專利名稱：：用于dna擴(kuò)增反應(yīng)的溶液預(yù)處理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及溶液預(yù)處理。具體而言，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)溶液的預(yù)處理。優(yōu)選說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)溶液用于脫氧核糖核酸(DNA)的擴(kuò)增反應(yīng)，所述預(yù)處理確保蛋白質(zhì)溶液中存在的任何污染性DNA不能參加DNA擴(kuò)增反應(yīng)。
背景技術(shù)：
：核酸的擴(kuò)增，特別是DNA的擴(kuò)增，已成為DNA分析工作中廣泛使用的工具。在只有微小量DNA存在的情況下尤其如此。目前，DNA擴(kuò)增的最普遍使用方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR是使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶和兩條大約20個(gè)堿基的引物來(lái)擴(kuò)增DNA堿基序列的方法，其中一條引物互補(bǔ)于要擴(kuò)增序列一端的(+)-鏈，而另一條引物互補(bǔ)于要擴(kuò)增序列另一端的(-)-鏈。因?yàn)樾潞铣傻腄NA鏈可以隨后用作相同引物序列的額外模板，引物退火、鏈延伸和分離的連續(xù)循環(huán)，使得目標(biāo)序列迅速且高特異性的擴(kuò)增。如果相關(guān)引物可以被顯影的話，PCR還可以用于檢測(cè)所定義序列在DNA樣品中的存在。DNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)PCR試劑被細(xì)菌性(或其他)DNA污染是PCR方法學(xué)的主要問(wèn)題。以前，這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)由幾個(gè)作者提出(Bottger，1990;Rand禾卩Houck，1990;Schmitd等人，1991;Hughes等人，1994;Maiwald等人，1994;Hilali等人，1997)。PCR擴(kuò)增微小量DNA的能力是它的一個(gè)最大優(yōu)勢(shì)。不過(guò)，這種能力也意味著任何痕量的污染性DNA也一起被擴(kuò)增。這種污染性DNA的擴(kuò)增可能產(chǎn)生令人誤解的、不明確的或者不正確的結(jié)果(Wilson等人，19卯)。具體而言，以高度保守和進(jìn)化性同源真菌性核糖體的16SrRNA基因?yàn)槟繕?biāo)使用通用引物來(lái)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生、進(jìn)化和診斷研究的觀念，經(jīng)常在PCR期間由產(chǎn)生假陽(yáng)性而被折衷(Hilali等人，1997;Corless等人，2000;Mohammadi等人，2003)。真菌性DNA在環(huán)境中是普遍存在的，幾乎在實(shí)驗(yàn)室人員處理的任何時(shí)期，也可能將污染性DNA引入到PCR混合物中(Kitchin等人，1990;Millar等人，2002)。DNA污染的其他源包括氣溶膠(Saksena等人，1991)，可消耗的PCR試劑，塑料器皿(Millar等人，2002)或商售PCR引物(Goto等人，2005)。特別是己重復(fù)報(bào)道，可商售購(gòu)得的DNA聚合酶是一種最可能的外源性細(xì)菌性DNA污染源(Rand和Houck，1990;Bottger，1990;Schmidt等人，1991;Hilali等人，1997;Newsome等人，2004)。Schmidt等人(1991)認(rèn)為，用來(lái)生產(chǎn)DNA聚合酶和酶純化設(shè)備(例如色譜柱)的微生物是將外源性DNA引入到DNA聚合酶的最可能的源。相反，兩項(xiàng)其他研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)有證據(jù)證明r叫-聚合酶中的外源性細(xì)菌性DNA來(lái)源于生產(chǎn)性生物體，例如大腸桿菌C^c/zen'cWaco/0或水生棲熱菌(J/zera7Ma，加'cM力(Rand和Houck，1990;Maiwald等人，1994)，污染性DNA被證明與熒光假單胞菌CP^w^附o"^y/womsce朋)、綠膿桿菌(i^ewt/o附o"oyaerwg7'mwa)、糞產(chǎn)堿桿菌(y4/caf/z'gene51j^ect^X^nl^felSI氮菌04zoto6a"erW"e/a"flK)最為相關(guān)(Maiwald等人，1994)。此外，Schmidt等人(1991)也已經(jīng)檢測(cè)到，污染性DNA來(lái)源于各批Tag-聚合酶制劑中的真核生物?？墒沁@些研究不考慮源，而是致力于強(qiáng)調(diào)外源性DNA普遍存在于可商售購(gòu)得的Tag-聚合酶制劑中。除去所述污染性DNA的策略包括，用紫外光(Ou等人，1991;Sarkar和Sommer,1991;Frothingham等人，1992;Sarkar和Sommer，1993;Goldenberger和Altwegg，1995)、DNaseI(Rochelle等人，1992;Hilali等人，1997)、^輻射(Deragon等人，1990)、限制性內(nèi)切酶(DeFililppes，1991;Sharma等人，1992;Mohammadi等人，2003)或8-甲氧基補(bǔ)骨脂素與紫外輻射組合(Ji皿o等人，1990;Meier等人，1993;Hughes等人，1994;Fahle等人，1999)來(lái)處理PCR主要混合物(mastermix)制劑。不過(guò)，后一方法學(xué)不能在Schmidt等人(1991)和Corless等人(2000)的研究中分別成功再現(xiàn)。不過(guò)這些方法都具有顯著缺點(diǎn)。例如，使用紫外輻射(256nrn)以除去外源性DNA是有問(wèn)題的，因?yàn)門aq聚合酶已被證明對(duì)于該處理是極端敏感的(Ou等人，1991)，擴(kuò)增效率降低了105倍以上(Sarkar和Sommer，1990)。類似地，很多引物(取決于它們的序列)對(duì)于紫外輻射也是敏感的，然而脫氧核苷酸三磷酸鹽卻基本上不受紫外處理的影響，但是可以降低凈化效率(Frothingham等人，1992)。迄今為止，用來(lái)降低不希望DNA的最有效方式是用DNaseI和/或限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR試劑進(jìn)行預(yù)處理(Sharma等人，1992;HiMi等人，1997;Carroll等人，1999;Heininger等人，2003;Mohammadi等人，2003)。不過(guò)，在模板DNA可以被加入到反應(yīng)中之前，使用DNaseI需要徹底的熱變性步驟，以除去任何殘留的酶活性。HiMi等人(1997)報(bào)道，高溫和延長(zhǎng)溫育周期(95'C下50分鐘，或10(TC下20分鐘)對(duì)于DNaseI的有效滅活是必不可少的。所述處理無(wú)法與大多數(shù)Tag-聚合酶的熱穩(wěn)定性相適合。如果不完全滅活的話，那么殘留的DNaseI就會(huì)損害模板DNA。為了避免PCR效率降低，已推薦使用高度熱穩(wěn)定性DeepventExo-⑧聚合酶。使用限制性內(nèi)切酶可能還是有問(wèn)題，因?yàn)槊副旧砜赡苁峭庠葱哉婢訢NA源(Jinno等人，1990)。在擴(kuò)增之后捕獲DNA方面已經(jīng)有一些成果，如NZ514707中所論述。不過(guò)，該組合物和方法需要使用結(jié)合增強(qiáng)劑和標(biāo)簽，所述標(biāo)簽隨后被用來(lái)分析和檢測(cè)擴(kuò)增子(amplicon)。因此，如果蛋白質(zhì)溶液快速且容易的預(yù)處理方法是可利用的，所述方法能凈化、或者防止任何污染性DNA參加任何進(jìn)一步PCR反應(yīng)或其他DNA擴(kuò)增方法，那么該方法就是有益的。所有參考文獻(xiàn)，包括在本說(shuō)明書(shū)中引用的任何專利或?qū)＠暾?qǐng)，都以此被參考引入本文中。并不認(rèn)可任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。所述參考文獻(xiàn)的論述聲明了它們作者的斷言，而本申請(qǐng)人保留挑戰(zhàn)所引用文獻(xiàn)精確性和相關(guān)性的權(quán)利?？梢郧宄乩斫猓M管本文中提及大量現(xiàn)有技術(shù)出版物，但所述參考文獻(xiàn)并不構(gòu)成任何所述文獻(xiàn)成為本領(lǐng)域一部分公知常識(shí)的認(rèn)可，無(wú)論是在新西蘭或任何其他國(guó)家。公認(rèn)的是，術(shù)語(yǔ)"包括"在不同權(quán)限下可以表示除外的或包含有的意思。對(duì)于本說(shuō)明書(shū)的目的而言，除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"包括"將是包含有的意思，也就是說(shuō)，其將表示不僅包含直接提及的所列出成分、而且還包括其他沒(méi)有明確說(shuō)明的成分或要素的意思。當(dāng)在涉及方法或處理的一個(gè)或多個(gè)步驟中使用術(shù)語(yǔ)"包括的"或"包括"時(shí)，同樣使用該解釋。本發(fā)明目的在于處理上述問(wèn)題，或者至少在于為公眾提供有用的選擇。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)將由于通過(guò)單獨(dú)舉例方式進(jìn)行的繼續(xù)描述而變得清楚。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種制備用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的溶液的方法，包括以下步驟a)將結(jié)合劑與堿溶液混合，b)對(duì)來(lái)自a)的混合物進(jìn)行刺激以便活化所述結(jié)合劑，導(dǎo)致所述結(jié)合劑結(jié)合到堿溶液中的任何DNA上，從而使得DNA是不起反應(yīng)性的，并且在DNA擴(kuò)增反應(yīng)期間不被一起擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供一種用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的溶液，其中所述溶液基本上是經(jīng)如上所述方法制備的。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種DNA擴(kuò)增的方法，包括以下歩驟a)基本上使用如上所述方法來(lái)制備溶液，和b)在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中使用來(lái)自a)的溶液。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種制備用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的溶液的方法，包括以下步驟a)確定堿溶液中污染性外源性DNA的量，b)確定要結(jié)合所有污染性DNA需要的結(jié)合劑濃度，c)將所需濃度的結(jié)合劑與堿溶液混合，d)對(duì)來(lái)自(c)的混合物進(jìn)行刺激以便活化所述結(jié)合劑，和e)—旦活化，所述結(jié)合劑會(huì)結(jié)合到堿溶液中的任何DNA上，從而使得所述DNA是不起反應(yīng)性的，并且在DNA擴(kuò)增反應(yīng)期間不被一起擴(kuò)增。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述堿溶液可以是蛋白質(zhì)溶液，本文中將這樣稱呼。不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到，結(jié)合污染性DNA的相同程序，可以在任何其他用于PCR或其他擴(kuò)增反應(yīng)、而對(duì)于核酸為游離所必需的溶液中被使用，所述溶液例如氯化鎂溶液。設(shè)想，幾乎所有使用酶來(lái)擴(kuò)增DNA的方法都可能含有污染性DNA，而所述方法應(yīng)該能除去污染性DNA而不影響酶活性。例如，連接酶鏈反應(yīng)，基于核酸序列擴(kuò)增，鏈置換擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增。本說(shuō)明書(shū)全文中，術(shù)語(yǔ)"堿溶液"應(yīng)該理解為任何蛋白質(zhì)或其他溶液的意思，其已被制備或者可商售購(gòu)得，以供DNA擴(kuò)增反應(yīng)用，但其可能仍包括污染性DNA。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)溶液可以是用來(lái)在PCR反應(yīng)中延長(zhǎng)核酸鏈的DNA聚合酶溶液。不過(guò)，這不應(yīng)被視為對(duì)本發(fā)明的限制，因?yàn)閷?duì)于DNA擴(kuò)增或檢測(cè)，本發(fā)明也可以使用其他蛋白質(zhì)溶液，例如限制性內(nèi)切酶。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)溶液可以是Taq聚合酶溶液，Taq聚合酶是從水生棲熱菌分離的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。在一個(gè)替換的實(shí)施方式中，所述堿溶液可以是PCR主要混合物，其含有除了要擴(kuò)增的模板DNA之外，進(jìn)行PCR反應(yīng)所需要的全部成分。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述堿溶液可以是RNA制劑。RNA分析經(jīng)常包括以下步驟從細(xì)胞提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RNA(例如mRNA、rRNA)分子的DNA復(fù)制(cDNA)，然后通過(guò)PCR或其他擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增cDNA。對(duì)于精確的結(jié)果，重要的是RNA提取物不能被細(xì)胞DNA污染。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述堿溶液可以是早于cDNA產(chǎn)生的RNA提取物。從任何源獲得的蛋白質(zhì)溶液都可能含有污染性DNA。例如，本發(fā)明人已經(jīng)研究三種最常使用的可商售購(gòu)得的T叫聚合酶制劑。所有這三者都含有大致相同水平的污染性DNA。必須篩選可商售購(gòu)得的Taq聚合酶制劑到低于"可接受"水平的DNA污染，不過(guò)，這并不意味著它們沒(méi)有被污染。研究者們一般接受，由擴(kuò)增引起的假陽(yáng)性，在沒(méi)有加入模板DNA時(shí)將在延長(zhǎng)的PCR運(yùn)轉(zhuǎn)中發(fā)生，即，高于36個(gè)循環(huán)。因此，很多研究者將限制PCR運(yùn)轉(zhuǎn)周期，以達(dá)到低于36-40個(gè)循環(huán)數(shù)的陽(yáng)性結(jié)果。為了達(dá)到該結(jié)果，必須確保加入足夠的模板DNA以覆蓋少量污染性DNA的作用。當(dāng)使用一般引物或通用引物時(shí)，最可能發(fā)生污染性DNA的一起擴(kuò)增。通用引物例如是將要結(jié)合到來(lái)自任何真菌物種DNA上的那些引物。本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，在用PCR進(jìn)行16SrRNA基因研究期間，遇到在沒(méi)有加入模板DNA的陰性對(duì)照樣品中產(chǎn)生假陽(yáng)性的嚴(yán)重問(wèn)題。使用新批次的PCR緩沖液、氯化鎂、脫氧核苷酸三磷酸鹽、引物、微孔水制劑、塑料器皿和抗氣溶膠性過(guò)濾吸頭進(jìn)行廣泛試驗(yàn)后，結(jié)論則是污染源為AmpliTaq⑧DNA聚合酶本身。因?yàn)槲廴拘訢NA是唯一值得注意的，或者是污染性DNA擴(kuò)增到可檢測(cè)水平時(shí)的問(wèn)題，本發(fā)明目標(biāo)在于作為在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中使用的溶液而用。在本說(shuō)明書(shū)全文中，擴(kuò)增反應(yīng)將被稱為PCR，因?yàn)檫@是最常使用的擴(kuò)增技術(shù)，不過(guò)，這并不應(yīng)被視為是限制，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明可以作為對(duì)于任何擴(kuò)增技術(shù)的溶液預(yù)處理而利用。在本說(shuō)明書(shū)全文中，應(yīng)該采用PCR的一般意思，也就是使用熱穩(wěn)定性聚合酶和兩條大約20個(gè)堿基的引物，一條引物互補(bǔ)于要擴(kuò)增序列一端的(+)-鏈，而另一條則互補(bǔ)于另一端的(-)-鏈。引物退火、鏈延伸和分離的重復(fù)循環(huán)使得目標(biāo)序列迅速且高特異性的擴(kuò)增。本發(fā)明提供一種快速且容易的結(jié)合污染性DNA并防止其一起擴(kuò)增的方法。所述防止任何污染性DNA參加DNA擴(kuò)增反應(yīng)的方法，能由商品供應(yīng)者進(jìn)行，從而能提供保證不含有DNA的聚合酶或主要混合物，或者因?yàn)樾枰倚枰獣r(shí)，所述方法也能由各個(gè)研究機(jī)構(gòu)或研究人員進(jìn)行。在本說(shuō)明書(shū)全文中，術(shù)語(yǔ)DNA應(yīng)該理解為它的一般意思，包括由嘌呤堿或嘧啶堿核苷酸組成的任何化合物，每個(gè)核苷酸都包括脫氧核糖糖基和磷酸基。為了防止蛋白質(zhì)溶液進(jìn)一步污染，優(yōu)選結(jié)合劑將會(huì)防止污染性DNA參加擴(kuò)增反應(yīng)，而需要最小可能數(shù)次的打開(kāi)、加入或從反應(yīng)管除去。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑可以是一種具有兩種不同形式的結(jié)合劑，一種形式為惰性形式，其中結(jié)合劑不會(huì)起反應(yīng)或結(jié)合到DNA上，而另一種形式為活性形式，其中結(jié)合劑會(huì)結(jié)合到DNA上。對(duì)于結(jié)合劑而言，必須能夠容易且快速地在惰性和活性形式(反之亦然)之間轉(zhuǎn)換。這意味著，可以向溶液中加入足夠數(shù)量的結(jié)合劑以結(jié)合污染性DNA，結(jié)合劑處于活化狀態(tài)時(shí)將只與污染性DNA結(jié)合。這意味著，一旦有些結(jié)合劑已經(jīng)與所有污染性DNA結(jié)合，那么剩余試劑就能回復(fù)成惰性形式，并不會(huì)結(jié)合到任何其它DNA上。這防止結(jié)合劑/污染性DNA組合干擾任何進(jìn)一步反應(yīng)，或者DNA擴(kuò)增期間一旦已經(jīng)加入靶DNA的話。重要的是，結(jié)合劑的活化作用和去活作用容易進(jìn)行并且可控制。這確保，只是在加入模板(靶)DNA和引發(fā)DNA擴(kuò)增反應(yīng)之前，試劑結(jié)合到任何污染性DNA上才會(huì)發(fā)生。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在存在刺激的情況下，所述結(jié)合劑將只為活性形式。這是很重要的，因?yàn)檫@意味著，一旦將結(jié)合劑從活化刺激中除去，它將不能結(jié)合到DNA上，特別是不能結(jié)合到之后被加入到所述蛋白質(zhì)溶液、或蛋白質(zhì)溶液和其他為擴(kuò)增所需成分中的模板DNA上。另一個(gè)重要特征在于，能夠控制什么時(shí)候活化結(jié)合劑，這意味著，在DNA擴(kuò)增之前，不必從蛋白質(zhì)溶液中除去結(jié)合劑和被結(jié)合的DNA。這是有利的，因?yàn)榻档土擞纱蜷_(kāi)容器/反應(yīng)管導(dǎo)致的進(jìn)一歩污染的可能性。所述結(jié)合劑不會(huì)分解或破壞污染性DNA，這也是有利的，因?yàn)檫@樣的片段或部分本身可能會(huì)干擾擴(kuò)增反應(yīng)。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，沒(méi)有任何其他溶液成分(例如酶)被結(jié)合劑影響的可能性。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑可以被外部刺激活化，所述外部刺激例如紫外光或普通光。不過(guò)，這不應(yīng)被視為限制，因?yàn)榇碳⑷Q于選擇的結(jié)合劑、和可以導(dǎo)致結(jié)合劑從惰性形式向活性形式(或反之亦然)轉(zhuǎn)移的刺激。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑是嵌入劑。在本說(shuō)明書(shū)全文中，術(shù)語(yǔ)"嵌入劑"應(yīng)理解為包括任何能嵌入于DNA中的試劑，就是要可逆地包括于兩個(gè)相鄰堿基對(duì)之間。一些充分研究的DNA嵌入劑包括乙錠、原黃素和鎮(zhèn)靜劑。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑可以是乙錠單疊氮化物(EMA)。在這種情況下，所述方法以污染性DNA與嵌入劑EMA的復(fù)合作用為基礎(chǔ)。EMA是溴化乙錠的光反應(yīng)性類似物，其在暗處以與其親代化合物相類似方式與DNA相互作用(Bolton和Kearns，1978;Garland等人，1980)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所加入結(jié)合劑的量可以剛好足夠結(jié)合污染性DNA。在EMA為結(jié)合劑的情況下，EMA優(yōu)選可以以1和5嗎m1—1之間的濃度使用。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以使用約為3嗎ml—1的EMA濃度。3嗎ml"的EMA濃度可足以從主要混合物制劑(mastermixpreparation)中完全除去污染性DNA，而不影響如10fg那樣低濃度的模板DNA的擴(kuò)增。最佳的是，加入的EMA是剛好足夠結(jié)合所有外源性DNA的最小滴度，同時(shí)使在與羥胺形成有關(guān)的溶液中的游離氮賓形成最小化。在大于5呢ml"的EMA濃度下，對(duì)于含有低于100pg模板DNA的那些反應(yīng)而言，PCR的抑制是明顯的?？缮淌圪?gòu)得的PCR試劑中污染性DNA的量會(huì)變化。因此，每一批DNA聚合酶或PCR主要混合物都會(huì)需要進(jìn)行EMA滴度的最佳化，以確保最大限度地除去污染性DNA，而同時(shí)保持PCR靈敏度。EMA是溴化乙錠的類似物，其中8-位上的氨基已經(jīng)被疊氮基所取代。EMA在暗處以與其親代化合物相同的方式嵌入到雙鏈DNA中，但是在用可見(jiàn)光進(jìn)行光活化作用后，EMA可以另外共價(jià)結(jié)合DNA(Bolton和Kearns，1978;Garland等人，1980)。因此，已經(jīng)與疊氮化物起化學(xué)反應(yīng)的DNA不能通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。因此，加入例如EMA的結(jié)合劑，可以通過(guò)向含有除模板DNA外所有擴(kuò)增成分的主要混合物中加入該成分，用來(lái)結(jié)合外源性DNA，并防止其在Taq聚合酶和PCR試劑中被一起擴(kuò)增。在光解作用中，EMA8-位上的疊氮基使用基本上大于400nm的長(zhǎng)波光來(lái)進(jìn)行光化學(xué)活化(Bolton和Keams，1978)，從而在結(jié)合點(diǎn)經(jīng)氮賓基與核酸共價(jià)交聯(lián)(Hardwick等人，1984;Cantrdl等人，1978)。溶液中殘留的未結(jié)合氮賓轉(zhuǎn)化成為羥胺(Graves等人，1981)，其與溶液的醛和/或酮成分起反應(yīng)-優(yōu)先與胞嘧啶起反應(yīng)-形成肟(Freese等人，1961)。共價(jià)交聯(lián)的DNA不能參加PCR擴(kuò)增，因此其干擾被消除(Nogva等人，2003)。在本說(shuō)明書(shū)全文中，關(guān)于污染性DNA的術(shù)語(yǔ)"不起反應(yīng)性的"應(yīng)理解為不能通過(guò)DNA擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增的意思。這意味著，盡管結(jié)合的污染性DNA殘存于溶液中，DNA水平卻保持在其最初的低水平上，而該水平通過(guò)在DNA擴(kuò)增后使用的通常檢測(cè)方法是不可檢測(cè)出的。在本說(shuō)明書(shū)全文中，術(shù)語(yǔ)"主要混合物"應(yīng)理解為PCR反應(yīng)所需的一些或所有成分混合物的意思，但不包括要擴(kuò)增的模板DNA。例如，PCR主要混合物可以含有l(wèi)XTaq主要混合物lOmMTris-HCL50mMKCL1.5mMMgCL20,2mMdNTPs0.5mMDTT5%甘油0.8%NP-400.05mM吐溫-2025U/mlTaqDNA聚合酶用于PCR/擴(kuò)增反應(yīng)的成分，可以根據(jù)研究者和目的而十分明顯的改變。一些添加劑是任選的，例如DTT、甘油、吐溫，總是存在其他物質(zhì)，但是所用濃度可以改變，例如引物和MgCL2。主要混合物的組成沒(méi)有像大多數(shù)污染性DNA都是由Taq聚合酶引入的那么重要，該混合物幾乎總是以0.5-2.0單位/反應(yīng)之間使用(認(rèn)為1單位/反應(yīng)是良好的平均值)。在本說(shuō)明書(shū)全文中，術(shù)語(yǔ)"模板DNA"應(yīng)理解為在PCR反應(yīng)期間進(jìn)行擴(kuò)增的靶DNA的思思o(jì)在本發(fā)明中，我們介紹一種新穎且快速的方法學(xué)，該方法在小于IO分鐘內(nèi)從PCR主要混合物中除去任何外源性雙鏈DNA。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括以下它提供一種快速且容易的方法，用來(lái)防止蛋白質(zhì)或其他溶液中的污染性DNA在DNA擴(kuò)增反應(yīng)(例如PCR)中被一起擴(kuò)增，在擴(kuò)增前捕獲DNA意味著，擴(kuò)增需要最小限度的模板DNA，和進(jìn)行超過(guò)36個(gè)循環(huán)的PCR循環(huán)就有把握不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性，它利用可容易利用的場(chǎng)外化合物，由此降低成本和制備時(shí)間，它會(huì)使得在酶或其他蛋白質(zhì)或化學(xué)成分存在下結(jié)合DNA，而對(duì)其沒(méi)有不利影響，結(jié)合劑不會(huì)導(dǎo)致污染性DNA分解，進(jìn)而防止其片段干擾DNA擴(kuò)增反應(yīng)，帶有被結(jié)合的污染性DNA的結(jié)合劑不必從溶液中除去，因此通過(guò)限制容器/反應(yīng)管需要打開(kāi)的次數(shù)來(lái)防止進(jìn)一歩可能的污染。通過(guò)使用例如紫外光的刺激控制結(jié)合劑呈活性的時(shí)間，防止結(jié)合劑或結(jié)合DNA的結(jié)合劑干擾任何后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)合劑不需要制備，除了在進(jìn)行本方法前調(diào)整到正確濃度，結(jié)合劑或者結(jié)合污染性DNA的結(jié)合劑不抑制Tag聚合酶，只需要將低水平結(jié)合劑加入到堿溶液或反應(yīng)混合物中。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的其它方面將由于以下說(shuō)明而變得清楚，所述說(shuō)明通過(guò)單獨(dú)舉例和參考附圖進(jìn)行，其中圖1是在0.1嗎m1—1EMA存在下使用低模板DNA濃度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，和產(chǎn)物濃度的象素密度圖譜，圖2是對(duì)于l昭m1—1的象素密度圖譜；圖3是對(duì)于3pgmr1的象素密度圖譜；圖4是對(duì)于5嗎m廠1的象素密度圖譜；圖5是對(duì)于10嗎ml—1的象素密度圖譜；圖6是使用IO嗎ml—1EMA和200pg牛DNA的象素密度圖譜；圖7是對(duì)于3嗎ml—1EMA在JumpStartTaqDNA聚合酶上的象素密度圖譜，禾口圖8是對(duì)于3pgml—1EMA在PlatinumTaqDNA聚合酶上的象素密度圖譜。本發(fā)明的最佳實(shí)施方式呈現(xiàn)的結(jié)果證明，EMA能在10分鐘內(nèi)從PCR主要混合物中完全且迅速地消除任何可擴(kuò)增的外源性DNA。凈化PCR主要混合物制劑所需的EMA量，取決于存在的污染性DNA的量。如圖1和2中所示，0.1的疊氮化物滴度和l嗎m廠1EMA不能從PCR制劑完全除去所有污染性DNA，盡管使用l嗎ml—1能除去數(shù)量上更多的外源性DNA(圖1和2的象素密度圖譜，泳道9)。需要EMA的濃度為3呢m1—1，以從所述主要混合物制劑完全除去污染性DNA。該濃度不會(huì)影響如10fg低濃度的模板DNA的擴(kuò)增(圖3，泳道8)。需要相同濃度的EMA(3嗎m廠1)來(lái)完全除去兩種其他測(cè)試的Taq-聚合酶中的污染性DNA:JumpStartTaq-聚合酶和PlatinumTaq-聚合酶(圖7和8，泳道9)。此外，10fgDNA的模板DNA濃度仍會(huì)被再次擴(kuò)增，而沒(méi)有任何副作用(圖7和8，泳道8)。EMA濃度大于5嗎m1—1時(shí)，對(duì)于那些含有小于100pg17模板DNA的反應(yīng)而言，PCR的抑制是明顯的(圖4和5，泳道5至8)。令人感到有趣的是，將200pg^tl—1消化的牛DNA加入到同樣制備的回復(fù)PCR性能的主要混合物中，表明對(duì)于模板濃度低于100pg的擴(kuò)增失敗不是由于Tag-聚合酶的抑制，而是由于由未結(jié)合的EMA除去模板。相反，消化的牛DNA的20pg^等分樣品不足以除去PCR抑制(未顯示數(shù)據(jù))。在瓊脂糖凝膠電泳之后，用NationalInstituteofHealth,USA，提供的可自由下載軟件ImageJ進(jìn)行PCR產(chǎn)物評(píng)價(jià)。該軟件用來(lái)計(jì)算瓊脂糖凝膠圖像中所選區(qū)域的象素值統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，從所述統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)制定線密度圖譜。相對(duì)大量擴(kuò)增子的所述計(jì)算機(jī)控制測(cè)量比直接目測(cè)具有優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)于陰性對(duì)照而言。該方法使i于溴化乙錠著色過(guò)程和凝膠到凝膠改變中的誤解或矛盾導(dǎo)致的不明確結(jié)果最小化。因此，本發(fā)明人考慮，使用ImageJ或類似計(jì)算機(jī)程序來(lái)監(jiān)控適當(dāng)?shù)膬艋潭?。可商售?gòu)得的PCR試劑中污染性DNA的量會(huì)變化，每批DNA聚合酶或PCR主要混合物都會(huì)需要使EMA滴度最佳化，以確保最大限度地除去污染性DNA，同時(shí)保持PCR靈敏度。最佳情況是，EMA能被加入到最小滴度-剛好足夠結(jié)合所有外源性DNA，同時(shí)使在與羥胺形成有關(guān)的溶液中游離氮賓的形成最小化。已經(jīng)證明，羥胺是誘變性的，能在高于250至500mM的濃度范圍之上結(jié)合并化學(xué)修飾DNA，誘變時(shí)間大于30分鐘(Aslanzadeh，1992;Freese等人，1961)。此外，羥胺在Cu(II)存在下、但是沒(méi)有Mn(III)、Mn(11)、Fe(III)或Fe(II)存在下，誘導(dǎo)DNA損傷(Yamamoto等人，1993)。幸運(yùn)的是，本發(fā)明人能證明，最佳的疊氮化物滴度為7.14pM(3嗎ml—1)，其對(duì)擴(kuò)增的模板DNA沒(méi)有不利作用，如通過(guò)自枯草芽孢桿菌(及w6"fc)BS的D-丙氨酸消旋酶基因的序列測(cè)定所示。Bolton和Keams(1978)報(bào)道，對(duì)于低比例的EMA/核酸而言，EMA到DNA的交聯(lián)產(chǎn)率為常數(shù)值75。/。。因此，PCR主要混合物中未結(jié)合的和反應(yīng)性的羥胺的量，在3嗎ml—1的最佳EMA滴度下，有效地為1.78pM。即使當(dāng)EMA以超過(guò)除去外源性DNA所需的量加入時(shí)，對(duì)于11.9pM(5]agml—1)的濃度而言，在擴(kuò)增的DNA序列中也沒(méi)有改變，盡管在此濃度下反應(yīng)性羥胺的部分為6.54^M。因此，本方法學(xué)會(huì)對(duì)無(wú)性系化和測(cè)序反應(yīng)沒(méi)有副作用，所述反應(yīng)可能在擴(kuò)增子上進(jìn)行。理論上說(shuō)來(lái)，模板DNA濃度大于100pg時(shí)，EMA最佳化歩驟可能是多余的，B卩，其中由于未結(jié)合的EMA而致的模板DNA少量損失可以被證實(shí)。在這些情形下，可以推薦EMA的濃度為4到5嗎m1—1?？傊痉椒茉赑CR期間41個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后(即，沒(méi)有加入的模板DNA)，完全排除與可商售購(gòu)得的DNA聚合酶和/或PCR試劑有關(guān)的任何污染性DNA被一起擴(kuò)增。重要的是，濃度為3照ml—iEMA，在消除污染性DNA和不干擾非常低模板濃度下的PCR擴(kuò)增兩方面是有效的。這證實(shí)PCR主要混合物制劑含有三種不同的Taq聚合酶。所提出的所述凈化方案要迅速簡(jiǎn)單使用，在PCR擴(kuò)增中IO分鐘內(nèi)完成。因此，本方法學(xué)非常適合作為常規(guī)的分子診斷工具，來(lái)分析其中不希望背景被擴(kuò)增的具有極低模板濃度的稀薄/靈敏PCR樣品，g卩，臨床和法醫(yī)樣品的分析。而且，所述方法能與實(shí)時(shí)定量的PCR應(yīng)用組合，盡管其必須產(chǎn)生于這樣的精神下，EMA是對(duì)于結(jié)合的、未結(jié)合的和光解狀態(tài)具有不同激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料(Bolton和Kearns，1978;Garland等人，1980;Graves等人，1981)。因此，其綜合成定量PCR化驗(yàn)肯定會(huì)與淬火和/或報(bào)道染料一致。此外，可能本方法會(huì)對(duì)分子生物學(xué)中使用的、其中DNA污染可能是問(wèn)題的任何其他酶同樣有效，例如限制性內(nèi)切酶和蛋白酶。實(shí)施例1.材料和方法l丄菌株和培養(yǎng)物制備Anoxybacillusflav他ermus菌株C和枯草芽孢桿菌屬(5ad〃wra^7fo)菌株BS被Ronimus等人從新西蘭奶粉中分離出來(lái)(2003)。培養(yǎng)物在55。C下胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中培養(yǎng)，所述肉湯補(bǔ)充有0.2%(w/v)可溶性馬鈴薯淀粉(Sigma;S2004)。1.2.模板DNA制備通過(guò)修改由Sambrook和Russel所述程序(2001)，從A.flavithermus和枯草芽孢桿菌提取DNA。生長(zhǎng)之后，收集10ml細(xì)胞懸液，并重新懸浮于1ml的50mMTrisHCL(pH8.0)、100mMNaCL和20mMEDTA中。總共加入2mgml—1溶菌酶和50嗎ml—1RNase，將樣品在37'C下溫育45分鐘。將SDS和蛋白酶K分別加至1。/。(w/v)和200嗎m廠1。然后將樣品在55"下溫育1小時(shí)。隨后，將樣品用等體積的苯酚氯仿(1:1)提取，接著用氯仿和氯仿異戊醇(24:1)提取。然后通過(guò)加入1/10體積的3M乙酸鈉和0.6體積的異丙醇、并在-2(TC下溫育15分鐘，使DNA沉淀。將DNA沉淀(pellet)用冰冷卻的80%乙醇洗滌兩次，空氣干燥，并將DNA沉淀重新懸浮于500pl的lxTE(10mMTris-HCL，1mMEDTA，pH8.0)中。從Sigma(D4764)購(gòu)買小牛胸腺脫氧核糖核酸的凍干粉末，并重新懸浮于1XTE中。將牛DNA的25嗎等分樣品，在100pl的含有1Kunitz單位DNaseI(Sigma,DN25)和10pi10XDNase緩沖液(10mmolI—1EDTA，75mmolI—1MgCL2禾B200mmolI—1Tris-HCL，pH7.5)的全部樣品體積中，在37'C下部分消化10分鐘。隨后，加入20mmol廠1EDTA，將密封樣品在沸水浴中溫育10分鐘，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)確認(rèn)未完成的消化程度。部分消化的牛DNA樣品用于從PCR主要混合物中結(jié)合并除去未結(jié)合的疊氮化物。所有DNA樣品都用NanoDrop(NanoDropTechnologies,Wilmington,DE19810，USA)來(lái)量化，并在-20°。下存儲(chǔ)。而且，在所有DNA處理中，除去實(shí)驗(yàn)室污染的措施包括，引入抗氣溶膠性過(guò)濾吸頭用于在無(wú)菌層流操作臺(tái)下移液和處理所有溶液與試劑。在使用前，所有水溶液都在清潔的1.5ml微量離心管中進(jìn)行45分鐘的紫外輻射(256nm)。1.3.聚核苷酸引物來(lái)自Rueckert等人(2005)研究的正向引物(5'-AGGAACACCAGTGGCGAAG-3')和反向引物(5'-GGATGTCAAGACCTGGTAAGG-3')，用于擴(kuò)增在711-998位(根據(jù)Brosius等人的編號(hào)(1980))的小區(qū)域核糖體16SrRNA基因。依據(jù)樣品中存在的模板DNA，希望PCR擴(kuò)增子的大小為大約300bp。來(lái)自枯草芽孢桿菌BS的D-丙氨酸消旋酶基因被擴(kuò)增，并使用來(lái)自枯草芽孢桿菌屬菌株168(NCBI登錄號(hào)M16207)D-丙氨酸消旋酶基因的衍生引物，來(lái)進(jìn)行測(cè)序。正向引物和反向引物分別為5'-AGCACAAAACCTTTTTACAGAGATAC-3'禾卩5'-TTAATTGCTTATATTTACCTGCAATAAAG-3'。1.4.聚合酶鏈反應(yīng)在該研究中，使用以下三種DNATag-聚合酶，viz.AmpliTaq聚合酶(Roche，Cat.No.11647687001)，JumpStartTMTaqDNA聚合酶(Sigma，D9307)和PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen，Cat.No.10966-026)。向該反應(yīng)提供由每個(gè)生產(chǎn)商供應(yīng)的相關(guān)鎂和PCR緩沖液。所有PCR反應(yīng)都用EppendorfMastercycler(Gradient)在包括25^終體積的0.5ml微量離心管中進(jìn)行。該擴(kuò)增方案使用Rueckert等人(2005)所述方案的修改方案，具有以下循環(huán)條件在94'C下150秒，然后在94"C下15秒(共循環(huán)41次)，在62"C下10秒，和在68匸下15秒。所述擴(kuò)增反應(yīng)含有4mMMgCL2或MgS04、0.2mMdNTPs、lxTaqPCR反應(yīng)緩沖液、1.25單位的適當(dāng)Taq聚合酶、100nM正向引物和反向引物、禾P0.1禾H10ml—1范圍內(nèi)的EMA。所述擴(kuò)增反應(yīng)含有10ng到10fg十進(jìn)制稀釋范圍內(nèi)的、來(lái)自A.flavithermus的DNA。一些PCR反應(yīng)還含有200和20pgpi—1之間的小牛胸腺DNA(用DNaseI處理后的)。對(duì)于每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)都包括兩個(gè)陰性對(duì)照樣品，其中兩個(gè)陰性對(duì)照樣品都不含有加入的模板DNA，其中一個(gè)陰性對(duì)照樣品另外不含有EMA。在存在0、3和5嗎ml—iEMA的條件下，來(lái)自枯草芽孢桿菌屬菌株BS的D-丙氨酸消旋酶被擴(kuò)增。含有EMA的擴(kuò)增反應(yīng)和測(cè)序反應(yīng)以一式兩份進(jìn)行。PCR反應(yīng)含有4mMMgCL2、0.2mMdNTPs、lxAmpliTaqPCR反應(yīng)緩沖液、1.25單位AmpliTaq聚合酶、600nM正向和反向引物、禾Plng枯草芽孢桿菌屬菌株BS的基因組DNA。所述PCR反應(yīng)在94匸下進(jìn)行150秒，然后在94'C下進(jìn)行20秒(循環(huán)41次)，在47'C進(jìn)行20秒和在72°C下進(jìn)行90秒。最后的在72'C下10分鐘的延伸步驟完成擴(kuò)增。1.5.D-丙氨酸消旋酶測(cè)序繼PCR之后，將擴(kuò)增反應(yīng)電泳通過(guò)1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠(SeaKem，LEAgarose)(部分2.8)。然后在紫外透照儀上簡(jiǎn)要觀察凝膠，同時(shí)將D-丙氨酸消旋酶擴(kuò)增產(chǎn)物用無(wú)菌刀片切除。切除的帶狀物用蠟?zāi)て?，并?20'C下冷凍。隨后，對(duì)包裹的凝膠施加穩(wěn)定的不變壓力，將滲出液收集到1.5ml微量離心管中。這些DNA樣品用苯酚:氯仿、氯仿和氯仿:異戊醇提取，然后進(jìn)一步用乙酸鈉/異丙醇來(lái)沉淀，并進(jìn)行量化，如本文所述。在正向和反向起始方向上，在MegaBACE毛細(xì)管DNA分析系統(tǒng)上通過(guò)WaikatoDNA測(cè)序設(shè)備，對(duì)每個(gè)樣品都進(jìn)行DNA測(cè)序。1.6.PCR主要混合物的乙錠單疊氮化物處理從Biotium，Inc.(USA)購(gòu)買5毫克固體溴化乙錠單疊氮化物(EMA)，根據(jù)生產(chǎn)商的建議，在暗處將其溶解于N,N-二甲基甲酰胺中。在-20'C下，將10mgml—iEMA儲(chǔ)液的50pl等分樣品存儲(chǔ)于不透光的微管中。在光解作用和加入A.flavithe匪s的模板DNA之前，以0.1、1、3、5禾H10嗎ml—1(用干苗微717k琉鬆、的汰齒炮PMA"fin入至llPPR:t藍(lán)、)巨仝物法ll別由.人人而&會(huì)紀(jì)迅杜TTMA至關(guān)重要的是，在暗室中在無(wú)光條件下將EMA加入到清潔的1.5ml微量離心微管中，然后將樣品在冰上溫育5分鐘。然后將樣品在500W鹵素光源(鋨鎢燈絲合金，T3Q光亮鹵素)下曝光3分鐘，光源距樣品管20cm遠(yuǎn)，同時(shí)保持樣品在冰上。隨后，在簡(jiǎn)單的離心步驟之前，將所述主要混合物被分裝到PCR微量離心管中，向每個(gè)樣品中加入連續(xù)稀釋的模板DNA，收集管底部的所有反應(yīng)混合物。然后將管放置到Mastercycler中，開(kāi)始擴(kuò)增反應(yīng)。為了確定殘留EMA對(duì)AmpliTaq聚合酶活性是否有副作用，組配含有3嗎ml—1EMA但不加入Taq聚合酶的主要混合物。所述主要混合物進(jìn)一步進(jìn)行所述溫育和光解。隨后，將所述主要混合物等分到PCR管中，以從1.25到0.0097U變化的兩倍連續(xù)稀釋度加入AmpliTaq聚合酶。加入100pgA.flav池ermus模板DNA后，在每個(gè)稀釋度下進(jìn)行PCR反應(yīng)。類似制備對(duì)照主要混合物，但是不加入EMA。1.7.大于5嗎ml^的EMA濃度對(duì)PCR效率的作用濃度大于5昭ml—1的EMA對(duì)PCR效率的作用，用含有10嗎m廠1染料的AmpliTaq聚合酶主要混合物進(jìn)行研究。繼2.6部分中概述的方案之后，將所述PCR主要混合物在暗處溫育5分鐘，并照亮3分鐘。在曝光后，向所述主要混合物中加入200或20pg^i戶部分DNasel消化的牛DNA，將樣品于暗處在冰上再溫育5分鐘，以使限制性牛DNA能與任何未結(jié)合的EMA起反應(yīng)。然后分配所述主要混合物，將十進(jìn)制連續(xù)稀釋的模板DNA的等分樣品加入到PCR管中，如2.4下所述引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)。1.8.瓊脂糖凝膠電泳、成像和評(píng)價(jià)繼PCR之后，將擴(kuò)增產(chǎn)物使用HORIZON11.14電泳箱(LifeTechnologies,GIBCOBRL)在55伏下(PowerPackModel250;LifeTechnologies,GIBCOBRL)電泳通過(guò)1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠(SeaKem，LEAgarose)。凝膠用溴化乙錠(20嗎ml—1)染色15分鐘，用蒸餾水脫色20分鐘。然后使凝膠顯現(xiàn)，用AlphalmagerTM(AlphaI皿otech，SanLeandro，CA，USA)捕獲圖像。在計(jì)算機(jī)圖像上，用可在http:〃rsb.info.nih.gov/ij/在線得到的來(lái)自WayneRasband(NationalInstituteofHealth,USA)的ImageJ1.32J軟件包，進(jìn)行數(shù)字化的瓊脂糖凝膠評(píng)價(jià)。所述軟件用來(lái)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)量，作為它們象素密度的測(cè)量值(灰度值)。打開(kāi)圖像進(jìn)入ImageJ之后，背景扣除和圖像亮度及對(duì)比調(diào)整兩者都用ImageJ的默認(rèn)設(shè)定值進(jìn)行。凝膠條帶使用"繪譜(plotprofile)"選項(xiàng)進(jìn)行分析。復(fù)制數(shù)據(jù)繪圖值坐標(biāo)，粘貼到MicrosoftExcel2004中，并用線圖選項(xiàng)(linechart)標(biāo)繪數(shù)據(jù)。2.結(jié)果2丄用來(lái)消除PCR主要混合物中外源性DNA污染的最佳EMA濃度的確定。用來(lái)從含有AmpliTaq聚合酶的PCR主要混合物中除去外源性DNA的最佳量EMA，在0.1、1、3、5和IO嗎ml—1的濃度范圍上確定。覆蓋從10ng到10fgA.flav他ermusDNA的模板DNA濃度，用來(lái)評(píng)價(jià)主要混合物對(duì)EMA結(jié)合的靈敏度。從這些試驗(yàn)所得結(jié)果顯示于圖1到5中。圖1到5的各陰性對(duì)照，其不含有模板DNA且不加入EMA(圖1到5中的泳道10)，都產(chǎn)生一個(gè)到兩個(gè)大約300bp的擴(kuò)增子。由此表明，PCR主要混合物中有可擴(kuò)增的外源性DNA存在。這與含有EMA但不含有模板DNA的陰性對(duì)照(圖1到5各圖中的泳道9)形成對(duì)比，其中PCR擴(kuò)增子的產(chǎn)生取決于所用EMA的量。低于l嗎ml—1的EMA濃度(圖1禾a2中的泳道9)不能完全除去PCR主要混合物中存在的所有外源性DNA，兩個(gè)反應(yīng)都產(chǎn)生適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增子。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的量-相對(duì)于象素密度圖譜中灰度值測(cè)得-在兩個(gè)樣品間顯著變化，用lMgm廠1EMA處理的陰性對(duì)照樣品(圖2，泳道9)比用0.1ugml—iEMA處理的陰性對(duì)照樣品(圖l，泳道9)明顯產(chǎn)生更少數(shù)量的PCR產(chǎn)物。3嗎m廠1和以上的EMA濃度成功地從主要混合物除去所有外源性DNA，對(duì)于這些樣品沒(méi)有觀察到PCR擴(kuò)增子(圖3到5，泳道9)。5嗎m廠1和以上的EMA濃度導(dǎo)致DNA模版濃度在10pg和以下時(shí)PCR失敗(圖4和5,泳道5到8)。因此，用來(lái)消除所述主要混合物中外源性DNA的EMA最佳量為3嗎m1—1(圖3)，而同時(shí)在模版DNA濃度低至10fg時(shí)顯示出不會(huì)干擾模板DNA的擴(kuò)增。2.2.大于5嗎m1—1的EMA濃度對(duì)PCR效率的作用對(duì)于含有10pg到10fg模板DNA并用5和10嗎ml—iEMA處理的PCR反應(yīng)的失敗(圖4和5，泳道5到8)，有兩種可能的解釋。首先，這些高濃度EMA使AmpliTaq聚合酶部分滅活，其次，高反應(yīng)性但未結(jié)合的氮賓由于超過(guò)EMA而存在于主要混合物中，隨后加入模板DNA時(shí)氮賓會(huì)結(jié)合模板DNA。在加入模板DNA之前，但在EMA光解之后，通過(guò)向PCR主要混合物中加入20或200pgpi—1DNaseI消化的牛DNA來(lái)檢驗(yàn)后一解釋。所述加入的DNA沒(méi)有被所用引物對(duì)擴(kuò)增，即，其沒(méi)有與模板DNA競(jìng)爭(zhēng)。在較低模板DNA濃度下，向PCR主要混合物中加入20pgpi—1牛DNA，沒(méi)有恢復(fù)PCR性能(沒(méi)有顯示數(shù)據(jù))。相反，對(duì)于含有10pg到10fg模板DNA的樣品而言，向所述主要混合物中加入200pg^d^牛DNA，則成功地恢復(fù)了擴(kuò)增反應(yīng)(圖6)。這些結(jié)果表明，AmpliTaq聚合酶活性并不受存在相對(duì)高濃度的EMA的影響，擴(kuò)增失敗可能是由于模板被未反應(yīng)的氮賓結(jié)合所致。2.3.殘留EMA對(duì)AmpliTaq聚合酶和模板DNA活性的作用為了進(jìn)一步降低殘留的未反應(yīng)疊氮化物對(duì)AmpliTaq聚合酶和模板DNA活性的作用，進(jìn)行另外兩個(gè)試驗(yàn)。在第一個(gè)試驗(yàn)中，使用分別含有0、3和5嗎ml—1EMA的PCR主要混合物制劑，從1ng模板DNA擴(kuò)增出來(lái)自枯草芽孢桿菌屬BS的D-丙氨酸消旋酶。隨后測(cè)定PCR產(chǎn)物序列，將它們的序列與己知的枯草芽孢桿菌168的D-丙氨酸消旋酶(1170bp)通過(guò)ClustalW比對(duì)法進(jìn)行比較(如表1中所示)。結(jié)果顯示，在3和5pgm廠1濃度下的EMA，或者光解作用中的任何其它次要產(chǎn)物，對(duì)擴(kuò)增和測(cè)序都沒(méi)有副作用。表l.確定枯草芽孢桿菌BS的D-丙氨酸消旋酶的序列(GenBank登錄號(hào)DQ291153)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(a)在光解和擴(kuò)增之前向PCR主要混合物中加入EMA。(b)對(duì)枯草芽孢桿菌168的全長(zhǎng)度D-丙氨酸消旋酶(1170bp)的絕對(duì)得分。在第二個(gè)試驗(yàn)中，將兩倍稀釋度系列的AmpliTaq聚合酶的等分樣品加入到用3嗎ml^EMA處理的主要混合物中，以便確定殘留的EMA對(duì)Taq聚合酶活性是否有副作用。從該試驗(yàn)所得結(jié)果表明，在對(duì)照(沒(méi)有加入EMA)和EMA處理的主要混合物之間，終點(diǎn)稀釋度略有不同。在對(duì)照中，在0.039單位/反應(yīng)的有效Taq聚合酶濃度下發(fā)生擴(kuò)增，然而，對(duì)于EMA處理的樣品而言，最低濃度為一個(gè)稀釋度以下，即，0.079單位的Taq聚合酶(未顯示數(shù)據(jù))。這等同于損失大約7%加入的Taq聚合酶活性，在正常PCR操作下這不會(huì)引人注意。2.4.施用DNA聚合酶，而不是AmpliTaq聚合酶對(duì)于從1.6部分中用來(lái)消除PCR主要混合物制劑中污染性DNA方案的確認(rèn)，還可以在3嗎ml—1EMA存在下、在含有JumpStartTag-聚合酶或Plati皿mTag-聚合酶的主要混合物上進(jìn)行。兩個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果在圖7和8中有所說(shuō)明，它們反映來(lái)自圖3的那些結(jié)果。來(lái)自圖7和8中泳道10的未處理陰性對(duì)照樣品證明了特定PCR擴(kuò)增子的擴(kuò)增，這證實(shí)兩種DNA聚合酶都是可擴(kuò)增的DNA源。密度圖譜表明，污染性DNA的定量差異是明顯的，JumpStartTaq-聚合酶弓|入大約2fg的可擴(kuò)增DNA/反應(yīng)，而PlatinumTag-聚合酶則引入大約40fg的可擴(kuò)增DNA/反應(yīng)。至關(guān)重要的是，用3嗎mrkMA進(jìn)行處理完全抑制了陰性對(duì)照反應(yīng)中污染性DNA的任何擴(kuò)增(圖7和8，泳道9)。而且，兩種PCR主要混合物仍然都能使外部加入的、10fg到10ng范圍內(nèi)的、來(lái)自A.flav池ermus的模板DNA擴(kuò)增(圖7禾卩8，泳道2妾U8)。參考文獻(xiàn)Aslanzahed,J.(1993).Applicationofhydroxylaminehydrochlorideforpost墨PCRsterilization.M/ecw/or朋dCW/w/ar尸ro6es7(2),145-150.Bolton,P.H.andKearns,D.R.(1978》Spectroscopicpropertiesofethidiummonoazide:afluorescentphotoaffmitylabelfornucleicacid.A^c/'ciesean:/z5(12),4891-4903.Bottger,E.,C.(1990).FrequentcontanminationofTaqpolymerasewithDNA.C7/m'ca/C7ze附/,36(6),1258-1259.Brosius,J.,Dull,T.J.，Sleeter,D.D.,Noller,H.F.(1980).GeneorganizationandprimarystructureofaribosomalRNAoperonfromEsc/zw-c/z/acW.■Aw""/q/"i/o/ogv148(2),107-27.Cantrell,C.E.,Yielding,K.L.,Pruitt,K.M.(1979).Efficiencyofphotolyticbindingofethidiummonoazidetonucleicacidsandsyntheticpolynucleotides.M/ecw/ariVa環(huán)aco/ogy15(2),322-330.Carroll,N.M.,Adamson,P.andOkhravi,N.(1999),EliminationofbacterialDNAfrom7^DNApolymerasesbyrestrictionendonucleasedigestion.Jowrwa/o/C7/"Zca/Af/cro^'o/ogy37(10)，3402-3404.Corless,C.E.,Guiver,M.,Borrow,R.,Edwards-Jones,V"Kaczmarski,E.B.andFox.A.J.(2000).Contaminationandsensitivityissueswithareal-timeuniversal16SrRNAPCR.Jowr"a/o/C7/"/ca/她ra6油gy38(5),1747-1752.DeFililppes,RM.(1991).DecontaminatingthepolymeraseChainReaction.別otec/zm々wes10(1)，26-30.Deragon,J.M.,Sinnett,D.，Mitchell,G,Potier,M.andLabudaD.(1990).UseofgammairradiationtoeliminateDNAcontaminationforPCR.M/c/e/c爿c/^y7^yrarc//18(20),6149.Fahle,G,A.,Gill，V.J.andFischer,S.H.(1999》Optimalofisopsoralentopreventampliconcarryover.Jowma/o/C7z'm'ca/M/cra^o/ogy37(1),261-262.Freeze,E.,Bautz,E.andFreese，E.B.(1961).Thechemicalandmutagenicspecificityofhydroxylamine.f/zeAto/ona/」a^附少^/\SWe"ce47,845-855.Frothingham.R.，Blitchington,R.B.,Lee,D，H.,Greene,R.C,Wilson,K.H.，(1992).UVabsorptioncomplicatesPCRdecontamination,5/她c/m々w^y13,208-210.Garland,F.，Graves,D.，E.，Yielding,L.,W.andCheung,H.，C.(1980).Comparativestudiesofthebindingofethidiumbromideanditsphotoreactiveanaloguestonucleicacidsbyfluorescenceandrapidkinetics.19(14)，3221-3226.Goldenberger,D.,Altwegg,M.(1995》EubacterialPCR:contaminatingDNAinprimerpreparationsanditseliminationbyUVlight.Jowraa/Mfcra6zWogy她/^ods21,27-32.Goto,M.,Ando，S.,Hachisuka,Y.andYoneyama,T.(2005).ContaminationofdiversenifHandnifH-likeDNAintocommercialPCRprimers.FEMSM'cro6z'o/og7c丄"&rs246(1),33-88.Graves,D.E.，>Vatkins,C.L.andYielding,L.W.(1981).Ethidiumanditsphotoreactiveanalogues:spectroscopicanalysisofdeoxyribonucleicacidbindingproperties.BZoc/^/mW/^20(7),1887-1892.HardwickJ.M.,vonSpreckenR.S.,Yielding,K.L.,Yielding,L.W.(1984).EthidiumbindingsitesonplasmidDNAdeterminedbyphotoaffinitylabeling.Toi/rwa/C7^mz'Wry1259(17),11090-11097.Heininger,A.,Binder,M.，Ellinger,A.,Botzenhart,K.，Unertl,K.，andDoring,G,,(2003).DNasepretreatmentofmastern;ixreagentsimprovesthevali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，所述堿溶液沒(méi)有用于擴(kuò)增反應(yīng)的模板DNA，(b)確定所述堿溶液中污染性外源性DNA的量，(c)確定要結(jié)合所有污染性DNA所需的結(jié)合劑濃度，所述結(jié)合劑具有至少一種活性形式和至少一種惰性形式，(d)將具有至少一種活性形式和至少一種惰性形式的所需濃度的結(jié)合劑與所述堿溶液混合，(e)將來(lái)自(d)的混合物進(jìn)行外部刺激，所述刺激將結(jié)合劑從惰性形式轉(zhuǎn)化成活性形式，并導(dǎo)致結(jié)合劑結(jié)合到堿溶液中的任何污染性DNA上，從而使得污染性DNA為不起反應(yīng)性的，且當(dāng)所述溶液隨后被用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)中期間加入模版DNA時(shí)污染性DNA不被一起擴(kuò)增，(f)除去外部刺激，由此將結(jié)合劑從活性形式轉(zhuǎn)化成惰性形式。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中所述堿溶液是蛋白質(zhì)溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1一3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述堿溶液是DNA聚合酶溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1一4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述堿溶液是Taq聚合酶溶液。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述堿溶液是PCR主要混合物(mastermk)。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中所述堿溶液是RNA制劑。8.根據(jù)權(quán)利要求l一7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述DNA擴(kuò)增反應(yīng)是PCR。9.根據(jù)權(quán)利要求1一8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述刺激為可見(jiàn)光。10.根據(jù)權(quán)利要求1一8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述刺激為紫外光。11.根據(jù)權(quán)利要求1一10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述結(jié)合劑是乙錠單疊氮化物。12.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的方法，其中所述乙錠單疊氮化物的濃度為1和5ugmL一13.根據(jù)權(quán)利要求ll中所述的方法，其中所述乙錠單疊氮化物的濃度約為3ugmL一1。14.一種用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的溶液，其中所述溶液經(jīng)權(quán)利要求1一13中任一項(xiàng)的方法制得。15.—種DNA擴(kuò)增的方法，包括以下步驟(a)使用權(quán)利要求1一13中任一項(xiàng)的方法制備溶液，禾口，(b)在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中使用來(lái)自(a)的溶液。16.—種制備用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的溶液的方法，基本如本文中所附說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例所述。17.—種用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的溶液，基本如本文實(shí)驗(yàn)例部分1.6、1.7、2.1、2.2、2.3、2.4和附圖所述。18.—種DNA擴(kuò)增的方法，基本如本文實(shí)驗(yàn)例部分1.6、1.7、2.1、2.2、2.3、2.4和附圖所述。全文摘要一種制備用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的溶液的方法，包括以下步驟將結(jié)合劑與堿溶液混合；將所述混合物(結(jié)合劑和堿溶液的混合物)進(jìn)行刺激從而活化結(jié)合劑，一旦活化，結(jié)合劑就會(huì)結(jié)合到堿溶液中的任何DNA上，從而使得DNA為不起反應(yīng)性的，且在DNA擴(kuò)增反應(yīng)期間不被一起擴(kuò)增。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101432443SQ200780015509公開(kāi)日2009年5月13日申請(qǐng)日期2007年3月8日優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日發(fā)明者休·威廉·摩根,安德魯斯·瑞克特申請(qǐng)人:懷卡托林克有限公司