專利名稱：生產(chǎn)生物燃料和相關(guān)材料的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物燃料如乙醇和相關(guān)材料的組合物和涉及生 產(chǎn)生物燃料如乙醇和相關(guān)材料的系統(tǒng)和方法。 技術(shù)背景的方法上有極大的興趣。以^暖水化合物形式存在的能源可在廢棄生物 質(zhì)和在專用能源作物如谷物(例如玉米和小麥)或草類(例如柳枝稷)中 見到。纖維素和木質(zhì)纖維素材料在許多應(yīng)用中得到了大量的生產(chǎn)、加 工和使用。當(dāng)前的挑戰(zhàn)是要開發(fā)出可行和經(jīng)濟(jì)的策略來將碳水化合物轉(zhuǎn)化 成可用的能源形式。從碳水化合物取得有用的能源的策略包括生產(chǎn)乙 醇("纖維素乙醇")和其他醇類(例如丁醇)，將碳水化合物轉(zhuǎn)化成氫和 通過燃料電池將碳水化合物直接轉(zhuǎn)化成電能。例如，以下文獻(xiàn)描述了 生物質(zhì)乙醇策略DiPardo, o/owwa/ o/ (9w//ooA: 五f/zawo/ /Vot/wc/7,ow a/W Z)e應(yīng)"t/ (EZ4 Forecast, 2002; Sheehan，所otec/wo/ogy /Vograss, 15:8179， 1999; Martin,五"^ywe A//croZjas Zbc/7w0/0gv, 31:274, 2002; Greer, 5/oCyc/e， 61-65, April 2005; Lynd, il^fcroZ /o/ogy awdMo/ecw/or i^v/evra， 66:3, 506-577, 2002; 和Lynd et al. in"Consolidated Bioprocessing of Cellulosic Biomass: An Update(纖維 素生物質(zhì)的聯(lián)合生物力。工最新資料),"Cw庁e"f Qpz'm'o" 跑ec/z"o/，， 16:577-583,2005。 發(fā)明概述本發(fā)明部分上基于對才直物發(fā)酵4炎菌(C7as/nWwm p/^to/erme"tara) 這種厭氧細(xì)菌的新特性的發(fā)現(xiàn)。例如，植物發(fā)酵梭菌的分離林(ISDgT， 美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection) 700394T)。 進(jìn)行了保藏，保藏的條件是保證該培養(yǎng)物在本專利申請的審理期間可 供經(jīng)美國專利商標(biāo)局局長按37 C.F.R. 1.14和35 U.S.C. 122認(rèn)定有權(quán) 獲得該培養(yǎng)物的人獲得。在提交本主題申請的對應(yīng)申請或后續(xù)申請的 國家，按照外國專利法的要求，本保藏物也可供獲得。但是應(yīng)認(rèn)識到， 保藏物的可獲得并不構(gòu)成這樣的許可，即在損害政府行為所授予的專 利權(quán)的情況下實(shí)施本主題發(fā)明。此外，本主題培養(yǎng)保藏物須按照微生 物寸呆藏布達(dá) <風(fēng)斯條約(Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms)的規(guī)定進(jìn)行保藏和供公眾獲得，即它們須進(jìn)行小心保 藏，以使它們在最近提出的提供保藏物樣品的要求后保持存活和不受 污染達(dá)至少五年的時(shí)間，且無論如何，在保藏日后保持存活和不受污 染達(dá)至少三十年的時(shí)間，或者在最后一次提出的從保藏庫獲取樣品的 要求后保持存活和不受污染達(dá)任何可能授權(quán)的公開了該培養(yǎng)物的專 利的可實(shí)施期限加五年的時(shí)間。保藏人確認(rèn)，萬一寄存機(jī)構(gòu)在被提出 要求時(shí)因?yàn)楸２匚锏那闆r不能夠提供樣品，保藏人有義務(wù)替換保藏 物。 一旦公開本主題培養(yǎng)保藏物的專利得到授權(quán)，所有對該保藏物對 公眾的可獲得性的限制都不可撤回地廢除。我們發(fā)現(xiàn)，植物發(fā)酵梭菌如ISDgT株單獨(dú)地或與一種或多種其他 微生物(例如酵母菌或其他細(xì)菌)組合在一起，能大規(guī)模地將碳水化合 物材料或包含碳水化合物的材料或碳水化合物的混合物發(fā)酵成可燃 燒燃料，例如乙醇，丙醇和/或氫。例如，植物發(fā)酵梭菌能將廢棄生物質(zhì)如鋸屑、木粉、木漿、紙漿、紙漿廢物流(waste steam)，草類(例 如柳枝稷(switchgrass))、生物質(zhì)植物和作物(例如兩節(jié)齊屬植物 (Crambe))、藻類、稻殼、甘蔗渣、黃麻、樹葉、草剪取物(grass clippings)、 玉米秸稈、玉米芯、玉米谷粒(磨碎玉米)、酒糟和蒸餾溶質(zhì)(distillers solute)發(fā)酵成乙醇、丙醇和氫。另外，也可生產(chǎn)其他有用的有機(jī)產(chǎn)物， 如有機(jī)酸(例如曱酸、乳酸和乙酸)或者它們的共軛堿(例如曱酸根、乳 酸根或乙酸根)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明表征了從一種或多種生物質(zhì)材料制備一種或 多種燃料的方法，所述方法包括提供包含高分子量碳水化合物的生物 質(zhì)材料；將該生物質(zhì)材料水解以提供水解生物質(zhì)材料；將該水解生物 質(zhì)材料與植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行組合；和將該水解生物質(zhì) 材料進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵的條件和時(shí)間足以生產(chǎn)燃料或燃料的混合物，例 如乙醇、丙醇和/或氬。除了燃料外，也可生產(chǎn)其他產(chǎn)物和/或聯(lián)產(chǎn)物(例 如有機(jī)酸和/或它們的共軛堿)。在一些實(shí)施方案中，碳水化合物在培 養(yǎng)基中的濃度大于約20mM。在其他實(shí)施方案中，濃度大于約1 mM， 例如大于2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12、 14、 16或大于約18mM。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包括水解裝置和發(fā)酵器的燃料設(shè) 施，該水解裝置設(shè)置成能水解包含高分子量碳水化合物的生物質(zhì)材 料，該發(fā)酵器設(shè)置成能容納其中*有植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞的培養(yǎng)基。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了制備一種或多種燃料的方法，所述 方法包括將植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞與木質(zhì)纖維素材料(和/或其他生物質(zhì)材 料)在培養(yǎng)基中進(jìn)行組合，和發(fā)酵該木質(zhì)纖維素材料，發(fā)酵的條件和 時(shí)間足以生產(chǎn)一種或多種燃料，例如乙醇、丙醇和/或氫。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了制備一種或多種燃料的方法，所述 方法包括將植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞與包含碳水化合物的材料在培養(yǎng)基中 進(jìn)行組合，和發(fā)酵該包含碳水化合物的材料，發(fā)酵的條件和時(shí)間足以 生產(chǎn)燃料。碳水化合物在培養(yǎng)基中的濃度大于20 mM，例如大于30 mM、 40mM、 50 mM、 75 mM，或甚至100mM或更高。在任何本文描述的方法中，植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞都可單獨(dú)地或與一 種或多種其他微生物(例如酵母菌或其他細(xì)菌)組合在一起進(jìn)行利用， 以生產(chǎn)燃料或別的有用產(chǎn)物，如有機(jī)酸或它們的共輒石咸，該酸或共軛 ^喊可以以鹽形式(例如鈉鹽或鉀鹽)分離出來。另 一種細(xì)菌的 一個(gè)實(shí)例是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單月包菌(Zymo附o"os附o&7/力的4壬"f可菌才朱。在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了用植物發(fā)酵梭菌單獨(dú)地或與一種或 多種其他微生物(如某個(gè)酵母菌菌抹或某個(gè)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌抹)共培 養(yǎng)地從一種或多種生物質(zhì)材料制備一種或多種燃料的方法。除了制備 燃料外，共培養(yǎng)物還可用來制備任何本文描述的聯(lián)產(chǎn)物，如有機(jī)酸或 其共軛堿或 鹽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了采用植物發(fā)酵梭菌從一種或多種生 物質(zhì)材料(如任何本文描述的那些材料)生產(chǎn)有機(jī)酸或其共軛堿或鹽的 方法。例如，其他有用的產(chǎn)物或聯(lián)產(chǎn)物可用作化工或醫(yī)藥行業(yè)的原料。 可以生產(chǎn)的酸(共輒i威)的實(shí)例包括乳酸(乳酸鹽)和乙酸(乙酸鹽)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包含植物發(fā)酵梭菌和一種或多種其 他微生物如酵母菌或其他細(xì)菌(運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌)的共培養(yǎng)物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包含植物發(fā)酵梭菌和一種或多種其 他微生物如酵母菌或其他細(xì)菌(運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌)的組合物。該組合物 可以是例如固體混合物(例如冷凍干燥混合物)的形式，或者各微生物 液體分散體(例如共培養(yǎng)物)的形式。在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了制備有用的產(chǎn)物如生物燃料的方 法，所述方法包括選擇生物質(zhì)或生物質(zhì)材料的混合物；將該生物質(zhì)與 包含植物發(fā)酵梭菌的培養(yǎng)基組合在一起；將該生物質(zhì)發(fā)酵第一段時(shí) 間，以提供第二生物質(zhì)材料；將第二生物質(zhì)材料(與或不與植物發(fā)酵 梭菌 一起)與不同于植物發(fā)酵梭菌的另 一種微生物或微生物的混合物 組合在一起；然后將第二生物質(zhì)發(fā)酵第二^R時(shí)間，以生產(chǎn)有用的材料， 如燃料或有機(jī)酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包含其中分散有植物發(fā)酵梭菌的培9養(yǎng)基的發(fā)酵器。除了植物發(fā)酵梭菌外，該培養(yǎng)基還可包含任何本文描 述的其他;隊(duì)生物中的 一種或多種。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包含植物發(fā)酵梭菌和與其共培養(yǎng)的 任何本文描述的其他微生物中的 一種或多種的發(fā)酵器。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包含其中分散有植物發(fā)酵梭菌的培 養(yǎng)基的發(fā)酵器。發(fā)酵器設(shè)置成能連續(xù)地除去發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇。在一些 實(shí)施方案中，產(chǎn)物的濃度保持基本上恒定，或者偏離平均濃度不超過
約25%。在一些實(shí)施方案中，將任何本文描述的生物質(zhì)連續(xù)地供給發(fā) 酵器。
在另 一個(gè)方面，本發(fā)明表征了通過任何本文描述的方法制備的產(chǎn)物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包含植物發(fā)酵梭菌的、例如用以給 發(fā)酵器接種的試劑盒(kit)。該試劑盒還可包含任何本文描述的其他微 生物中的任何一種或多種。例如，該試劑盒中的各^f敬生物可以在單一 容器或多個(gè)容器中組合在一起。該試劑盒中的各微生物可分散在培養(yǎng) 基中，或者它們可冷凍干燥。該試劑盒還可包含促酵物材料(starter materials)如營養(yǎng)物。
植物發(fā)酵梭菌(美國模式培養(yǎng)物保藏所7003947)是根據(jù)ISDgT培 養(yǎng)抹(Warnick et al.， /"^7 加'owa/ /owma/ o/ S，e顧ric
M/craWo/ogy, 52:1155-60, 2002)的表現(xiàn)型和基因型特征 來定義的。本發(fā)明主要涉及用以生產(chǎn)燃料和/或其他有用的有機(jī)產(chǎn)物 的系統(tǒng)、方法和組合物，該系統(tǒng)、方法和組合物涉及到植物發(fā)酵梭菌 菌種的ISDgT菌株和/或任何其他菌抹，該任何其他菌林可衍自ISDgT 菌株或單獨(dú)分離。菌種(species)是用標(biāo)準(zhǔn)的分類學(xué)考慮(taxonomic consideration) (Stackebrandt and Goebel, /打fem加'owa/ /owma/ o/ 5ywem加'c Sac&n'o/ogy, 44:846-9， 1994)來定義的。與才莫式菌4朱(ISDgT) 相比16S rRNA序列同源性值為97°/。及以上的菌4朱認(rèn)為是植物發(fā)酵梭 菌的菌林，除非證明它們的DNA重締合值(DNA re-association value)小于70%。存在著大量的證據(jù)表明，DNA重締合值為70%或以上的 微生物也具有至少96% DNA序列同 一性和擁有定義菌種的表現(xiàn)型性 狀。對植物發(fā)酵梭菌ISDgT菌抹的基因組序列的分析表明，存在著大 量的可能涉及到植物多糖發(fā)酵的機(jī)制和途徑的基因和遺傳基因座，這 導(dǎo)致了這種微生物的不同尋常的發(fā)酵特性?；谏鲜龅姆诸悓W(xué)考慮， 植物發(fā)酵梭菌菌種的所有菌林也會(huì)擁有所有的或幾乎所有的這些發(fā) 酵特性。植物發(fā)酵梭菌菌抹可以是天然分離物，或者是遺傳修飾菌株。 新系統(tǒng)和方法的優(yōu)點(diǎn)包括以下任何一個(gè)或以下多個(gè)的組合。植物 發(fā)酵梭菌能高效率地將廣譜材料發(fā)酵成燃料。優(yōu)選地，可用廢棄物如 乳糖、廢紙、樹葉、草剪取物和/或鋸屑來制備燃料。植物發(fā)酵梭菌 即使在高濃度的碳水化合物下也保持活性。包含碳水化合物的材料往 往可以未加工就使用，即不需進(jìn)行預(yù)處理。例如，在一些情況下，沒 有必要用酸、堿或酶預(yù)處理纖維素材料以釋放出較低分子量的糖類， 這些糖類在發(fā)酵前構(gòu)成纖維素材料的一部分。相反，植物發(fā)酵梭菌能 將未加工過的纖維素材料發(fā)酵成燃料。在一些情況下，木質(zhì)纖維素材 料例如鋸屑或柳枝稷可不除去木質(zhì)素和/或半纖維素就加以使用。植 物發(fā)酵梭菌細(xì)胞能在寬廣的溫度和pH范圍下生長和發(fā)酵。在發(fā)酵過 程中發(fā)酵培養(yǎng)基的pH可不必進(jìn)行調(diào)節(jié)。在一些情況下，植物發(fā)酵梭 菌細(xì)胞能與一種或多種其他微生物一起組合使用，以增加所需產(chǎn)物例 如乙醇的收率。另外，植物發(fā)酵梭菌能將高濃度的五碳糖或者包含五 碳糖重復(fù)單元的聚合物發(fā)酵成可燃燒燃料。五碳糖類(如木糖)或者包 含五碳糖重復(fù)單元(如木聚糖)和植物細(xì)胞壁"半纖維素，，級份的其他 成分的聚合物，與木質(zhì)纖維素材料的其他聚合成分伴隨一起，被植物 發(fā)酵梭菌水解和發(fā)酵而產(chǎn)生諸如乙醇和氫的產(chǎn)物。五碳糖類或者包含 五碳糖重復(fù)單元的聚合物，似乎不會(huì)轉(zhuǎn)移植物發(fā)酵梭菌的代謝資源。 此外，植物發(fā)酵梭菌能發(fā)酵較高的纖維素濃度，例如大于40mM(葡 萄糖當(dāng)量)，從而增加乙醇收率。其他纖維素發(fā)酵微生物通常不會(huì)發(fā) 酵高過約20 mM (葡萄糖當(dāng)量)的纖維素濃度，在較高纖維素濃度下乙醇生產(chǎn)會(huì)P爭J氐(Desvaux et al., J/ / /. 五"Wra". M"/crofc/o/ogy, 66， 2461-2470, 2000)。
碳水化合物可以是多聚、寡聚、二聚、三聚或單聚碳水化合物。 如碳水化合物由不止一個(gè)重復(fù)單元形成，則每個(gè)重復(fù)單元可以相同或 不同。多聚碳水化合物的實(shí)例包括纖維素、木聚糖、果膠和淀粉，而 纖維二糖和乳糖是二聚碳水化合物的實(shí)例。單聚碳水化合物的實(shí)例包 括葡萄糖和木糖。本文所用的術(shù)語"低分子量碳水化合物"是任何用通 用校準(zhǔn)曲線測定出式量或數(shù)均分子量小于約1,000的碳水化合物。一 般地，術(shù)語"高分子量碳水化合物"是任何分子量大于1,000，例如大 于5,000,大于10,000,大于25,000，大于50，000，大于IOO，OOO，大 于150,000或大于250,000的碳水化合物。
對于具有確定的(defmed)單一結(jié)構(gòu)、有確定和可計(jì)算的式量的石友 水化合物，例如單聚或二聚碳水化合物(例如分別為阿拉伯糖和纖維 二糖)，濃度是用該碳水化合物的式量計(jì)算的。對于沒有確定的單一 結(jié)構(gòu)的碳水化合物，例如多聚碳水化合物(例如纖維素)，濃度是基于 這樣的假設(shè)計(jì)算的整塊的(entire mass of)多聚碳水化合物能被水解 成據(jù)以形成該多聚碳水化合物的單聚碳水化合物單元。然后應(yīng)用單聚 碳水化合物單元的式量來計(jì)算單體等價(jià)單元(monomer equivalent unit) 的濃度。例如，純纖維素完全是由葡萄糖重復(fù)單元構(gòu)成的。假設(shè)整塊 的纖維素被水解成葡萄糖，則IO克纖維素會(huì)產(chǎn)生出IO克葡萄糖。葡 萄糖((36&206)的式量為180.16 amu。10克葡萄糖為0.056摩爾葡萄糖。 如果這個(gè)數(shù)量的葡萄糖在1L的溶液中，則濃度會(huì)是0.056 M或56 mM。如果聚合物具有不止一個(gè)重復(fù)單元，則有支定整塊的多聚碳水化 合物能被水解成據(jù)以形成該多聚碳水化合物的單聚碳水化合物單元， 將濃度計(jì)算成總平均碳水化合物濃度。例如，如果多聚碳水化合物完 全由兩種重復(fù)單元構(gòu)成，水解X克多聚碳水化合物會(huì)產(chǎn)生出X克單 聚碳水化合物。復(fù)合式量是第一單聚碳水化合物的摩爾分?jǐn)?shù)和它的式 量的乘積與第二單聚碳水化合物的摩爾分?jǐn)?shù)和它的式量的乘積之和。而碳水化合物的平均摩爾數(shù)是X克除以復(fù)合式量。將平均摩爾數(shù)除 以該摩爾數(shù)所在溶液的數(shù)量，得出平均碳水化合物濃度。
"可發(fā)酵材料"是植物發(fā)酵梭菌(例如ISDgT)能至少部分上將其轉(zhuǎn)
化成燃料(例如乙醇、丙醇或氫)和/或別的有用產(chǎn)物(例如有沖幾酸)的材料。
生物質(zhì)是有機(jī)的、非成化石的材料，它是或者衍自死的或活的生 物(例如植物或動(dòng)物)。生物質(zhì)排除已被地質(zhì)過程轉(zhuǎn)化成諸如煤或石油 的物質(zhì)的材料，但包括通過化學(xué)處理活的或死的生物或者這種生物的 殘余物而衍自這種生物的材料。生物質(zhì)的實(shí)例包括木材、木材相關(guān)材
料(例如則花板)、紙張、草(例如柳枝稷，芒屬(M^c"W/ms))、稻殼、
甘蔗渣、棉花、黃麻、大麻、亞麻、竹子、西沙爾麻、馬尼拉麻、稻 草、樹葉、草剪取物、玉米桔稈、玉米芯、酒糟、豆類植物、高粱和 生物質(zhì)作物(例如兩節(jié)齊屬植物)。
所有本文用到的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語除非另有定義，否則其含義與本
發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。以下描述的 是合適的方法和材料，不過類似于或等同于本文所述這些方法和材料 的方法和材料也可用于本發(fā)明的實(shí)施或試驗(yàn)。所有本文提到的出版 物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。如 出現(xiàn)沖突，則以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施 例只出于說明目的，并不意在限制本發(fā)明。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)可從以下詳述內(nèi)容和從權(quán)利要求書中 顯而易見地得知。


圖1是容納其中分散有植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞的培養(yǎng)基的發(fā)酵容器 的示意截面圖。
圖2是用以使生物質(zhì)纖絲化的旋轉(zhuǎn)刀切割機(jī)的示意截面圖。 圖3A是在圖2的旋轉(zhuǎn)刀切割機(jī)中剪切的纖維素材料的照片。 圖3B是圖3A所示材料的高倍放大顯微照片。
13圖4是顯示用酸水解預(yù)處理從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇和氫的工藝的框圖。
圖5A是顯示用酶水解預(yù)處理從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇和氫的工藝的框圖。
圖5B是顯示用沒有經(jīng)過酶預(yù)處理的生物質(zhì)從中生產(chǎn)乙醇和氫的 工藝的框圖。
圖5C是顯示用沒有經(jīng)過化學(xué)或酶預(yù)處理、但任選經(jīng)過蒸汽處理 的生物質(zhì)從中生產(chǎn)乙醇和氫的工藝的框圖。
圖6是顯示將各種初始纖維素濃度(按葡萄糖當(dāng)量計(jì))與植物發(fā)酵 梭菌 一起發(fā)酵所獲得的主要產(chǎn)物和產(chǎn)物濃度的柱形圖。
發(fā)明詳述
圖1顯示了容納其中溶解或分散有可發(fā)酵材料的培養(yǎng)基12的發(fā) 酵容器10?？砂l(fā)酵材料是或者包括碳水化合物，例如葡萄糖、纖維 二糖或纖維素。培養(yǎng)基12當(dāng)中還分散有眾多植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞14, 如ISDgT細(xì)胞。植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞14能發(fā)酵可發(fā)酵材料從而生產(chǎn)可 燃燒燃料，例如乙醇和/或氫。還可生產(chǎn)其他有用的產(chǎn)物和聯(lián)產(chǎn)物。 其他產(chǎn)物可包括有才幾酸(例如曱酸、乳酸和乙酸)或者它們的共軛石咸(例 如曱酸根(formate)、乳酸根(lactate)或乙酸根(acetate)離子)。
植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞14 (美國模式培養(yǎng)物保藏所7003947)是從美國 馬薩諸塞州Quabbin水庫附近的森林覆蓋地的間歇河河床中的濕淤 泥分離的。 一般地，ISDgT細(xì)胞14是細(xì)長挺直能運(yùn)動(dòng)的桿菌(0.5-0.8 x 3.0-15.0 jim)，能形成圓形的終端芽孢(直徑0.9-1.5 (im)。植物發(fā)酵沖炎 菌細(xì)胞的另夕卜的特4正在Warnick et al., /"A / 五vo/. M/cra&o/ogv, 52， 1155-1160 (2002)中有描述。
植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞14是在厭氧環(huán)境中培養(yǎng)的，這通過將基本上 無氧的氣體鼓泡通過鼓泡器16來實(shí)現(xiàn)和/或維持，該鼓泡器16包括 浸沒在培養(yǎng)基12的表面19下的氣體出口 18。培養(yǎng)基12中的過量氣體和反應(yīng)流出物(effluent)充滿頂部空間22，最終通過容器壁30中形 成的氣體出口孔21排出。可用來維持厭氧條件的氣體包括N2、N2/C02 (80:20)、 N2/C02/H2 (83:10:7)和惰性氣體例如氦氣和氬氣。在一些實(shí) 施情況中，為實(shí)現(xiàn)和/或維持均勻性，將培養(yǎng)基12加以攪拌(如箭頭 40所示)。也可通過將容器10搖動(dòng)或振動(dòng)來維持均勻性。
在一些情況中，懸浮在培養(yǎng)基12中的植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞14的濃 度為約106至約1(f個(gè)細(xì)胞/mL,例如約107至約1()S個(gè)細(xì)胞^L。在一 些實(shí)施情況中，發(fā)酵初始濃度為約10"個(gè)細(xì)胞/mL。
我們發(fā)現(xiàn)，植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞14既能發(fā)酵低濃度(例如0.01 mM 至約5mM)的碳水化合物，也能發(fā)酵高濃度的碳水化合物，且通常在 相對較高濃度的碳水化合物下它們的作用也不受抑制，而這種濃度會(huì) 對其他微生物具有不利影響。例如，培養(yǎng)基中的碳水化合物濃度可大 于20mM，例如大于25mM、 30mM、 40mM、 50 mM、 60 mM、 75 mM、 100 mM、 150 mM、 200 mM、 250 mM、 300 mM,或甚至大于 500mM或更高。在任何這些實(shí)施方案中，碳水化合物的濃度一般小 于2,000 mM。
可發(fā)酵材料可以是或者可包括一種或多種低分子量碳水化合物。 低分子量碳水化合物可以是例如單糖、二糖、寡糖或它們的混合物。 單糖可以是例如丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖、壬糖或它們的混合 物。例如，單糖可以是阿拉伯糖、甘油醛、二羥基丙酮、赤蘚糖、核 糖、核酮糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、果糖、景天 庚酮糖、神經(jīng)氨酸或它們的混合物。二糖可以是例如蔗糖、乳糖、麥 芽糖、龍膽二糖或它們的混合物。
在一些實(shí)施方案中，低分子量碳水化合物是通過分解高分子量多 糖(例如纖維素、半纖維素的木聚糖組分或其他組分、果"交和/或淀粉) 產(chǎn)生的。這個(gè)4支術(shù)可有利;也和直才妄J4應(yīng)用于廢物流(waste stream)例如 廢紙(如廢新聞?dòng)眉埡蛷U紙板箱)。在一些情況中，分解操作是作為單 獨(dú)的過程進(jìn)行，然后低分子量碳水化合物再進(jìn)行利用。在其他情況中，高分子量碳水化合物直接加到培養(yǎng)基中并原位分解成低分子量碳水 化合物。在一些實(shí)施情況中，這通過化學(xué)法例如氧化、堿水解和/或
酸水解來進(jìn)行。化學(xué)水解在Bjerre，所ofec/z"o/.歷oe"g.， 49:568, 1996 和Kim et al., 5/ofec/wo/.18:489, 2002中有描述。
在一些實(shí)施情況中，低分子量碳水化合物是通過用 一種或多種酶 例如內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(CBH)分解多糖 來產(chǎn)生。這些酶可作為酶制劑加到多糖源中，或者它們可由微生物例 如黑曲霉(^sperg/〃ws w/ge。 BKMF 1305和里氏木霉(7Wc/2o&wwf r^se/) RUT C30原位產(chǎn)生。酶促分解在T. Juhasz, Food rec/z. 說ofec/z"o/. (2003), 41, 49中有論述。
在具體的實(shí)施情況中，將乳糖用作碳水化合物。干酪工業(yè)會(huì)產(chǎn)生 出大量的乳4唐。例如，Elliott,尸raceed/"^ o/Ae ^"wwa/ Aforac/7a〃 C/ze^se Sew/war f26^^估計(jì)美國干酪工業(yè)每年生產(chǎn)約4.7億磅乳糖，另 外歐洲生產(chǎn)7.26億磅。乳糖可單獨(dú)地或與其他生長底物一起作為植 物發(fā)酵梭菌的生長底物在發(fā)酵器中使用，所述發(fā)酵器例如是給主發(fā)酵 器供料的種子發(fā)酵器。乳糖加到發(fā)酵容器中，可用來增大低分子量碳 水化合物的發(fā)酵和/或加速纖維素或其他高分子量碳水化合物的分解 和發(fā)酵。
可發(fā)酵材料可以是或者可包括一種或多種高分子量碳水化合物。 高分子量碳水化合物包括例如聚半乳糖醛酸、纖維素、微晶纖維素、 果膠、淀粉、木聚糖、其他半纖維素聚合物或它們的混合物。微晶纖 維素和改性微晶纖維素可從FMC Biopolymer市售獲得，商品名為 AVICEL 。
可發(fā)酵材料還可以是或者可包括一種或多種生物質(zhì)材料，例如纖 維素材料或木質(zhì)纖維素材料。纖維素材料是包含纖維素但基本上不包 含木質(zhì)素(例如小于0.5重量百分比)的材料。纖維素材料可以是天然 的、半合成的或完全合成的材料。例如，棉花是天然的纖維素材料。 半合成的纖維素材料包括例如嫘縈(再生纖維素)和包含棉花纖維的紡織品，它們例如獲自原始?xì)堄嗉徔棽牧?例如邊角料)或消費(fèi)者用過的 廢料(例如破布)。其他半合成纖維素材料包括酒糟(例如來自玉米乙醇
工業(yè))、紙和紙制品如多層涂料紙(polycoatedpaper)和牛皮紙。紙和紙 制品可以是原始材料，或者可以是消費(fèi)者用過的廢棄材料。
木質(zhì)纖維素材料包含纖維素和一定百分比的木質(zhì)素，例如至少約
0.5重量百分比至約60重量百分比或更多的木質(zhì)素。木質(zhì)素可認(rèn)為是 多酚材^K 一些木質(zhì)素可由以下結(jié)構(gòu)(I)表示
H H
(I)
木質(zhì)素可以高度分枝，也可以是部分交聯(lián)。木質(zhì)素在結(jié)構(gòu)上可具 有顯著的變化，這種變化至少部分上取決于木質(zhì)素的來源，例如它是 衍自軟木材還是硬木材。
木質(zhì)纖維素材料包括例如造紙污泥；木材、木材相關(guān)材料，例如 鋸屑、刨花板或樹葉；和天然纖維來源，例如樹木(如白楊樹)、草(如
柳枝稷)、樹葉、草剪取物、稻殼、甘蔗渣、黃麻、大麻、亞麻、竹 子、西沙爾麻、馬尼拉麻、稻草、玉米秸稈、玉米芯、麥桿、稻殼和 椰子毛。
在具體的實(shí)施情況中，可采用獲自諸如以下樹木的木質(zhì)纖維素材
料針葉樹，例如加拿大鐵杉(rwga ca""6fe"w》、銀杏樹(G/"&o 6//6oa)、 4S筆片白(/wmj^n^ v/rg/wea"a)、 山+》(戶/"ws mwgo)、 喜馬4立雅 雪杉(Ce^m cfeocbra)、西方紅雪松(77wya / /Zcato)、普通紫杉(J"oxws 6accato)、科羅拉多云杉(尸/cea ;或者落葉樹，例如花楸
(5"w6ws)、 樣股樹(五wca/yp加gw朋//)、 摔樹(5efw/a p/a妙/ j/〃a)或挪威槭(^cerp/ato"o/cfey)。也可采用白楊樹、山毛櫸樹、糖楓樹和橡樹。
在一些情況中，植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞可直接發(fā)酵木質(zhì)纖維素材料而 無需除去木質(zhì)素。
但是，在某些實(shí)施方案中，在發(fā)酵前從木質(zhì)纖維素材料中除去至 少一些木質(zhì)素是有益的。例如，從木質(zhì)纖維素材料除去木質(zhì)素能使剩 余的纖維素材料更多孔和具有更大的表面積，這可例如增加發(fā)酵速率 和乙醇收率。木質(zhì)素可例如通過亞硫酸鹽法、堿法或通過硫酸鹽法 (Kraft process)從木質(zhì)纖維素材料中除去。這些方法和其他的方法在 Meister, U.S. Patent No. 5,138,007和Knauf et al.， /w/m2W0wa/ Swgar ■/owr""/, 106:1263, 147-150 (2004)中有描述。柳枝稷的木質(zhì)素含量為約 17.6% (干重量百分比)，這與玉米秸稈大約相同。書寫紙的木質(zhì)素含 量在約零百分比木質(zhì)素至約12百分比木質(zhì)素之間。 一些辦公室用紙 的木質(zhì)素含量在約11-12百分比的范圍。Mosier et al.， rec/mo/ogv 96:673, 2005論述了 一些材料的木質(zhì)素含量及一些除去木 質(zhì)素的預(yù)處理策略。假若木質(zhì)素被除去，它可在工藝過程中用作能源， 例如通過燃燒木質(zhì)素來加熱鍋爐。
纖維素材料可從木質(zhì)纖維素材料獲得，做法是將木質(zhì)纖維素材料 進(jìn)行化學(xué)處理，使木質(zhì)素溶解至能讓纖維素材料與木質(zhì)素分離(例如 以纖維的形式分離)的程度。木質(zhì)纖維素材料若是來自樹木，則溶解 的木質(zhì)素通常占材料的約25-45%。
可將材料進(jìn)行破碎(reduced in size),例如通過在旋轉(zhuǎn)刀切割機(jī)中 剪切材料或者通過在球磨機(jī)中粉碎材料來進(jìn)行。若用旋轉(zhuǎn)刀切割機(jī)來 破碎材料例如纖維素材料或木質(zhì)纖維素材料，通常所得的材料實(shí)際上 是纖絲狀的，具有很大的長度-直徑比，例如大于5/1、大于10/1、大 于15A、大于20/1，或甚至大于25/1。若使用球磨機(jī)，通常所得的材 料為粉狀形式，通常具有基本上球形的顆粒，例如直徑小于5微米， 例如小于4微米、小于2.5微米、小于1微米。
圖2顯示的旋轉(zhuǎn)刀切割機(jī)100包括料斗101，該料斗可裝載纖維
18素材料或木質(zhì)纖維素材料102(例如為碎片形式)。纖維素材料或木質(zhì)
纖維素材料被吸入剪切區(qū)103，并在固定刀片104和旋轉(zhuǎn)刀片106之 間被剪切。篩子105防止纖維素材料或木質(zhì)纖維素材料離開剪切區(qū) 103,直到材料被破碎到小得足以通過篩子中界定的孔口。纖維素材 料或木質(zhì)纖維素材料一旦穿過了篩子中的孔口，就被箱子110截留。 為幫助收集剪切的纖絲狀纖維素材料或木質(zhì)纖維素材料，可將箱子 IIO維持在低于標(biāo)稱大氣壓的壓力下。收集在箱子中的纖絲狀纖維素 材料或木質(zhì)纖維素材料具有相對較低的堆積密度，例如小于0.5克/ 立方厘米，如小于0.3克/立方厘米，或甚至小于0.2克/立方厘米，和 具有"蓬松"外觀，如圖3A和3B所示。
在一些實(shí)施情況中，宜使用具有相對較大表面積和/或相對較高 孔隙率的纖絲狀材料。例如，合宜的纖絲狀材料其表面積大于0.5 m2/g,例如大于1.0m2/g、 1.5m2/g、 1.75 m2/g、 5 m2/g，或甚至大于 10 m2/g (用BET Brunauer Emmett Teller表面積測量法測量)；和/或其 孔隙率大于70%,例如大于80%、 87.5%、 90%,或甚至大于95%(用 水銀孔率測量法測量)。高表面積和/或高孔隙率能增加水解速率和/ 或發(fā)酵速率。
可使用任何上述材料的摻合物，例如從紙張來源獲得的材料和從 棉花獲得的材料的摻合物。
在一些實(shí)施方案中，將包含其中分散有植物發(fā)酵梭菌的培養(yǎng)基的 發(fā)酵器設(shè)置成能連續(xù)除去發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇。在一些實(shí)施方案中，所需 產(chǎn)物的濃度保持基本上恒定，或者偏離平均濃度不超過約25%，這例 如是在約10 mM至約25 mM的初始濃度下發(fā)酵2、 3、 4、 5、 6或10 小時(shí)后測量的。在一些實(shí)施方案中，將任何本文描述的生物質(zhì)材料或 混合物連續(xù)投入發(fā)酵器中。
植物發(fā)酵梭菌的培養(yǎng)基可包括另外的成分，如緩沖劑，例如 NaHC03、 NH4C1、 NaH2P(VH20、 K2HP04和KH2P04;電解質(zhì)，例 如KCl和NaCl;生長因子；表面活性劑；和螯合劑。生長因子包括
19例如生物素、葉酸、鹽酸吡,辛、核黃素、尿素、酵母膏、胸腺嗜啶、
胰蛋白胨、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥苷、尿嘧啶、煙酸、泛酸、B12 (氰 鈷胺素)、對氨基苯曱酸和疏辛酸。礦物質(zhì)包括例如MgS04、 MnS04* H20、 FeS04'7H20、 CaCl2*2H20、 CoCl2'6H20、 ZnCl2,CuS04'5H20、 A1K(S04)2*12H20、 H3B03、 Na2Mo04、 NiCl2'6H20和NaW04*2H20。
螯合劑包括例如氮三乙酸。表面活性劑包括例如聚乙二醇(PEG)、聚 丙二醇(PPG)、共聚物PEG和PPG及聚乙烯醇。
在一些實(shí)施情況中，發(fā)酵條件包括將培養(yǎng)基維持在小于約45。C， 例如小于約42。C (例如約34。C至38。C,或者約37。C)的溫度。在任 何這些實(shí)施情況中，通常將培養(yǎng)基維持在高于約5。C、例如高于約 15。C的溫度。
在一些實(shí)施情況中，發(fā)酵條件包括將培養(yǎng)基維持在低于約9.5、 例如約6.0-9.0或者約8-8.5的pH。通常，在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基pH 的變化一般不會(huì)超過1.5個(gè)pH單位。例如，如果發(fā)酵在約7.5的pH 開始，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH通常不會(huì)低于6.0，這在細(xì)胞的生長pH范圍 內(nèi)。
植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞能適應(yīng)相對較高濃度的乙醇，例如7重量百分 比或更高，如12.5重量百分比?？墒怪参锇l(fā)酵梭菌細(xì)胞在發(fā)酵前先 在富含乙醇的環(huán)境(例如7百分比乙醇)中生長，以使細(xì)胞適應(yīng)更高濃 度的乙醇，例如20百分比。在一些實(shí)施方案中，使植物發(fā)酵梭菌適 應(yīng)逐步提高濃度的乙醇，例如從2百分比乙醇開始，接著是5百分比 乙醇，再接著是10百分比乙醇。
除了乙醇外還可生產(chǎn)其他產(chǎn)物，或者可生產(chǎn)乙醇以外的產(chǎn)物。更 全面地說，發(fā)酵產(chǎn)物包括燃料如醇類(例如乙醇、正丙醇、異丙醇、 正丁醇或它們的混合物)和氫。其他產(chǎn)物包括有機(jī)酸(例如曱酸、乳酸、 乙酸或它們的混合物)或者它們的共扼石咸(例如甲酸才艮、乳酸根或乙酸 根離子)或其鹽。
植物發(fā)酵梭菌如ISDgT菌株可單獨(dú)使用或與一種或多種其他微生物組合使用，所述其他微生物如酵母菌或真菌(例如釀酒酵母
(Sacc/zaramjKcas ceww'w'"g)、 樹干畢赤氏酵母(P/c/n'a s爭'to)、木霉屬 (7Hc/zot/enwa species)、黑曲霉屬(A^erg/〃Ms species))或者其4也細(xì)菌(例 如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zywomo"os wo6/to)、產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(尺/eZwW/a o砂toca)、 大腸4干菌co/z')、 丙酉同丁酉享才炎菌(C7o^n'^wm acetoZ w一c調(diào))、拜氏梭菌(C7oWnW畫 6ez)'en,"c嗣、溶纟氏梭菌 (C7o血W畫 / op,wo/vera)、 解纖維素梭菌 (C7o血W騰 ce〃w/o/"z'cwm)、 約氏4炎菌(C7o^WcZ/ww 乂osi//)、 白蚊#炎菌(C7o^WtZ/ww ^rm/"(i/s)、纟千纟,素斗炎菌(C7astnVZ/t/m ce〃w/os7')、十夬生沖炎菌((7/01 化/6^"/ 7 ce/wcmsce"力、包氏梭菌(C7oWn'血附po/w/e")、 嗟細(xì)胞梭菌 (C7c^nWww ce〃w/ovoram))。例如，若將纖維素分解梭菌(C7菌林)與 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在含有纖維素作為生長底物的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)生長，
其乙醇收率為單獨(dú)梭菌培養(yǎng)物的2.5倍(Leschine and Canale-Parola， Cw^reWM/craZn'o/ogv, 11:129-136, 1984)。各孩史生物混合物可以以固體 混合物(例如冷凍干燥混合物)的形式或各微生物液體分散體(例如共 培養(yǎng)物)的形式提供，與植物發(fā)酵梭菌進(jìn)行共培養(yǎng)生長，或者各微生 物可依次加到培養(yǎng)基中，例如通過在加入植物發(fā)酵4臾菌之前或之后加 入另 一種《效生物來進(jìn)行加入。
另外，任何本文描述的生物質(zhì)材料或任何本文描述的生物質(zhì)材料 的混合物，可用一種或多種本文描述的微生物以依次方式或同時(shí)方式 進(jìn)行處理。例如，生物質(zhì)(或生物質(zhì)混合物)可用各微生物混合物(例如 共培養(yǎng)物)進(jìn)行同時(shí)處理，或者生物質(zhì)(或生物質(zhì)混合物)可首先用第一 ;微生物或第一^f效生物混合物(例如一種或多種酵母菌、真菌或其他細(xì) 菌)進(jìn)行處理，然后所得的生物質(zhì)可用一種或多種植物發(fā)酵梭菌菌林 進(jìn)行處理。在其他實(shí)施方案中，生物質(zhì)材料(或生物質(zhì)混合物)首先用 一種或多種植物發(fā)酵梭菌菌抹進(jìn)行處理，然后所得的生物質(zhì)用一種或 多種其他微生物(任何 一種本文描述的微生物或本文描述的各微生物 的混合物)處理。從生物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)乙醇
通常，有兩種基本方法來大規(guī)模利用植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞從生物質(zhì) 生產(chǎn)燃料級乙醇。在第一種方法中，首先是將包含高分子量碳水化合 物的生物質(zhì)材料水解成較低分子量的碳水化合物，然后利用植物發(fā)酵 梭菌細(xì)胞發(fā)酵較低分子量的碳水化合物而生產(chǎn)乙醇。在第二種方法 中，不對生物質(zhì)材料進(jìn)行化學(xué)和/或酶促預(yù)處理而直接發(fā)酵生物質(zhì)材
料本身。在第一種方法中，可用酸例如Br6nsted酸(如石克酸或鹽酸)、 4成(例如氫氧化鈉)、水熱法、氨纖維爆破法("EFEX，，)、石灰法、酶或 者這些方法的組合來進(jìn)行水解。氫和其他發(fā)酵產(chǎn)物可進(jìn)行捕集并按需 進(jìn)行純化，或者例如通過燃燒處理掉。例如，可將氫氣燒掉，或者在 工藝過程中用作能源，例如用以驅(qū)動(dòng)蒸汽鍋爐(例如通過燃燒來進(jìn)行)。 生物質(zhì)的水解和/或蒸汽處理可例如增加生物質(zhì)的孔隙率和/或表面 積，這往往會(huì)使纖維素材料更加暴露于植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞，從而可提 高發(fā)酵速率和收率。木質(zhì)素的除去可例如提供用以驅(qū)動(dòng)鍋爐的可燃燒 燃料，也可例如增加生物質(zhì)的孔隙率和/或表面積，這往往會(huì)提高發(fā) 酵速率和收率。 一般地，在任何下述的實(shí)施方案中，碳水化合物在培 養(yǎng)基中的初始濃度大于20mM，例如大于30mM、 50mM、 75 mM、 100 mM、 150 mM、 200 mM，或甚至大于500mM。
采用酸水解預(yù)處理從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇
圖4示出了從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的工藝158，該工藝是首先在酸化 裝置160中用酸處理懸浮在水中的生物質(zhì)(例如約10至約60重量百 分比)。生物質(zhì)可以是例如木片、鋸屑、粉碎的農(nóng)作物廢棄物或生物 質(zhì)作物(例如玉米秸稈或柳枝稷)、玉米精制殘余物、剪切的紙制品(如 圖3A和3B所示的制品)，或者這些材料和其他纖維素材料和/或木質(zhì) 纖維素材料的混合物。生物質(zhì)可以這樣進(jìn)行酸化將氣體二氧化硫鼓 泡通過懸浮于水中的生物質(zhì)，或者加入強(qiáng)酸如石克酸、鹽酸或硝酸。在酸化過程中，將pH維持在低于約3，例如低于約2.5或低于約1.5。 除了已經(jīng)在酸化裝置中的酸外，還可任選加入金屬鹽以幫助生物質(zhì)的 水解，所述金屬鹽如硫酸亞鐵、硫酸鐵、氯化鐵、硫酸鋁、氯化鋁、 硫酸鎂或它們的混合物?？蓪⑸镔|(zhì)在酸化裝置160中在例如約40°C 至約80°C的溫度下保持例如約1-6小時(shí)。
在酸化裝置160中酸化后，可將生物質(zhì)在脫水裝置164中脫水， 例如通過壓榨或通過離心脫水，以除去大部分的酸化水。如果需要， 可將酸化水在酸化裝置160中再使用。
酸浸漬過的生物質(zhì)通過例如自流式供料裝置或回轉(zhuǎn)閥供料裝置 供入水解裝置166中，所述供料裝置在一些情況中不會(huì)很大地增加生 物質(zhì)的密度。將蒸汽噴射到水解裝置166中，以直接接觸生物質(zhì)并將 其加熱到所需的溫度。蒸汽的溫度為例如約130。C至約220。C，蒸汽 噴射連續(xù)進(jìn)行例如約IO分鐘至約120分鐘的時(shí)間。接著將水解物卸 出到在例如約100°C至約190°C的溫度下運(yùn)4亍的閃蒸罐170中，并在 罐170中保持約1小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間，以將生物質(zhì)進(jìn)一步水解成 例如可溶性寡糖和單聚糖類。
然后將水解物供入提取器172，例如逆流提取器、螺旋輸送提取
器或真空帶式提取器。在提取器172，水解物用溫度例如約40°C至 約90°C的熱水進(jìn)行洗滌。例如，水解物用一定量的水進(jìn)行洗滌，該 量大于其自身重量，如大于其自自身重量的兩倍，例如三倍、四倍、 八倍，或甚至大于其自身重量的十倍。
將堿例如石灰或氨水形式的堿加到pH調(diào)節(jié)和過濾裝置180中的 提取物，以將提取物的pH調(diào)節(jié)到約7至約8。將加堿過程中出現(xiàn)的 任何沉淀物除去，濾液送到發(fā)酵器182,該發(fā)酵器容納著其中分散有 植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞的培養(yǎng)基。碳水化合物在培養(yǎng)基中的初始濃度為 20mM至約100 mM。懸浮在培養(yǎng)基中的植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞的濃度為 例如約107至約1(f個(gè)細(xì)胞/mL。在一個(gè)實(shí)施情況中，培養(yǎng)基(稱為GS-2) 含有(均以g/L表示)酵母膏，6.0;尿素，2.1; K2HPQ4， 2.9; KH2P04，
231.5; MOPS; 10.0; 二水合檸檬酸三鈉，3.0;鹽酸半胱氨酸，2.0。 在其他實(shí)施情況中，可將一些成分加到GS-2培養(yǎng)基或者取代GS-2 培養(yǎng)基成分，這些成分包括胰蛋白胨，2.0;腺嘌呤，0.02;胞嘧啶， 0.05;鳥苦，0.02;胸腺嘧啶，0.05;尿嘧啶，0.04;和一定量的維生 素溶液，例如10 g/mL，按Wolin et al., Sac&n'o/ogy， 87:993， 1964的 描述制備。將來自pH和過濾裝置180的提取物加以調(diào)節(jié)，使得培養(yǎng) 基中的碳水化合物的初始濃度為例如約pH 7.0-pH 7.5。
如果需要，在發(fā)酵開始時(shí)，除了水解物外，還可將低分子量碳水 化合物例如乳糖加至例如約1.0g/L-5g/L的初始濃度。這能幫助快速 增加植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞的數(shù)量，在發(fā)酵器中建立酶類。在將氮?dú)夤呐?通過培養(yǎng)基的情況下讓發(fā)酵進(jìn)行例如約8小時(shí)至72小時(shí)的一段時(shí)間， 同時(shí)保持例如約15°C-40。C的溫度。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氫氣由氮?dú)鈴?發(fā)酵器182帶出，并加以收集或燒掉。
將來自提取器172的已提取固形物脫水，然后供入第二酸化裝置 190。來自提取器的固形物被浸泡在酸與任選金屬鹽的水溶液中。在 酸化過程中，pH維持在低于約3,例如低于約2.5或低于約1.5。生 物質(zhì)裝在第二酸化裝置190中，在例如約40。C至約80°C的溫度下保 持例如約1小時(shí)至6小時(shí)。
在酸化裝置190中酸化后，將生物質(zhì)在脫水裝置200中脫水，例 如通過壓榨或通過離心脫水，以除去大部分的酸化水。如果需要，可 將酸化水在酸化裝置160和/或酸化裝置190中再使用。
將酸浸漬過的生物質(zhì)供入第二水解裝置202。將蒸汽噴射到第二 水解裝置202中，以直接接觸生物質(zhì)并將其加熱到所需的溫度。蒸汽 的溫度和處理的時(shí)間通常與第一水解裝置166中所用的相同。接著將 水解物卸出到在例如約140。C至約190。C的溫度下運(yùn)行的閃蒸罐204 中，并在罐204中保持約0.5至約12小時(shí)的一段時(shí)間，以進(jìn)一步水 解生物質(zhì)。
將石咸加到pH調(diào)節(jié)和過濾裝置210中的提取物，以將提取物的pH調(diào)節(jié)到約7至約8。將加堿過程中出現(xiàn)的任何沉淀物除去，濾液與發(fā) 酵器182的內(nèi)容物合并，然后送到發(fā)酵器212。在將氮?dú)夤呐萃ㄟ^培
養(yǎng)基的情況下讓發(fā)酵進(jìn)行例如約15小時(shí)至ioo小時(shí)的一^a時(shí)間，同
時(shí)保持例如約25。C至35°C的溫度。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氫氣由氮?dú)鈴?發(fā)酵器212帶出，并加以收集或燒掉。
發(fā)酵后，將發(fā)酵器212的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到蒸餾裝置220，蒸餾 和收集到96%乙醇/4%水(體積)。對該96%乙醇進(jìn)行共沸蒸餾可獲得 燃料級乙醇(99-100%乙醇)，做法例如是加入苯后將所得混合物再蒸 餾，或者使該96%乙醇通過分子篩以除去水。
用酶水解預(yù)處理從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇
圖5A示出了從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的工藝228，該工藝是首先在水 解裝置230中用酶或酶混合物處理例如懸浮在水中的生物質(zhì)(10-60重 量百分比)，所述酶例如是對半纖維素、果膠和淀粉的各組分有活性 的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶(CBH)、 (3-葡萄糖 苦酶、糖香水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、裂解酶和酯酶。在水解過程中，通 過加入氫氧化鈉將pH維持在約6.0至約7.5。生物質(zhì)在水解裝置230 中在例如約25°C至約40°C的溫度下并在氮?dú)庵斜３掷缂s6小時(shí)至 120小時(shí)。
水解后，將堿(例如石灰或氨水形式的堿)和/或酸(例如硫酸水溶 液形式的酸)通過pH調(diào)節(jié)裝置234加到水解裝置230的內(nèi)容物，以將 內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)到約7至約8。調(diào)節(jié)pH后，將水解裝置230的全 部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到發(fā)酵器240，該發(fā)酵器容納著其中分散有植物發(fā)酵梭 菌細(xì)胞的培養(yǎng)基。碳水化合物在培養(yǎng)基中的初始濃度為20 mM至約 100 mM。懸浮在培養(yǎng)基中的植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞的濃度為例如約107 至約l(^個(gè)細(xì)胞/mL。在一個(gè)實(shí)施情況中，培養(yǎng)基含有(均以g/L表示) 酵母膏，6.0;尿素，2.1; K2HP04, 2.9; KH2P04， 1.5; MOPS; 10.0; 二水合檸檬酸三鈉，3.0;鹽酸半胱氨酸。將來自水解裝置230的流出物加以調(diào)節(jié)，使得培養(yǎng)基中的碳水化合物的初始濃度為例如約
50-200 mM。如果需要，在發(fā)酵開始時(shí)，可將纖維二糖加至例如約1.0 g/L-5g/L的初始濃度，或者可加入乳糖，以加速發(fā)酵或水解。在將氮 氣鼓泡通過培養(yǎng)基的情況下讓發(fā)酵進(jìn)行例如約8小時(shí)至72小時(shí)的一 段時(shí)間，同時(shí)保持例如約15。C-40。C的溫度。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氫氣 由氮?dú)鈴陌l(fā)酵器240帶出，并加以收集或燒掉。
在發(fā)酵后，將發(fā)酵器240的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到蒸餾裝置242，燃 料級乙醇可如上所述獲得。
從不經(jīng)酸或酶預(yù)處理的生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇
圖5B示出了從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的工藝250,該工藝是首先給容 納容器252裝入懸浮在水中的生物質(zhì)(例如10-60重量百分比)。可讓 生物質(zhì)浸泡例如約1小時(shí)至36小時(shí)的時(shí)間，若在正常大氣壓下，浸 泡溫度為例如約25°C至約卯。C，若在高于正常大氣壓(例如約1.5大 氣壓至約10大氣壓)的壓力下，浸泡溫度例如為約100°C至約175。C。 過了浸泡時(shí)間后，將堿(例如石灰或氨水形式的堿)和/或酸(例如硫酸 水溶液形式的酸)通過pH調(diào)節(jié)裝置260加到容納容器252的內(nèi)容物， 以將內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)到約7至約8。調(diào)節(jié)pH后，將容納容器252 的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到發(fā)酵器262,該發(fā)酵器容納著其中分散有植物發(fā) 酵梭菌細(xì)胞的培養(yǎng)基。碳水化合物在培養(yǎng)基中的初始濃度為20 mM 至約100mM。發(fā)酵在上述條件下在發(fā)酵容器262中進(jìn)行。燃料級乙 醇同樣如上所述在蒸餾裝置270中蒸餾。
圖5C示出了從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的工藝300。將生物質(zhì)(除去或不 除去木質(zhì)素)和任選蒸汽裝入發(fā)酵器302。如果木質(zhì)素被除去，它可在 任何能量密集過程中使用，例如用作能源以驅(qū)動(dòng)蒸餾裝置。蒸汽的有 利作用是將生物質(zhì)滅菌，同時(shí)還使生物質(zhì)疏松和更具反應(yīng)性。將生物 質(zhì)裝入發(fā)酵器302,加入水(如果需要)，使得總物料的例如約10-60 重量百分比是懸浮生物質(zhì)?？勺屔镔|(zhì)浸泡例如約1小時(shí)至36小時(shí)的時(shí)間，若在正常大氣壓下，浸泡溫度為例如約25。C至約卯。C,若 在高于正常大氣壓(例如約1.5大氣壓至約10大氣壓)的壓力下，浸泡 溫度例如為約100°C至約175。C。過了浸泡時(shí)間后，將堿(例如石灰 或氨水形式的堿)和/或酸(例如硫酸水溶液形式的酸)通過pH調(diào)節(jié)裝 置306加到發(fā)酵器302的內(nèi)容物，以將內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)到約7至約 8。
容納著其中分散有植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞的培養(yǎng)基的種子發(fā)酵器304 是用來生長植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞。懸浮在培養(yǎng)基中的植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞 的濃度，在生長開始時(shí)為例如約1(^個(gè)細(xì)胞/mL，當(dāng)種子混合物可供 用以發(fā)酵碳水化合物時(shí)為約1()S個(gè)細(xì)胞/mL。碳水化合物在培養(yǎng)基中 的初始濃度為20mM至約100 mM。在一個(gè)實(shí)施情況中，培養(yǎng)基含有 (均以g/L表示)酵母膏，6.0;尿素，2.1; K2HP04， 2.9; KH2P04， 1.5; MOPS; 10.0; 二水合檸檬酸三鈉，3.0;和鹽酸半胱氨酸。將種子發(fā) 酵器304的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到保持在約室溫下的發(fā)酵器302,并讓其 在上述條件下進(jìn)行發(fā)酵。燃料級乙醇同樣如上所述在蒸餾裝置270中 蒸餾。
組合釆用酸水解預(yù)處理和酶水解預(yù)處理從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇
也可組合采用酸水解預(yù)處理和酶水解預(yù)處理，從生物質(zhì)生產(chǎn)乙 醇。例如，初始水解可用酸來進(jìn)行，例如在酸化裝置中進(jìn)行處理，接 著進(jìn)行蒸汽噴射(如圖4所示)，然后可用酶水解對初始水解的生物質(zhì) 施以最終水解(如圖5A所示)。
方法。在任何本文描述的方法中，木質(zhì)素可在發(fā)酵前除去。此外，由 任何本文描述的方法，可除了生產(chǎn)乙醇外還生產(chǎn)其他產(chǎn)物，或者生產(chǎn) 乙醇以外的產(chǎn)物。更全面地說，發(fā)酵產(chǎn)物包括燃料如醇類和氫以及其 他產(chǎn)物如有機(jī)酸。植物發(fā)酵梭菌如ISDgT菌林可單獨(dú)使用，或者與任 何本文描述的其他微生物(例如酵母菌或其他細(xì)菌)中的一種或多種協(xié)同組合使用。 實(shí)施例
本公開內(nèi)容由以下實(shí)施例作進(jìn)一步的描述，這些實(shí)施例并不限制 權(quán)利要求書中所描述的本發(fā)明范圍。
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將植物發(fā)酵梭菌在培養(yǎng)管中于初始pH 7.5的 GS-2纖維素培養(yǎng)基中在N2氣氛下進(jìn)行生長。初始植物發(fā)酵梭菌濃度 為約0.8—1.1 X 1()7個(gè)細(xì)胞/mL,溫育溫度為30°C。
圖6顯示纖維素分解結(jié)束時(shí)的乙醇(E)、乙酸根(A)、曱酸根(F) 和乳酸根(L)濃度與初始纖維素濃度(按葡萄糖當(dāng)量計(jì))的函數(shù)關(guān)系。在 37mM的初始纖維素濃度下，乳酸根(L)、乙酸根(A)和乙醇(E)的濃度 分別為4 mM、 20 mM和59 mM。在這個(gè)初始濃度下，曱酸才艮(F)未 檢測出。在74mM的初始纖維素濃度下，乳酸根(L)、曱酸根(F)、乙 酸根(A)和乙醇(E)的濃度分別為7 mM、 10 mM、 20 mM和123 mM; 在148 mM的濃度下，乳酸根(L)、曱酸根(F)、乙酸根(A)和乙醇(E) 的濃度分別為10mM、 17mM、 20mM和160mM。圖6顯示，高濃 度的纖維素不會(huì)抑制植物發(fā)酵梭菌的作用，因?yàn)橐掖?E)的濃度隨著 纖維素初始濃度的增加而增加。
這個(gè)結(jié)果與用其他纖維素發(fā)酵^f效生物獲得的結(jié)果形成了對比，這 些其他纖維素發(fā)酵微生物不能發(fā)酵更高濃度的纖維素(例如按葡萄糖 當(dāng)量計(jì)高于約40 mM)，在較高的纖維素濃度下其產(chǎn)生的乙醇量降低 (參見Desvaux et al.,五謂？ow. Mjfcra6/o/ogy, 66， 2461-2470, 2000)。還值得注意的是，當(dāng)使用植物發(fā)酵梭菌時(shí)，乙酸根水平不會(huì) 隨著纖維素初始濃度的增加而顯著增加，這一點(diǎn)會(huì)是有利的，因?yàn)橛?更多的纖維素轉(zhuǎn)向制造更具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的乙醇。 一般來說，其他纖維素 分解細(xì)菌產(chǎn)生的乙醇比乙酸根少(按摩爾數(shù)計(jì))，且乙醇與乙酸根的比 值隨著初始纖維素濃度的增加而下降(參見例如上文的Desvaux et al.)。
28在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將植物發(fā)酵梭菌在培養(yǎng)管中的GS-2培養(yǎng)基中 生長，該培養(yǎng)基含有纖維素25或50 mM (葡萄糖當(dāng)量)或者木聚糖25 或50 mM (木糖當(dāng)量)或者纖維素加木聚糖各25或50 mM,總碳水化 合物濃度為50或100 mM (單糖當(dāng)量)。培養(yǎng)基的初始pH為7.5，初 始植物發(fā)酵梭菌濃度為0.8-1.1 X 1(^個(gè)細(xì)胞/mL。培養(yǎng)物在N2氣氛、 30。C下溫育。碳水化合物降解通過目測來監(jiān)測。
在含有兩種碳水化合物的培養(yǎng)物中，纖維素和木聚糖同時(shí)都降
解。纖維素或木聚糖在含有兩種碳7jC化合物的培養(yǎng)物中的分解速率等
于或大于在含有單一碳水化合物的培養(yǎng)物中的分解速率。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證 明植物發(fā)酵梭菌培養(yǎng)物對纖維素的發(fā)酵不受木聚糖的抑制，木聚糖是 五碳糖聚合物，是半纖維素的重要組分。此外，這個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)纖維素 和木聚糖同時(shí)被植物發(fā)酵梭菌培養(yǎng)物發(fā)酵，這一點(diǎn)會(huì)是有利的，因?yàn)?大多數(shù)天然來源的生物質(zhì)含有碳水化合物混合物，其中纖維素為最豐 富的組分，半纖維素如木聚糖的豐富程度僅次于纖維素。與此對比， 似乎其他微生物不能發(fā)酵5碳糖類或包含5碳糖重復(fù)單元的聚合物。 而且對于其他微生物，5碳糖類或其聚合物實(shí)際上會(huì)干擾微生物的代 謝過程，從而降低發(fā)酵速率和乙醇收率。
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將植物發(fā)酵梭菌在培養(yǎng)管中的含有10、 20或 40 g/L淀粉(Difco可溶性淀粉)的GS-2培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)基的初始 pH為7.5,初始植物發(fā)酵4炎菌濃度為0.8-1.1 X 1(^個(gè)細(xì)胞/mL。培養(yǎng) 物在N2氣氛、30。C下溫育。淀粉發(fā)酵由氣體的產(chǎn)生和培養(yǎng)物濁度的 增加指示。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，測定發(fā)酵產(chǎn)物的濃度。在10g/L的初始淀粉 濃度下，乳酸根、甲酸根、乙酸根和乙醇的濃度分別為lmM、 2mM、 4mM和69mM。在20 g/L的初始淀粉濃度下，乳酸根、曱酸根、乙 酸根和乙醇的濃度分別為3 mM、 4 mM、 5 mM和127 mM。在40 g/L 的初始淀粉濃度下，乳酸根、乙酸根和乙醇的濃度分別為11 mM、 4 mM和132mM。在這個(gè)靠后的實(shí)驗(yàn)中沒有檢測到曱酸根。這些實(shí)驗(yàn) 表明，較高濃度的淀粉不會(huì)抑制植物發(fā)酵梭菌的作用，因?yàn)橐掖嫉臐舛入S著淀粉初始濃度的增加而增加，這個(gè)結(jié)果類似于上述的在遞增的纖維素濃度下培養(yǎng)細(xì)胞所得的結(jié)果。
在第四個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將植物發(fā)酵梭菌在培養(yǎng)管中的GS-2培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng)基含有磨碎的玉米27 g/L或者濕酒糟10.5 g/L或者切碎的玉米秸稈20 g/L或者切碎的柳枝稷20 g/L。培養(yǎng)基的初始pH為7.5，初始植物發(fā)酵梭菌濃度為0.8 -1.1 X 1(^個(gè)細(xì)胞/mL。培養(yǎng)物在N2氣氛、30°C下溫育。由氣體的產(chǎn)生顯示所有的底物都^皮發(fā)酵，且所有培養(yǎng)物中的主要發(fā)酵產(chǎn)物都是乙醇。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，無需對這些纖維素原料進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理，且無需添加纖維素酶或其他酶類，植物發(fā)酵梭菌就能將這些纖維素原料發(fā)酵成乙醇。
在最后一個(gè)實(shí)例中，對植物發(fā)酵梭菌的基因組序列的分析支持了這樣的結(jié)論，即這種微生物擁有不同尋常的發(fā)酵特性，特別適合于分解植物生物質(zhì)的多種組分并將這些組分發(fā)酵成乙醇。植物發(fā)酵梭菌的基因組已由美國能源部的聯(lián)合基因組研究院(the Joint GenomeInstitute of the US Department of Energy)進(jìn)行了測序。序列拼接草圖最早在2005年11月8日獲得，并在2006年5月20日公布于眾(http:〃genome.ornl.gov/microbial/cphy/)。這個(gè)拼接草圖含有4.5 MB的核苷酸序列，該序列區(qū)分成169個(gè)毗連區(qū)段，由這些區(qū)段得到3671個(gè)推定蛋白質(zhì)。2006年12月對序列中的空隙進(jìn)行了閉合，預(yù)期2007年初獲得完成的序列。
我們研究了基因組序列，尋找關(guān)于碳水化合物攝取機(jī)制的證據(jù)，以證實(shí)植物發(fā)酵梭菌不同尋常的發(fā)酵特性及其分解植物生物質(zhì)的多種組分的能力。植物發(fā)酵梭菌的基因組含有超過100個(gè)ABC類型的運(yùn)送系統(tǒng)，其中52個(gè)似乎致力于將碳水化合物運(yùn)送到細(xì)胞中。雖然這些運(yùn)送系統(tǒng)中有一些專用于單糖如葡萄糖、巖藻糖或木糖，但其他的系統(tǒng)無疑參與二糖(例如纖維二糖)、三糖和四糖的運(yùn)送。碳水化合物運(yùn)送系統(tǒng)的這個(gè)異常寬廣的多樣性在微生物當(dāng)中是前所未有的，它表明植物發(fā)酵梭菌特別適合于分解纖維素生物質(zhì)。其他實(shí)施方案
應(yīng)認(rèn)識到，盡管已結(jié)合發(fā)明詳述對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但前面的描述是旨在說明而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是由所附權(quán)利要求書的范圍來限定的。
其他的方面、優(yōu)點(diǎn)和修改方案也落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種從生物質(zhì)材料制造燃料的方法，所述方法包括提供包含高分子量碳水化合物的生物質(zhì)材料；水解該生物質(zhì)材料以提供水解的生物質(zhì)材料；將水解的生物質(zhì)材料與植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行組合，其中碳水化合物在培養(yǎng)基中的濃度大于20mM；和將水解的生物質(zhì)材料進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵的條件和時(shí)間足以產(chǎn)生燃料。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述燃料包含選自乙醇、正丙醇、 異丙醇、正丁醇和它們的混合物的醇類。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述生物質(zhì)材料通過用酸進(jìn)行處理 來水解。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中所述生物質(zhì)材料通過用酶或酶混合 物進(jìn)行處理來水解。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述生物質(zhì)材料通過用酸進(jìn)行處理 后用酶進(jìn)行處理來水解。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中所述生物質(zhì)材料在水解前先進(jìn)行破碎。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中所述水解步驟包括用酸在酸化裝置 中預(yù)處理，然后脫水。
8. —種燃料設(shè)施，所述設(shè)施包括水解裝置，該水解裝置設(shè)置成能水解包含高分子量碳水化合物 的生物質(zhì)材料；和發(fā)酵器，該發(fā)酵器設(shè)置成能容納其中分散有植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞 的培養(yǎng)基。
9. 權(quán)利要求8的燃料設(shè)施，其中所述設(shè)置成能容納其中分散有 植物發(fā)酵梭菌的培養(yǎng)基的發(fā)酵器還包含一種或多種植物發(fā)酵梭菌之外的其他;微生物。
10. 權(quán)利要求9的燃料設(shè)施，其中所述一種或多種其他微生物 包括一種或多種酵母菌。
11. 權(quán)利要求10的燃料設(shè)施，其中所述一種或多種其他微生物 包括一種或多種細(xì)菌。
12. 權(quán)利要求ll的燃料設(shè)施，其中所述一種或多種細(xì)菌包括運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的任何一種或多種菌株。
13. —種制造燃料的方法，所述方法包括 將植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞與木質(zhì)纖維素材料在培養(yǎng)基中進(jìn)行組合；和將木質(zhì)纖維素材料進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵的條件和時(shí)間足以產(chǎn)生燃料。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述木質(zhì)纖維素材料選自木材、 木漿、造紙污泥、紙漿廢物流、刨花板、草、稻殼、甘蔗渣、棉花、 黃麻、大麻、亞麻、竹子、西沙爾麻、馬尼拉麻、稻草、玉米芯、玉 米秸稈、酒糟、樹葉、麥桿、椰子毛、海藻、柳枝稷、芒屬植物、豆 科植物、高粱、生物質(zhì)作物(兩節(jié)齊屬植物)和它們的混合物。
15. 權(quán)利要求13的方法，其中所述培養(yǎng)基中溶解有選自生長因 子、礦物質(zhì)、表面活性劑、螯合劑和它們的混合物的成分。
16. 權(quán)利要求13的方法，其中所述條件包括將培養(yǎng)基維持在低 于約45。C的溫度。
17. 權(quán)利要求13的方法，其中所述條件包括維持培養(yǎng)基的pH 低于約9.5。
18. 權(quán)利要求13的方法，其中所述燃料是乙醇，且其中條件包 括維持乙醇的濃度4氐于約1 M。
19. 一種制造燃料的方法，所述方法包括 將植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞與包含碳水化合物的材料在培養(yǎng)基中進(jìn)行組合，其中所述碳水化合物在培養(yǎng)基中的濃度大于40mM;和將所述包含碳水化合物的材料進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵的條件和時(shí)間足 以產(chǎn)生燃料。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述濃度大于50mM。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述濃度大于100mM。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述濃度小于2000mM。
23. 權(quán)利要求19的方法，其中所述材料包含分子量低于1,000 的低分子量碳水化合物。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述低分子量碳水化合物選自阿 拉伯糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、甘露糖、核糖、 木糖和它們的混合物。
25. 權(quán)利要求19的方法，其中所述材料包含分子量大于l，OOO 的高分子量碳水化合物。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述高分子量碳水化合物選自纖 維素、微晶纖維素、聚半乳糖醛酸、果膠、淀粉、木聚糖和它們的混 合物。
27. 權(quán)利要求19的方法，其中所述材料加以粉碎，使得它的粒 徑在約5微米-50微米之間。
28. 權(quán)利要求19的方法，其中所述材料包含兩種或多種碳水化 合物的摻合物。
29. 權(quán)利要求19的方法，其中所述材料包含纖維素材料或木質(zhì) 纖維素材料。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述纖維素材料或木質(zhì)纖維素材 料選自多層涂料紙、牛皮紙、造紙污泥、木材、木漿、酒糟、刨花板、 樹葉、草、草剪取物、稻殼、甘蔗渣、棉花、黃麻、大麻、亞麻、竹子、西沙爾麻、馬尼拉麻、稻草、玉米芯、玉米秸稈、麥桿、椰子毛、 海藻、柳枝稷、兩節(jié)芥屬植物、生物質(zhì)作物和它們的混合物。
31. 權(quán)利要求19的方法，其中所述材料包含通過分解高分子量 碳水化合物形成的低分子量碳水化合物。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述分解包括使用酶。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述酶選自對半纖維素、果膠和 淀粉的各組分有活性的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解 酶(CBH)、 P-葡萄糖苷酶、糖苷水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、裂解酶和酯酶 和它們的混合物。
34. 權(quán)利要求19的方法，其中所述材料基本上不含木質(zhì)素。
35. —種方法，所述方法包括將植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞、第二微生物和包含碳水化合物的材料在培養(yǎng)基中進(jìn)行組合；和將所述包含碳水化合物的材料進(jìn)行發(fā)酵。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述發(fā)酵進(jìn)行的條件和時(shí)間足以 生產(chǎn)燃料。
37. 權(quán)利要求35的方法，其中所述第二微生物包含酵母菌。
38. 權(quán)利要求35的方法，其中所述第二微生物包含植物發(fā)酵梭 菌之外的細(xì)菌。
39. —種組合物，所述組合物包含植物發(fā)酵梭菌和第二微生物。
全文摘要
植物發(fā)酵梭菌細(xì)胞(美國模式培養(yǎng)物保藏所700394^T)和該菌種的所有其他菌株能將諸如生物質(zhì)的材料發(fā)酵成有用的產(chǎn)物和聯(lián)產(chǎn)物，如乙醇、氫和有機(jī)酸。還公開了包含植物發(fā)酵梭菌的組合物。
文檔編號C12P7/06GK101522904SQ200780011397
公開日2009年9月2日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月27日
發(fā)明者S·萊欣, T·A·沃尼克 申請人:麻薩諸塞州大學(xué)