專利名稱：：制備l-甲硫氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及高效制備L-甲硫氨酸的微生物和方法。具體地，本發(fā)明所涉及的方法中可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量是增加的。
背景技術(shù)：
：當前，全世界甲硫氨酸的年產(chǎn)量是大約500,000噸。甲硫氨酸是禽類家畜詞養(yǎng)的首要限制性氨基酸，且因此主要作為飼料補充物而使用。與其他工業(yè)氨基酸不同的是，甲硫氨酸幾乎完全以化學(xué)合成產(chǎn)生的D-和L-甲硫氨酸的外消旋物而使用。由于動物能夠代謝甲硫氨酸的兩種立體異構(gòu)體，因此直接飼喂化學(xué)方法產(chǎn)生的外消旋混合物是可行的(D'MelloandLewis,EffectofNutritionDeficienciesinAnimals:AminoAcids,Rechgigl(Ed.),CRCHandbookSeriesinNutritionandFood,441-490，1978)。不過，仍然需要以僅產(chǎn)生L-甲硫氨酸的生物技術(shù)方法來替代現(xiàn)有的化學(xué)生產(chǎn)方法。這是因為低水平補充的L-甲硫氨酸相對于D-甲硫氨酸而言是更好的含硫氨基酸來源(KatzandBaker(1975)Poult.Sci.545:1667-74)。此外，化學(xué)方法使用更加危險的化合物且產(chǎn)生大量廢液。而高效的生物技術(shù)方法可完全避免化學(xué)生產(chǎn)的這些缺點。對于其他氨基酸例如谷氨酸，已知可采用發(fā)酵方法進行制備。為此，己經(jīng)證實某些微生物非常適合，如大腸桿菌(Esc/7en'c/H'aco/!')和谷氨酸棒桿菌(Coo^e6ac&Wwwg/wtom/cwm)。通過發(fā)酵產(chǎn)生氨基酸還有一個特別的優(yōu)勢，即僅產(chǎn)生L-氨基酸。此外也避免了使用對環(huán)境不利的化合物如溶劑等。不過，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)甲硫氨酸若要成為化學(xué)合成方法的替代方法，其必須滿足能夠以與化學(xué)方法生產(chǎn)相當?shù)某杀緦崿F(xiàn)商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)甲硫氨酸的要求。因此，生產(chǎn)L-甲硫氨酸需要通過大規(guī)模培養(yǎng)為大量產(chǎn)生并分泌該分子而開發(fā)的細菌。方法的改進可涉及發(fā)酵措施如攪拌和補充氧氣，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵過程中糖的濃度，或產(chǎn)物的處理如通過離子交換層析，7或微生物本身的內(nèi)在產(chǎn)量特性?？刹捎谜T變和突變體選擇的方法來改進微生物的產(chǎn)量特性。以此方式可獲得對抗代謝物具有抗性的高產(chǎn)菌株或是具有重要調(diào)節(jié)作用的代謝物的營養(yǎng)缺陷型高產(chǎn)菌株。一些年來也采用重組DNA技術(shù)通過擴增個別的氨基酸生物合成基因并研究其對氨基酸產(chǎn)量的作用而改進產(chǎn)生L-氨基酸的微生物菌株。Riickertetal.((2003)JournalofBiotechnology104:213-228)分析了谷氨酸棒桿菌中的L-甲硫氨酸生物合成途徑。MetZ(也稱為MetY)和MetB的已知功能得到了確認，而MetC(也稱為AecD)被證實是胱硫醚-卩-裂合酶。此外，該研究還鑒定了MetE和MetH，它們催化將L-同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為L-甲硫氨酸。WO02/097096使用了來自棒狀細菌的編碼McbR阻抑物基因(也稱為MetD)的核苷酸序列以及使用其中該McbR阻抑物基因被弱化的細菌來制備氨基酸的方法。根據(jù)WO02/097096，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物McbR的弱化提高了棒狀細菌中L-甲硫氨酸的產(chǎn)量。WO02/097096還披露，除了弱化McbR阻抑物基因以外，增強或過表達編碼胱硫醚-y-合酶的MetB基因?qū)χ苽銵-甲硫氨酸是優(yōu)選的。篩選為生產(chǎn)特定分子而改進的菌株是好使且困難的過程。因此，仍然亟需能夠高效產(chǎn)生L-甲硫氨酸和/或L-甲硫氨酸含量顯著提高的可用于獲得甲硫氨酸化合物的微生物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供在微生物中高效生產(chǎn)L-甲硫氨酸的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供高效生產(chǎn)L-甲硫氨酸的微生物。本發(fā)明的這些目的以及從說明書中可明了的其他目的可通過獨立權(quán)利要求的技術(shù)方案而實現(xiàn)。本發(fā)明的其他實施方式由從屬權(quán)利要求定義。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了在微生物中制備L-甲硫氨酸的方法，其中可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量是增加的。通過將微生物培養(yǎng)在富含絲氨酸的培養(yǎng)基中可增加微生物可利用的絲氨酸的量。8也可通過對微生物進行遺傳學(xué)修飾而增加可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了在微生物中制備L-甲硫氨酸的方法，其中所述微生物在富含絲氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了一種方法，其中所述微生物在參與絲氨酸代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面被遺傳學(xué)修飾。在參與絲氨酸代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面對微生物進行修飾可包括提高一或多種參與絲氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性、降低一或多種參與絲氨酸降解為丙酮酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性、提高一或多種參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性和/或降低一或多種參與絲氨酸自細胞中輸出的蛋白質(zhì)的含量和/或生物學(xué)活性。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方式，所述參與絲氨酸合成的酶選自D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)、磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)和磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SerC)。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式，所述參與絲氨酸合成的酶被修飾以降低或防止L-絲氨酸的反饋抑制。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方式，所述一或多種參與絲氨酸降解為丙酮酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的。優(yōu)選地，所述編碼參與絲氨酸降解的酶的基因被破壞，且最優(yōu)選地，所述基因被消除。所述參與絲氨酸降解的酶優(yōu)選地是sdaA。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方式，一或多種參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)的含量和/或生物學(xué)活性與野生型生物體相比是降低的，優(yōu)選地，所述編碼所述參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)的基因被破壞，且最優(yōu)選地，所述基因被消除。所述參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)優(yōu)選地是ThrE。根據(jù)本發(fā)明的方法的再一個實施方式，一或多種參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的。所述參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶優(yōu)選地選自絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，除了通過在富含絲氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物而增加可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量和/或在參與絲氨酸代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面對微生物進行遺傳學(xué)修飾以外，一或多9種參與甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型生物體相比是升高的。優(yōu)選地，所述參與甲硫氨酸合成的酶選自高絲氨酸-o-乙酰轉(zhuǎn)移酶(MetA)、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(O-acetylhomoserinesulfhydrolase)(MetZ)、鈷胺素(I)依賴性甲硫氨酸合酶I(cob(I)alamindependentmethioninesynthaseI)(MetH)和鈷胺素(I)非依賴性甲硫氨酸合酶II(cob(I)alaminindependentmethioninesynthaseII)(MetE)、天冬氨酸激酶(lysC)和高絲氨酸脫氫酶(hom)。在本發(fā)明的方法的另一個實施方式中，除了通過在富含絲氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物而增加可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量和/或在參與絲氨酸代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面對微生物進行遺傳學(xué)修飾以外，一或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白的含量和/或生物學(xué)活性與野生型生物體相比是降低的。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白是MbcR，其如果存在，可阻抑編碼用于合成甲硫氨酸的酶的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方式，所述微生物選自棒狀細菌、分枝桿菌、鏈霉菌科、沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌和假單胞菌。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方式，所需的L-甲硫氨酸于培養(yǎng)基或所述微生物的細胞中濃縮。在本發(fā)明的另一個方面，提供了從發(fā)酵肉湯制備含L-甲硫氨酸的動物詞料添加劑的方法，其包括以下步驟-在一方法中使用微生物制備L-甲硫氨酸，所述方法中可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量是增加的；-自含L-甲硫氨酸的發(fā)酵肉湯中除去水；-除去發(fā)酵過程中形成的生物量的0至100wt,%，如10-90wt,%、或20-80wt,%、或30-70wt,0/。、或40-60wt,0/。、或約50wt,o/o;禾口-干燥所述發(fā)酵肉湯以獲得粉狀或顆粒狀的動物飼料添加劑。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了超量產(chǎn)生L-甲硫氨酸的微生物，其中-一或多種參與絲氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的；和/或10-一或多種參與絲氨酸降解為丙酮酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的；和/或-一或多種參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的；和域-一或多種參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的；且其中-一或多種參與甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的；和/或-一或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的。此外，本發(fā)明的另一個方面涉及微生物在生產(chǎn)L-甲硫氨酸中的用途，所述微生物經(jīng)遺傳學(xué)修飾后其中絲氨酸的量是升高的，且所述微生物在甲硫氨酸合成方面是遺傳學(xué)修飾的。圖la是微生物如谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸生物合成途徑的模型。參與絲氨酸合成的酶為SerA(D-3-磷酸甘油酸脫氫酶)、SerB(磷酸絲氨酸磷酸酶)和SerC(磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)。參與絲氨酸降解的酶為sdaA(絲氨酸脫水酶)。絲氨酸經(jīng)glyA-shmt(絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)的活性被轉(zhuǎn)化為甲基供體亞甲基四氫葉酸，該酶催化將亞甲基轉(zhuǎn)移至四氫葉酸。該反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)品是甘氨酸。圖lb是微生物如谷氨酸棒桿菌中L-甲硫氨酸生物合成途徑的模型。參與的酶是MetA(高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶)、MetB(胱硫醚^-合酶)、MetZ(0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶)、MetC(胱硫醚-P-裂合酶)、鈷胺素(I)依賴性甲硫氨酸合酶I(MetH)和鈷胺素(I)非依賴性甲硫氨酸合酶II(MetE)。具體實施方式詳述在詳細描述本發(fā)明的示例性實施方式之前，先給出以下定義。術(shù)語"甲硫氨酸合成效率"描述的是甲硫氨酸的碳產(chǎn)率(carbonyieldofmethionine)。這種效率以碳底物形式進入系統(tǒng)的能量輸入的百分比進行計算。除非另有說明，否則在本發(fā)明中，該值以百分數(shù)表示((甲硫氨酸摩爾數(shù))(碳底物摩爾數(shù))-1x100)。術(shù)語"絲氨酸合成效率"描述的是絲氨酸的碳產(chǎn)率。這種效率以碳底物形式迸入系統(tǒng)的能量輸入的百分比進行計算。除非另有說明，否則在本發(fā)明中，該值以百分數(shù)表示((絲氨酸摩爾數(shù))(碳底物摩爾數(shù))"x100)。本發(fā)明的優(yōu)選的碳源是糖，例如單糖、二糖或多糖。例如，選自如下一組的糖可作為特別優(yōu)選的碳源葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。術(shù)語"提高的甲硫氨酸合成效率"涉及培養(yǎng)在富含絲氨酸的培養(yǎng)基中和/或經(jīng)遺傳學(xué)修飾且具有更高甲硫氨酸合成效率的微生物與培養(yǎng)在標準條件下的野生型生物體之間的比較。術(shù)語"甲硫氨酸的產(chǎn)率"描述的是按照每單位重量細胞量所獲得的甲硫氨酸的量而計算出的甲硫氨酸的產(chǎn)率。術(shù)語"絲氨酸的產(chǎn)率"描述的是按照每單位重量細胞量所獲得的絲氨酸的量而計算出的絲氨酸的產(chǎn)率。術(shù)語"甲硫氨酸途徑"是本領(lǐng)域所熟知的，其描述的是發(fā)生在野生型生物體中并導(dǎo)致生物合成甲硫氨酸的一系列反應(yīng)。該途徑在不同生物體之間可有變化。有關(guān)生物體特異性途徑的詳情可參考教科書和以下網(wǎng)頁所列科技文獻http:〃www.genome.ip/hegg/metabolism.html。具體地，甲硫氨酸途徑在本發(fā)明中的意義見圖lb。術(shù)語"絲氨酸途徑"是本領(lǐng)域所熟知的，其描述的是發(fā)生在野生型生物體中并導(dǎo)致生物合成絲氨酸的一系列反應(yīng)。該途徑在不同生物體之間可有變化。有關(guān)生物體特異性途徑的詳情可參考教科書和以下網(wǎng)頁所列科技文獻http:〃www.genome.i。。具體地，絲氨酸途徑在本發(fā)明中的意義見圖la。術(shù)語"生物體"或"微生物"在本發(fā)明中指的是通常用于生產(chǎn)氨基酸如甲硫氨酸的任何生物體。具體地，術(shù)語"生物體"指的是原核細胞、低等真核細胞和植物。一組優(yōu)選的上述生物體包括放線菌、藍細菌、蛋白菌、橙色綠曲菌(C/2/orayZe;owawra""acw力、小塔螺屬物種1(i^e//"/"/)、嗜鹽菌和/或甲烷球菌，優(yōu)選地是棒狀細菌、分枝桿菌、鏈霉菌、沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌和/或假單胞菌。特別優(yōu)選的微生物選自谷氨酸棒桿菌、大12腸桿菌、芽孢桿菌屬微生物特別是枯草芽孢桿菌05a"7/wM^/to)、和鏈霉菌屬微生物。本發(fā)明的生物體也可包括酵母，例如粟酒裂殖酵母(5t/n,zosacc/Mro77^cespom6e)、酉良酒酵母(iSacc/7aramycescerev/w'ae)禾口巴斯德畢赤氏酵母(尸z'c/H'a;aston》。術(shù)語"超量產(chǎn)生L-甲硫氨酸的微生物"在本發(fā)明中指的是一種微生物，其與培養(yǎng)在標準條件下的野生型微生物相比，產(chǎn)生甲硫氨酸的效率和/或產(chǎn)率和/或量升高至少50%、至少70%、80%或90%、至少100%、至少200%、至少300°/。、400%或500%、至少600%、至少700%或800%、至少900%或至少1000%或更高。優(yōu)選地，所述微生物選自棒狀細菌、分枝桿菌、鏈霉菌科、沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌和假單胞菌。更優(yōu)選地，所述微生物是大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌。最優(yōu)選地，所述微生物是谷氨酸棒桿菌。術(shù)語"野生型生物體"或"野生型微生物"涉及未被遺傳學(xué)修飾的生物體。術(shù)語"代謝物"指的是在生物體代謝途徑中用作前體、中間物和/或終產(chǎn)物的化合物。此類代謝物不僅可作為化學(xué)構(gòu)建單元，還可對酶或其代謝活性發(fā)揮調(diào)節(jié)活性。從文獻可知，此類代謝物可抑制或刺激酶的活性(Stryer，Biochemistry(2002)W.H.Freeman&Company,NewYork,NewYork)。在本發(fā)明中，術(shù)語"外代謝物(extemalmetabolite)"包括底物例如葡萄糖、硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫化物、氨、氧氧氣、絲氨酸等等。在某些實施方式中，(外)代謝物包含所謂的Cl-代謝物類。該類代謝物可起到甲基供體的作用，其包括例如甲酸、甲醛、甲醇、甲硫醇、二甲基二硫化物等化合物。術(shù)語"產(chǎn)物"包括甲硫氨酸、生物量、co2、等等。氨基酸包含所有蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元，因此對于生物體內(nèi)正常的細胞功能是必需的。術(shù)語"氨基酸"是本領(lǐng)域已知的。蛋白源氨基酸(proteinogenicaminoacid)有20種，它們是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，在蛋白質(zhì)中通過肽鍵相連接，而非蛋白源氨基酸正常情況下不存在于蛋白質(zhì)中(見Ullmann'sEncyclopaediaofIndustrialChemistry,Vol.A2,pages57-97，VCH,Weinheim(1985))。氨基酸可以是D-或L-光學(xué)構(gòu)型的，不過L-氨基酸通常是天然存在的蛋白質(zhì)中的唯一類型。20種蛋白源氨基酸在原核細胞和真核細胞中的生物合成和降解途徑己經(jīng)得到清楚地表征(例如參見Stryer,L.Biochemistry,5thedition(2002))。必需氨基酸，即組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸，由于其生物合成復(fù)雜，因此需要從營養(yǎng)中獲得，但它們可通過簡單的生物合成途徑被容易地轉(zhuǎn)化為ll種非必需氨基酸，即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸。高等底物的確能夠合成這些氨基酸中的一部分，但飲食中必須提供必需氮基酸，這樣才能進行正常的蛋白質(zhì)合成。除了它們在蛋白質(zhì)生物合成中的功能，這些氨基酸本身也是令人感興趣的化合物，其中許多己經(jīng)用于食品業(yè)、飼料業(yè)、化學(xué)品、化妝品、農(nóng)業(yè)和制藥業(yè)。賴氨酸不僅在人類中是重要的營養(yǎng)氨基酸，在單胃動物如禽類和豬中也是如此。谷氨酸最常見的是用作調(diào)味劑，與天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸一樣，廣泛用于食品業(yè)。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸均用于制藥業(yè)。谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸用于制藥業(yè)和化妝品工業(yè)。蘇氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是常見的飼料添加劑(Leuchtenberger，W.(1996)，Aminoacids-technicalproductionanduse,p.466-502inRehmetal.(editors)Biotechnology,Vol.6,Chapter14a，VCH:Weinheim)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些氨基酸可用作前體，用于合成合成的氨基酸和蛋白質(zhì)，如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥色氨酸及其他，見Ullmann'sEncyclopaediaofIndustrialChemistry,Vol.A2，p.57-97，VCH:Weinheim,1985。天然氨基酸在能夠產(chǎn)生這些天然氨基酸的生物體例如細菌中的生物合成已經(jīng)被充分表征(有關(guān)細菌氨基酸的生物合成及其調(diào)控的綜述可參見UmbargerH.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47:533-606)。通過對擰檬酸循環(huán)的中間體a-酮戊二酸的還原性胺化可合成谷氨酸。隨后可自谷氨酸分別產(chǎn)生谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸。絲氨酸的生物合成經(jīng)過三個步驟，由3-磷酸甘油酸(糖酵解的中間體)開始，經(jīng)過氧化、轉(zhuǎn)氨作用和水解步驟后得到絲氨酸。半胱氨酸和甘氨酸均自絲氨酸產(chǎn)生前者是通過同型半胱氨酸與絲氨酸的縮合，而后者是通過在由絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)中將側(cè)鏈p-碳原子轉(zhuǎn)移給四氫葉酸。苯丙氨酸和酪氨酸是自糖酵解和戊糖磷酸途徑的前體赤蘚糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸合成的，其中在生物合成途徑的9個步驟中，兩者的不同僅在合成預(yù)苯酸(prephenate)之后的最后兩個步驟。色氨酸也產(chǎn)生自這兩種最初的分子，但其合成途徑包括ll個步驟。也可自苯丙氨酸合成酪氨酸，該反應(yīng)由苯丙氨酸羥化酶催化。丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸均為丙酮酸(糖酵解的終產(chǎn)物)的生物合成產(chǎn)物。天冬氨酸是從檸檬酸循環(huán)的中間體草酰乙酸形成的。天冬酰胺、甲硫氨酸、蘇氨酸和賴氨酸分別通過轉(zhuǎn)化天冬氨酸而產(chǎn)生。異亮氨酸可自蘇氨酸形成。組氨酸是經(jīng)過一種復(fù)雜的9個步驟的途徑而自5-磷酸核糖-l-焦磷酸酯(一種活化的糖)產(chǎn)生的。氨基酸如超過細胞合成蛋白質(zhì)所需的量則不能被儲存，而是降解產(chǎn)生中間體，用于細胞的主要代謝途徑(綜述見Stryer,L.，Biochemistry,5thedition(2002),Chapter23"ProteinTurnover:Aminoaciddegradationandtheureacycle")。盡管細胞能夠?qū)⑦^量的氨基酸轉(zhuǎn)化為有用的代謝中間體，但就能量、前體分子以及氨基酸合成所需的酶而言，產(chǎn)生氨基酸的代價是很高的。因此，氨基酸的生物合成受到反饋抑制(其中特定氨基酸的存在減慢或完全阻止該氨基酸本身的產(chǎn)生)并不出乎意料(有關(guān)氨基酸生物合成途徑的反饋機制的綜述見Stryer,L.，Biochemistry,5thedition(2002),Chapter24:"Biosynthesisofaminoacids")。因此，任何特定氨基酸的產(chǎn)量均受到細胞中該氨基酸的量的限制。革蘭氏陽性土壤細菌谷氨酸棒桿菌被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)不同的氨基酸。賴氨酸和谷氨酸是主要的工業(yè)產(chǎn)品，其生物合成已經(jīng)被研究多年，與此不同的是，有關(guān)調(diào)節(jié)甲硫氨酸生物合成途徑的知識十分有限。至少其途徑中的關(guān)鍵酶仍是未知的(見圖lb)。高絲氨酸是通過由天冬氨酸激酶(lysC)、P-天冬氨酸半醛脫氫酶和高絲氨酸脫氫酶(hom)催化的3個連續(xù)的反應(yīng)而自天冬氨酸產(chǎn)生的。谷氨酸棒桿菌通過高絲氨酸-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(MetA)(EC2.3丄31)的乙?；饔没罨呓z氨酸。還己知轉(zhuǎn)硫作用和直接巰基化均用于產(chǎn)生同型半胱氨酸(Hwang,B.J.etal(2002)J.Bacteriol.184(5):1277-86)。轉(zhuǎn)硫作用由胱硫醚個合酶(MetB)(EC2.5丄48)催化(Hwang，B.J.etal.(1999)Mo1Cells93:300-8)。在該反應(yīng)中，半胱氨酸和O-15乙酰基-高絲氨酸結(jié)合為胱硫醚，后者被胱硫醚-P-裂合酶(MetC，其也稱為AecD)(EC4.4.1.8)(Kim，J.W.etal(2001)MolCells112:220-5;Ruckertetal.(2003)，見上)水解為同型半胱氨酸、丙酮酸和氨。在直接巰基化中，O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(MetZ，其也稱為MetY)(EC2.5.1.49)(Ruckertetal.(2003)，見上)將O-乙酰高絲氨酸和硫化物轉(zhuǎn)化為同型半胱氨酸和醋酸。最后，谷氨酸棒桿菌具有兩種將同型半胱氨酸S-甲基化的酶，產(chǎn)生甲硫氨酸(Lee，H.S.andHwang，B.J.(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.625-6:459-67;Ruckertetal.，2003，見上)，這兩種酶是鈷胺素(I)依賴性甲硫氨酸合酶I(MetH)(EC2丄U3)和鈷胺素(I)非依賴性甲硫氨酸合酶II(MetE)(EC2丄U4)。前者使用5-甲基四氫葉酸而后者使用5-甲基四氫蝶酰三-L-谷氨酸(5-1116&)^6&311)^1"(^161>0>^1^丄-glutamate)作為甲基供體。最近，發(fā)現(xiàn)了一種推定的TetR-家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白(Reyetal.(2003)JournalofBiotechnology103:51-65)。該調(diào)節(jié)物被發(fā)現(xiàn)可阻抑一些編碼甲硫氨酸和硫代謝的酶的基因的轉(zhuǎn)錄?；蚯贸鲈撜{(diào)節(jié)物蛋白導(dǎo)致以下基因的表達增加編碼高絲氨酸脫氫酶的hom、編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的metZ、編碼S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合酶(EC2.5丄6)的metK、編碼半胱氨酸合酶(EC2.5丄47)的cysK、編碼推定的NADPH-依賴性亞硫酸鹽還原酶的cysl、以及編碼推定的鏈烷磺酸鹽單加氧酶的ssuD。Reyetal.(MolecularMicrobiology(2005)56:871-887)還發(fā)現(xiàn)metB基因在mcbR陰性株中被顯著誘導(dǎo)。絲氨酸自糖酵解中間體3-磷酸甘油酸合成，后者首先經(jīng)3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA;EC:1丄1.95)的作用被氧化為磷酸羥基丙酮酸。第二步，由磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SerC;EC:2.6丄52)催化的對磷酸羥基丙酮酸的轉(zhuǎn)氨作用形成磷酸絲氨酸，后者隨后被磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB;EC:3丄3.3)脫磷酸化，得到L-絲氨酸。L-絲氨酸可被絲氨酸脫水酶sdaA(EC:4.3丄17)轉(zhuǎn)化為丙酮酸，以及被絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT;EC2丄2.1)轉(zhuǎn)化為甘氨酸和亞甲基四氫葉酸(見圖la)。亞甲基四氫葉酸可通過亞甲基四氫葉酸還原酶metF(EC1.5丄20)的活性被轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸?，F(xiàn)已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，增加可被微生物代謝所利用的絲氨酸的量可導(dǎo)致該微生物內(nèi)L-甲硫氨酸的產(chǎn)量增加。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，即增加提供給微生物的絲氨酸的量可導(dǎo)致甲硫氨酸的合成增加，且因此L-甲硫氨酸的合成效率和/或產(chǎn)率得以提高?？赏ㄟ^將微生物培養(yǎng)在富含絲氨酸的培養(yǎng)基中而增加可供微生物代謝所利用的絲氨酸的?；蛘呋蛄硗獾?，可對微生物的參與絲氨酸代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面進行遺傳學(xué)修飾。如果將在參與絲氨酸代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面進行了遺傳學(xué)修飾的微生物培養(yǎng)于富含絲氨酸的培養(yǎng)基中，這可對甲硫氨酸的產(chǎn)率造成更大的影響。術(shù)語"代謝"意欲包括細胞內(nèi)發(fā)生的并導(dǎo)致分子合成和降解的所有生化反應(yīng)。術(shù)語"增加絲氨酸的量"指的是能夠被微生物利用用于合成生物分子的絲氨酸的量與培養(yǎng)在標準培養(yǎng)條件下的野生型微生物相比增加至少10%、至少20%、至少30°/。、優(yōu)選地至少40°/。、優(yōu)選地至少50%、更優(yōu)選地至少60°/。和70%、甚至更優(yōu)選地至少80%和90°/。、特別優(yōu)選地至少100%、110%和120%、和最優(yōu)選地至少160°/。、200%和250%。細胞內(nèi)絲氨酸的量可通過Wittmannetal.((2004)Anal.Biochem.327(1):135-139)所述的方法確定。術(shù)語"標準條件"指的是在不富含絲氨酸的標準培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。培養(yǎng)的溫度、pH和時間可以變化，如下所述。各種微生物的標準培養(yǎng)條件可參考教科書，例如SambrookandRussdl，MolecularCloning—Alaboratorymanual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,3rdedition(2001)。例如，大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌菌株常規(guī)生長在MB或LB和BHI肉湯中(Follettie,M.T.etal.(1993)J.Bacteriol.175:4096-4103,DifcoBectonDickinson)。大腸桿菌的常用標準基本培養(yǎng)基(minimalmedia)是M9和改良的MCGC(Yoshihamaetal.(1985)J.Bacteriol.162:591-507;Liebletal.(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210.)。其他用于培養(yǎng)細菌的合適的標準培養(yǎng)基包括NZCYM、SOB、TB、CG12!/2和YT。本發(fā)明所述的"標準培養(yǎng)基"意欲包括所有適合用于培養(yǎng)本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基均包括優(yōu)選的基本培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的標準培養(yǎng)基不包括已經(jīng)添加了或要添加一或多種氨基酸的培養(yǎng)基。"基本培養(yǎng)基"是僅含有供野生型細胞生長的基本必需品的培養(yǎng)基，如無機鹽、碳源和水。與之不同的是，"富集培養(yǎng)基"用于滿足特定微生物的所有生長需求，即除了基本培養(yǎng)基的內(nèi)容以外，還含有例如生長因子?？砂凑杖缦滤龅牧繉⒖股靥砑又翗藴逝囵B(yǎng)基中(微克/毫升)氨芐青霉素，50;卡那霉素,25;萘啶酸，25，以便篩選轉(zhuǎn)化的菌株。遺傳學(xué)修飾的棒狀桿菌通常培養(yǎng)在合成的或天然的生長培養(yǎng)基中。用于棒狀桿菌的多種生長培養(yǎng)基是已知的且能夠容易地獲得(Liebetal.(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32:205-210;vonderOstenetal.(1998)BiotechnologyLetters11:11-16;Liebl(1992)"TheGenusCorynebacterium,in:TheProcaryotes,VolumeII，Balows，A.etal.，eds.Springer-Verlag)。谷氨酸棒桿菌載體的實例可參見HandbookofCorynebacterium(Eggeling，L.Bott，M.,eds.，CRCpressUSA2005)。合適的培養(yǎng)基包括一或多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和微量元素。優(yōu)選的碳源是糖，例如單糖、二糖或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素可作為很好的碳源。也可以通過復(fù)雜化合物例如糖蜜或糖精制過程的其他副產(chǎn)品來提供糖。補充不同碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是醇和有機酸，例如甲醇、乙醇、乙酸或乳酸。氮源通常是有機或無機氮化合物。示例性的氮源包括氨氣或氨鹽，如NH4Cl或(NH4)2S04、NH4OH、硝酸鹽、尿素、氨基酸或復(fù)合氮源，如玉米浸液、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等等?？墒褂貌煌蛟磳崿F(xiàn)超量生產(chǎn)甲硫氨酸?？墒褂昧蛩猁}、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽以及更多還原的硫源如H2S和硫化物以及衍生物。也可使用有機硫源如甲硫醇、巰基乙酸鹽、硫氰酸鹽、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸、以及其他含硫化合物來實現(xiàn)甲硫氨酸的高效生產(chǎn)。甲酸和/或甲硫醇與其他C1源如甲醛、甲醇和二甲基二硫化物一樣，也可作為補充物。可加入到培養(yǎng)基中的無機鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳鋅、銅和鐵的鹽酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽。可在培養(yǎng)基中加入螯合化合物以保持溶液中金屬離子。特別有用的螯合化合物包括二羥基苯酚類如兒茶酚或原兒茶酸(protocatechuate)，或有機酸如檸檬酸。培養(yǎng)基通常還含有其他生長因子如維生素或生長促進劑，這些的實例包括生物素、核黃素、硫胺18素、葉酸、煙酸、泛酸鹽和維生素B6。生長因子和鹽常產(chǎn)生自復(fù)雜培養(yǎng)基組分如酵母提取物、糖蜜、玉米浸液等等。培養(yǎng)基化合物的確切組成很大程度上取決于即將進行的實驗并需要根據(jù)各種具體情況分別確定。有關(guān)培養(yǎng)基優(yōu)化的信息可參見教科書"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach(eds.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRLPress(1997)pp.53-73，ISBN0199635773)。也可以選擇商品化的生長培養(yǎng)基，如標準1(Merck)或BHI(腦心臟輸注，DIFCO)或其他。所有培養(yǎng)基組分均應(yīng)該是滅菌的，可通過加熱(1.5巴，121°C，20分鐘)或過濾除菌。這些組分可一起滅菌或者在必要時分別滅菌。制備用于細菌培養(yǎng)的標準培養(yǎng)基通常不涉及添加單獨的氨基酸。而在用于標準培養(yǎng)條件下的富集培養(yǎng)基中則添加氨基酸的混合物，例如蛋白胨或胰蛋白胨。因此，通過向如上所述的標準培養(yǎng)基中額外添加確定濃度的純絲氨酸，可得到本發(fā)明的富含絲氨酸的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，添加到所述培養(yǎng)基中的絲氨酸的濃度為O.lmM至100mM，優(yōu)選地為1至50mM，更優(yōu)選地為5mM至20mM，且最優(yōu)選地，絲氨酸的濃度為10mM。也可以向連續(xù)補料發(fā)酵過程中補入絲氨酸的儲存液，以使得絲氨酸的當前濃度維持在O.lmM至10mM之間，優(yōu)選地在0.1mM至5mM之間，且最優(yōu)選地在0.1mM至1mM之間。也可通過在參與絲氨酸代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面對微生物進行遺傳學(xué)修飾而增加可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量。術(shù)語"遺傳學(xué)修飾"在本發(fā)明中指的是微生物已經(jīng)通過基因工程技術(shù)進行了修飾，從而使表達的一或多種蛋白質(zhì)的量發(fā)生改變，這些蛋白質(zhì)既可以是天然存在于野生型生物體的、也可以是天然情況下不存在于野生型微生物中的蛋白質(zhì)，或者表達的蛋白質(zhì)與野生型微生物的蛋白質(zhì)相比具有改變的活性。術(shù)語"絲氨酸代謝"意欲包含所有導(dǎo)致絲氨酸合成和絲氨酸降解的反應(yīng)。術(shù)語"絲氨酸轉(zhuǎn)運"指的是通絲氨酸過特定的轉(zhuǎn)運蛋白而輸入到細胞內(nèi)或輸出到細胞外。至于增加或降低蛋白質(zhì)的含量或量和/或生物學(xué)活性，可采用本領(lǐng)域已知的所有用于增加或降低宿主(例如上述的生物體)內(nèi)蛋白質(zhì)的量和/或活性19的方法。可通過表達外源形式的相應(yīng)蛋白質(zhì)而增加蛋白質(zhì)的量。此外，可通過影響啟動子和/或增強子元件的活性和/或在轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后水平調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性的其他調(diào)節(jié)活性如磷酸化、異戊烯化等來增加內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達。除了簡單地增加一或多種蛋白質(zhì)的量，還可利用攜帶特定突變的酶來提高蛋白質(zhì)的活性，所述突變使得所述酶的活性升高。此類突變可以，例如，滅活酶中負責反饋抑制的那部分。通過例如在這些酶中引入非保守性突變，酶不再受到反饋調(diào)節(jié)，且因此在產(chǎn)生較多分子的時候酶的活性仍不被下調(diào)?？梢詫⑼蛔円雰?nèi)源性的所述酶中，或可以過量表達相應(yīng)的突變形式的外源性酶。此類突變可包括點突變、缺失或插入。點突變可以是保守性的(一種氨基酸被具有類似生物化學(xué)性質(zhì)的另一種氨基酸取代)或非保守性(一種氨基酸被生物化學(xué)性質(zhì)不相似的另一種氨基酸取代)。此外，缺失部分可包括僅僅兩或三個氨基酸直至相應(yīng)蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)域?？勺晕墨I中找到使得D-3-磷酸甘油酸脫氫酶不受L-絲氨酸反饋調(diào)節(jié)的合適的突變實例，例如參見Belletal.(2002)Eur.J.Biochem.269:4176-4184;Al-Rabieeetal.(1996)J.Biol.Chem.271(38):23235-23238;Peters-Wendischetal.(2005)Appl.Environ.Microbiol.71(11):7139-7144。通過引用將這些文章并入本申請。因此，可通過不同的途徑來增加蛋白質(zhì)的量和域活性，例如通過關(guān)閉轉(zhuǎn)錄、翻譯或蛋白水平的抑制調(diào)節(jié)機制，或通過使得編碼這些蛋白質(zhì)的核酸的基因表達比野生型增加，例如通過誘導(dǎo)內(nèi)源性基因或者通過引入編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子。在一個實施方式中，通過使編碼酶例如SerA[EC:1丄1.95]、SerB[EC:3丄3.3]和SerC[EC:2.6.1.52]、SHMT[EC1.2.1.2]、metF[EC1.5丄20]的核酸的基因表達增加，或者通過使編碼蛋白質(zhì)例如sdaA[EC:4.3丄17]禾口ThrE的核酸的基因表達降低，可分別實現(xiàn)與野生型相比酶活性或量的增加。可自相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫獲得編碼這些蛋白質(zhì)的核酸序列，例如NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL(http:〃www.embl.org)、Expasy(http:〃www.expasy.org/)、KEGG(http:〃www.genome.ad.jp/kegg/kegg:,html)等等。表l給出了一些實例。20表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>PMT1431，DR1291,PMT9312一1452,TTC0586，Msp_1145,Atlgl7745,TTHA0952,PMM1354，At4g34200，RB6248,PMN2A—0926,CJE0970，Cj0891c,Pear—0417,CMC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一0843,PA3736,DET1206，amb3728,Rru—A2410,LIC10571，LA3638,SMU.965，BAS1825,BA一2468，GBAA1968，BA1968，cbdb—A1123,GOX1517,PMM1051,HCH一01779,RB8510,DVU08卯，Pro1150,Nham—2309,Tmden—1904,Sde—1209,Psyc—0253,ELI—13775,RSP—0403，L0090,Dde—2731，Pcryo—0279,Nwi—1647,lp—0571,BH翻O，SP01734,Jann一2998，blr4362,RPA2504,EF2422,DP1732，LBA1212,RPD—2495,RPC—2816,CC1383,RPB_2966,CJE0145,Cj0149c,Acid345一1481,ZMO0483:Bpro一5333，SAK—1205,gbsll87Jhp0761,SHI579,SAG1120,HP0822,SE1009,SE訓(xùn)897,SAOUHSC一01320，SAUSA300—1226，SAB1186,SACOL1362,SAS1268,SAR1338,MW1215，SAV1328，SA1164,HH1750,SSP1438,lp一2535，TTE2152,SAR11—1025，DR1278,PFL一3809,Dgeo—0610,Mhun—2292，DSY3981，PP0664,MA2572,ABC1578,Mbar一A1898,TTHA0489,TTC0115，MM2713,Mbur_1087,BH1737,AF0935,MK1554,MTH417,VNG2650G，Msp一0487,ABC0023,rrnAC2408,TK1627,TM0547,MJ1602,NP0302A,BH1253,MMP1702,BCE2626,LmjF07.0260,BCZK2354，BT9727一2388,BAS2433,BA_3119,GBAA2608，BA2608，BC2548，Acid345一4165，CTC00886,ST1519,Saci一1636,APE1144，SSO0657,PF1104，Adeh一3931,PAB0610,PH1075,Cag—0142,PAE2868,YJR139C，XOO1820,Plut一1983,XAC3038,Adeh一1400，XCV3175,PT01417,SCO0420,SRU_0482，XC」253，XCC2855,SO4055,CT2030,SPBC776.03,AO0卯003000721，TVN0385,ABL080W,AO090009000136,CPS—0456,HI0089,orfl9.2951，Sden一0616，UTI89一C4525,AfU3gl1640,MS1703,SBO一3960，SSO一4114，STM4101，SC3992,t3517,STY3768,c4893，ECs4869，Z5495,JW3911,b3940，AN2882.2,ECA4251,C麵129C,NTHI0167，plu4755,ECA3891,YPTB0602,YP3723,y3718,YPO0459,PM0113,S3729,SF4018,SPA3944,Mfla—1298,PSHAa2379，PBPRA0262，X002242,STM0002,SC0002,SPA0002,麵2,STY0002，c0003，SRU一0691，XCC蘭,PD1273,BPEN一115，SDY一3775，VC2684，SDY一0002,SBO—0001，YPTB0106,YP0118,y0303,YPO0116,UTI89一C0002,ECs0002,Z0002,JW0001,b0002，VV3007，VV11365,XC—2389，VP2764,XF2225,SSO—0002,S0002,SF0002除了增加可被微生物代謝所利用的絲氨酸的量之外，增加甲硫氨酸合成的另一途徑是降低一或多種參與阻抑那些參與甲硫氨酸合成的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白的含量和/或生物學(xué)活性。WO02/097096公開了此種阻抑物基因的一個實例，稱為McbR或MetD。弱化該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物提高了棒狀細菌L-甲硫氨酸的超量。通過將編碼表1和減2的酶的核酸引入生物體、優(yōu)選地谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌，可提高表1和/或2的酶的量和/或活性。原則上，就增加量和/或活性而言，可使用具有表l和2所列蛋白質(zhì)的酶活性的不同生物體的蛋白質(zhì)。當真核細胞來源的含有內(nèi)含子的核酸序列準備在不能剪接相應(yīng)的mRNA的細胞中表達或者無法使得所述細胞能夠剪接相應(yīng)的mRNA時，可使用已經(jīng)剪接的核酸序列，如相應(yīng)的cDNA。本說42明書中提及的所有核酸可以是，例如RNA、DNA或cDNA序列。為了產(chǎn)生更加高效合成甲硫氨酸的生物體，改變酶的量和/或活性并不僅限于表1和2中所列的酶。任何與表1和2的酶同源并在其他生物體中行使同樣功能的酶均有可能非常適合于調(diào)節(jié)量和/或活性，以便通過過表達來影響代謝流量(metabolicflux)。下文給出了同源性和相同性的定義。在本發(fā)明的通過培養(yǎng)微生物制備L-甲硫氮酸的一個方法中，將一或多個編碼上述功能性或非功能性、反饋調(diào)節(jié)型或反饋非依賴型酶中之一的核酸序列分別轉(zhuǎn)移至微生物中，例如谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌。這種轉(zhuǎn)移導(dǎo)致所述酶的表達增加，并相應(yīng)地導(dǎo)致更高的代謝流量通過所需反應(yīng)途徑。根據(jù)本發(fā)明，增加特定生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的量和/或活性通常包括以下步驟a)產(chǎn)生自5'-3'-方向包含以下核酸序列的載體，優(yōu)選地為DNA序列-在所述生物體內(nèi)有功能的啟動子序列；-與之可操縱連接的編碼表1或2的蛋白質(zhì)的DNA序列或其功能性等價部分；-在所述生物體內(nèi)有功能的終止序列；b)將步驟a)的所述載體轉(zhuǎn)移至所述生物體中，并任選地，整合至相應(yīng)的基因組中。如果將超過一種的編碼參與絲氨酸代謝和轉(zhuǎn)運和/或甲硫氨酸合成的蛋白質(zhì)的核酸序列引入微生物，則這些不同的核酸序列可位于同一個載體或不同載體上。如果它們位于不同的載體上，則這些載體可同時或先后引入到微生物中。本發(fā)明范圍內(nèi)的酶功能性等價部分指的是編碼表1或2的酶的核酸序列的片段，這些片段的表達所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)仍具有相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)的酶活性?？赏ㄟ^現(xiàn)有技術(shù)的方法確定酶活性(例如參見Choetal.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:8525-8530，其涉及SerB活性的分析方法；Peters-Wendischetal.(2002)Appl.Microbiol.Biotechnol.60:437-441，其涉及SerA活性的分析方法)。根據(jù)本發(fā)明，非功能性酶的核酸序列和氨基酸序列分別與功能性酶及其功能性等價部分相同，但在某些位點具有核苷酸或氨基酸的點突變、插入或缺失，其作用是所述非功能性酶不能催化相應(yīng)的反應(yīng)，或其催化能力非常有限。這些非功能性酶不同于那些仍具有催化相應(yīng)反應(yīng)的能力卻不再受到反饋調(diào)節(jié)的酶。非功能性酶還包括在核酸序列水平或氨基酸序列水平攜帶點突變、插入或缺失的酶，這些酶不具有與所述酶的生理性結(jié)合配偶體(如其底物)相互作用的能力或該能力較低。非功能性突變體不能催化衍生出該突變體的野生型酶所能夠催化的反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"非功能性酶"不包括那些與相應(yīng)的功能性酶在氨基酸水平和核酸水平分別不具有基本的序列同源性的基因或蛋白質(zhì)。因此，不能催化相應(yīng)反應(yīng)且與相應(yīng)的酶不具有基本的序列同源性的蛋白質(zhì)從定義上講不是本發(fā)明的"非功能性酶"。非功能性酶在本發(fā)明中也稱為失活的或者無活性的酶。因此，攜帶上述點突變、插入和/或缺失的本發(fā)明的表l和2的非功能性酶的特征在于，其與本發(fā)明的表1和2的野生型酶或其功能性等價部分具有基本的序列同源性。當然，也可使用與編碼表1或2的蛋白質(zhì)的核酸序列以及編碼其功能性等價蛋白質(zhì)的核酸序列具有基本序列同源性的核酸分子來實施本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明，基本序列同源性通常被理解為，一DNA分子或蛋白質(zhì)的核酸序列或氨基酸序列分別與表1或2的蛋白質(zhì)或其功能性等價部分的核酸序列或氨基酸序列具有至少40%、優(yōu)選地至少50%、更優(yōu)選地至少60%、還優(yōu)選地至少70%、特別優(yōu)選地至少90%、特別優(yōu)選地至少95%和最優(yōu)選地至少98%的相同性。兩種蛋白質(zhì)的相同性被理解為在蛋白質(zhì)相應(yīng)全長上的氨基酸相同性，特別是通過借助于使用CLUSTAL方法(Higginsetal.(1989)Comput.Appl.Biosci.5(2):151)的Lasergene軟4牛(DNAStar,Inc.,Madison，Wisconsin(USA))進行比較而計算出的相同性。DNA序列的相同性做相對應(yīng)的理解。如果核酸分子在相同的5'-3'-順序中具有相同的核苷酸，則這些核酸分子是相同的。上述方法可用于增加編碼表1和/或2的功能性或非功能性、反饋調(diào)節(jié)型或反饋非依賴型酶的DNA序列或其功能性等價部分的表達。本領(lǐng)域人員熟知如何使用上述包含調(diào)節(jié)序列例如啟動子和終止序列的載體。此外，本領(lǐng)域人員熟知如何將步驟a)的載體轉(zhuǎn)移至生物體如谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌內(nèi)，并熟知哪些特性對于載體整合進生物體的基因組是必需的。若要通過轉(zhuǎn)移來自一種生物體(如大腸桿菌)的編碼一種特定蛋白質(zhì)的核酸來增加另一種生物體(如谷氨酸棒桿菌)中該特定蛋白質(zhì)的含量，則應(yīng)該根據(jù)遺傳密碼子將由例如來自大腸桿菌的核酸序列所編碼的氨基酸序列回譯(back-translate)為主要包含哪些因生物體特異性密碼子用法而在谷氨酸棒桿菌中更加常用的密碼子的核酸序列?？赏ㄟ^使用計算機分析相關(guān)生物體的其他已知基因而確定所述密碼子用法。根據(jù)本發(fā)明，增加編碼表1或2的蛋白質(zhì)的核酸的基因表達和活性也可理解為是操縱生物體(特別是谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌)的相應(yīng)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達。這可通過例如改變編碼這些蛋白質(zhì)的基因的啟動子DNA序列而實現(xiàn)。這種改變引起這些酶的表達率被改變，優(yōu)選被提高，這可通過缺失或插入DNA序列而實現(xiàn)。此外，可通過調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)分別改變和增加內(nèi)源性基因的表達，所述調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)不存在于轉(zhuǎn)化的生物體中，但與這些基因的啟動子相互作用。這種調(diào)節(jié)物可以是由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄活化物結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白質(zhì)，例如參見WO96/06166。增加內(nèi)源性基因表達的另一種可能方式是上調(diào)參與所述內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，例如通過過表達的方式。過表達轉(zhuǎn)錄因子的措施是本領(lǐng)域人員已知的，并己經(jīng)公開用于在本發(fā)明的范圍內(nèi)的表l和2的酶。此外，可通過對內(nèi)源性基因拷貝的靶向誘變而改變內(nèi)源性基因的活性。也可通過影響蛋白質(zhì)的翻譯后修飾而改變表1或2的蛋白質(zhì)的活性。這可以通過例如過表達或基因沉默等措施來調(diào)節(jié)參與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的酶(如激酶或磷酸酶)的活性而實現(xiàn)。在另一個實施方式中，可以改進酶的功效或破壞其別構(gòu)調(diào)節(jié)區(qū)域，以便阻止對化合物產(chǎn)生的反饋抑制。類似地，可使降解酶缺失或通過取代、缺失或添加對其進行修飾，使得其對表1中的所需酶的降解活性降低，而不損害細胞的活力。在各種情況中，可以提高一或多種高純化合物的總體產(chǎn)量或產(chǎn)率。表1和域2的蛋白質(zhì)和核苷酸分子的此類改變還可提高除甲硫氨酸以外的其他高純化合物的產(chǎn)生，例如其他含硫化合物如半胱氨酸或谷胱甘肽、其他氨基酸、維生素、輔因子、營養(yǎng)物、核苷酸、核苷、和海藻糖。任何一種化合物的代謝均必然涉及細胞內(nèi)的其他生物合成和降解途徑，而一條途徑中的必要的輔因子、中間體、或底物也很可能從另一條此類途徑中得到補充或受到限制。因此，通過調(diào)節(jié)一或多種表l和/或2的蛋白質(zhì)的活性，除導(dǎo)致甲硫氨酸合成的那些途徑之外，還可影響其他高純化合物生物合成或降解途徑活性的產(chǎn)生或效率。也可基于來自另一種不同代謝過程的化合物的細胞內(nèi)水平來調(diào)節(jié)酶的表達和功能，且基本生長所需的分子(如氨基酸和核苷酸)的細胞內(nèi)水平可對大規(guī)模培養(yǎng)的微生物的活力產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。因此，調(diào)節(jié)表1和/或2的氨基酸合成酶使得它們不再應(yīng)答于反饋抑制或使得它們的效率或利用率得以提高，可導(dǎo)致更高的代謝流量通過甲硫氨酸生產(chǎn)途徑。上述這些用于增加或引入表1和2的蛋白質(zhì)的量和/或活性的策略并非是限制性的；對這些策略加以改動對本領(lǐng)域人員而言將是顯而易見的。對于減少或抑制或降低表1和域2的任何一種蛋白質(zhì)的量或含量和/或活性，也有各種不同的策略。表1和/或2的內(nèi)源性酶的表達例如可通過表達特異性結(jié)合這些基因的啟動子序列的適體而調(diào)節(jié)。根據(jù)適體結(jié)合刺激性或阻抑性啟動子區(qū)域，可增加或降低表1和域2的蛋白質(zhì)的量以及活性。適體可被設(shè)計為能夠特異性結(jié)合酶本身，并例如通過結(jié)合相應(yīng)的酶的催化中心而降低酶的活性。適體的表達通常是通過基于載體的過表達而實現(xiàn)的(見上)，這一點以及適體的設(shè)計和選擇均是本領(lǐng)域人員所熟知的(FamuIoketal.(1999)CurrTopMicrobiolImmunol.243:123-36)。此外，可通過本領(lǐng)域人員熟知的各種實驗方法來降低表1和/或2的內(nèi)源性酶的量和活性。這些方法通常被冠以如下名稱"基因沉默"、"基因弱化"、"基因破壞"或"基因消除"。例如，可通過將前述的含有反義順序的編碼所述酶或其部分的DNA序列的載體轉(zhuǎn)移至生物體如谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌中而使得內(nèi)源性基因的表達沉默。這是基于如下事實，即這種載體在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生能夠與從內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄而來的mRNA相雜交的RNA，并由此阻止其翻譯。為了表達反義RNA，可選擇能夠在各種細胞類型中指導(dǎo)反義RNA分子持續(xù)表達的調(diào)節(jié)序列，例如病毒啟動子和/或增強子，或可選擇能夠指導(dǎo)反義RNA以組成型、組織或細胞類型特異性方式表達的調(diào)節(jié)序列。反義表達載體的形式可以是重組質(zhì)粒、噬菌?；蛉趸牟《?，其中在高效調(diào)節(jié)區(qū)域的控制下產(chǎn)生反義核酸，其活性可由載體被引入其中的細胞類型決定。對于使用反義基因來調(diào)節(jié)基因表達的討論可參見WeintraubH.etai.(1985)TrendsinGenetics1(1):22-25。原則上，反義策略可與核酶方法聯(lián)合。核酶是具有催化活性的RNA序列，當與反義序列聯(lián)合時，其催化裂解耙序列(Tanneretal.(1999)FEMSMicrobiolRev.23(3):257-75)。這可增強反義策略的效力。在植物中，可通過RNA干擾或稱為共抑制(co-suppression)的方法實現(xiàn)基因沉默。其他的方法是通過將RNA/DNA寡核苷酸引入生物體而在內(nèi)源性基因中引入無義突變(Zhuetal.(2000)Nat.Biotechnol.18(5):555-558)或通過同源重組方式產(chǎn)生敲除突變體(Hohnetal.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96:8321-8323.)。為了產(chǎn)生同源重組微生物，制備含有編碼表1或2的蛋白質(zhì)的基因的至少一部分的載體，其中已經(jīng)引入了缺失、添加或取代，由此改變(例如功能性破壞)所述內(nèi)源性基因。優(yōu)選地，內(nèi)源性基因是谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌的基因，但其也可以是來自相關(guān)細菌或者甚至是來自酵母或植物的同系物。在一個實施方式中，所述載體被設(shè)計為使得在同源重組后，所述內(nèi)源性基因被功能性破壞，即其不編碼功能性的酶。這種載體也稱為"敲除"載體?；蛘?，所述載體被設(shè)計為使得在同源重組后，所述內(nèi)源性基因被突變或被改變，但仍然編碼功能性的蛋白質(zhì)(例如可改變上游調(diào)節(jié)區(qū)域以便改變表1或2的內(nèi)源性酶的表達)。在同源重組載體中，內(nèi)源性基因中發(fā)生改變的部分在其5'和3'端側(cè)翼具有額外的內(nèi)源性基因的核酸序列，以便在載體攜帶的內(nèi)源性基因與(微)生物體的內(nèi)源性基因之間實現(xiàn)同源重組。所述額外的側(cè)翼內(nèi)源性核酸序列的長度足以與內(nèi)源性基因成功進行同源重組。典型地，可在載體中納入數(shù)百堿基至幾千堿基的側(cè)翼DNA(5'和3'端均有)(參見例如Thomas,K.R.,andCapecchi,M.R.(1987)Cell51(3):503-512和Schaferetal.(1994)Gene145:69-73，見同源重組載體的說明)。載體被引入微生物(例如通過電穿孔)，然后使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)選擇出其中所引入的基因與編碼表1或2的蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因已經(jīng)發(fā)生同源重組的細胞。在另一個實施方式中，宿主細胞內(nèi)編碼表1或2的蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因被破壞(例如通過同源重組或本領(lǐng)域已知的其他遺傳學(xué)方法)，以至于不發(fā)生其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達。在另一個實施方式中，宿主細胞內(nèi)編碼表1或2的蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因或引入的基因通過一或多個點突變、缺失或倒位(iiwersion)而被改變，但仍編碼功能性酶。仍在另一個實施方式，(微)生物體內(nèi)編碼表1或2的蛋白質(zhì)內(nèi)源性基因的一或多個調(diào)節(jié)區(qū)域(例如啟動子、阻抑物或誘導(dǎo)物)被改變(例如通過缺失、截短、倒位、或點突變)，使得內(nèi)源性基因的表達被調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域人員可以理解，可使用本發(fā)明的方法容易地制備含有一種以上編碼表1和2的蛋白質(zhì)的基因和蛋白質(zhì)修飾的宿主細胞，且這樣的宿主細胞屬于本發(fā)明的范圍。此外，也可借助于特異性DNA結(jié)合元件(例如鋅指轉(zhuǎn)錄因子類的元件)實現(xiàn)基因表達(但非基因過表達)。此外，可向細胞中引入抑制靶蛋白本身的元件。蛋白質(zhì)結(jié)合元件可以是例如前述的適體(Famuloketal.(1999)CurrTopMicrobiolImmunol.243:123-36)。其在生物體內(nèi)的表達能夠降低表1或2的酶的量和/或活性的其他蛋白質(zhì)結(jié)合元件可選自特異性抗體?？砂凑諛藴史桨府a(chǎn)生單克隆、多克隆、或重組的特異性抗體(GuidetoProteinPurification,Meth.Enzymol.182，pp.663-679(1990)，M.P.Deutscher,ed.)。文獻也描述了抗體的表達(Fiedleretal.(1997)Immunotechnology3:205-216;MaynardandGeorgiou(2000)Annu,Rev.Biomed.Eng.2:339-76)。本領(lǐng)域人員熟知上述技術(shù)。因此，也熟知用于例如反義方法的核酸構(gòu)建體必須具有的大小，以及相應(yīng)的核酸序列必須具有怎樣的互補性、同源性或相同性。術(shù)語"互補性"描述的是核酸分子與另一核酸分子通過兩種互補堿基之間的氫鍵雜交的能力。本領(lǐng)域人員已知兩種核酸分子為了能夠彼此雜交并不需要一定具有100%的互補性。能夠與另一種核酸序列雜交的核酸序列與所述另一種核酸序列的互補性分別為優(yōu)選地至少40%、至少50%、至少60%、更優(yōu)選地至少70%、特別優(yōu)選地至少80%、更特別優(yōu)選地至少卯％、尤其優(yōu)選地至少95%和最優(yōu)選地至少98或100%。反義序列與內(nèi)源性mRNA序列的雜交典型地在體內(nèi)細胞條件下發(fā)生或在體外發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明，雜交在足以保證發(fā)生特異性雜交的嚴格性條件下在體內(nèi)或體外進行。嚴格性體外雜交條件是本領(lǐng)域人員已知的，并可自文獻獲知(見例如Sambrooketal.，MolecularCloning,3rdedition2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress)。術(shù)語"特異性雜交"指的是如下情況，即在嚴格性條件下，分子優(yōu)先與特定核酸序列結(jié)合，而該核酸序列是復(fù)雜的混合物，如DNA或RNA分子的混合物。因此，術(shù)語"嚴格性條件"指的是，在該條件下，核酸序列優(yōu)先與互補性靶序列結(jié)合，而與其他序列不結(jié)合或至少結(jié)合程度明顯降低。嚴格性條件取決于一些條件。較長的序列在更高溫度發(fā)生雜交。通常，選擇的嚴格性條件能夠使得在給定的離子強度和給定pH值時，雜交溫度比解鏈溫度(Tm)低大約5°C。Tm是(在給定pH值、離子強度和給定核酸濃度條件下)與靶序列互補的分子中的50%與所述靶序列雜交時的溫度。典型地，嚴格性條件包括0.01至1.0M鈉離子(或其他鹽的離子)之間的鹽濃度以及pH值在7.0至8.3之間。對于短分子(例如對于包含10至50個核苷酸之間的分子)，該溫度為至少30°C。此外，嚴格性條件可包括加入去穩(wěn)定劑，如甲酰胺。典型的雜交和洗滌緩沖液具有如下組成。0.5%SDS5xSSC50mMNaP04,pH6.80.1。/。Na-焦磷酸鹽5x登哈特試劑(Denhardt'sreagent)100ng鮭精^雜3^)^^預(yù)雜交溶液lxl06cpm/mL探針(5-10min95°C)2ftc51SC:3MNaCl0.3M擰檬酸鈉49以HCl調(diào)至pH75ftc微特微.5gFicoll5g聚乙烯吡咯垸酮5g牛血清白蛋白加蒸餾水至500mL典型的雜交程序如下-.存透以lxSSC/0.1%SDS洗滌膜30min，65°C:^^^充'至少2h，50-55°C染充，55-60。C過夜洗絲,5min2xSSC/0.1%SDS雜交溫度30min2xSSC/0.1%SDS雜交溫度30minlxSSC/0.1%SDS雜交溫度45min0.2xSSC/0.1%SDS65。C5minO.lxSSC室溫術(shù)語"有義"和"反義"以及"反義方向(antisenseorientation)"均是本領(lǐng)域人員已知的。此外，本領(lǐng)域人員己知用于反義方法的核酸分子所必須具有的長度，以及它們與其靶序列所必須具有的同源性或互補性。因此，本領(lǐng)域人員也知道用于基因沉默方法的核酸分子所必須具有的長度。以反義為目的，互補性序列長度超過IOO個核苷酸、80個核苷酸、60個核苷酸、40個核苷酸、和20個核苷酸即可以是足夠的。更長的核苷酸長度當然也是足夠的。上述方法的組合應(yīng)用也是可以的。根據(jù)本發(fā)明，如果使用以5'-3'-方向可操縱地連接于在生物體內(nèi)有活性的啟動子的DNA序列，則通常所構(gòu)建的載體在轉(zhuǎn)移到所述生物體的細胞內(nèi)之后，可實現(xiàn)編碼序列的過表達，或分別引起內(nèi)源性核酸序列的抑制或競爭和阻斷由其表達的蛋白質(zhì)。也可通過在生物體內(nèi)過表達非功能性突變體而降低特定酶的活性。因此，不能催化有關(guān)反應(yīng)、但能夠結(jié)合例如底物或輔因子的非功能性突變體，經(jīng)過表達后，可與內(nèi)源性酶競爭并抑制反應(yīng)。降低宿主細胞內(nèi)酶的量和/或活性的其他方法是本領(lǐng)域人員已知的。本發(fā)明的另一個方面涉及載體，優(yōu)選地是表達載體，其含有編碼表1或2的一種蛋白質(zhì)的核酸(或其部分)或其組合。在本發(fā)明中，術(shù)語"載體"指的是核酸分子，其能夠轉(zhuǎn)運與其相連接的其他核酸。一種類型的載體是"質(zhì)粒"，其指的是一種環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中可連接額外的DNA區(qū)段。另一種類型的載體是病毒載體，其中可將額外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組內(nèi)。某些載體在所引入的宿主細胞中能夠自我復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起始點的細菌載體和附加型哺乳動物細胞載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物細胞載體)在引入宿主細胞后整合到宿主基因組中，并隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操縱地連接的基因的表達。此類載體在此稱為"表達載體"。通常，重組DNA技術(shù)所用的表達載體一般是質(zhì)粒的形式。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因為質(zhì)粒是最為常用的載體形式。不過，本發(fā)明也包括其他形式的表達載體，例如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，它們可發(fā)揮相同的功能。本發(fā)明的重組表達載體可包含編碼表1或2的蛋白質(zhì)之一的核酸，其形式適合于在宿主細胞中表達相應(yīng)的核酸，這意味著所述重組表達載體包括可操作地連接于待表達核酸序列的一或多個基于進行表達所用的宿主細胞而選擇的調(diào)節(jié)序列。在重組表達載體中，"可操作地連接"指的是感興趣的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列連接的方式允許核苷酸序列被表達(例如在體外的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意欲包括啟動子、阻抑物結(jié)合位點、活化物結(jié)合位點、增強子和其他表達控制元件(如終止子、腺苷酸化信號、或mRNA二級結(jié)構(gòu)的其他元件)。此類調(diào)節(jié)序列例如可參見Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990)。調(diào)節(jié)序列包括那些在許多宿主細胞類型中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達的調(diào)節(jié)序列以及那些僅在特定宿主細胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達的調(diào)節(jié)序列。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列例如為，啟動子如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SP02、e-Pp-orePL、sod、ef-tu、groE，它們優(yōu)選地在細菌中使用。額外的調(diào)節(jié)序列例如為，來自于酵母和真菌的啟動子，如ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH，來自于植物的啟動子，如CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLSl、B33、nos或遍在蛋白-或菜豆蛋白-啟動子。也可以使用人工啟動子。本領(lǐng)域人員能夠理解，表達載體的設(shè)計取決于一些因素，例如所選擇的待轉(zhuǎn)化的宿主細胞、蛋白質(zhì)的期望表達水平等等。本發(fā)明的表達載體可被引入到宿主細胞中以便產(chǎn)生由編碼表1和/或2的酶的核酸所編碼的蛋白質(zhì)或肽，包括融合蛋白或融合肽。本發(fā)明的重組表達載體可被設(shè)計用于在原核細胞或真核細胞中表達表l和/或2的酶。例如，表1和/或2的酶的基因可表達于細菌細胞如谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌；昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)；酵母和其他真菌細胞(見Romanos，M.A.etal.(1992)Yeast8:423-488;vandenHondel，C.A.M.J.丄etal.(1991)in:MoreGeneManipulationsinFungi,J.W.Bennet&L.L.Lasure,eds.,p.396-428:AcademicPress:SanDiego;vandenHondel,C.A.M.J.J.&Punt,P.J.(1991)in:AppliedMolecularGeneticsofFungi,Peberdy,J.F.etal"eds.，p.1-28,CambridgeUniversityPress:Cambridge);藻類和多細胞植物細胞(見Schmidt,R.andWillmitzer，L.(1988)PlantCellR印.(7):583-586)。合適的宿主細胞可進一步參見Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(19卯)?；蛘?，可在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達載體，例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。在原核細胞中表達蛋白質(zhì)最常見地是使用含有指導(dǎo)融合蛋白或非融合52蛋白的表達的組成型或誘導(dǎo)型啟動子而進行。融合載體給插入的核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)添加一些氨基酸，通常是在重組蛋白質(zhì)的氨基端，但也可以在c端或蛋白質(zhì)內(nèi)部的合適區(qū)域。此類融合載體典型地用于3個目的1)增加重組蛋白質(zhì)的表達；2)增加重組蛋白質(zhì)的可溶性；和3)通過提供用于親和純化的配體而有助于重組蛋白質(zhì)的純化。在融合表達載體中，通常在融合部分與重組蛋白質(zhì)的連接處引入蛋白酶裂解位點，以便在融合蛋白被純化后使重組蛋白質(zhì)與融合部分分離。此類酶及其同種識別序列(cognaterecognitionsequences)包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pQE(Qiagen)、pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.andJohnson,K,S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBioabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，它們分別融合谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、或蛋白A。谷氨酸棒桿菌載體的實例可參見HandbookofCorynebacterium2005Eggeling，L.Bott,M.,eds"CRCpressUSA。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc(Amannetal.(1988)Gene69:301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、prN-III113-Bl、egtll、pBdCl、和pETlld(Studieretal.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(1990)60-89;Pouwelsetal"eds.(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYorkISBN0444904018)。來自pTrc載體的耙基因表達依賴于宿主RNA聚合酶自雜交trp-lac融合啟動子轉(zhuǎn)錄。來自pETlld載體的靶基因表達依賴于由共表達的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的自T7gnlO-lac融合啟動子的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)從攜帶置于lacUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7gnl基因的常駐X原噬菌體提供。對于其他種類細菌的轉(zhuǎn)化，可選擇合適的載體。例如，已知質(zhì)粒pIJlOl，pIJ364,pIJ702和pIJ361可用于轉(zhuǎn)化鏈霉菌，而質(zhì)粒pUBllO、pC194、或pBD214適合用于轉(zhuǎn)化芽孢桿菌。一些用于將遺傳信息轉(zhuǎn)移至棒桿菌內(nèi)的質(zhì)粒包括pHM1519、pBLl、pSA77、或pAJ667(Pouwelsetal"eds.(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYorkIBSN0444904018)。53最大化重組蛋白質(zhì)表達的一個策略是在對所述重組蛋白質(zhì)的蛋白酶裂解方面能力受損的宿主細菌中表達該蛋白(Gottesman，S.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(19卯)119-128)。另一種策略是改變待插入至表達載體內(nèi)的核酸的核酸序列，使得各種氨基酸的各密碼子在選定用于表達的細菌如谷氨酸棒桿菌內(nèi)是被優(yōu)先使用的密碼子(Wadaetal.(1992)NucleicAcidsRes.20:2111-2118)?？刹捎脴藴实腄NA合成技術(shù)進行本發(fā)明的核酸序列的這種改變。在另一個實施方式中，蛋白質(zhì)表達載體是酵母表達載體。用于在酵母(釀酒酵母)中表達的載體的實例包括pYepSecl(Baldari，etal,(1987)EmboJ.6:229-234)、2i、pAG-l、Yep6、Yepl3、pEMBLYe23、pMFa(KurjanandHerskowitz(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultzetal.(1987)Gene54:113-123)、禾npYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。用于構(gòu)建適合用于其他真菌例如絲狀真菌中的載體的載體和方法可詳見，例如vandenHondel，C.A.M.丄J.&Punt，P.J.(1991)in:AppliedMolecularGeneticsofFungi,J.F.Peberdy,etal.，eds"p.1-28,CambridgeUniversityPress:Cambridge禾卩Pouwelsetal.，eds.(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYork(ISBN0444904018)。在另一個實施方式中，表1和2的蛋白質(zhì)可在單細胞植物細胞(例如藻類)或來自高等植物的植物細胞(如種子植物例如谷物植物)中表達。植物表達載體的實例可詳見，例如Beckeretal.(1992)PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bevan,M.W.(1984)Nucl.Acid.Res.12:8711-8721，并包括pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、禾口pDH51(Pouwelsetal"eds.(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYorkISBN0444904018)。用于原核細胞和真核細胞的其他合適的表達系統(tǒng)可參見Sambrook，J.etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual.3rded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2003的16和17章。在另一個實施方式中，重組表達載體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)先在多細胞生物體的特定細胞類型中表達，如在植物細胞中(例如使用組織特異性調(diào)節(jié)元件來表達所述核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的另一方面涉及其中引入了本發(fā)明的重組表達載體的生物體或宿主細胞。術(shù)語"宿主細胞"和"重組宿主細胞"在此可互換使用。要理解這些術(shù)語不僅指特定的所研究的細胞，也指這種細胞的子代或者潛在的子代。由于在傳代過程中因突變或者環(huán)境影響會出現(xiàn)某些改變，因此子代實際上可以與親代細胞不完全相同，但其仍包括在這里所用術(shù)語的范圍內(nèi)。宿主細胞可以是任何原核細胞或真核細胞。例如，表l和/或2的蛋白質(zhì)可表達于細菌細胞如谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母或植物。其他合適的宿主細胞是本領(lǐng)域人員已知的?？赏ㄟ^常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核細胞或真核細胞。在本發(fā)明中，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"、"接合(conjugation)"和"轉(zhuǎn)導(dǎo)"指的是用于將外來核酸(例如線性DNA或RNA，例如線性化的載體或無載體的基因構(gòu)建體本身)或載體形式的核酸(例如質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子或其他DNA)引入宿主細胞內(nèi)的多種現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂染、天然感受態(tài)、化合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、或電穿孔。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的方法可參見Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual.3rded"ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，2003)。在本發(fā)明中，"坎貝爾插入(Campbellin)"指的是初始宿主細胞的轉(zhuǎn)化體，其中通過單次同源重組事件(交換進來事件(cross-inevent))將完整的環(huán)狀雙鏈DNA分子(例如質(zhì)粒)整合到染色體中，這有效地導(dǎo)致線性化形式的所述環(huán)狀DNA分子插入到染色體中與所述環(huán)狀DNA分子的第一DNA序列同源的第一DNA序列中。該名稱來自阿蘭'坎貝爾教授(AlanCampbell),其最先提出了這種重組方式。"被坎貝爾插入(Campbelledin)"指的是己經(jīng)被整合到"坎貝爾插入"轉(zhuǎn)化體的染色體中的線性化的DNA序列。"坎貝爾插入"含有雙份的第一同源DNA序列，其中每一拷貝包括并跨越一個拷貝的同源重組交換點。在本發(fā)明中，"坎貝爾刪除(Campbellout)"指的是來自"坎貝爾插入"轉(zhuǎn)化體的子代細胞，其中在"被坎貝爾插入"DNA的線性化插入體DNA中所含的第二DNA序列與染色體中與所述線性化插入體的第二DNA序列同源的第二DNA序列之間發(fā)生了第二同源重組事件(交換出去事件(cross-outevent)),該第二重組事件導(dǎo)致所整合的DNA序列的一部分發(fā)生缺失(丟棄)，但重要的是，這還導(dǎo)致所整合的"被坎貝爾插入"DNA的一部分(其可以甚至僅僅為一個堿基)留在染色體中，這樣一來，與初始宿主細胞相比，所述"坎貝爾刪除"細胞在染色體中便含有一或多個故意的變化(例如，單堿基取代、多堿基取代、插入異源基因或DNA序列、插入額外一或多拷貝的同源基因或修飾的同源基因、或插入包含一種以上的如上所述的實例的DNA序列)。"坎貝爾刪除"細胞或菌株通常(但并非必然)是通過針對"被坎貝爾插入"DNA序列的一部分(希望丟棄的那部分)中所含的基因進行反選擇而獲得的，例如枯草芽孢桿菌^W基因，當細胞培養(yǎng)于存在5%至10%的蔗糖條件下時，該基因的表達對細胞是致死性的。無論是否進行反選擇，均可使用任何可篩選表型通過篩選而獲得或鑒定出所需的"坎貝爾刪除"細胞，所述可篩選表型例如但不限于，集落形態(tài)、集落顏色、是否存在抗生素抗性、通過聚合酶鏈反應(yīng)檢測是否存在給定的DNA序列、是否存在營養(yǎng)缺陷型、是否存在某種酶、集落核酸雜交、抗體篩選等等。術(shù)語"坎貝爾插入"和"坎貝爾刪除"也可用作不同時態(tài)的動詞來指代上述的方法或過程。要理解導(dǎo)致"坎貝爾插入"或"坎貝爾刪除"的同源重組事件可出現(xiàn)在同源DNA序列內(nèi)的一系列DNA堿基上，且由于同源序列在該一系列DNA堿基的至少一部分上彼此相同，因此通常不可能精確地指出交換事件的發(fā)生之處。換言之，不可能精確地指出哪一序列最初是來自插入的DNA的，而哪一序列最初是來自染色體DNA的。此外，所述第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常由部分非同源性區(qū)域間隔開，而正是該非同源性區(qū)域仍然留在"坎貝爾刪除"細胞的染色體中。實踐中，在谷氨酸棒桿菌中，典型的第一和第二同源DNA序列的長度通常為至少約200個堿基對，并可多達數(shù)千堿基對。不過，更短或者更長的序列也可用于該過程。例如，第一和第二同源序列的長度可在約500至2000個堿基的范圍，并且將第一和第二同源序列設(shè)置為大致相同的長度，優(yōu)選地使它們的差異小于200個堿基對，且最優(yōu)選地使兩者中較短者的堿基對長度至少是較長者長度的70%，將有利于自"坎貝爾插入"獲得"坎貝爾刪除"。為了鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼選擇標記物(如抗生素抗性)的基因隨感興趣的基因一起引入宿主細胞。優(yōu)選的選擇標記物包括那些賦予藥物抗性的標記物，所述藥物例如為卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、G418、潮霉素和甲氨蝶呤?？蓪⒕幋a選擇標記物的核酸分子置于編碼表1和/或2的蛋白質(zhì)的同一載體中引入宿主細胞，或可以將其置于另外的載體中引入。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了引入的核酸的細胞可通過藥物篩選得以鑒定(例如，已經(jīng)引入了選擇標記物基因的細胞能夠存活，但其他細胞則會死亡)。在另一個實施方式中，可產(chǎn)生含有如下系統(tǒng)的重組微生物，所述系統(tǒng)能夠增強表達選定的和/或引入的基因。在高GC生物體如谷氨酸棒桿菌中改變并增強基因表達的實例可參見WO2005/059144、WO2005/059143和WO2005/059093。在另一個實施方式中，可產(chǎn)生含有如下的選定系統(tǒng)的重組微生物，所述選定系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)所引入的基因的受控表達。例如，將載體中的表1或2的基因置于lac操縱子的控制下，這使得僅當存在IPTG的情況下基因發(fā)生表達。此類調(diào)控系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法還包括自培養(yǎng)基或宿主細胞中分離甲硫氨酸。前面已經(jīng)描述了適合用于本發(fā)明的方法的培養(yǎng)基。如果使用遺傳學(xué)修飾的微生物，可以使用標準培養(yǎng)基，其可以是富含絲氨酸的。如果使用野生型微生物，其必須培養(yǎng)在富含絲氨酸的培養(yǎng)基中以實現(xiàn)發(fā)明的效果。用生長于瓊脂板、例如己經(jīng)在30°C孵育過的CM板(10g/L葡萄糖、2.5g/LNaCl、2g/1尿素、10g/L多蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L肉提取物、22g/L瓊脂，以2MNaOH調(diào)至pH6.8)上的細胞接種于培養(yǎng)基使得OD600為0.5-1.5。既可通過加入來自CM板的細菌細胞鹽水懸液也可通過加入細菌的液體預(yù)培養(yǎng)物而實現(xiàn)培養(yǎng)基接種過程。培養(yǎng)溫度應(yīng)該在15。C至45。C范圍內(nèi)。實驗過程中的溫度可保持恒定或可以改變。培養(yǎng)基的pH可在5至8.5范圍內(nèi)，優(yōu)選地在7.0附近，并可通過向培養(yǎng)基加入緩沖液而維持pH。用于此目的的抑制示例性緩沖液是磷酸鉀緩沖液。合成緩沖物如MOPS、HEPES、ACES等可替代使用或同時使用。也可在生長過程中通過加入NaOH或NHUOH來維持穩(wěn)定的培養(yǎng)pH值。如果使用復(fù)雜培養(yǎng)基成分如酵母提取物，則不必使用額外的緩沖物，因為其中許多復(fù)雜化合物具有高緩沖能力。如果使用發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物，也可用氣態(tài)氨來控制pH。培養(yǎng)時間通常為數(shù)小時至數(shù)日。時間的選擇是為了使得最大量的產(chǎn)物積聚在肉湯中，但不會使得微生物的聚集密度過高而導(dǎo)致細胞死亡。可在多種容器中實施所述生長實驗，例如微滴定板、玻璃管、玻璃瓶或不同體積的玻璃或金屬發(fā)酵罐。為了篩選大量克隆，微生物應(yīng)該培養(yǎng)在微滴定板、玻璃管、或搖瓶中，有無擋板均可。優(yōu)選地，使用100mL搖瓶，其中加入10%(體積比)的所需生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)瓶應(yīng)該在旋轉(zhuǎn)搖床上搖動(幅度25mm)，速度在100rpm至300rpm?？赏ㄟ^保持濕環(huán)境而消除蒸發(fā)損失；或者，應(yīng)該對蒸發(fā)損失進行數(shù)學(xué)校正。如果要測試遺傳學(xué)修飾的克隆，則也應(yīng)該測試未修飾的對照克隆或者只含有基本質(zhì)粒而無任何插入體的對照克隆。培養(yǎng)后，通過在保證細菌完好無損的條件下進行離心收集細菌?？赏ㄟ^添加酸或堿來處理發(fā)酵后的肉湯以獲得合適的pH值，使得甲硫氨酸可結(jié)合于由陰離子或陽離子交換基質(zhì)組成的基質(zhì)?；蛘呋虺笆龃胧┮酝?，可通過蒸發(fā)或者冷卻至20-0。C之間的溫度而濃縮含有或不含有生物量的肉湯。在這些條件下，發(fā)酵肉湯中的甲硫氨酸可結(jié)晶，因為在pH值為3至9之間的水中，甲硫氨酸的溶解度很低并依賴于溶劑的溫度?；蛘呋虺鲜龃胧┮酝猓赏ㄟ^例如噴霧干燥或其他干燥方法來干燥積聚在肉湯中的含有或不含有生物量的甲硫氨酸。在所有這些情況下，制備出的物質(zhì)可含有重量比為5-99%的甲硫氨酸、優(yōu)選地重量比為15-99%的甲硫氨酸、更優(yōu)選地重量比為30-99%的甲硫氨酸、甚至更優(yōu)選地重量比為50-99%的甲硫氨酸、以及最優(yōu)選地重量比為70-99%的甲硫氨酸。盡管在此結(jié)合谷氨酸棒桿菌和L-甲硫氨酸的產(chǎn)生描述了本發(fā)明，但應(yīng)該指出的是，本發(fā)明也可用于其他微生物以及用于產(chǎn)生其他氨基酸。此外，應(yīng)該指出的是，"包含"并不排除任何其他元素或步驟，且"一"并不排除復(fù)數(shù)。此外，應(yīng)該指出的是，參照上述實施方式之一所描述的特征或步驟也可與上述其他實施方式的其他特征或步驟組合使用。以下通過實施例進一步闡述本發(fā)明，這些實施例不能理解為是限制性的。本申請所引用的所有參考文獻、專利申請、專利、公開的專利申請、表格、附錄以及序列均通過引用并入本申請。58實施例菌抹谷氨酸棒桿菌ATCC13032(野生型)來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA,USA)。MbcR的敲除突變體是如下構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌M1840是衍生自野生型ATCC13032的AMcbR菌株(Reyetal.,2003，見上)。以質(zhì)粒pH430(SEQIDNo.l)轉(zhuǎn)化ATCC13032并"被坎貝爾插入"以產(chǎn)生"坎貝爾插入"菌株。"坎貝爾插入"菌株隨后"被坎貝爾刪除(Campbelledout)"以產(chǎn)生"坎貝爾刪除"菌株M1840,其具有McbR基因的缺失。培養(yǎng)基M1840培養(yǎng)在CG121/2基本培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基是通過混合不同儲存溶液(溶液l-8)而制備的。溶液l:25.0g葡萄糖力口100mlH2O，高壓滅菌溶液2:4.0gKH2PO416.0gK2HPO4以NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加695mlH20，高壓滅菌溶液3:10.0g(NH4)2SO4以NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，j^200mlH2O,高壓滅菌溶液4:2.5gMgS04x7H20加10mlH2O，過濾溶液5:0.1gCaCl2加10mlH2O，過濾溶液6:0.3g3，4-二羥苯甲酸以NaOH調(diào)節(jié)pH至12.0，力卩10mlH20，過濾59溶液7:50pi維生素B12(儲存液100pg/ml)0.015g硫胺素10pl磷酸吡哆醛(儲存液:0.1mg/ml)5ml生物素(儲存液1mg/ml)加50mlH20，過濾溶液8:0.5gFeSO4x7H2O0.5gMnS04xH200.1gZnS04x7H20500piCuS04x5H20(儲存液0.02g/ml)50pilNiCl2x6H20(儲存液0.02g/ml)50)ilNa6Mo7024x2H20(儲存液0.02g/ml)以HCl調(diào)節(jié)pH至l，加50mlH20，過濾通過混合80ml的溶液1、695ml的溶液2、200ml的溶液3、和各1ml的溶液4至8，制備1L的CG12W基本培養(yǎng)基。此外，加入20ml無菌水。對于富含絲氨酸的培養(yǎng)基，在CG12K基本培養(yǎng)基中加入10mM絲氨酸。培養(yǎng)條件細胞培養(yǎng)于板中，30°C。預(yù)培養(yǎng)物在含有25mL豐富液體培養(yǎng)基的帶擋板的250mL搖瓶中生長過夜。離心(2min,10000g,4。C)收集細胞，以0.9%NaCl洗漆兩次，用于接種CG12!/2基本培養(yǎng)基，進行第二預(yù)培養(yǎng)。如上所述收集第二預(yù)培養(yǎng)物，用作在CG12^基本培養(yǎng)基中進行的主培養(yǎng)的起始物。在對數(shù)生長期的后期收集細胞。其他實驗在含50mL培養(yǎng)基的帶擋板的500mL搖瓶中在旋轉(zhuǎn)搖床上進行(250rpm,30°C,搖動半徑2.5cm)。細胞提取和氣基脧走量如前所述提取細胞(Wittmannetal.(2004)Anal.Biochem.327:135-139)。通過HPLC(Agilent1100，Waldbronn，Germany)定量甲硫氨酸。分析前使用分析天平對所有樣品以225的a-氨基丁酸水溶液進行1:10稀釋。a-氨基丁酸作為定量的內(nèi)對照。使用熒光檢測器(340nm激發(fā)波長，450nm發(fā)射波長；Agilent,Waldbronn,Germany)檢測氨基酸。為此，以o-酞二醛進行柱前衍生化(Roth(1971)Anal.Chem.43:880-882)。結(jié)果在基本培養(yǎng)基中加入絲氨酸后，細胞內(nèi)甲硫氨酸濃度從生長在非富集培養(yǎng)基中細胞的0.42i,g/干物質(zhì)，升高至生長在富集絲氨酸的培養(yǎng)基中細胞的0.71±().12g/干物質(zhì)。S叫IDNo.1:>pH430tcg3gctctccaatctccactg鄉(xiāng)tectteatccttccgggg3attcgggcgctt犯atcg3ga城鄉(xiāng)cc3tcEiccttttaataacaatacaatgaataattggaataggtcgacacctttggagcggagccggttaaaattggcagcattcaccgaaagaaaaggagaaccacatgcttgccctaggttggattacatggatcattattggtggtctagctggttggattgcctccaagattaaaggcactgatgctcagcaaggaattttgctgaacatagtcgtcggtattatcggtggtttgttaggcggctggctgcttggaatcttcggagtggatgttgccggtggcggcttgatcttcagcttcatcacatgtctgattggtgctgtcattttgctgacgatcgtgcagttcttcactcggaagaagtaatctgctttaaatccgtagggcctgttgatatttcgatatcaacaggccttttggtcattttggggtggaaaaagcgctagacttgcctgtggattaaaactatacgaaccggtttgtctatattggtgttagacagttcgtcgtatcttgaaacagaccaacccgaaaggacgtggccgaacgtggctgctagctaatccttgatggtggacttgctggatctcgattggtccacaacatcagtcctcttgagacggctcgcgatttggctcggcagttgttgtcggctccacctgcggactactcaatttagtttcttcattttccgaaggggtatcttcgttgggggaggcgtcgataagccccttctttttagctttaacctcagcgcgacgctgctttaagcgctgcatggcggcgcggttcatttcacgttgcgtttcgcgcctcttgttcgcgatttctttgcgggcctgttttgcttcgttgatttcggcagtacgggttttggtgagttccacgtttgttgcgtgaagcgttgaggcgttccatggggtgagaatcatcagggcgcggtttttgcgtcgtgtccacaggaagatgcgcttttctttttgttttgcgcggtagatgtcgcgctgctctaggtggtgcactttgaaatcgtcggtaagtgggtatttgcgttccaaaatgaccatcatgatgattgtttggaggagcgtccacaggttgttgctgacgcgtcatatgactagttcggacctagggatatcgtcgacatcgatgctcttctgcgttaattaacaattgggatcctctagacccgggatttaaatcgctagcgggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttCtg3gcgggactctggggttcg3aatg3ccgacca3gcgacgccca3cctgccatcacg3gatttcgattcc3ccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctgg3gttcttcgccc3cgctEigcggcgcgccggccggcccggtgtg幼ataccgc3c鄉(xiāng)tgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgc3cg犯ccccccgttc3gcccg3ccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtcca3cccggt犯g3cacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaaggccggccgcggccgccatcggcattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtctttgacaacagatgttttcttgcctttgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgattgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacattgtttcctttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatccatttttaacacaaggccagttttgttcagcggcttgtatgggccagttaaagaattagaaacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgt3atgccgtc肌tcgtca臓gatccgcggg3gtC3gtg幼caggteccatttgccgttcattttEiaagacgttcgcgcgttcaatttcatctgttactgtgttagatgcaatcagcggtttcatcac加ttcagtgtgtaatcatcgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgctttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgctttgttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttccagtgtttgcttcaaatactaagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgtcgcctgagctgtagttgccttcatcgatgaactgctgtacattttgatacgtttttccgtcaccgtcaaagattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctgatgctgatacgttaacttgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttccgtcagatgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatcgaatttgtcgctgtctttaaagacgcggccagcgtttttccagctgtcaatagaagtttcgccgactttttgatagaacatgtaaatcgatgtgtcatccgcatttttaggatctccggctaatgcaaagacgatgtggtag63<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>權(quán)利要求1、在微生物中制備L-甲硫氨酸的方法，包括以下步驟-培養(yǎng)所述微生物，其中可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量是增加的；和-分離L-甲硫氨酸。2、權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物在富含絲氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3、權(quán)利要求2的方法，其中添加到所述培養(yǎng)基中的絲氨酸的濃度為O.lmM至lOOmM，優(yōu)選地為1至50mM，更優(yōu)選地為5mM至20mM，且最優(yōu)選地絲氨酸的濃度為10mM。4、前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述微生物在參與絲氨酸代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面被遺傳學(xué)修飾。5、權(quán)利要求4的方法，其中一或多種參與絲氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的。6、權(quán)利要求4或5的方法，其中所述參與絲氨酸合成的酶選自D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)、磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)和磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SerC)。7、權(quán)利要求5或6的方法，其中所述參與絲氨酸合成的酶被修飾以降低或防止L-絲氨酸的反饋抑制。8、權(quán)利要求7的方法，其中所述被反饋抑制的酶是D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)。9、前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中一或多種參與絲氨酸降解為丙酮酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的。10、權(quán)利要求9的方法，其中編碼所述參與絲氨酸降解為丙酮酸的酶的基因被破壞且優(yōu)選地被消除。11、權(quán)利要求9或10的方法，其中所述酶是絲氨酸脫水酶(sdaA)。12、前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中一或多種參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的。13、權(quán)利要求12的方法，其中編碼所述參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)的基因被破壞且優(yōu)選地被消除。14、權(quán)利要求12或13的方法，其中所述蛋白質(zhì)是ThrE。15、前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中一或多種參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的。16、權(quán)利要求15的方法，其中所述參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶選自絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MetF)。17、前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中一或多種參與甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的。18、權(quán)利要求17的方法，其中所述參與甲硫氨酸合成的酶選自天冬氨酸激酶(lysC)、高絲氨酸脫氫酶(hom)、高絲氨酸-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(MetA)、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(MetZ)、鈷胺素(I)依賴性甲硫氨酸合酶I(MetH)和鈷胺素(I)非依賴性甲硫氨酸合酶II(MetE)。19、前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中一或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的。20、權(quán)利要求19的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白是McbR。21、前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述微生物選自棒狀細菌、分枝桿菌、鏈霉菌科、沙門氏菌、大腸桿菌C^c/zen'c/^co//)、志賀氏菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌和假單胞菌。22、權(quán)利要求21的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌(C07"e6acten'wwg/wtofwz'cww)、大腸桿菌、或枯草芽孢桿菌(5a"'〃"s23、前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中L-甲硫氨酸于培養(yǎng)基或所述微生物的細胞中濃縮。24、自發(fā)酵肉湯中制備含L-甲硫氨酸的飼料添加劑的方法，包括以下步驟-培養(yǎng)所述微生物，其中可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量是增加的；-自含L-甲硫氨酸的發(fā)酵肉湯中除去水；-除去0至100^.-%的發(fā)酵過程中形成的生物量；和-干燥所述發(fā)酵肉湯以獲得粉狀或顆粒狀的動物詞料添加劑。25、權(quán)利要求24的方法，其中所述微生物在富含絲氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。26、權(quán)利要求25的方法，其中添加到所述培養(yǎng)基中的絲氨酸的濃度為0.1mM至100mM，優(yōu)選地為1至50mM，更優(yōu)選地為5mM至20mM，以及最優(yōu)選地絲氨酸的濃度為10mM。27、權(quán)利要求24至26中任一項的方法，其中所述微生物在參與絲氨酸代謝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面被遺傳學(xué)修飾。28、權(quán)利要求27的方法，其中一或多種參與絲氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的。29、權(quán)利要求27或28的方法，其中所述參與絲氨酸合成的酶選自D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)、磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)和磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SerC)。30、權(quán)利要求28或29的方法，其中所述參與絲氨酸合成的酶被修飾以降低或防止L-絲氨酸的反饋抑制。31、權(quán)利要求30的方法，其中被反饋抑制的酶是D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)。32、權(quán)利要求24至31中任一項的方法，其中一或多種參與絲氨酸降解為丙酮酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的。33、權(quán)利要求32的方法，其中編碼所述參與絲氨酸降解為丙酮酸的酶的基因被破壞且優(yōu)選地被消除。34、權(quán)利要求32或33的方法，其中所述酶是絲氨酸脫水酶(sdaA)。35、權(quán)利要求24至34中任一項的方法，其中一或多種參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的。36、權(quán)利要求35的方法，其中編碼所述參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)的基因被破壞且優(yōu)選地被消除。37、權(quán)利要求35或36的方法，其中所述蛋白質(zhì)是ThrE。38、權(quán)利要求24至37中任一項的方法，其中一或多種參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的。39、權(quán)利要求38的方法，其中所述參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶選自絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MetF)。40、權(quán)利要求24至39中任一項的方法，其中一或多種參與甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的。41、權(quán)利要求40的方法，其中所述參與甲硫氨酸合成的酶選自天冬氨酸激酶(lysC)、高絲氨酸脫氫酶(hom)、高絲氨酸-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(MetA)、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(MetZ)、鈷胺素(I)依賴性甲硫氨酸合酶I(MetH)和鈷胺素(I)非依賴性甲硫氨酸合酶II(MetE)。42、權(quán)利要求24至41中任一項的方法，其中一或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的。43、權(quán)利要求42的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白是McbR。44、權(quán)利要求24至43中任一項的方法，其中所述微生物選自棒狀細菌、分枝桿菌、鏈霉菌科、沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌和假單胞菌。45、權(quán)利要求44的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌,或枯草芽孢桿菌。46、超量產(chǎn)生L-甲硫氨酸的微生物，其中-一或多種參與絲氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的；和/或-一或多種參與絲氨酸降解為丙酮酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的；和減-一或多種參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的；禾口/或-一或多種參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的；且其中-一或多種參與甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是升高的；和/或-一或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白的含量和/或生物學(xué)活性與野生型微生物相比是降低的。47、權(quán)利要求46的微生物，其中所述參與絲氨酸合成的酶選自D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)、磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)和磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SerC)。48、權(quán)利要求46或47的微生物，其中所述參與絲氨酸合成的酶被修飾以降低或防止L-絲氨酸的反饋抑制。49、權(quán)利要求46至48中任一項的微生物，其中所述參與絲氨酸降解為丙酮酸的酶是sdaA。50、權(quán)利要求46至49中任一項的微生物，其中所述參與絲氨酸輸出的蛋白質(zhì)是ThrE。51、權(quán)利要求46至50中任一項的微生物，其中所述參與將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸的酶選自絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MetF)。52、權(quán)利要求46至51中任一項的微生物，其中所述參與甲硫氨酸合成的酶選自天冬氨酸激酶(lysC)、高絲氨酸脫氫酶(hom)、高絲氨酸-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(MetA)、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(MetZ)、鈷胺素(I)依賴性甲硫氨酸合酶I(MetH)和鈷胺素(I)非依賴性甲硫氨酸合酶II(MetE)。53、權(quán)利要求46至52中任一項的微生物，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白是McbR。54、權(quán)利要求46至53中任一項的微生物，其中所述微生物選自棒狀細菌、分枝桿菌、鏈霉菌科、沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌和假單胞菌。55、權(quán)利要求54的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、或枯草芽孢桿菌。56、權(quán)利要求46至55中任一項的微生物在生產(chǎn)L-甲硫氨酸中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及高效制備L-甲硫氨酸的微生物和方法。具體地，本發(fā)明所涉及的方法中可被所述微生物的代謝所利用的絲氨酸的量是增加的。文檔編號C12P13/12GK101454460SQ200780018641公開日2009年6月10日申請日期2007年5月24日優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日發(fā)明者A·黑羅爾德,C·克洛普羅格,C·維特曼,E·海因茨勒,H·施羅德,J·佩羅,J·克勒默,M·威廉斯,O·澤爾德,R·優(yōu)卡姆,T·帕特松,T·赫爾曼申請人:贏創(chuàng)德固賽有限責任公司