí)則沒有觀察到可測的活性。此處體現(xiàn)的G117H/E197QHuBchE對(duì)OP化合物抑制的耐受顯示了可用于功能篩選設(shè)計(jì)的重要特征。原則上，該方法(用硫替換氧化酯)可用于任意酯，從而開發(fā)HT功能篩選。其它的示例可參見實(shí)施例13。模型OP化合物抑制HuBchE的抑制速率常數(shù)測定。本發(fā)明研究了模型OP化合物對(duì)純化的HuBchE的時(shí)間依賴性抑制的動(dòng)力學(xué)，其中采用了七個(gè)抑制劑濃度，對(duì)每個(gè)抑制劑濃度取了五個(gè)時(shí)間點(diǎn)。所有OP模型化合物對(duì)HuBchE的抑制均為一級(jí)抑制(圖4A顯示了對(duì)化合物1、2、3和乙膦疏膽堿選定的抑制劑濃度)。以kapp(—級(jí)抑制速率常數(shù))對(duì)OP化合物濃度進(jìn)行重新作圖可得到被測試的OP化合物與HuBchE反應(yīng)的抑制常數(shù)(表7)。OP化合物對(duì)HuBchE的抑制常數(shù)可通過以kapp(min")對(duì)圖4所示的OP濃度進(jìn)行雙倒數(shù)作圖得到。圖4B顯示了化合物1的代表圖。表7.OP化合物對(duì)HuBchE的抑制常數(shù)。36<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>化合物在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性以及自發(fā)水解。由于OP模型化合物被用于基于細(xì)胞的檢測方法，且由于預(yù)期的低轉(zhuǎn)換率和長孵育周期，這些化合物在測定條件下培養(yǎng)基存在下的穩(wěn)定性便非常重要。化合物的不依賴于酶的自發(fā)水解(即，緩沖液介導(dǎo)的、H20介導(dǎo)的、以及培養(yǎng)基介導(dǎo)的水解)可通過在DTNB存在下的無酶的測定緩沖液中孵育化合物后通過UV-Vis在412nm下進(jìn)行監(jiān)測。所有三種化合物均未顯示可檢測的水解，顯示這些化合物在用于功能篩選的測定條件下未測得自發(fā)水解(或極為有限的背景水解)?；衔锏姆€(wěn)定性也可通過在H20中于室溫下進(jìn)行長期貯存之前和之后測試抑制HuBchE的能力進(jìn)行檢查。結(jié)果顯示化合物1和2在貯存條件下較為穩(wěn)定抑制HuBchE活性的能力僅出現(xiàn)了少量的下降。而化合物3在該條件下相當(dāng)穩(wěn)定。實(shí)施例9.通過基因體外重組(geneshuffle)創(chuàng)建RhBchE/HuBchE嵌合和HuBchE之間有23個(gè)氨基酸的差異。下文的表8顯示了來自八個(gè)隨機(jī)選擇克隆在HuBchE和RhBchE之間的不同氨基酸殘基。表8.HuBchE和RhBchE之間的不同氨基酸殘基。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>提高了該庫的多樣性同時(shí)不會(huì)引入太多可形成無功能酶的有害突變。實(shí)施例10.AD-介導(dǎo)的HuBchE表達(dá)。AD系統(tǒng)是另一種被廣泛用于表達(dá)人源蛋白的病毒表達(dá)系統(tǒng)。AD可以感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并允許重組蛋白在多種分裂和非分裂哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)。對(duì)來自用不同滴度重組病毒感染的細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行了BchE活性分析，培養(yǎng)基中的BchE活性顯示COS細(xì)胞感染后的HuBchE表達(dá)具有劑量依賴性以及時(shí)間依賴性。類似的結(jié)果可由CHO細(xì)胞獲得(數(shù)據(jù)未顯示)。如圖6所示，在培養(yǎng)基中積累的BchE活性隨時(shí)間呈指數(shù)增長。AD構(gòu)建體具有復(fù)制缺陷；當(dāng)COS細(xì)胞被感染時(shí)其它病毒顆粒不能被生成。因此，培養(yǎng)基中酶活性的連續(xù)提高提示感染的細(xì)胞在數(shù)天內(nèi)連續(xù)生成BchE酶。在用顯微鏡檢查時(shí)，由AD感染引起的CPE(細(xì)胞集中)直至感染后第4和第5天才較為明顯。圖6B顯示了培養(yǎng)基的western印跡分析，反映HuBchE以時(shí)間依賴性和劑量依賴性方式的存在，且與圖6A所示的結(jié)果具有很好的一致性。WT和G117H/E197QHuBchE的腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。ViralPowerAD表達(dá)系統(tǒng)被用于克隆HuBchE酶。對(duì)用于構(gòu)建庫的構(gòu)建過程的克隆和重組效率進(jìn)行了確定。通過在重組反應(yīng)中采用300ngpAD/CMV/V5/DEST質(zhì)粒并使用轉(zhuǎn)化效率為lxl0、fu/嗎的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，我們?cè)诿總€(gè)重組反應(yīng)中獲得了約50個(gè)重組克隆。對(duì)12個(gè)隨機(jī)選擇的克隆進(jìn)行限制性消化，揭示其中75%攜帶了正確的HuBchE插入物。這顯示為了克隆突變庫，采用10嗎的DNA進(jìn)行重組步驟，以及更有效的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞(lx1010cfu/(ig)可生成lxl06f組克隆。這證實(shí)了使用AD構(gòu)建體生成可有效進(jìn)行成功的功能篩選的大型突變庫的可行性。HuBchE-AD的生成以及確認(rèn)AD表達(dá)系統(tǒng)的重組WT和G117H/E197Q所述生成了重組WT-和Gl17H/E197Q-hBchE-AD，并進(jìn)行收集。圖7顯示了pAD-WT-hBchE和pAD-G117H/E197Q-hBchE轉(zhuǎn)染導(dǎo)致HuBchE活性的提升，而對(duì)照載體pAD-lacZ的轉(zhuǎn)染僅顯示一致的背景活性。這提示pAD-WT-hBchE和pAD-G117H/E197Q-hBchE的構(gòu)建是成功的。對(duì)高效OP解毒劑的功能篩選技術(shù)的IHiE。開發(fā)基于細(xì)胞的固相酶檢測方法相對(duì)其它采用培養(yǎng)基中酶測定的檢測方法具有顯著的優(yōu)勢(shì)，前者具有以更少的人力和成本處理相對(duì)大型的突變庫的能力。穩(wěn)定表達(dá)HuBchEWT或G117H/E197QHuBchE的CH0-K1細(xì)胞首先被用于確定檢測條件。洗滌預(yù)接種的細(xì)胞并以含1W瓊脂的無色MEM進(jìn)行覆蓋。瓊脂凝固后，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱(過夜)以使BchE酶分泌并擴(kuò)散在瓊脂中。根據(jù)顯微鏡下的觀察，在這樣的孵育條件下細(xì)胞可至少保持10天的健康狀態(tài)。含1mMBchl和0.1mMDTNB的Ellman反應(yīng)混合物可在含1%瓊脂的無色MEM中制備。將反應(yīng)混合物覆蓋在上述制備的細(xì)胞培養(yǎng)平板上，并在室溫下孵育。在Ellman反應(yīng)中形成視覺可測的黃色，并在孵育10分鐘后掃描該平板。該平板還可在40分鐘孵育后以平板閱讀器(Victor2，PerkinElmer)檢測OD405吸收(數(shù)據(jù)未顯示)。該實(shí)驗(yàn)揭示細(xì)胞表達(dá)的HuBchE可擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂，且在提供Ellamn反應(yīng)試劑時(shí)會(huì)積累視覺可測的黃色產(chǎn)物。瓊脂和瓊脂糖作為固相介質(zhì)的比較。在上述測定中，盡管我們可容易地通過出現(xiàn)黃色檢測BchE的水解，我們發(fā)現(xiàn)該黃色產(chǎn)物并不一直穩(wěn)定，且會(huì)在長期孵育(數(shù)小時(shí)至過夜)中消失。由于我們對(duì)部分酯底物如OP化合物預(yù)期更長的孵育時(shí)間，我們需要解決這一穩(wěn)定性問題。如圖8所示，在前30-60分鐘內(nèi)產(chǎn)物的形成不受涂覆的兩層中的瓊脂或瓊脂糖影響，提示HuBchE以類似的方法生成并擴(kuò)散進(jìn)入固相。然而，在更長的孵育周期中，固相中瓊脂的存在可導(dǎo)致脫色和吸收減少。僅當(dāng)在兩層中均用瓊脂糖涂覆細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)物才會(huì)在長期孵育中穩(wěn)定(圖8B)。HuBchE活性的局部檢測。開發(fā)固相活性篩選的優(yōu)勢(shì)之一在于它在小的局部區(qū)域鑒定功能活性的能力。使得可以以成本效益的方式方便地篩選大型庫。我們采用連續(xù)稀釋的穩(wěn)定表達(dá)WTHuBchE的CHO-K1細(xì)胞檢測了當(dāng)前已開發(fā)的檢測方法是否具有這種優(yōu)勢(shì)。如圖9所示，在底物添加數(shù)分鐘內(nèi)，在HuBchE表達(dá)細(xì)胞的對(duì)應(yīng)位置具有明顯的肉眼可見的黃斑。對(duì)于具有更多細(xì)胞克隆(約100/平板)的平板，這些斑塊混合在一起，無法進(jìn)行區(qū)分(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)于約20克隆/平板的平板，這些黃斑可容易地被區(qū)分開(圖9)。在IOcm培養(yǎng)皿上區(qū)別鑒定約20個(gè)反應(yīng)性斑點(diǎn)的能力提示只要在功能篩選中檢測到的陽性克隆少于20個(gè)，便可將大型庫放在培養(yǎng)平板上。陽性克隆可在連續(xù)稀釋后容易地純化。實(shí)施例11.將固相BchE活性檢測方法用于檢測AD-BchE重組病毒。我們嘗試通過固相BchE活性檢測方法來檢測AD-重組病毒。AD系統(tǒng)的使用通常涉及緩慢的滴定過程，因?yàn)榘邏K的形成較為緩慢。BchE活性檢測方法可開發(fā)用于在更短時(shí)間內(nèi)估計(jì)病毒滴度的替代方法。連續(xù)稀釋的HuBchE-AD病毒可用于感染預(yù)接種在6孔板上的293A細(xì)胞。感染后1小時(shí)將瓊脂糖-MEM混合物覆蓋在細(xì)胞上。在初始感染的次日對(duì)平板上的BchE活性進(jìn)行染色。盡管更高滴度感染的細(xì)胞在感染后第2天被染黃，在感染后4天的低滴度感染微孔中出現(xiàn)了與圖9類似的顯著黃斑。感染后4天，使用Bchl和DTNB的30分鐘內(nèi)形成黃斑。對(duì)形成的斑點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。在形成了多個(gè)斑點(diǎn)的微孔中，這種黃色很快融合在一起。在具有4個(gè)或4個(gè)以下斑點(diǎn)的微孔中進(jìn)行斑點(diǎn)鑒別較為容易。采用此處開發(fā)的檢測方法來取代傳統(tǒng)的斑塊檢測法進(jìn)行病毒滴度確定可為每個(gè)滴定過程節(jié)約大概7天。從鑒定的黃斑分離病毒，并從瓊脂糖培養(yǎng)平板挖出填料。圖9顯示了在實(shí)驗(yàn)中分離的具體填料的圖示。由經(jīng)過高病毒滴度感染并在BchE活性染色后顯示黃色的微孔可分離得到陽性填料。由經(jīng)過最高病毒稀釋物感染且在BchE活性染色后不顯示黃色的微孔可分離得到陰性填料。樣本填料可從染色后形成顯著黃斑的微孔分離，將斑塊挖出成為樣本填料。背景填料可從染色后形成顯著黃斑的徵孔分離，將鄰近斑塊的未染色區(qū)域挖出成為背景填料。將分離的填料轉(zhuǎn)移至含有0.5ml培養(yǎng)基的管中，并在4。C下孵育過夜。將來自陽性填料和樣本填料的培養(yǎng)基稀釋10倍。然后使用與填料孵育的培養(yǎng)基(N1至3，Pl至3，Sl至3和Bl至3)和稀釋培養(yǎng)基(P'1至3和S'1至3)感染預(yù)接種在24孔板中的293A細(xì)胞。培養(yǎng)基中的BchE活性在感染后24和48小時(shí)測定，表9顯示了平均活性。表9.培養(yǎng)基中各填料的BchE活性。HrW-3Bl-32德023*0.0448.000.2純0372.000.35±0.056.47±1.91HrPl-324.004膽4.14*0.9172,W6,52*0.75掛S!-324,000,93*0.094謹(jǐn)4.24土0.3(J7雄錫士L2942陰性填料未導(dǎo)致BchE表達(dá)(Nl-3)。陽性和樣本填料可提高BchE活性(Sl-3和Pl-3)。有趣的是，從接近樣本填料處分離的背景填料可導(dǎo)致較低的活性水平(Bl-3，48小時(shí))。該活性水平低于從樣本或活性填料獲得的IO倍稀釋液(Bl-3，S'l-3和Fl-3)。該結(jié)果揭示l)我們能夠通過分離染成黃色的瓊脂糖填料來分離HuBchE-AD;2)來自填料的病毒擴(kuò)散至附近區(qū)域并可能導(dǎo)致附近填料(<0.5cm)小于10%的污染。進(jìn)一步分離病斑將顯著提高各填料中的病毒純度。這些結(jié)果已作為II期功能篩選設(shè)計(jì)的重要參考點(diǎn)。功能篩選檢測方法的驗(yàn)證。為了驗(yàn)證固相功能篩選并測驗(yàn)使用該固相檢測方法從突變庫鑒定OP催化劑的可行性，將AD-G117/E197Q重組病毒(IOpfu)與不同量的野生型HuBchE重組病毒(O、10、100和500pfu)混合。用混合的重組病毒感染293A細(xì)胞。感染后24小時(shí)，以含1%瓊脂糖的MEM覆蓋細(xì)胞。感染后48小時(shí)，向涂覆的細(xì)胞加入0.4mM化合物1，與表達(dá)的重組HuBchE和突變體相互作用。在感染后的第4天，如上所迷以BchI作為底物在DTNB的存在下對(duì)涂覆細(xì)胞染色。在以相同數(shù)量的AD-G117H/E197QHuBchE病毒(混合有數(shù)量增加的AD-WTHuBchE病毒)感染的平板中得到類似數(shù)量的黃斑。從平板中挖出黃色瓊脂糖斑點(diǎn)，并與無血清培養(yǎng)基在單獨(dú)的管中醉育。使用與基因插入物相交的AD特異性引物進(jìn)行的PCR分析培養(yǎng)基中釋放的重組病毒。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。序列分析證實(shí)在前3個(gè)平板(帶有10pfu的G117H/E197Q以及O、10和100pfu的WTHuBchE)分離的填料中攜帶干凈的G117H/E197Q序列。對(duì)于帶有10pfuG117H/E197Q混合500pfuWTHuBchE的平板，可觀察到G117H/E197Q和WT的混合序列。這些實(shí)驗(yàn)證明通過AD表達(dá)系統(tǒng)，固相檢測方法可從OP敏感的重組病毒背景中分離對(duì)化合物1耐受的HuBchE變體。當(dāng)背景水平重組病毒水平較高時(shí)，填料純化步驟將提高分離效率。用點(diǎn)飽和突變庫的功能篩選系統(tǒng)的優(yōu)化和驗(yàn)證。此處顯示了功能篩選系統(tǒng)用于分子進(jìn)化法的可行性。在高通量功能篩選中對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行了改良，并完全驗(yàn)證了它的靈敏度、處理能力以及再現(xiàn)性。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，在兩個(gè)氨基酸位置G117和E197進(jìn)行了點(diǎn)飽和突變。采用了上文簡述的點(diǎn)飽和突變技術(shù)。對(duì)最終的全長PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并驗(yàn)證了整合的突變密碼子。質(zhì)粒DNA由七個(gè)隨機(jī)選擇的pAD-huBuChE克隆制備得到。對(duì)來自這七個(gè)克隆的BchE編碼區(qū)進(jìn)行了測序和分析。測序結(jié)果揭示這七個(gè)克隆代表了在氨基酸位置117和197具有高度多樣性的庫。該多樣性庫作為功能選擇的基礎(chǔ)。功能篩選。根據(jù)以上顯示的結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)了使用上述開發(fā)的系統(tǒng)對(duì)OP催化性酶進(jìn)行功能篩選的工作流程圖(方案12)。該功能篩選涉及固相篩選、液相篩選、斑塊純化、活性確認(rèn)、基因擴(kuò)增和測序。該設(shè)計(jì)的工作流程可以鑒定具有所需的有機(jī)或無機(jī)酯水解催化活性的BchE變體。類似的方法可用于分離可卡因催化性酶。綜上，我們從獼猴克隆了新BchE酶，并對(duì)底物特異性和抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了鑒定。我們合成了三種可用于OP催化性酶功能篩選的OP類似化合物。我們構(gòu)建了突變庫，并驗(yàn)證了用于BchE功能婦選的AD高水平表達(dá)系統(tǒng)。并同時(shí)開發(fā)和驗(yàn)證了基于固相活性的功能篩選。本發(fā)明建立的技術(shù)和研究工具提供了分子進(jìn)化的充分能力，將HuBchE持續(xù)改善為針對(duì)神經(jīng)毒劑、可卡因或其它潛在的有害有機(jī)或無機(jī)酯的催化性解毒酶。實(shí)施例12.新型OP類似物的化學(xué)合成。分別設(shè)計(jì)了模擬神經(jīng)毒劑VX、梭曼和沙林的OP類似物。方案l.(A)常用的神經(jīng)毒劑的結(jié)構(gòu)和(B)模擬相應(yīng)神經(jīng)毒劑的模型有機(jī)44磷酸酯化合物的化學(xué)合成c<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>O共12,3化合物l，R-dH^CHfCH^化合物2，R《M,C(CHj^化合物3,:RaCMjCI^NpS^CM^Jj的TBf^甲—蕃—1)ROHHCL,勁H2,P稀，賴通鄉(xiāng)3ESM,H5t;贈(zèng)《!,Na2C03,如方案1所示，一般的步驟包括(士)-麻黃堿和二氯甲基疏代膦反應(yīng)形成2,3,4-三甲基-5-苯基-1,3,2-噁唑磷烷-2-疏酮。根據(jù)順序2,3,4-三甲基-5-苯基-1,3,2-噁唑磷烷-2-硫酮與醇反應(yīng)，然后進(jìn)行氫解。用碘甲烷烷基化所得的烷基氫甲基疏代膦酸酯以提供所需的O-烷基S-甲基甲基硫代膦酸酯化合物。該目標(biāo)化合物的化學(xué)合成方法包括所有中間體的鑒定，并顯示如下。2，3，4-三甲基-5-苯基-l，3，2-噪唑磷烷-2-疏酮的合成2,3,4-三甲基-5-苯基-1,3,2-噪唑磷烷-2-硫酮的外消旋混合物可參照Cooper，等人(J.Chem.Soc.PerkinTrans.1977，17，1969-80)的步驟制備(方案2)。方案2.2，3，4-三甲基-5-苯基-1，3，2-噁唑磷烷-2-疏酮的合成。sTEA,甲苯將二氯甲基疏代膦(8.0g,53.7mmol)的甲苯溶液(25mL)緩慢添加至(士)-麻黃堿(13.0g，64.4mmol)在三乙胺(27.2g，268mmol)和甲苯(210mL)中的攪拌溶液中。添加完成后將反應(yīng)混合物在室溫和氬氣下暗處攪拌24小時(shí)，過濾，用水洗滌，干燥(MgS04)，并真空濃縮得到淺黃色油。在二氧化硅上柱層析(己烷/乙酸乙酯，3:1,v/v)得到油狀的非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的混合物(5.39g,22.4mmo1，42%)。TLC(己烷/乙酸乙酯，3:1，v/v)RF=0.26;lHNMR(CDC13)7.24-7.37(m，5H)，5.64(dd,JHP=3.0Hz,JHH=6.0Hz，0.5H)，5.47(dd，JHP=2.1Hz，JHH=5.7Hz，0.5H)，3.61(m,1H)，2.75(d，JHP=12.3Hz，1.5H)，2.66(d，JHP=12.0Hz，1.5H)2.04(d，JHP=14.4Hz，1.5H),l,93(d，JHP=14.0Hz，1.5H)，0.80(d,JHP=6.6Hz，1.5H),0.73(d，JHP=6.6Hz,1.5H);MS(ESI)[M+H]+m/z對(duì)CnH18NOPS計(jì)算得到242，測得242。方案3.用于異丁基氯甲基琉代膦酸酯合成的中間體化合物5的合成。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>如方案3所示，將含于異丁基醇(3mL)和干甲基乙基酮(MEK,3mL)的千HC1飽和溶液緩慢添加至2，3，4-三甲基-5-苯基-l,3,2-噁唑磷烷-2-疏酮(1.05g，4.36mmol)在異丁基醇(7mL)和MEK(7mL)中的冰凍、攪拌溶液中。將反應(yīng)混合物在暗處室溫下攪拌1.5小時(shí)，然后注入冰冷的10%Na2CO3水溶液(25mL)。該水性混合物可不經(jīng)純化直接用于下述的氫化反應(yīng)。異丁基氫甲基疏代膦酸酯的合成。方案4.異丁基氫甲M代膦酸酯的合成。V、EtOH,H20H，，瞎C，、o'用水(50mL)和乙醇(75mL)稀釋來自前述反應(yīng)并包含5的粗品混合物。向該溶液添加Pd/C(160mg)，然后將填充了H2(g)的氣球裝入該圓底燒瓶。經(jīng)過處理并以氯仿/異丙基醇(4:l，v/v)萃取后合并有機(jī)層，干燥(MgS04)，過濾，并濃縮提供粗品油(390mg，53%)。1HNMR(CDC13)3.79(m,2H),1.91(m，1H)，1.82(d,JHP=15.6Hz，3H)0.90(d，J=6.9Hz，6H).O-異丁基S-甲基甲基石克代膦酸酯的合成。方案5.O-異丁基S-甲基甲基統(tǒng)代膦酸酯的合成。s9如方案5所示，向6(302mg，1.79mmol)在用乙醇(25mL)稀釋的10%Na2C03(aq)(2.5mL)中形成的溶液中添加碘甲烷(2.54g，17.9mmol)。24小時(shí)后，處理該反應(yīng)物并用水洗滌有機(jī)物質(zhì)，干燥(MgS04)，真空濃縮以^是供淺褐色油。以Kugelrohr裝置經(jīng)過球?qū)η驕p壓蒸餾(bulb-to-bulbdistillation)得到透明油狀的純產(chǎn)物(100mg,0.55mmol，31%)。1HNMR(CDC13)3.75(m，2H)，2.21(d，JHP=12.9Hz，3H)，1.88(m,1H),1.71(d，JHP=15.6Hz,3H)。中間體化合物9的合成。方案6.中間體化合物9的合成。47蓉h-》、ph如方案6所示，將干HC1的新戊基醇(3.0mL)和干甲基乙基酮(MEK，3mL)飽和溶液緩慢添加至2,3,4-三甲基-5-苯基-l,3,2-噁唑磷烷-2-疏酮(1.05g，4.36mmol)在新戊基醇(7.0g，79.4mmol)和MEK(7mL)中形成的冰凍、攪拌溶液中。將反應(yīng)混合物在暗處室溫下攪拌1.5小時(shí)，然后注入冰冷的10%Na2CO3水溶液(25mL)中。該水性混合物可不經(jīng)純化直接用于如下所述的氫化反應(yīng)。新戊基氫甲M代膦酸酯的合成。方案7.新戊基氬甲M代膦酸酯的合成。sH3<L鳳S2;以及相應(yīng)的塔崩類似物。S-烷基甲基硫代膦酸酯可采用必要的醇鈉或含于醇中的溴和含于醇中的硝酸銀進(jìn)行親核置換。烷氧化物和AgN03/ROH反應(yīng)提供了在磷上的約80%的構(gòu)型轉(zhuǎn)化，而采用Br2/ROH的置換反應(yīng)可^是供100%的構(gòu)型轉(zhuǎn)化。該溴促進(jìn)的替換通常較快且具有高產(chǎn)率。然而，據(jù)報(bào)道在某些空間擁擠的位置，溴促進(jìn)的醇解可在構(gòu)型基本保留的情況下進(jìn)行。羧酸的保護(hù)可能是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)率所必須的。或者，使用Br2/Fmoc-絲氨酸或-酪氨酸反應(yīng)。如果該反應(yīng)未產(chǎn)生令人滿意的產(chǎn)率，則可進(jìn)行改良。我們?cè)ㄟ^NMR實(shí)驗(yàn)觀察到以間位氯過苯甲酸(MCPBA)氧化活化l-13(實(shí)施例13)形成能被親核試劑快速攻擊的S-氧化物。因此，l-13(實(shí)施例13)的S-氧化物的處理以及痕量水的添加快速定量地形成了相應(yīng)的醇(通過LCMS判斷)，其中該S-(0)-CH3基團(tuán)被OH基團(tuán)替換。在1.2當(dāng)量MCPBA/CHCu的存在下將l-13(實(shí)施例13)在4°C下處理5分鐘，然后添加1當(dāng)量的FmocSer將同樣能夠有效地生成所需的OP-結(jié)合的Fmoc絲氨酸或酪氨酸。將OP-結(jié)合的Fmoc絲氨酸或酪氨酸整合進(jìn)入所述普通八肽合成，將提供所需的用于免疫研究的OP-結(jié)合十肽。61對(duì)Che或白蛋白的活性位點(diǎn)有機(jī)磷酸化絲氨酸的抗血清。對(duì)于人、靈長動(dòng)物和大鼠AchE以及人、靈長動(dòng)物和大鼠BuChE,在絲氨酸活性位點(diǎn)兩側(cè)的五個(gè)氨基酸均相同(即TLFGESAGAAS)(SEQIDNO:ll)?；谠撔畔ⅲ腖FGESAGAAC(SEQIDNO:12)被用于開發(fā)OP-結(jié)合物選擇性抗血清。人白蛋白肽的部分序列(YKFQNALLVRYTKKVPQV)(SEQIDNO:13)、大鼠白蛋白肽的部分序列(YGFQNAILVRYTQKAPQV)(SEQIDNO:14)和小鼠白蛋白肽的部分序列(YGFQNAILVRYTQKAPQV)(SEQIDNO:15)同樣地被用于抗血清的獲取。加合蛋白也可被直接使用。重要之處在于用半胱氨酸或含疏接頭替換末端絲氨酸。這將為生物探測器提供必要的吸附化學(xué)作用(在下文討論)。所述十肽的總體使用將節(jié)約資源(因?yàn)樗鼘?duì)AChE和BuChE均適用)并允許抗血清的更大利用。以下ChE將同時(shí)代表兩種酶(以及類似物，白蛋白)。代號(hào)10S和10SP指非磷酸化十肽和磷酸化十肽?？?ChE10S和抗-ChE10SP抗血清可通過用已有描述的結(jié)合了匙孔血藍(lán)蛋白的ChE10S和ChE10SP肽免疫兔后生成。應(yīng)當(dāng)注意從OP-結(jié)合的肽(ChE10SP)獲得抗血清的同時(shí)從天然或非結(jié)合肽(ChE10S)獲得抗血清作為對(duì)照。該結(jié)合可通過標(biāo)準(zhǔn)步驟實(shí)現(xiàn)。兔可由商業(yè)實(shí)驗(yàn)室以標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行免疫。除了ChE10SP十肽包含來自神經(jīng)毒劑l-13(實(shí)施例13)的相同OP-結(jié)合物外，所需的肽通過上述的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行合成。抗血清以DEAEAffi-gel藍(lán)膠柱進(jìn)行層析純化。OP-結(jié)合的十肽通過Cys偶合至Affi-gel珠，以這些珠子純化該抗血清。特異性較低的抗血清通過1MNaSCN洗脫，而十肽特異性洗脫組分(以lM甘氨酸-HCl洗脫并迅速緩沖至pH8)通過ELISA分析確認(rèn)特異性抗體。Western印跡如上進(jìn)行。為了鑒定該抗血清的特異性，用0.5mM神經(jīng)毒劑類似物l-13(實(shí)施例13)或運(yùn)載體THF在4。C下處理大鼠、靈長動(dòng)物和人AChE以及BuChE或白蛋白622小時(shí)或直至根據(jù)Ellman比色法測定的酶活下降至1-2%。酶可由動(dòng)物血清或重組來源通過親和純化得到。我們的實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有重組HuChE和靈長動(dòng)物BuChE，大鼠BuChE可從大鼠血清純化得到。AChE可從動(dòng)物血細(xì)胞膜中純化得到。被抑制的酶可通過采用變性凝膠的免疫印跡進(jìn)行分析。作為陽性對(duì)照，可通過多克隆抗-ChE抗血清標(biāo)記免疫印跡，以顯示存在同等的識(shí)別以及存在完整的酶。在不同OP-結(jié)合和非結(jié)合的酶之間的竟?fàn)幮詫?shí)驗(yàn)可通過OP-選擇性抗血清檢測以顯示特異性。這將測試我們有關(guān)抗-ChE10SP對(duì)OP-結(jié)合的絲氨酸具有特異性同時(shí)也對(duì)結(jié)合的OP具有特異性的假設(shè)。在單個(gè)凝膠和免疫印跡中，對(duì)處理的作用進(jìn)行比較，并對(duì)各處理?xiàng)l件下含等量蛋白的樣本進(jìn)行了檢測。在各抗血清的線性范圍內(nèi)用密度分析對(duì)采用抗-ChE10SP抗血清和對(duì)照抗血清標(biāo)記的蛋白條帶強(qiáng)度的變化進(jìn)行定量?？寡灞挥迷陉嚵惺缴锾綔y器中，以在生物液體或環(huán)境樣本中檢測作為OP暴露選擇性探針的OP衍生的Chef。本說明書中所引用的所有出版物和專利申請(qǐng)均引用作為參考，其引用程度如同每一個(gè)單獨(dú)的出版物和專利申請(qǐng)均被特定單獨(dú)地引用作為參考一樣。盡管前述發(fā)明已通過闡述和實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)應(yīng)當(dāng)能夠輕易理解可在不脫離附加權(quán)利要求的精神和范圍的情況下對(duì)其進(jìn)行一定的更改和調(diào)整。6權(quán)利要求1.一種解毒方法，該方法包括將丁酰膽堿酯酶(BchE)與有機(jī)磷酸酯制劑、濫用的藥物、除草劑或殺蟲劑相接觸。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在體內(nèi)。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在體外。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述有機(jī)磷酸酯制劑為選自沙林、梭曼、GF、塔崩和VX的神經(jīng)毒劑。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述有機(jī)磷酸酯制劑為選自化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13的化合物。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述濫用的藥物為可卡因。7.—種針對(duì)丁酰膽堿酯酶(BchE)活性篩選化合物的方法，該方法包括以下步驟a)將BchE與所述化合物進(jìn)行孵育；并b)檢測BchE的抑制作為所述化合物的生物或藥理活性的指標(biāo)。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE或其變體。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述化合物選自化合物1、2、3、4、5、10.—種在載體中制備BchE突變庫的方法。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述載體為pENTRA或腺病毒載體。12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE或其變體。13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述BchE為人BchE或其變體。14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE和人BchE或其變體的混合物。15.—種通過將BchE突變庫包裝在腺病毒顆粒中用重組腺病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)爿包的方法。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE或其變體。17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述BchE為人BchE或其變體。18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE和人BchE或其變體的混合物。19.一種檢測如權(quán)利要求9所述的被感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基中BchE表達(dá)的方法，該方法包4舌以下步驟a)收集感染后培養(yǎng)基；以及b)分析所述培養(yǎng)基中的BchE活性。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述BchE活性采用Ellman法或western印跡分析進(jìn)行分析。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE或其變體。22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述BchE為人BchE或其變體。23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE和人BchE或其變體的混合物。24.—種檢測表達(dá)BchE的原核或真核細(xì)胞中的BchE的方法，該方法包括以下步驟a)在選自化合物l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13的有機(jī)磷酸酯化合物的存在下，用含瓊脂糖的培養(yǎng)基覆蓋所述細(xì)胞；b)將步驟(a)的混合物孵育不同的時(shí)間長度；并c)在碘化丁酰硫代膽堿和DTNB的存在下，在含瓊脂糖的覆蓋緩沖液中;f僉測BchE活性。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE或其變體。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述BchE為人BchE或其變體。27.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE和人BchE或其變體的混合物。28.—種通過表達(dá)BchE的原核或真核細(xì)胞檢測BchE的方法，該方法包括以下步驟a)在神經(jīng)毒劑或殺蟲劑的存在下，以含瓊脂糖的培養(yǎng)基覆蓋所述細(xì)胞；b)將步驟(a)的混合物孵育不同的時(shí)間長度；并c)檢測含碘化丁酰硫代膽堿和DTNB的含瓊脂糖的覆蓋緩沖液中的BchE活性。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE或其變體。30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述BchE為人BchE或其變體。31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述BchE為恒河猴BchE和人BchE或其變體的混合物。32.如權(quán)利要求24或28所述的方法，其中BchE的細(xì)胞表達(dá)來自于如權(quán)利要求15中所述的重組病毒感染。33.—種分離表達(dá)BchE的重組病毒的方法，該方法包括如權(quán)利要求24所述的步驟，進(jìn)一步包括從選擇性染色的黃斑處挖出瓊脂糖填料，并將該填料轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)基。34.—種對(duì)如權(quán)利要求33所述的分離的填料進(jìn)行表征的方法，進(jìn)一步包括用與所述填料一起孵育的培養(yǎng)基來感染細(xì)胞，并通過如權(quán)利要求19，24或28任意一項(xiàng)所述的方法監(jiān)測BchE的表達(dá)。35.—種從如權(quán)利要求33所述的分離的填料中純化單獨(dú)重組病毒的方法，該方法包括連續(xù)稀釋所述培養(yǎng)基，如權(quán)利要求15所述以稀釋的培養(yǎng)基感染細(xì)胞，如權(quán)利要求32所述檢測BchE，并如權(quán)利要求33所述分離單獨(dú)的染色填料。36.—種對(duì)如權(quán)利要求33或35所述的分離的填料進(jìn)行表征的方法，該方法通過用腺病毒載體和/或BchE基因特異性引物對(duì)與所述填料一起孵育的培養(yǎng)基中的重組病毒所編碼的BchE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。37.編碼恒河猴丁酰膽堿酯酶(RhBchE)突變體及其片段的分離和純化的DNA。38.用于檢測OP物質(zhì)、濫用的藥物、除草劑或殺蟲劑的陣列式生物探測器。全文摘要本發(fā)明涉及無機(jī)或有機(jī)酯的解毒方法，所述無機(jī)或有機(jī)酯包括OP神經(jīng)毒劑、可卡因和相應(yīng)的類似物。更具體而言，通過闡述用于治療的更有效的水解酶，本發(fā)明涉及對(duì)具有潛在神經(jīng)毒性的酯或其它酯基團(tuán)的處理。本發(fā)明提供了合成的OP類似物的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了用于檢測生物和環(huán)境樣本中的OP毒劑的診斷方法和陣列式生物探測器。文檔編號(hào)C12N9/18GK101500600SQ200780029116公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2007年6月5日優(yōu)先權(quán)日2006年6月7日發(fā)明者軍張,約翰·R·卡什曼申請(qǐng)人:人類生物分子研究所