專利名稱：胰腺內(nèi)分泌和腺泡腫瘤中的微小rna表達(dá)異常的制作方法
發(fā)明人:Carlo M.Croce和George A.Calin
政府資助
本發(fā)明全部或部分由來(lái)自國(guó)立癌癥研究所的項(xiàng)目基金P01CA76259和P01CA81534資助。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
根據(jù)癌癥在胰腺中發(fā)現(xiàn)的位置或根據(jù)癌癥起源的細(xì)胞類型，可以對(duì)胰腺癌分類。胰腺癌可以發(fā)生在胰腺的頭、體或尾部，癥狀可以隨腫瘤在胰腺中的位置而變化。70-80％的胰腺癌發(fā)生在胰腺頭部。大多數(shù)胰腺癌是外分泌類型，超過(guò)90％的這些外分泌胰腺癌是腺癌。它們幾乎全都是導(dǎo)管腺癌，其中所述癌癥發(fā)生在襯在胰腺導(dǎo)管內(nèi)的細(xì)胞中。另外，存在更罕見(jiàn)類型的外分泌胰腺癌，例如囊性腫瘤、腺泡細(xì)胞癌和肉瘤。囊性腫瘤是在胰腺造成囊腫或填充液體的液囊的腫瘤。肉瘤(一種將胰腺細(xì)胞保持在一起的結(jié)締組織的癌)是罕見(jiàn)的，最常見(jiàn)于兒童。
除了外分泌癌以外，胰腺的內(nèi)分泌癌也會(huì)發(fā)生。內(nèi)分泌癌可以參照它們產(chǎn)生的激素來(lái)命名，例如，胃泌素瘤(它們產(chǎn)生胃泌素)，胰島素瘤(它們產(chǎn)生胰島素)，生長(zhǎng)抑素瘤(它們產(chǎn)生生長(zhǎng)抑素)，舒血管腸肽瘤(它們產(chǎn)生VIP)和胰高血糖素瘤(它們產(chǎn)生胰高血糖素)。另外，可以發(fā)生胰腺淋巴瘤，盡管它們是罕見(jiàn)的。
胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)可以偶發(fā)地或作為1型多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病(MEN1)綜合征的一部分而發(fā)生(Kloppel，G.等人，Ann.N.Y.Acad.ScL 1014:13-27(2004))。根據(jù)由于激素分泌過(guò)多造成的癥狀是否存在，這些腫瘤在臨床上分為功能性的(F-PET)或無(wú)功能的(NF-PET)。F-PET主要由胰島素瘤代表。在診斷時(shí)，在僅10％的胰島素瘤、但是在高達(dá)60％的NF-PET中觀察到轉(zhuǎn)移性疾病，且大多數(shù)PET-相關(guān)的死亡由肝轉(zhuǎn)移造成(Kloppel，G.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:13-21(2004))。PET之間的惡性潛力差別巨大，不能在組織學(xué)形態(tài)的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)。實(shí)際上，絕大多數(shù)的PET是分化良好的內(nèi)分泌腫瘤(WDET)，僅在鑒別出侵入或轉(zhuǎn)移時(shí)被定義為分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)(Kloppel，G.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:13-27(2004))。
胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)是一種非常罕見(jiàn)的不同于導(dǎo)管腺癌和PET的腫瘤類型，盡管通過(guò)在三分之一病例中神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記的表達(dá)和混合的腺泡-內(nèi)分泌癌的存在，觀察到與PET的一些重疊(Ohike，N.等人，Virchows Arch.445:231-35(2004))。PACC總是惡性的，生存中值是18個(gè)月，這位于胰腺導(dǎo)管腺癌和內(nèi)分泌腫瘤(分別是6個(gè)月和40個(gè)月)之間(Holen，K.D.等人，J.Clin.Oncol.20:4673-78(2002))。
關(guān)于PET的分子發(fā)病機(jī)理知之甚少(Kloppel，G.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:13-27(2004))。MEN1基因的滅活是在散發(fā)的PET中鑒別出的最常見(jiàn)的遺傳事件，而通常參與胰腺腺癌的基因中的突變不常見(jiàn)(Perren，A.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:199-208(2004))。關(guān)于PACC的分子異常知之更少(Abraham，S.C.等人，Am.J.Pathol.160:953-62(2002))。關(guān)于PACC沒(méi)有可得到的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，我們對(duì)發(fā)生在PET中的基因表達(dá)變化的理解仍然是在起始階段(Hansel，D.E.等人，Clin.Cancer Res.70:6152-58(2004))。
微小RNA是小的(20-24個(gè)核苷酸)非編碼RNA基因產(chǎn)物，其在許多生物學(xué)過(guò)程(例如細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡和發(fā)育定時(shí))中起關(guān)鍵作用。為了實(shí)現(xiàn)這些功能，微小RNA會(huì)負(fù)面調(diào)節(jié)它們的靶mRNA的穩(wěn)定性和/或翻譯效率(Ambros，V.，Nature 437:350-55(2004))。目前，已知313個(gè)獨(dú)特的成熟的人微小RNA，已經(jīng)在人類中實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其中的223個(gè)(www.microrna.sanger.ac.uk)。近年來(lái)的研究表明，特定miRNA的異常表達(dá)可涉及人的疾病，例如神經(jīng)障礙(Ishizuka，A.，等人，GenesDev.16:2497-2508(2002))和癌癥。具體地，已在人慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)中發(fā)現(xiàn)miR-16-1和/或miR-15a的不當(dāng)表達(dá)(Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:15524-15529(2002))。已經(jīng)將微小RNA的異常表達(dá)與癌癥相聯(lián)系，基于它們的微小RNA譜，可以區(qū)分特定癌癥類型的診斷/預(yù)后特征(Caldas，C和J.D.Brenton，Nature Med 17:712-14(2005)；Croce，CM.，和G.A.Calin，Cell122:6-7(2005))。功能研究也已經(jīng)將異常微小RNA表達(dá)與致癌作用相聯(lián)系(Chan，J.A.等人，Cancer Res.65:6029-33(2005)；Cheng，A.M.等人，Nucleic Acids Res.33:1290-97(2005)；He，L.等人，Nature435:828-33(2005)；和Johnson，S.M.等人，Cell 720:635-47(2005))。
包含所有已知的人微小RNA的微陣列的發(fā)展和應(yīng)用，已允許同時(shí)分析樣品中的每一種miRNA的表達(dá)(Liu，C.G.，等人，Proc Natl.Acad.Sci U.S.A.101:9740-9744(2004))。這些微小RNA微陣列不僅已用于確認(rèn)miR-16-1在人CLL細(xì)胞中失調(diào)，而且還用于產(chǎn)生與明確定義的人CLL的臨床病理特征關(guān)聯(lián)的miRNA表達(dá)特征譜(Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:1175-11760(2004))。
對(duì)在胰腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的微小RNA的鑒別，可以輔助指出參與胰腺癌(例如，胰腺內(nèi)分泌腫瘤，腺泡癌)的特定miRNA。此外，對(duì)這些miRNA的假定的靶的鑒定可幫助闡明它們的致病作用。本發(fā)明提供了用于胰腺癌的診斷、預(yù)后和治療的新的方法和組合物。
發(fā)明概述 本發(fā)明部分地基于對(duì)與胰腺癌細(xì)胞中改變的表達(dá)水平有關(guān)的特定miRNA的鑒別。
因此，本發(fā)明包括診斷受試者是否患有胰腺癌或處于發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，將受試者測(cè)試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比較。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示著受試者患有胰腺癌或處于發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103，miR-107和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-23a，miR-26b，miR-192，miR-342和其組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-155。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103，miR-107，miR-155和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-103，與對(duì)照樣品相比，它在測(cè)試樣品中被增量調(diào)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-107，與對(duì)照樣品相比，它在測(cè)試樣品中被增量調(diào)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-155，與對(duì)照樣品相比，它在測(cè)試樣品中被減量調(diào)節(jié)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所有這3種miR(miR-103，miR-107和miR-155)與對(duì)照樣品中的相應(yīng)miR相對(duì)比。
在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌是胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌是胰腺外分泌腫瘤(例如，腺癌)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)和胰腺外分泌腫瘤(例如，腺癌)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌選自:腺泡細(xì)胞癌(PACG)和胰島素瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)，胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)和胰島素瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述診斷方法可以用于診斷任意類型的胰腺癌。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是診斷受試者是否患有胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)或處于發(fā)生胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。在該方法中，將受試者測(cè)試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比較。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示著受試者患有PACC或處于發(fā)生PACC的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-25，miR-200c，miR-335，miR-21，miR-103-1，miR-92-1，miR-181b-2，miR-191，miR-93，miR-26a-1，miR-17，miR-20，miR-107，miR-26b，miR-215，miR-92-2，miR-192，miR-342，miR-100，miR-3p21-v，miR-106a，miR-15a，miR-23a，miR-181b-1，miR-128b，miR-106b，miR-194-1，miR-219-1，miR-242和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-218-2，miR-339，miR-326，miR-34c，miR-152，miR-138-2，miR-128a和其組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是診斷受試者患有的胰腺癌的類型的方法。在該方法中，將受試者測(cè)試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比較。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示胰腺癌的類型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌的類型選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)和胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌的類型選自:分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)和胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125a，miR-99a，miR-132和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-148a。
在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌的類型選自:胰島素瘤和無(wú)功能的胰腺內(nèi)分泌腫瘤(NF-PET)。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是胰島素瘤，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-204，miR-203，miR-211和其組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是確定患胰腺癌的受試者的預(yù)后的方法。在該方法中，測(cè)定受試者測(cè)試樣品(例如，胰腺癌樣品)中與胰腺癌的不良預(yù)后有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示著不良預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量的至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌伴隨著轉(zhuǎn)移和/或高增殖指數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是確定受試者的胰腺癌是否是轉(zhuǎn)移性的方法。在該方法中，測(cè)定受試者測(cè)試樣品(例如，胰腺癌樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示著轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是確定受試者的胰腺癌是否具有高增殖指數(shù)的方法。在該方法中，測(cè)定受試者測(cè)試樣品(例如，胰腺癌樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示著高增殖指數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是確定患胰腺癌的受試者的預(yù)后的方法。在該方法中，測(cè)定受試者測(cè)試樣品(例如，胰腺癌樣品)中PDCD4的水平。相對(duì)于對(duì)照樣品中PDCD4的水平，測(cè)試樣品中PDCD4的水平的改變(例如增加、降低)指示著不良預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中PDCD4的水平小于對(duì)照樣品中PDCD4的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌伴隨著轉(zhuǎn)移和/或高增殖指數(shù)。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的眾多技術(shù)(例如，定量或半定量RT-PCR，RNA印跡分析，溶液雜交檢測(cè))，可以測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，如下測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平:從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸，使靶寡脫氧核苷酸與一種或多種miRNA-特異性探針寡核苷酸(例如，包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜，并對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜。測(cè)試樣品中至少一種miRNA的信號(hào)相對(duì)于對(duì)照樣品的變化指示著受試者患有胰腺癌或處于發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)相比，至少一種miRNA的信號(hào)增量調(diào)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)相比，至少一種miRNA的信號(hào)減量調(diào)節(jié)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述微陣列包含針對(duì)所有已知的人miRNA的實(shí)質(zhì)部分的miRNA-特異性探針寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列包含針對(duì)一種或多種選自下述的miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375，miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
本發(fā)明也提供了診斷受試者是否患有不良預(yù)后的胰腺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。在該方法中，通過(guò)從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸，測(cè)量與胰腺癌的不良預(yù)后有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。然后使靶寡脫氧核苷酸與一種或多種miRNA-特異性探針寡核苷酸(例如，包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜，將測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜相對(duì)比。測(cè)試樣品中至少一種miRNA的信號(hào)相對(duì)于對(duì)照樣品的變化指示著受試者患有不良預(yù)后的胰腺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-21信號(hào)的變化指示著受試者患有不良預(yù)后的胰腺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
本發(fā)明也包括治療受試者胰腺癌的方法，其中受試者癌細(xì)胞中的至少一種miR基因產(chǎn)物失調(diào)(例如，減量調(diào)節(jié)，增量調(diào)節(jié))。當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在胰腺癌細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)時(shí)，該方法包括，施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用給受試者的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合(或一種或多種這些miR的分離的變體或生物活性片段)。當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中增量調(diào)節(jié)時(shí)，該方法包括，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物會(huì)抑制選自下述的miR基因產(chǎn)物:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。
在一個(gè)有關(guān)的實(shí)施方案中，治療受試者的胰腺癌的方法另外包括下述步驟:首先測(cè)定受試者胰腺癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量，和對(duì)比該miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照細(xì)胞中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。如果胰腺癌細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的表達(dá)失調(diào)(例如，減量調(diào)節(jié)，增量調(diào)節(jié))，該方法另外包括，改變胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量小于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的所述miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物活性片段施用給受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量大于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因的表達(dá)的化合物施用給受試者。合適的miR和抑制miR基因的表達(dá)的化合物包括，例如，本文所述的那些。
本發(fā)明另外提供了用于治療胰腺癌的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于在胰腺癌細(xì)胞中具有比合適的對(duì)照細(xì)胞降低的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物(即，減量調(diào)節(jié))。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述分離的miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種抑制miR表達(dá)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)大于對(duì)照細(xì)胞(即，增量調(diào)節(jié))的miR基因產(chǎn)物是特異性的。在某些實(shí)施方案中，所述抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)一種或多種選自下述的miR基因產(chǎn)物是特異性的:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。
本發(fā)明也包括鑒定抗胰腺癌劑的方法，其包括，給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，并測(cè)量細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括，給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，并測(cè)量與胰腺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的增加，指示著測(cè)試試劑是抗胰腺癌劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，與胰腺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平有關(guān)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
在其它實(shí)施方案中，該方法包括，給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，并測(cè)量與胰腺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對(duì)照細(xì)胞相比，所述細(xì)胞中與胰腺癌中增加的表達(dá)水平有關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平的降低，指示著測(cè)試試劑是抗胰腺癌劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，與胰腺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平有關(guān)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。
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圖1A描述了12個(gè)正常胰腺(正常)和44個(gè)胰腺腫瘤的miRNA表達(dá)非監(jiān)督分級(jí)聚類圖，所述胰腺腫瘤包括22個(gè)分化良好的胰腺內(nèi)分泌腫瘤(WDET)，18個(gè)分化良好的胰腺內(nèi)分泌癌(WDEC)和4個(gè)胰腺腺泡細(xì)胞癌(ACC)(在頂部列出)。WDET樣品包括11個(gè)胰島素瘤(INS)和1個(gè)無(wú)功能的PET(NF)；WDEC樣品包括1個(gè)INS和17個(gè)NF-PET。應(yīng)用中值拋光算法，并選擇具有更高四分位數(shù)間距的前200個(gè)探針(其含有成熟的微小RNA序列)，使用由此得到的重復(fù)點(diǎn)的累計(jì)值進(jìn)行分析。值得注意地，PACC樣品落入一個(gè)獨(dú)特的簇中，該簇是包括所有PET的更寬簇的一部分，盡管胰島素瘤和NF-PET之間沒(méi)有特征性譜。如所示的，共同的微小RNA表達(dá)模式將胰腺內(nèi)分泌和腺泡腫瘤與正常胰腺區(qū)分開(kāi)。
圖1B描述了與正常組織相比發(fā)現(xiàn)在PET中增量調(diào)節(jié)的特定微小RNA(增量調(diào)節(jié)的微小RNA以紅色顯示)。
圖1C描述了與正常組織相比發(fā)現(xiàn)在PET中增量調(diào)節(jié)的特定微小RNA(增量調(diào)節(jié)的微小RNA以紅色顯示)。
圖1D描述了與無(wú)功能的PET相比在胰島素瘤中增量調(diào)節(jié)的2種微小RNA(增量調(diào)節(jié)的微小RNA以藍(lán)色顯示)。
圖1E描述了與正常組織相比發(fā)現(xiàn)在PET中減量調(diào)節(jié)的特定微小RNA(減量調(diào)節(jié)的微小RNA以綠色顯示)。
圖2A描述的方框和細(xì)線圖顯示了miR-103和miR-155的表達(dá)水平，它們通過(guò)對(duì)12個(gè)正常胰腺(正常)和44個(gè)胰腺腫瘤的微陣列分析來(lái)測(cè)量，所述胰腺腫瘤包括22個(gè)分化良好的胰腺內(nèi)分泌腫瘤(WDET)，18個(gè)分化良好的胰腺內(nèi)分泌癌(WDEC)和4個(gè)胰腺腺泡細(xì)胞癌(ACC)。用粗線突出中值強(qiáng)度。如所示的，miR-103的過(guò)表達(dá)和miR-155的表達(dá)缺失對(duì)于胰腺胰島和腺泡腫瘤是特殊的。
圖2B描述了RNA印跡分析，它與圖2A所示的微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)平行。5S rRNA(5S-RNA)用作加樣對(duì)照。
圖3A描述的方框和細(xì)線圖顯示了miR-204的表達(dá)水平，它通過(guò)對(duì)12個(gè)正常胰腺(正常)、12個(gè)胰島素瘤、28個(gè)無(wú)功能的胰腺內(nèi)分泌腫瘤(NF-PET)和4個(gè)胰腺腺泡細(xì)胞癌(ACC)的微陣列分析來(lái)測(cè)量。用粗線突出中值強(qiáng)度。
圖3B的圖顯示了通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)評(píng)價(jià)的miR-204表達(dá)和胰島素染色之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。
圖3C描述了RNA印跡分析，它證實(shí)了微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)，并表明miR-204過(guò)表達(dá)是胰島素瘤特異性的。5S rRNA(5S-RNA)用作加樣對(duì)照。
圖4A描述的方框和細(xì)線圖顯示了有(轉(zhuǎn)移+)或沒(méi)有(轉(zhuǎn)移-)肝轉(zhuǎn)移的胰腺內(nèi)分泌腫瘤之間miR-21的不同表達(dá)水平，這通過(guò)微陣列分析來(lái)測(cè)量。如所示的，miR-21的表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移的存在強(qiáng)烈相關(guān)。
圖4B描述的方框和細(xì)線圖顯示了，如通過(guò)Ki67免疫組織化學(xué)測(cè)量的增殖指數(shù)>2％(高)或≤2％(低)的腫瘤之間miR-21的不同表達(dá)水平，這通過(guò)微陣列分析來(lái)測(cè)量。如所示的，miR-21的表達(dá)與腫瘤增殖指數(shù)強(qiáng)烈相關(guān)。
圖4C描述了RNA印跡分析，它證實(shí)了微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)。5S rRNA(5S-RNA)用作加樣對(duì)照。
圖5的圖顯示了正常胰腺(*)、轉(zhuǎn)移性(▲)和非轉(zhuǎn)移性(Δ)PET中miR-21和PDCD4 mRNA的表達(dá)。穩(wěn)健的局部加權(quán)的回歸函數(shù)已經(jīng)用于擬合數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的線。如所示的，miR-21的表達(dá)和它的推定mRNA靶PDCD4之間存在負(fù)相關(guān)。
圖6A描述的RNA印跡分析顯示了所有測(cè)試的胰腺胰島素瘤和無(wú)功能的內(nèi)分泌腫瘤(NF-PET)中miR-26b和miR-107的過(guò)表達(dá)。這些結(jié)果驗(yàn)證了對(duì)于過(guò)表達(dá)的微小RNA的微陣列數(shù)據(jù)。5S rRNA(5S-RNA)用作加樣對(duì)照。
圖6B描述的RNA印跡分析顯示了所有測(cè)試的胰腺胰島素瘤和無(wú)功能的內(nèi)分泌腫瘤(NF-PET)中miR-23a和miR-342的過(guò)表達(dá)。這些結(jié)果驗(yàn)證了對(duì)于過(guò)表達(dá)的微小RNA的微陣列數(shù)據(jù)。5S rRNA(5S-RNA)用作加樣對(duì)照。
圖6C描述的RNA印跡分析顯示了8個(gè)分化良好的內(nèi)分泌腫瘤(WDET)中的4個(gè)、所有4個(gè)分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)和1個(gè)腺泡細(xì)胞癌(ACC)中的miR-192過(guò)表達(dá)。這些結(jié)果驗(yàn)證了對(duì)于過(guò)表達(dá)的微小RNA的微陣列數(shù)據(jù)。5S rRNA(5S-RNA)用作加樣對(duì)照。
圖7A描述的RNA印跡分析表明，miR-375是胰腺-特異性的miR。5S rRNA(5S-RNA)用作加樣對(duì)照。
圖7B描述的RNA印跡分析表明，miR-375的表達(dá)是胰腺內(nèi)分泌和腺泡腫瘤的特征，無(wú)論存在(胰島素瘤)或不存在(NF-PET)臨床上明顯的胰島素分泌過(guò)多。NF-PET，無(wú)功能的胰腺內(nèi)分泌腫瘤。5SrRNA(5S-RNA)用作加樣對(duì)照。如所示的，miR-375表達(dá)在胰腺胰島和腺泡腫瘤中是共有的。
圖7C描述的RNA印跡分析表明，miR-375的表達(dá)是胰腺內(nèi)分泌和腺泡腫瘤的特征，無(wú)論存在(胰島素瘤)或不存在(NF-PET和ACC)臨床上明顯的胰島素分泌過(guò)多。NF-PET，無(wú)功能的胰腺內(nèi)分泌腫瘤；ACC，胰腺腺泡細(xì)胞癌。5S rRNA(5S-RNA)用作加樣對(duì)照。如所示的，miR-375表達(dá)在胰腺胰島和腺泡腫瘤中是共有的。
發(fā)明詳述 本發(fā)明部分地基于胰腺癌細(xì)胞中相對(duì)于正常對(duì)照細(xì)胞具有改變的表達(dá)的特定miRNA的鑒別，并基于這些微小RNA與特定診斷、預(yù)后和治療特征的關(guān)聯(lián)。如本文所述的: i)微小RNA表達(dá)的共同譜會(huì)區(qū)分胰腺腫瘤類型和正常胰腺，從而暗示特定微小RNA在胰腺腫瘤發(fā)生中的參與； ii)伴隨miR-155表達(dá)缺失的miR-103和miR-107的表達(dá)，會(huì)區(qū)別胰腺腫瘤和正常胰腺； iii)至少10種微小RNA會(huì)區(qū)分內(nèi)分泌腫瘤和腺泡腫瘤，并暗示在內(nèi)分泌分化和/或內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生中的特定微小RNA； iv)miR-204主要在胰島素瘤中表達(dá)，并與胰島素的免疫組織化學(xué)表達(dá)相關(guān)聯(lián)；和 v)miR-21的過(guò)表達(dá)與高Ki67增殖指數(shù)和肝轉(zhuǎn)移的存在強(qiáng)烈相關(guān)。
這些結(jié)果暗示，微小RNA表達(dá)的改變與內(nèi)分泌和腺泡致瘤性轉(zhuǎn)化和惡性進(jìn)展相關(guān)。因此，特定微小RNA的表達(dá)，以及這樣的微小RNA表達(dá)的改變，可以用于本文所述的診斷、預(yù)后和治療方法中。
如本文中互換使用的，＂miR基因產(chǎn)物＂＂微小RNA＂＂miR＂或＂miRNA＂是指來(lái)自miR基因的未加工的或加工過(guò)的RNA轉(zhuǎn)錄物。由于miR基因產(chǎn)物不翻譯成蛋白，術(shù)語(yǔ)＂miR基因產(chǎn)物＂不包括蛋白。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱作＂miR前體＂，通常包含長(zhǎng)度為約70-100個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物。miR前體可以用RNA酶(例如，Dicer，Argonaut，RNA酶III(例如，大腸桿菌RNA酶III))消化加工成有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。該有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也稱作＂加工過(guò)的＂miR基因產(chǎn)物或＂成熟的＂miRNA。
所述有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子可以通過(guò)天然加工途徑(例如，使用完整細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過(guò)合成加工途徑(例如，使用分離的加工酶，例如分離的Dicer，Argonaut，或RNA酶III)從miR前體得到。應(yīng)當(dāng)理解，所述有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也可以通過(guò)生物或化學(xué)合成直接生成，不必從miR前體加工。當(dāng)在本文中用名稱提及微小RNA時(shí)，該名稱對(duì)應(yīng)著前體和成熟形式兩者，除非另有說(shuō)明。
本發(fā)明包括診斷受試者是否患有胰腺癌或處于發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括測(cè)量受試者測(cè)試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，和對(duì)比測(cè)試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。如本文使用的，＂受試者＂可以是患有胰腺癌或被懷疑患有胰腺癌的任意哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者是患有胰腺癌或被懷疑患有胰腺癌的人。
胰腺癌可以是任意形式的胰腺癌，例如，不同組織學(xué)的胰腺癌(例如，外分泌腫瘤，內(nèi)分泌腫瘤，癌，淋巴瘤)。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌是胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌是胰腺外分泌腫瘤(例如，腺癌)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)和胰腺外分泌腫瘤(例如，腺癌)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌選自:腺泡細(xì)胞癌(PACC)和胰島素瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)，胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)和胰島素瘤。此外，如本文所述的，胰腺癌可以伴隨特定預(yù)后(例如，低生存率，快速進(jìn)展)。
表1a和1b描述了特定的前體和成熟人微小RNA的核苷酸序列。
表1a-人微小RNA前體序列。
*前體序列中加下劃線的序列對(duì)應(yīng)著成熟的加工過(guò)的miR轉(zhuǎn)錄物(參見(jiàn)表1b)。有些前體序列具有2個(gè)加下劃線的序列，它們表示源自相同前體的2種不同的成熟miR。所有序列都是人的。
表1b-人成熟微小RNA序列。
可以在從受試者得到的生物樣品的細(xì)胞中測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，通過(guò)常規(guī)活組織檢查技術(shù)，可以從被懷疑患有胰腺癌的受試者取出組織樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從受試者取出血液樣品，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以分離白細(xì)胞，用于DNA提取。血液或組織樣品優(yōu)選地在開(kāi)始放療、化療或其它治療性處理之前從受試者得到。對(duì)應(yīng)的對(duì)照組織或血液樣品或?qū)φ諈⒄諛悠?，可以從該受試者未受影響的組織、從正常人個(gè)體或正常個(gè)體的群體、或從與受試者樣品中大多數(shù)細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞得到。然后與來(lái)自受試者的樣品一起，加工處理對(duì)照組織或血液樣品，從而可以將來(lái)自受試者樣品的細(xì)胞中從給定miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來(lái)自對(duì)照樣品的細(xì)胞的相應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相對(duì)比?；蛘?，可以與測(cè)試樣品分開(kāi)地(例如，在不同時(shí)間)得到并加工參照樣品，并可將來(lái)自測(cè)試樣品的細(xì)胞中從給定miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來(lái)自參照樣品的相應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相對(duì)比。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被＂增量調(diào)節(jié)＂)。如本文使用的，當(dāng)來(lái)自受試者的細(xì)胞或組織樣品中miR基因產(chǎn)物的量大于對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)物的量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被＂增量調(diào)節(jié)＂。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被＂減量調(diào)節(jié)＂)。如本文使用的，當(dāng)從來(lái)自受試者的細(xì)胞或組織樣品中的基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的量小于從對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)生的量時(shí)，miR基因的表達(dá)被＂減量調(diào)節(jié)＂。相對(duì)于一種或多種RNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，可以測(cè)定對(duì)照和正常樣品中的相對(duì)miR基因表達(dá)。所述標(biāo)準(zhǔn)可包含，例如，零miR基因表達(dá)水平，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的miR基因表達(dá)水平，受試者的未受影響的組織中的miR基因表達(dá)水平，或以前對(duì)正常人對(duì)照群體得到的miR基因表達(dá)的平均水平。
與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，從受試者得到的樣品中miR基因產(chǎn)物的水平的改變(即，增加或降低)，指示著在受試者中存在胰腺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。本文描述了在胰腺癌中具有比正常胰腺組織更高的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103，miR-107和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-23a，miR-26b，miR-192，miR-342和其組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。本文描述了在胰腺癌中具有比正常胰腺組織更低的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-155。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-103，miR-107，miR-155和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-103，與對(duì)照樣品相比，它在測(cè)試樣品中被增量調(diào)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-107，與對(duì)照樣品相比，它在測(cè)試樣品中被增量調(diào)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-155，與對(duì)照樣品相比，它在測(cè)試樣品中被減量調(diào)節(jié)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所有這3種miR(miR-103，miR-107和miR-155)與對(duì)照樣品中的相應(yīng)miR相對(duì)比。如本文所述和例示的，miR-103和miR-107的表達(dá)，與miR-155表達(dá)的缺失相結(jié)合，會(huì)將胰腺腫瘤與正常胰腺區(qū)分開(kāi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌是胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌是胰腺外分泌腫瘤(例如，腺癌)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)和胰腺外分泌腫瘤(例如，腺癌)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌選自:腺泡細(xì)胞癌(PACC)和胰島素瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)，胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)和胰島素瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述診斷方法可以用于診斷任意類型的胰腺癌。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是診斷受試者是否患有胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)或處于發(fā)生該癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。在該方法中，將受試者測(cè)試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比較。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示著受試者患有PACC或處于發(fā)生PACC的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增量調(diào)節(jié)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-25，miR-200c，miR-335，miR-21，miR-103-1，miR-92-1，miR-181b-2，miR-191，miR-93，miR-26a-1，miR-17，miR-20，miR-107，miR-26b，miR-215，miR-92-2，miR-192，miR-342，miR-100，miR-3p21-v，miR-106a，miR-15a，miR-23a，miR-181b-1，miR-128b，miR-106b，miR-194-1，miR-219-1，miR-242和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，減量調(diào)節(jié)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-218-2，miR-339，miR-326，miR-34c，miR-152，miR-138-2，miR-128a和其組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是診斷受試者患有的胰腺癌的類型的方法。在該方法中，將受試者測(cè)試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比較。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示胰腺癌的類型。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌的類型選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)和胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)，且增量調(diào)節(jié)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)，且減量調(diào)節(jié)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，iniR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其組合。如本文所述的，特定miR基因產(chǎn)物的表達(dá)可以區(qū)分PET和PACC(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌的類型選自:分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)和胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)，且增量調(diào)節(jié)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125a，miR-99a，miR-132和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)，且減量調(diào)節(jié)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-148a。如本文所述的，特定miR基因產(chǎn)物的表達(dá)可以區(qū)分WDEC和PACC(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷的胰腺癌的類型選自:胰島素瘤和無(wú)功能的胰腺內(nèi)分泌腫瘤(NF-PET)。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌的類型是胰島素瘤，增量調(diào)節(jié)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-204，miR-203，miR-211和其組合。如本文所述的，特定miR基因產(chǎn)物的表達(dá)可以區(qū)分WDEC和PACC(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例)。
本發(fā)明也提供了確定患胰腺癌的受試者的預(yù)后的方法。在該方法中，測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其與胰腺癌中的特定預(yù)后(例如，良好的或積極的預(yù)后，差的或不良的預(yù)后)有關(guān)。與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如，增加，減少)，指示著受試者患有具有特定預(yù)后的胰腺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物與不良(即，差)預(yù)后有關(guān)。不良預(yù)后的實(shí)例包括、但不限于，低生存率和快速疾病進(jìn)展。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量的增量調(diào)節(jié)的至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌伴隨著轉(zhuǎn)移和/或高增殖指數(shù)。如本文所述的，特定miR基因產(chǎn)物的表達(dá)，其與胰腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，可以預(yù)測(cè)受試者胰腺癌的嚴(yán)重性(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例)。在某些實(shí)施方案中，如下測(cè)量所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平:從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸，使所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜，并對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是測(cè)定受試者的胰腺癌是否是轉(zhuǎn)移性的方法。如本文所述的，大多數(shù)PET-有關(guān)的死亡由肝轉(zhuǎn)移造成。因而，對(duì)轉(zhuǎn)移性胰腺癌的鑒別，可以輔助確定適宜的治療選擇。在該方法中，測(cè)定受試者測(cè)試樣品(例如，胰腺癌樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示著轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增量調(diào)節(jié)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是確定受試者的胰腺癌是否具有高增殖指數(shù)的方法。如已知的，具有高增殖指數(shù)的胰腺癌具有不良預(yù)后，因此，對(duì)具有高增殖指數(shù)的胰腺癌的鑒別，也可以輔助確定適宜的治療選擇。在該方法中，測(cè)定受試者測(cè)試樣品(例如，胰腺癌樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加、降低)指示著高增殖指數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增量調(diào)節(jié)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
對(duì)特定miR基因產(chǎn)物(例如，與對(duì)照樣品相比，表現(xiàn)出增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)的表達(dá)的那些miR基因產(chǎn)物)的靶物的鑒別，可以輔助闡明微小RNA的作用機(jī)理。如本文所例示的，鑒別出了選擇的微小RNA(即miR-103/miR-107，miR-155，miR-204/miR-211和miR-21)的特定推定靶物。分析揭示了胰腺癌樣品中特定微小RNA的許多增量調(diào)節(jié)的(28個(gè)靶基因)和減量調(diào)節(jié)的(7個(gè)靶基因)靶基因。如表10所述，在胰腺癌樣品中鑒別出了miR-103/miR-107的28個(gè)增量調(diào)節(jié)的靶基因和7個(gè)減量調(diào)節(jié)的靶基因(實(shí)施例和表10)。另外，在胰腺癌樣品中鑒別出了miR-103/miR-107的2個(gè)增量調(diào)節(jié)的靶基因和2個(gè)減量調(diào)節(jié)的靶基因，以及miR-21的1個(gè)增量調(diào)節(jié)的靶基因和1個(gè)減量調(diào)節(jié)的靶基因(實(shí)施例和表10)。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，特定微小RNA的靶基因(例如，在表10中列出的那些)的表達(dá)，可以用于診斷癌癥(例如，胰腺癌)。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的方法和/或本文所述的測(cè)量微小RNA的表達(dá)水平的方法(例如，定量或半-定量RT-PCR，RNA印跡分析，溶液雜交檢測(cè)，微陣列分析)，不經(jīng)不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)，可以測(cè)量任意的這些靶基因的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量的靶基因是程序性細(xì)胞死亡4(PDCD4)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是確定患胰腺癌的受試者的預(yù)后的方法。在該方法中，測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品(例如，胰腺癌樣品)中的PDCD4的水平。與對(duì)照樣品中PDCD4的水平相比，測(cè)試樣品中PDCD4的水平的改變(例如，增加，減少)指示著不良預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中PDCD4的水平小于對(duì)照樣品中PDCD4的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰腺癌伴隨著轉(zhuǎn)移和/或高增殖指數(shù)。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的眾多技術(shù)(例如，定量或半定量RT-PCR，RNA印跡分析，溶液雜交檢測(cè))，可以測(cè)量所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，如下測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平:從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸，使所述靶寡脫氧核苷酸與一種或多種miRNA-特異性探針寡核苷酸(例如，包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜，并對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜。測(cè)試樣品中至少一種miRNA的信號(hào)相對(duì)于對(duì)照樣品的變化指示著受試者患有胰腺癌或處于發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miRNA的信號(hào)相對(duì)于從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)增量調(diào)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miRNA的信號(hào)相對(duì)于從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)減量調(diào)節(jié)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述微陣列包含針對(duì)所有已知的人miRNA的實(shí)質(zhì)部分的miRNA-特異性探針寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列包含針對(duì)一種或多種選自下述的miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375，miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
可以從由已知的miRNA序列產(chǎn)生的基因特異性寡核苷酸探針制備微陣列。微陣列可包含對(duì)于每種miRNA的兩種不同的寡核苷酸探針，一種包含活性的成熟序列，另一種對(duì)于該miRNA的前體是特異性的。微陣列還可以包含對(duì)照，例如一個(gè)或多個(gè)與人直系同源物相異僅少數(shù)堿基的小鼠序列，該序列可用作雜交嚴(yán)格性條件的對(duì)照。還可將來(lái)自兩個(gè)物種的tRNA和其它RNA(例如，rRNA，mRNA)印在微芯片上，為特異性雜交提供內(nèi)部的、相對(duì)穩(wěn)定的陽(yáng)性對(duì)照。還可在微芯片上包含非特異性雜交的一個(gè)或多個(gè)合適的對(duì)照。為此，基于與任何已知的miRNA不存在任何同源性來(lái)選擇序列。
可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)制造微陣列。例如，在位置C6上對(duì)合適長(zhǎng)度例如40個(gè)核苷酸的探針寡核苷酸進(jìn)行5’-胺修飾，然后使用可商購(gòu)獲得的微陣列系統(tǒng)例如GeneMachine OmniGridTM 100Microarrayer和Amersham CodeLinkTM活化載玻片進(jìn)行印制。通過(guò)用標(biāo)記的引物逆轉(zhuǎn)錄靶RNA來(lái)制備相應(yīng)于靶RNA的標(biāo)記的cDNA寡物。在第一鏈合成后，使RNA/DNA雜交體變性以降解RNA模板。然后將所制備的標(biāo)記的靶cDNA在雜交條件下與微陣列芯片雜交，所述條件是例如在25℃下在6X SSPE/30％甲酰胺中進(jìn)行18小時(shí)，然后在37℃下在0.75XTNT中洗滌40分鐘。雜交在陣列上在固定的探針DNA識(shí)別樣品中的互補(bǔ)靶cDNA的位置上發(fā)生。標(biāo)記的靶cDNA標(biāo)記了陣列上發(fā)生結(jié)合的確切位置，從而允許自動(dòng)檢測(cè)和定量。輸出由一列雜交事件組成，其顯示了特定cDNA序列的相對(duì)豐度，從而顯示患者樣品中相應(yīng)的互補(bǔ)miR的相對(duì)豐度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，標(biāo)記的cDNA寡物是從生物素標(biāo)記的引物制備的生物素標(biāo)記的cDNA。然后通過(guò)使用例如鏈霉抗生物素-Alexa647綴合物直接檢測(cè)含生物素的轉(zhuǎn)錄物來(lái)處理微陣列和使用常規(guī)的掃描方法掃描微陣列。陣列上各點(diǎn)的圖像強(qiáng)度與患者樣品中相應(yīng)的miR的豐度成比例。
陣列的使用對(duì)于miRNA表達(dá)檢測(cè)具有幾個(gè)有利方面。第一，可在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)在相同的樣品中鑒定數(shù)百個(gè)基因的整體表達(dá)。第二，通過(guò)對(duì)寡核苷酸探針的仔細(xì)設(shè)計(jì)，可鑒定成熟和前體分子的表達(dá)。第三，與RNA印跡分析相比，芯片需要少量的RNA，并且使用2.5μg的總RNA可提供可重復(fù)的結(jié)果。相對(duì)有限數(shù)量的miRNA(每個(gè)物種數(shù)百個(gè))允許構(gòu)建幾個(gè)物種的共同微陣列，對(duì)于各物種具有不同的寡核苷酸探針。該工具允許對(duì)多種不同條件下各已知miR的跨物種表達(dá)進(jìn)行分析。
除了用于特定miR的定量表達(dá)水平測(cè)定外，包含相應(yīng)于相當(dāng)大部分的miRNome(優(yōu)選整個(gè)miRNome)的miRNA特異性探針寡核苷酸的微芯片可用于確定miR基因表達(dá)譜，從而進(jìn)行miR表達(dá)模式的分析。不同的miR特征譜可與已建立的疾病標(biāo)記或直接與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
根據(jù)本文描述的表達(dá)譜確定分析法，定量逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自獲自懷疑患有癌癥(例如，胰腺癌)的受試者的樣品的總RNA，以提供一組與樣品中的RNA互補(bǔ)的標(biāo)記的靶寡脫氧核苷酸。然后使所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供樣品的雜交譜。結(jié)果是展示樣品中miRNA的表達(dá)模式的樣品的雜交譜。雜交譜包含來(lái)自樣品的靶寡脫氧核苷酸與微陣列中的miRNA特異性探針寡核苷酸結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)。該譜可記錄為結(jié)合的存在或不存在(信號(hào)相對(duì)于零信號(hào))。更優(yōu)選，記錄的譜包括來(lái)自各雜交的信號(hào)的強(qiáng)度。將譜與從正常例如非癌性的對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜進(jìn)行比較。信號(hào)的改變指示著受試者中存在癌癥或發(fā)生癌癥的傾向。
用于測(cè)量miR基因表達(dá)的其它技術(shù)也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)，并且包括用于測(cè)量RNA轉(zhuǎn)錄和降解的速率的各種技術(shù)。
本發(fā)明也提供了診斷受試者是否患有不良預(yù)后的胰腺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。在該方法中，通過(guò)從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸，測(cè)量與胰腺癌的不良預(yù)后有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。然后將所述靶寡脫氧核苷酸與一種或多種miRNA-特異性探針寡核苷酸(例如，包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜，并將測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜相對(duì)比。測(cè)試樣品中至少一種miRNA的信號(hào)相對(duì)于對(duì)照樣品的變化指示著受試者患有不良預(yù)后的胰腺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-21信號(hào)的變化指示著受試者患有不良預(yù)后的胰腺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
在本發(fā)明的診斷、預(yù)后和治療方法的具體實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是下述的一種或多種:let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
如本文所述的，使用適用于檢測(cè)生物樣品中的RNA表達(dá)水平的任意技術(shù)，可以測(cè)量樣品中miR基因產(chǎn)物的水平。用于測(cè)定生物樣品(例如，細(xì)胞，組織)中RNA表達(dá)水平的合適技術(shù)(例如，RNA印跡分析，RT-PCR，原位雜交)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用RNA印跡分析，檢測(cè)至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可以如下從細(xì)胞純化總細(xì)胞RNA:在有核酸提取緩沖液存在下勻漿，隨后離心。沉淀核酸，通過(guò)用DNA酶處理和沉淀，去除DNA。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)瓊脂糖凝膠上的凝膠電泳分離RNA分子，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜。然后通過(guò)加熱，將RNA固定化在濾膜上。使用與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的適當(dāng)標(biāo)記的DNA或RNA探針，進(jìn)行對(duì)特定RNA的檢測(cè)和定量。參見(jiàn)，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，J.Sambrook等人編，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapter 7，其所有公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。
從表1a和表1b中提供的核酸序列，可以生成用于給定miR基因產(chǎn)物的RNA印跡雜交的合適探針(例如，DNA探針，RNA探針)，包括、但不限于，與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互補(bǔ)性的探針，以及與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物具有完全互補(bǔ)性的探針。標(biāo)記的DNA和RNA探針的制備方法，和其與靶核苷酸序列的雜交的條件，描述在Molecular Cloning:A Laboratory Manual，J.Sambrook等人編，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapters 10和11，其所有公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)參考引用并入本文。
例如，核酸探針可用下述物質(zhì)標(biāo)記，例如，放射性核素，例如3H，32P，33P，14C，或35S；重金屬；能起到標(biāo)記配體的特異性結(jié)合對(duì)成員功能的配體(例如，生物素，抗生物素蛋白或抗體)；熒光分子；化學(xué)發(fā)光分子；酶等。
通過(guò)Rigby等人(1977)，J.Mol.Biol.113:237-251的切口平移方法，或通過(guò)Fienberg等人(1983)，Anal.Biochem.132:6-13的隨機(jī)引物法，可以將探針標(biāo)記成高比放射性，所述文獻(xiàn)的所有公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)參考引用并入本文。后者是從單鏈DNA或從RNA模板合成高比放射性的32P-標(biāo)記的探針的選擇方法。例如，通過(guò)根據(jù)切口平移方法用高放射性的核苷酸替換現(xiàn)有的核苷酸，可以制備比放射性大大超過(guò)108cpm/微克的32P-標(biāo)記的核酸探針。然后通過(guò)使雜交的濾膜曝光于照相膠片，可以進(jìn)行雜交的放射自顯影檢測(cè)。對(duì)雜交的濾膜曝光的照相膠片的光密度掃描，會(huì)提供miR基因轉(zhuǎn)錄物水平的精確測(cè)量。使用另一個(gè)方案，通過(guò)計(jì)算機(jī)化成像系統(tǒng)，例如可從AmershamBiosciences，Piscataway，NJ得到的Molecular Dynamics 400-B 2D磷光計(jì)，可以定量miR基因轉(zhuǎn)錄物水平。
當(dāng)DNA或RNA探針的放射性核素標(biāo)記不可行時(shí)，隨機(jī)-引物方法可以用于將類似物例如dTTP類似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己?；?-3-氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸摻入探針?lè)肿又?。通過(guò)與生物素-結(jié)合蛋白(例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素和抗體(例如，抗-生物素抗體)，其偶聯(lián)到熒光染料或產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶)的反應(yīng)，可以檢測(cè)生物素基化的探針寡核苷酸。
除了RNA印跡和其它RNA雜交技術(shù)以外，使用原位雜交技術(shù)，可以測(cè)定RNA轉(zhuǎn)錄物的水平。該技術(shù)需要比RNA印跡技術(shù)更少的細(xì)胞，包括將整個(gè)細(xì)胞放置在顯微鏡蓋玻片上，用含有放射性的或其它標(biāo)記的核酸(例如，cDNA或RNA)探針的溶液探測(cè)細(xì)胞的核酸內(nèi)容物。該技術(shù)特別適用于分析來(lái)自受試者的組織活檢樣品。原位雜交技術(shù)的實(shí)踐更詳細(xì)地描述在美國(guó)專利號(hào)5,427,916，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。從表1a和表1b中提供的核酸序列，可以生成適用于給定miR基因產(chǎn)物的原位雜交的探針，包括、但不限于，與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互補(bǔ)性的探針，以及與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物具有完全互補(bǔ)性的探針，如上所述。
通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄miR基因轉(zhuǎn)錄物，隨后通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物，也可以測(cè)定細(xì)胞中miR基因轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)數(shù)目?？赏ㄟ^(guò)與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)例如來(lái)自存在于相同樣品中的“管家”基因的mRNA的水平比較，來(lái)定量miR基因轉(zhuǎn)錄物的水平。用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的合適的“管家”基因包括例如肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)。用于定量和半-定量RT-PCR的方法和其變化形式，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
在一些情況下，可能希望同時(shí)測(cè)定樣品中許多不同miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。在其它情況下，可能希望測(cè)定所有已知的與癌癥(例如，胰腺癌)相關(guān)的miR基因的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。評(píng)估數(shù)百個(gè)miR基因或基因產(chǎn)物的癌癥特異性表達(dá)水平是非常耗時(shí)的，并且需要大量總RNA(對(duì)于每個(gè)RNA印跡至少20μg)和需要放射性同位素的放射自顯影技術(shù)。
為克服這些限制，可構(gòu)建微芯片形式(即，微陣列)的寡物文庫(kù)，其包含對(duì)于一組miR基因特異性的一組寡核苷酸(例如，寡脫氧核苷酸)探針。通過(guò)使用該微陣列，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核苷酸，然后使其與微陣列上的探針寡脫氧核苷酸雜交，從而產(chǎn)生雜交或表達(dá)譜，來(lái)測(cè)定生物樣品中多種微小RNA的表達(dá)水平。然后可將測(cè)試樣品的雜交譜與對(duì)照樣品進(jìn)行比較，以確定在胰腺癌細(xì)胞中具有改變的表達(dá)水平的微小RNA。如本文所用的，“探針寡核苷酸”或“探針寡脫氧核苷酸”是指能夠與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸?！鞍泄押塑账帷被颉鞍泄衙撗鹾塑账帷笔侵复龣z測(cè)(例如通過(guò)雜交)的分子?！癿iR-特異性探針寡核苷酸”或“對(duì)miR特異性的探針寡核苷酸”是指具有經(jīng)選擇與特定miR基因產(chǎn)物雜交或與該特定miR基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄物雜交的序列的探針寡核苷酸。
特定樣品的“表達(dá)譜”(expression profile)或“雜交譜”(hybridization profile)基本上是樣品的狀態(tài)的指紋圖譜；盡管兩種狀態(tài)可具有相似表達(dá)的任何特定基因，但同時(shí)評(píng)估多個(gè)基因可允許產(chǎn)生對(duì)于細(xì)胞狀態(tài)獨(dú)特的基因表達(dá)譜。即，正常組織可與胰腺癌組織區(qū)別，并且在胰腺癌組織內(nèi)，可確定不同的預(yù)后狀態(tài)(例如，良好的或差的長(zhǎng)期存活希望)。通過(guò)比較不同狀態(tài)中的胰腺癌組織的表達(dá)譜，可獲得關(guān)于哪些基因在這些狀態(tài)每一種中是重要的(包括基因的增量調(diào)節(jié)和減量調(diào)節(jié))信息。在胰腺癌組織或正常胰腺組織中差異表達(dá)的序列的鑒定以及導(dǎo)致不同的預(yù)后結(jié)果的差異表達(dá)的鑒定，允許以許多方式使用該信息。例如，可評(píng)價(jià)特定的治療方案(例如，以確定化療藥物是否起著改善特定患者的長(zhǎng)期預(yù)后的作用)。類似地，可通過(guò)將患者的樣品與已知的表達(dá)譜比較來(lái)進(jìn)行或確認(rèn)診斷。此外，這些基因表達(dá)譜(或個(gè)別基因)允許篩選抑制胰腺癌表達(dá)譜或?qū)⒉涣碱A(yù)后譜轉(zhuǎn)變成更好的預(yù)后譜的藥物候選品。
不希望受任何一種理論的束縛，認(rèn)為細(xì)胞中一種或多種miR基因產(chǎn)物的水平的變化可導(dǎo)致這些miR的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)靶物失調(diào)，這可導(dǎo)致胰腺癌的形成。因此，改變miR基因產(chǎn)物的水平(例如，通過(guò)減少在胰腺癌細(xì)胞中被增量調(diào)節(jié)的miR的水平，通過(guò)增加在癌細(xì)胞中被減量調(diào)節(jié)的miR的水平)可成功地治療胰腺癌。
因此，本發(fā)明包括治療受試者中的胰腺癌的方法，其中至少一種miR基因產(chǎn)物在受試者的細(xì)胞(例如，胰腺癌細(xì)胞)中失調(diào)(例如，減量調(diào)節(jié)、增量調(diào)節(jié))。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品(例如，胰腺癌樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品(例如，胰腺癌樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在胰腺癌細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)時(shí)，該方法包括施用有效量的所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖。例如，當(dāng)miR基因產(chǎn)物在受試者癌細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)時(shí)，給受試者施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物可以抑制癌細(xì)胞的增殖。給受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物可以與在癌細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)的內(nèi)源野生型miR基因產(chǎn)物(例如，表1a或表1b所示的miR基因產(chǎn)物)相同，或可以是其變體或生物活性片段。如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的＂變體＂是指與相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物具有小于100％同一性、且具有相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性的miRNA。這樣的生物活性的實(shí)例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)(例如，抑制靶RNA分子的翻譯，調(diào)控靶RNA分子的穩(wěn)定性，抑制靶RNA分子的加工)和抑制與胰腺癌有關(guān)的細(xì)胞過(guò)程(例如，細(xì)胞分化，細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞死亡)。這些變體包括物種變體和作為miR基因中的一個(gè)或多個(gè)突變(例如，置換，缺失，插入)的結(jié)果的變體。在某些實(shí)施方案中，所述變體與相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的＂生物活性片段＂是指具有相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性的的miR基因產(chǎn)物的RNA片段。如上所述，這樣的生物活性的實(shí)例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)和抑制與胰腺癌有關(guān)的細(xì)胞過(guò)程。在某些實(shí)施方案中，所述生物活性片段的長(zhǎng)度是至少約5，7，10，12，15，或17個(gè)核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以與一種或多種其它的抗癌治療相組合，將分離的miR基因產(chǎn)物施用給受試者。合適的抗癌治療包括、但不限于，化療，放療和其組合(例如，放化療)。
當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中增量調(diào)節(jié)時(shí)，該方法包括，給受試者施用有效量的抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。這樣的化合物在本文中稱作抑制miR基因表達(dá)的化合物。合適的抑制miR基因表達(dá)的化合物的實(shí)例包括、但不限于，在本文中所述的那些(例如，雙鏈RNA，反義核酸和酶RNA分子)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抑制miR基因表達(dá)的化合物可以與一種或多種其它的抗癌治療相組合地施用給受試者。合適的抗癌治療包括、但不限于，化療，放療和其組合(例如，放化療)。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，在胰腺癌中失調(diào)的(和施用給受試者的)分離的miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合(或這些miR中一種或多種的分離的變體或生物活性片段)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，施用的miR基因產(chǎn)物不是下述的一種或多種:let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
如所述的，當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中增量調(diào)節(jié)時(shí)，該方法包括，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物會(huì)抑制選自下述的miR基因產(chǎn)物:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。
在一個(gè)有關(guān)的實(shí)施方案中，治療受試者的胰腺癌的方法另外包括下述步驟:首先測(cè)定受試者胰腺癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量，和對(duì)比所述miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照細(xì)胞中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。如果胰腺癌細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的表達(dá)失調(diào)(例如，減量調(diào)節(jié)，增量調(diào)節(jié))，該方法另外包括，改變胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量小于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的所述miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物活性片段施用給受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量大于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因的表達(dá)的化合物施用給受試者。合適的miR和抑制miR基因的表達(dá)的化合物包括，例如，本文所述的那些。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“治療”、“醫(yī)治”和“醫(yī)療”是指改善與疾病或病癥例如胰腺癌相關(guān)的癥狀，包括阻止或延遲疾病癥狀的發(fā)作和/或減少疾病或病癥的癥狀的嚴(yán)重度或頻率。術(shù)語(yǔ)“受試者”、“患者”和“個(gè)體”在本文定義為包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物，包括但不限于，靈長(zhǎng)類動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族動(dòng)物、羊科動(dòng)物、馬科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物或鼠類物種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物是人。
如本文所用的，分離的miR基因產(chǎn)物的“有效量”是足以抑制患胰腺癌的受試者中癌細(xì)胞增殖的量。通過(guò)考慮諸如受試者的身材大小和體重、疾病侵入的程度、受試者的年齡、健康和性別、給藥途徑以及給藥是局部的還是全身性的等因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定對(duì)給定受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量。
例如，分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可基于被治療的腫瘤塊的近似重量?？赏ㄟ^(guò)計(jì)算團(tuán)塊的近似體積確定腫瘤塊的近似重量，其中1立方厘米的體積大致相當(dāng)于1克?；谀[瘤塊的重量的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可以在約10-500微克/克的腫瘤塊的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，腫癌塊可以是至少約10微克/克的腫瘤塊，至少約60微克/克的腫瘤塊或至少約100微克/克的腫瘤塊。
分離的miR基因產(chǎn)物的有效量還可基于被治療的受試者的近似或估計(jì)的體重。優(yōu)選，如本文所描述的，通過(guò)胃腸外或腸內(nèi)給藥施用該有效量。例如，對(duì)受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可在約5至3000微克/kg的體重，約700至1000微克/kg的體重的范圍內(nèi)變動(dòng)，或大于約1000微克/kg的體重。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也可容易地確定對(duì)給定的受試者施用分離的miR基因產(chǎn)物的合適的給藥方案。例如，可對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物一次(例如，作為單次注射或沉積(deposition))?；蛘撸擅刻鞂?duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物1次或2次，持續(xù)約3至約28天，更特別地約7至約10天的時(shí)期。在特定的給藥方案中，每天1次施用miR基因產(chǎn)物，進(jìn)行7天。當(dāng)給藥方案包括多次施用時(shí)，要理解對(duì)受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量可包括在整個(gè)給藥方案中施用的基因產(chǎn)物的總量。
如本文所用的，“分離的”miR基因產(chǎn)物是合成的或通過(guò)人干預(yù)從天然狀態(tài)改變的或取出的產(chǎn)物。例如，合成的miR基因產(chǎn)物或部分地或完全地與其天然狀態(tài)的共存材料分離的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”。分離的miR基因產(chǎn)物可以基本上純化的形式存在，或可存在于已遞送了該miR基因產(chǎn)物的細(xì)胞中。因此，有意遞送至細(xì)胞或有意在細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”miR基因產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi)從miR前體分子產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物也被認(rèn)為是“分離的”分子。根據(jù)本發(fā)明，本文所述的分離的miR基因產(chǎn)物可以用于生產(chǎn)治療受試者(例如，人)的胰腺癌的藥物。
可使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得分離的miR基因產(chǎn)物。例如，可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法化學(xué)合成或重組產(chǎn)生miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀，化學(xué)合成miR基因產(chǎn)物。合成的RNA分子或合成試劑的商業(yè)提供商包括例如Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，U.S.A.)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，U.S.A.)、Glen Research(Sterling，VA，U.S.A.)、ChemGenes(Ashland，MA，U.S.A.)和Cruachem(Glasgow，UK)。
或者，可使用任何合適的啟動(dòng)子從重組環(huán)狀或線性DNA質(zhì)粒表達(dá)miR基因產(chǎn)物。用于從質(zhì)粒表達(dá)RNA的合適的啟動(dòng)子包括例如U6或H1RNA pol III啟動(dòng)子序列或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。其它合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可包含用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動(dòng)子。
可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物。也可將從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物遞送至和直接在癌細(xì)胞中表達(dá)。下面更詳細(xì)地討論重組質(zhì)粒用于將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途。
可從分開(kāi)的重組質(zhì)粒表達(dá)miR基因產(chǎn)物，或可從相同的重組質(zhì)粒表達(dá)它們。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物從單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)為RNA前體分子，然后前體分子通過(guò)合適的加工系統(tǒng)(包括但不限于存在于癌細(xì)胞內(nèi)的加工系統(tǒng))加工成功能性miR基因產(chǎn)物。其它合適的加工系統(tǒng)包括，例如，體外果蠅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)(lysate system)(例如，如屬于Tuschl等人的美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)?zhí)?002/0086356中描述的，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文)和大腸桿菌RNA酶III系統(tǒng)(例如，如屬于Yang等人的美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)?zhí)?004/0014113中描述的，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文)。
適合用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇，用于將核酸序列插入質(zhì)粒以表達(dá)基因產(chǎn)物的方法和將重組質(zhì)粒遞送入目的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。參見(jiàn)，例如，Zeng等人(2002)，Molecular Cell 9:1327-1333；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20:446-448；Brummelkamp等人(2002)，Science 296:550-553；Miyagishi等人(2002)，Nat.Biotechnol.20:497-500；Paddison等人(2002)，Genes Dev.16:948-958；Lee等人(2002)，Nat.Biotechnol.20:500-505；和Paul等人(2002)，Nat.Biotechnol.20:505-508，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。
在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒包含在CMV即早期啟動(dòng)子控制之下的編碼miR前體RNA的序列。如本文所用的，“在啟動(dòng)子控制之下”意指編碼miR基因產(chǎn)物的核酸序列位于啟動(dòng)子的3’，這樣啟動(dòng)子可起始編碼miR基因產(chǎn)物的序列的轉(zhuǎn)錄。
也可從重組病毒載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物?？蓮膬蓚€(gè)分開(kāi)的重組病毒載體或從相同的病毒載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組病毒載體表達(dá)的RNA，或可在癌細(xì)胞中直接表達(dá)它。下面更詳細(xì)地描述重組病毒載體將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途。
本發(fā)明的重組病毒載體包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列和用于表達(dá)RNA序列的任何合適的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括、但不限于例如U6或H1 RNA pol III啟動(dòng)子序列或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。其它合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。本發(fā)明的重組病毒載體還可包含用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動(dòng)子。
可使用能夠接受miR基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；例如來(lái)源于腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒(LV)、桿狀病毒、鼠白血病病毒)、皰疹病毒等的載體。適當(dāng)時(shí)，可通過(guò)用包膜蛋白和來(lái)自其它病毒的其它表面蛋白假型化載體或通過(guò)置換不同的病毒衣殼蛋白來(lái)改變病毒載體的向性。
例如，可用來(lái)自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病毒病毒、埃博拉病毒、莫科拉病等的表面蛋白假型化本發(fā)明的慢病毒載體。通過(guò)對(duì)載體進(jìn)行基因工程改造以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的AAV載體，從而使其靶向不同的細(xì)胞。例如，在血清2型基因組上表達(dá)血清2型衣殼的AAV載體稱為AAV 2/2?？捎醚?型衣殼蛋白基因取代AAV2/2載體中的該血清2型衣殼蛋白基因以產(chǎn)生AAV 2/5載體。用于構(gòu)建表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)；參見(jiàn)，例如，Rabinowitz，J.E.，等人(2002)，J.Virol.76:791-801，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。
適合用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇、用于將表達(dá)RNA的核酸序列插入載體的方法、將病毒載體遞送至目的細(xì)胞的方法以及表達(dá)的RNA產(chǎn)物的回收在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。參見(jiàn)，例如，Dornburg(1995)，Gene Therap.2:301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques 6:608-614；Miller(1990)，Hum.Gene Therap.1:5-14；和Anderson(1998)，Nature 392:25-30，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。
特別合適的病毒載體是來(lái)源于AV和AAV的載體。用于表達(dá)本發(fā)明的miR基因產(chǎn)物的合適的AV載體、用于構(gòu)建重組AV載體的方法以及將載體遞送入靶細(xì)胞的方法描述于Xia等人(2002)，Nat.Biotech.20:1006-1010中，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的合適的AAV載體、用于構(gòu)建重組AAV載體的方法以及將載體遞送入靶細(xì)胞的方法描述于Samulski等人(1987)，J.Virol.61:3096-3101；Fisher等人(1996)，J.Virol.，70:520-532；Samulski等人(1989)，J.Virol.63:3822-3826；美國(guó)專利號(hào)5,252,479；美國(guó)專利號(hào)5,139,941；國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 94/13788；和國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 93/24641，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，從包含CMV立即早期啟動(dòng)子的單個(gè)重組AAV載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物。
在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組AAV病毒載體包含在人U6RNA的控制下、與polyT終止序列可操作連接的編碼miR前體RNA的核酸序列。如本文所用的，“與polyT終止序列可操作連接”是指編碼有義或反義鏈的核酸序列以5’方向與polyT終止信號(hào)直接相鄰。在從載體轉(zhuǎn)錄miR序列的過(guò)程中，polyT終止信號(hào)起著終止轉(zhuǎn)錄的作用。
在本發(fā)明的治療方法的其它實(shí)施方案中，可對(duì)受試者施用有效量的至少一種抑制miR表達(dá)的化合物。如本文所用的，“抑制miR表達(dá)”是指在治療后miR基因產(chǎn)物的前體和/或活性、成熟形式的產(chǎn)量比治療前產(chǎn)生的量低。通過(guò)使用例如本文討論的測(cè)定miR轉(zhuǎn)錄物水平的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定miR表達(dá)在癌細(xì)胞中是否已被抑制。抑制可在基因表達(dá)的水平上發(fā)生(即，通過(guò)抑制編碼miR基因產(chǎn)物的miR基因的轉(zhuǎn)錄)或在加工水平上發(fā)生(例如，通過(guò)抑制miR前體加工成成熟的、活性miR)。
如本文所用的，抑制miR表達(dá)的化合物的“有效量”是足以在患癌癥(例如，胰腺癌)的受試者中抑制癌細(xì)胞的增殖的量。通過(guò)考慮諸如受試者的身材大小和體重、疾病侵入的程度、受試者的年齡、健康和性別、給藥途徑和給藥是局部的還是全身性的等因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定抑制miR表達(dá)的化合物的有效量。
例如，抑制表達(dá)的化合物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的近似重量，如本文所述。抑制miR表達(dá)的化合物的有效量也可基于待治療的受試者的近似或估計(jì)重量，如本文所述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也可容易地確定對(duì)給定的受試者施用抑制miR表達(dá)的化合物的合適的給藥方案，如本文所述。用于抑制miR基因表達(dá)的合適的化合物包括雙鏈RNA(例如短的或小的干擾RNA或“siRNA”)、反義核酸和酶RNA分子例如核酶。此類化合物中的各化合物可靶向給定的miR基因產(chǎn)物和干擾靶miR基因產(chǎn)物的表達(dá)(例如，通過(guò)抑制翻譯，通過(guò)誘導(dǎo)切割和/或降解)。
例如，通過(guò)用與miR基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90％、例如至少95％、至少98％、至少99％、或100％序列同源性的分離的雙鏈RNA(＂dsRNA＂)分子誘導(dǎo)對(duì)miR基因的RNA干擾，可以抑制給定miR基因的表達(dá)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，dsRNA分子是＂短的或小的干擾RNA＂或＂siRNA＂。
用于本方法的siRNA包含長(zhǎng)度為約17個(gè)核苷酸至約29個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度為約19至約25個(gè)核苷酸的短的雙鏈RNA。siRNA包含根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基配對(duì)相互作用(以下稱“堿基配對(duì)”)退火在一起的有義RNA鏈和互補(bǔ)反義RNA鏈。有義鏈包含基本上與靶miR基因產(chǎn)物內(nèi)包含的核酸序列一致的核酸序列。
如本文所用的，siRNA中與靶mRNA中包含的靶序列“基本上一致”的核酸序列是與靶序列一致或與靶序列相異1個(gè)或2個(gè)核苷酸的核酸序列。siRNA的有義和反義鏈可包含兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈RNA分子，或可包含其中兩個(gè)互補(bǔ)部分是堿基配對(duì)的并且通過(guò)單鏈“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”區(qū)域共價(jià)連接的單鏈分子。
siRNA可以是與天然存在的RNA不同在于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、置換和/或改變的改變的RNA。此類改變可包括非核苷酸材料的添加，例如添加至siRNA的末端或添加至siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸，或使siRNA對(duì)核酸酶降解具有抗性的修飾或用脫氧核糖核苷酸對(duì)siRNA中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。
siRNA的一條或兩條鏈還可包含3′突出端。如本文所用的，“3′突出端”是指從雙鏈RNA鏈的3′末端延伸的至少一個(gè)未配對(duì)的核苷酸。因此，在某些實(shí)施方案中，siRNA包含長(zhǎng)度為1個(gè)至約6個(gè)核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)、長(zhǎng)度為1至約5個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為1至約4個(gè)核苷酸或長(zhǎng)度為約2至約4個(gè)核苷酸的至少一個(gè)3′突出端。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，3′突出端存在于siRNA的兩條鏈上，且長(zhǎng)度為2個(gè)核苷酸。例如，siRNA的各鏈包含二胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dithymidylic acid)(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3′突出端。
可通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)的方法產(chǎn)生siRNA，或如上面關(guān)于分離的miR基因產(chǎn)物所描述的，可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)。用于產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于屬于Gewirtz的美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)?zhí)?002/0173478和屬于Reich等人的美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)?zhí)?004/0018176，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。
還可通過(guò)反義核酸來(lái)抑制給定的miR基因的表達(dá)。如本文所用的，“反義核酸”是指通過(guò)RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用結(jié)合至靶RNA的核酸分子，其可改變靶RNA的活性。適合用于本發(fā)明的方法的反義核酸是通常包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的單鏈核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合體、肽核酸(PNA))。反義核酸可包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100％互補(bǔ)、75-100％互補(bǔ)或95-100％互補(bǔ)的核酸序列。表1a和表1b中提供了特定人miR基因產(chǎn)物的核酸序列。不希望受限于任何理論，認(rèn)為反義核酸激活RNA酶H或降解miR基因產(chǎn)物/反義核酸雙鏈體的另一種細(xì)胞核酸酶。
反義核酸還可包含對(duì)核酸主鏈的修飾或?qū)μ呛蛪A基部分(或其等同物)的修飾，以增強(qiáng)靶物特異性、對(duì)核酸酶的抗性、與分子的功效相關(guān)的遞送或其它性質(zhì)。此類修飾包括膽固醇部分、雙鏈體插入劑(例如吖啶)或一種或多種抗核酸酶基團(tuán)。
可通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法產(chǎn)生反義核酸，或如上面關(guān)于分離的miR基因產(chǎn)物所描述的，可從重組質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)。用于產(chǎn)生和檢測(cè)的示例性方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)；參見(jiàn)，例如，Stein和Cheng(1993)，Science 261:1004和Woolf等人的美國(guó)專利號(hào)5,849,902，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。
還可用酶核酸抑制給定的miR基因的表達(dá)。如本文所用的，“酶核酸”是指包含具有與miR基因產(chǎn)物的連續(xù)核酸序列的互補(bǔ)性的底物結(jié)合區(qū)的核酸，其能夠特異性切割miR基因產(chǎn)物。酶核酸底物結(jié)合區(qū)可以與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列例如50-100％互補(bǔ)、75-100％互補(bǔ)或95-100％互補(bǔ)。酶核酸還可包含在堿基、糖和/或磷酸基團(tuán)上的修飾。用于本發(fā)明的方法的示例性酶核酸是核酶。
酶核酸可通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法產(chǎn)生，或如上面關(guān)于分離的miR基因產(chǎn)物所描述的，可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)。用于產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck(1995)，Nucleic Acids Res.23:2092-96；Hammann等人(1999)，Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev.9:25-31；和屬于Cech等人的美國(guó)專利號(hào)4,987,071，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。
至少一種miR基因產(chǎn)物或至少一種抑制miR表達(dá)的化合物的施用，將抑制患有癌癥(例如，胰腺癌)的受試者中的癌細(xì)胞的增殖。如本文所用的，“抑制癌細(xì)胞的增殖”是指殺死細(xì)胞或永久性地或臨時(shí)性地阻止或減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果在施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物后，受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目保持恒定或減少，那么可推斷此類細(xì)胞的增殖被抑制。如果癌細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目增加但腫瘤生長(zhǎng)速率減小也可推斷癌細(xì)胞的增殖被抑制。
可通過(guò)直接測(cè)量或通過(guò)從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤塊的大小估計(jì)來(lái)確定受試者體內(nèi)的癌細(xì)胞的數(shù)目。例如，可通過(guò)免疫組織學(xué)方法、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)或設(shè)計(jì)用于檢測(cè)癌細(xì)胞的特征性表面標(biāo)記的其它技術(shù)測(cè)量受試者中的癌細(xì)胞數(shù)目。
可通過(guò)直接目視觀察或通過(guò)診斷性影像學(xué)方法例如X射線、磁共振顯像、超聲和閃爍照相術(shù)確定腫瘤塊的大小。如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，可以用或不用造影劑，使用用于確定腫瘤塊的大小的診斷性影像法。還可使用物理方法例如組織塊的觸診或使用測(cè)量?jī)x器例如測(cè)徑器測(cè)量組織塊來(lái)確定腫瘤塊的大小。
可通過(guò)適合將這些化合物遞送至受試者的癌細(xì)胞的任何方法對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物。例如，可通過(guò)適合于用這些化合物或用包含編碼這些化合物的序列的核酸轉(zhuǎn)染受試者的細(xì)胞的方法來(lái)施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR表達(dá)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法在本領(lǐng)域內(nèi)熟知，包括例如核酸至細(xì)胞的細(xì)胞核或前核的直接注射、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移或通過(guò)親脂材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo)的核酸遞送、bioballistic或粒子加速；磷酸鈣沉淀和通過(guò)病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
例如，可用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移化合物DOTAP(甲基硫酸N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基-銨，Boehringer-Mannheim)或等同物例如LIPOFECTIN轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用的核酸的量對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐不是至關(guān)重要的；可用0.1-100微克的核酸/105個(gè)細(xì)胞獲得可接受的結(jié)果。例如，可使用每105個(gè)細(xì)胞約0.5微克質(zhì)粒于3微克DOTAP中的比率。
還可通過(guò)任何合適的腸內(nèi)或胃腸外給藥途徑對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物。用于本方法的合適的腸內(nèi)給藥途徑包括例如口服、直腸或鼻內(nèi)遞送。合適的胃腸外給藥途徑包括例如血管內(nèi)給藥(例如，至脈管系統(tǒng)的靜脈內(nèi)快速注射、靜脈輸注、動(dòng)脈內(nèi)快速濃注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和導(dǎo)管滴注)；組織外周和組織內(nèi)注射(例如，瘤周和瘤內(nèi)注射、視網(wǎng)膜內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如通過(guò)滲透泵)；對(duì)目的組織的直接施用，例如通過(guò)導(dǎo)管或其它安置裝置(例如，視網(wǎng)膜彈丸劑或栓劑或包含多孔、無(wú)孔或凝膠狀材料的植入體)；以及吸入。特別適合的給藥途徑是注射、輸注和直接至腫瘤的注射。
在本方法中，可將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物作為裸RNA與遞送試劑一起或作為核酸(例如，重組質(zhì)?；虿《据d體)給受試者施用，所述核酸包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列。合適的遞送試劑包括例如Mirus Transit TKO親脂試劑、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚陽(yáng)離子(例如，多聚賴氨酸)和脂質(zhì)體。
包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的重組質(zhì)粒和病毒載體以及用于遞送此類質(zhì)粒和載體至癌細(xì)胞的技術(shù)在本文討論，和/或是本領(lǐng)域眾所周知的。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體用于將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至受試者。脂質(zhì)體也可以增加基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期?？蓮臉?biāo)準(zhǔn)的形成小囊泡的脂質(zhì)(其通常包括中性或帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇)形成用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體。通常通過(guò)考慮諸如想要的脂質(zhì)體大小和血流中脂質(zhì)體的半衰期等因素，指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。用于制備脂質(zhì)體的許多方法是已知的，例如，如在Szoka等人(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美國(guó)專利號(hào)4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文)中描述。
用于本方法的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向癌細(xì)胞的配體分子。結(jié)合癌細(xì)胞中普遍存在的受體的配體例如結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。
還可對(duì)用于本方法的脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(“MMS”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(“RES”)清除。此類經(jīng)修飾的脂質(zhì)體具有存在于表面上或整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中的調(diào)理作用抑制部分。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可包含調(diào)理作用抑制部分和配體兩者。
用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分通常是結(jié)合至脂質(zhì)體膜的大的親水聚合物。如本文所用的，當(dāng)其例如通過(guò)脂溶性錨嵌入膜本身中或通過(guò)與膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)直接結(jié)合而被化學(xué)地或物理地附著至膜時(shí)，調(diào)理作用抑制部分“結(jié)合”至脂質(zhì)體膜。這些調(diào)理作用抑制性親水聚合物形成了顯著減少脂質(zhì)體被MMS和RES攝取的保護(hù)表面層；例如，如美國(guó)專利號(hào)4,920,016中所描述的，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。
適合用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選是具有約500至約40,000道爾頓和優(yōu)選約2,000至約20,000道爾頓的數(shù)量平均分子量的水溶性聚合物。此類聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)或它們的衍生物；例如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯酮；線性的、分支的或樹(shù)狀聚酰胺-胺(polyamidoamines)；聚丙烯酸；多元醇，例如羧基或氨基化學(xué)連接至其的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合適的。此外，調(diào)理作用抑制性聚合物可以是PEG與多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。調(diào)理作用抑制性聚合物也可以是包含氨基酸或羧酸例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、海藻酸、角叉菜膠的天然多糖；氨化多糖或寡糖(線性或分支的)；或羧化多糖或低聚糖，例如與碳酸的衍生物反應(yīng)，獲得羧基的連接。優(yōu)選，調(diào)理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)稱為“PEG化脂質(zhì)體”。
可通過(guò)許多熟知的技術(shù)中的任一種將調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜結(jié)合。例如，可將PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯結(jié)合至磷脂酰乙醇胺脂溶性錨，然后再將其結(jié)合至膜。類似地，可使用Na(CN)BH3和溶劑混合物(例如以30:12比例的四氫呋喃和水)在60℃下通過(guò)還原氨化作用用硬脂酰胺脂溶性錨衍生葡聚糖聚合物。
用調(diào)理作用抑制部分修飾的脂質(zhì)體在循環(huán)中比未修飾的脂質(zhì)體保持長(zhǎng)得多的時(shí)間。因此，這樣的脂質(zhì)體有時(shí)稱為“秘密(stealth)”脂質(zhì)體。已知秘密脂質(zhì)體在由多孔的或“滲漏的”微血管滋養(yǎng)的組織中積累。因此，特征在于該微血管缺陷的組織例如實(shí)體瘤將有效率地積累這些脂質(zhì)體；參見(jiàn)Gabizon，等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，18:6949-53。此外，減少的由RES進(jìn)行的吸收通過(guò)防止脂質(zhì)體在肝和脾中大量積累而降低了秘密脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制部分修飾的脂質(zhì)體特別適合將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至腫瘤細(xì)胞。
按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)，在給受試者施用之前，可將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物配制為藥物組合物，有時(shí)稱為“藥物”。因此，本發(fā)明包括用于治療胰腺癌的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于這樣的miR基因產(chǎn)物，即相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞，該miR基因產(chǎn)物在胰腺癌細(xì)胞中具有減少的表達(dá)水平(即，減量調(diào)節(jié))。在某些實(shí)施方案中，所述分離的miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-210或miR-212。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-21，miR-143，miR-205或miR-9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-214，miR-218-2，miR-145，miR-106a，miR-192，miR-203，miR-150，miR-220，miR-212或miR-9。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種抑制miR表達(dá)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)大于對(duì)照細(xì)胞(即，增量調(diào)節(jié))的miR基因產(chǎn)物是特異性的。在某些實(shí)施方案中，所述抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)一種或多種選自下述的miR基因產(chǎn)物是特異性的:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的miR基因產(chǎn)物對(duì)miR-15a或miR-16-1不是特異性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物對(duì)miR-210或miR-212不是特異性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物對(duì)miR-21，miR-143，miR-205或miR-9不是特異性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物對(duì)miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-214，miR-218-2，miR-145，miR-106a，miR-192，miR-203，miR-150，miR-220，miR-212或miR-9不是特異性的。
本發(fā)明的藥物組合物的特征在于是至少無(wú)菌的和無(wú)熱原的。如本文所用的，“藥物組合物”包括用于人和獸醫(yī)用途的制劑。用于制備本發(fā)明的藥物組合物的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，例如，如Remington′s Pharmaceutical Science，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.(1985)中所描述的，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考引用并入本文。
本發(fā)明的藥物組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體相混合的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)(例如，0.1-90％重量)或其生理上可接受的鹽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物另外包含一種或多種抗癌劑(例如，化療劑)。本發(fā)明的藥物制劑也可以包含由脂質(zhì)體包封的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)，和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含不是miR-15，miR-16，miR-143和/或miR-145的miR基因或基因產(chǎn)物。
特別合適的藥學(xué)上可接受的載體是水、緩沖水溶液、生理鹽水、0.4％的鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含對(duì)核酸酶的降解具有抗性的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地合成對(duì)核酸酶具有抗性的核酸，例如通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)在2’位置被修飾的核糖核苷酸摻入miR基因產(chǎn)物。合適的2’-修飾的核糖核苷酸包括在2’位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修飾的核糖核苷酸。
本發(fā)明的藥物組合物還可包含常規(guī)藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑(osmolalityadjusting agent)、緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括例如生理生物相容性緩沖劑(例如，鹽酸氨丁三醇(tromethaminehydrochloride))、螯合劑(例如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合物(例如，DTPA鈣、CaNaDTPA-雙酰胺)的加入，或任意地，鈣或鈉鹽(例如，氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的加入。可包裝本發(fā)明的藥物組合物以使以液體形式使用或可將其凍干。
對(duì)于本發(fā)明的固體藥物組合物，可使用常規(guī)的無(wú)毒性固體藥學(xué)上可接受的載體例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。
例如，用于口服給藥的固體藥物組合物可包含上列的任何載體和賦形劑和10-95％，優(yōu)選25％-75％的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)。用于氣霧劑(吸入)給藥的藥物組合物可包含封裝在上述脂質(zhì)體中的按重量計(jì)算0.01-20％、優(yōu)選按重量計(jì)算1％-10％的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)和噴射劑。當(dāng)需要時(shí)也可包含載體；例如用于鼻內(nèi)給藥的卵磷脂。
本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種抗癌劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，組合物包含至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)和至少一種化療劑。適用于本發(fā)明的方法的化療劑，包括、但不限于，DNA-烷化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn)定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，HMG-CoA抑制劑，CDK抑制劑，細(xì)胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三鏈螺旋DNA，核酸適體，和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。適用于本發(fā)明的組合物的試劑的實(shí)例包括、但不限于，阿糖胞苷，甲氨蝶呤，長(zhǎng)春新堿，依托泊苷(VP-16)，多柔比星(阿霉素)，順鉑(CDDP)，地塞米松，arglabin，環(huán)磷酰胺，沙可來(lái)新，甲基亞硝基脲，氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶(5FU)，長(zhǎng)春堿，喜樹(shù)堿，放線菌素-D，絲裂霉素C，過(guò)氧化氫，奧沙利鉑，伊立替康，托泊替康，亞葉酸，卡莫司汀，鏈佐星，CPT-11，泰素，他莫昔芬，達(dá)卡巴嗪，利妥昔單抗，柔紅霉素，1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶，伊馬替尼，氟達(dá)拉濱，多西他賽和FOLFOX4。
本發(fā)明也包括鑒定抗胰腺癌劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，并測(cè)量細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括，給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，并測(cè)量與胰腺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。相對(duì)于合適的對(duì)照(例如，對(duì)照細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平)，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的增加指示著測(cè)試試劑是抗胰腺癌劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種與胰腺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平相關(guān)的miR基因產(chǎn)物選自miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是下述的一種或多種:let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
在其它實(shí)施方案中，該方法包括，給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，并測(cè)量與胰腺癌細(xì)胞中增強(qiáng)的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于合適的對(duì)照(例如，對(duì)照細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平)，所述細(xì)胞中與胰腺癌中增強(qiáng)的表達(dá)水平有關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平的降低指示著測(cè)試試劑是抗胰腺癌劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種與胰腺癌細(xì)胞中增強(qiáng)的表達(dá)水平有關(guān)的miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是下述的一種或多種:let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
合適的試劑包括但不限于藥物(例如，小分子、肽)，和生物大分子(例如，蛋白質(zhì)、核酸)?？赏ㄟ^(guò)重組、合成方法產(chǎn)生該試劑，或其可從天然來(lái)源分離(即，純化)。用于對(duì)細(xì)胞提供此類試劑的各種方法(例如，轉(zhuǎn)染)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，上文中描述了幾種這樣的方法。用于檢測(cè)至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法(例如，RNA印跡法、原位雜交法、RT-PCR、表達(dá)譜分析)在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。上文中也描述了這些方法中的幾種方法。
現(xiàn)在通過(guò)下列非限制性實(shí)施例解釋本發(fā)明。
實(shí)施例 材料和方法 患者數(shù)據(jù)，腫瘤細(xì)胞富集和RNA提取。
在表2中報(bào)道了從意大利Verona大學(xué)病理系的冷凍組織庫(kù)得到的40個(gè)PET和4個(gè)PACC的臨床病理學(xué)特征。所有腫瘤都是散發(fā)的，這通過(guò)患者的直接面談得到的個(gè)人和家族史來(lái)評(píng)判。通過(guò)組織病理學(xué)和細(xì)胞標(biāo)記分析來(lái)診斷PET，并根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)分類(Kloppel，G.等人，＂The Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Cell System and ItsTumors:The WHO Classification.＂Ann.N.Y.Acad.Set1014:13-27(2004))。它們包括28個(gè)無(wú)功能的和12個(gè)有功能的腫瘤。28個(gè)NF-PET包括11個(gè)分化良好的內(nèi)分泌腫瘤(WDET)和18個(gè)分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)。12個(gè)F-PET是胰島素瘤，其包括11個(gè)WDET和1個(gè)WDEC。根據(jù)考慮腫瘤大小、Ki-67增殖指數(shù)和血管侵入的WHO標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為WDET具有良性的或不確定的生物學(xué)行為(表2)。通過(guò)腫瘤細(xì)胞中脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶的免疫組織化學(xué)表達(dá)，證實(shí)了PACC的診斷。作為對(duì)照，在12個(gè)相對(duì)應(yīng)的患者標(biāo)本中采取正常的胰腺。
在所有情況下，通過(guò)顯微解剖或恒冷箱富集，得到超過(guò)90％的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)從至少10個(gè)20-30μm厚的冷凍切片提取總RNA，每5個(gè)切片檢查樣品的細(xì)胞組成。在每種情況下，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)證實(shí)總RNA的完整性。
表2.胰腺內(nèi)分泌和腺泡腫瘤的臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)。


a病例用前面有F或NF(它們分別是功能性的或無(wú)功能的內(nèi)分泌腫瘤)的隨機(jī)分配的數(shù)字標(biāo)示。
bWDEC，分化良好的內(nèi)分泌癌；WDET-b，分化良好的具有良性行為的內(nèi)分泌腫瘤；WDET-u，分化良好的具有不確定生物學(xué)行為的內(nèi)分泌腫瘤。
c侵入胰周脂肪和/或鄰近器官(例如十二指腸，膽總管，脾)。
dIHC，免疫組織化學(xué)；pos，陽(yáng)性；pos-w，弱信號(hào)的陽(yáng)性；neg，陰性。
e通過(guò)Ki67免疫組織化學(xué)測(cè)量的增殖指數(shù)。
fLN，淋巴結(jié)。
gn.a.，未得到。
微小RNA微陣列雜交和定量。
如前所述(Liu，C.G.等人，＂An Oligonucleotide Microchip forGenome-Wide microRNA Profiling in human and Mouse Tissues.＂Proa Natl.Acad.Sci.USA 707:9740-44(2004))，在微小RNA微陣列芯片上進(jìn)行微小RNA標(biāo)記和雜交。簡(jiǎn)而言之，使用生物素末端標(biāo)記的隨機(jī)八聚體，逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自每個(gè)樣品的5μg總RNA。在我們定制的微小RNA微陣列芯片(OSU-CCC 2.0版)上進(jìn)行雜交，該芯片含有含注解的活性部位的一式四份安置的460個(gè)成熟微小RNA(235個(gè)人類的，222個(gè)小鼠的，和3個(gè)擬南芥的)的探針。經(jīng)常，對(duì)給定的成熟的微小RNA存在超過(guò)1個(gè)探針組。另外，存在用于檢測(cè)微小RNA前體的與大多數(shù)前-微小RNA相對(duì)應(yīng)的一式四份探針。微陣列也包括對(duì)幾種剪接snRNA包括U6的探針。用鏈霉抗生物素-Alexa647綴合物檢測(cè)雜交信號(hào)，并使用Axon 4000B掃描。使用Genepix 6.0軟件(AxonInstruments(現(xiàn)為Molecular Devices Corp.)，Sunnyvale，CA)，定量掃描圖像。
微小RNA微陣列數(shù)據(jù)的計(jì)算分析 使用R軟件v.2.0.1-和Bioconductor v.1.6包(Gentleman，R.C.等人，＂Bioconductor:Open Software Development forComputational Biology and Bioinformatics.＂Genome Biol.5:R80(2004))，建立大多數(shù)分析和圖像。按照順序，從56個(gè)微小RNA微陣列的數(shù)據(jù)集合去除空白和探針對(duì)照點(diǎn)，然后從中值信號(hào)減去局部背景。接著，使用通過(guò)vsn包中的柵格在每個(gè)陣列中分層的方差-穩(wěn)定化轉(zhuǎn)化，標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。隨后，使用genefilter包來(lái)去除其強(qiáng)度小于所有陣列中第99百分位數(shù)的空白點(diǎn)的所有點(diǎn)。與空白/陰性對(duì)照探針的相對(duì)雜交和隨后的RNA分析表明，小于4.5的log-轉(zhuǎn)化的信號(hào)的絕對(duì)值是不可靠的。
使用samr包，通過(guò)直接的2級(jí)非配對(duì)比較，進(jìn)一步分析得到的數(shù)據(jù)。應(yīng)用在它們的標(biāo)題中特別報(bào)道的輸入標(biāo)準(zhǔn)(基于倍數(shù)變化和δ值)，得到差異表達(dá)的微小RNA的表。為了增加嚴(yán)格性，進(jìn)一步過(guò)濾微小RNA探針，保留具有至少3個(gè)顯著復(fù)本的微小RNA探針。
使用應(yīng)用Tukey的中值拋光算法得到的重復(fù)點(diǎn)的累計(jì)值，進(jìn)行分級(jí)聚類分析。使用具有最高四分位數(shù)間距的前200個(gè)探針進(jìn)行分析，所述探針含有成熟的微小RNA序列。用于聚類樣品和基因的距離度量分別是皮爾森關(guān)聯(lián)和歐幾里德距離法。群聚方法是完全-關(guān)聯(lián)。使用Maple Tree(0.2.3.2版)(www.mapletree.sourceforge.net)，顯現(xiàn)輸出。使用MIAMExpress，將所有數(shù)據(jù)呈遞給Array Express數(shù)據(jù)庫(kù)。
通過(guò)皮爾森關(guān)聯(lián)，測(cè)量微小RNA之間協(xié)同表達(dá)的水平，當(dāng)它們的距離低于50kb時(shí)，將微小RNA基因分配到同一簇(Baskerville，S.和D.P.Bartel，“Microarray Profiling of microRNAs RevealsFrequent Coexpression with Neighboring miRNAs and Host Genes.”RNA 11:241-47(2005))。接著，使用Mann-Whitney非參量檢驗(yàn)法，將屬于同一簇的微小RNA之間測(cè)量的關(guān)聯(lián)值集合與簇中每個(gè)微小RNA相對(duì)于該簇以外的所有其它微小RNA之間測(cè)量的關(guān)聯(lián)值集合相對(duì)比。
RNA印跡。
將5μg總RNA在15％Criterion預(yù)制PAGE/尿素凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA)上電泳，轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上，并在ULTRAhybTM-Oligo雜交緩沖液(Ambion，Austin，TX)中在37℃與32P末端標(biāo)記的DNA探針雜交過(guò)夜。在37℃用2X SSC/0.5％ SDS洗滌膜2次，每次30分鐘。DNA探針是相對(duì)于成熟微小RNA的反義寡核苷酸，相對(duì)于5S RNA的用作對(duì)照。使用Typhoon9410磷光計(jì)(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)分析濾膜，使用ImageQuant TL(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)定量。通過(guò)在0.1％ SDS水溶液中煮沸5分鐘，剝離印跡，并重新探測(cè)幾分鐘。
結(jié)果 使用定制的微陣列，測(cè)定12個(gè)正常胰腺樣品和44個(gè)胰腺腫瘤(包括40個(gè)PET和4個(gè)PACC)的微小RNA表達(dá)譜。經(jīng)證實(shí)該平臺(tái)會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)健的結(jié)果，如通過(guò)幾個(gè)以前的研究所驗(yàn)證的(Liu，C.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9740-44(2004)；Calin，G.等人，New Eng1.J.Med.353(17):1793-1801(2005)；Iorio，M.V.等人，Cancer Res.65:7065-70(2005))。在基因組簇中物理連鎖的微小RNA共表達(dá)的發(fā)現(xiàn)提供了進(jìn)一步的支持，這證實(shí)了分組的微小RNA基因表現(xiàn)出協(xié)同表達(dá)(Baskerville，S.，和D.P.Bartel，RNA 77:241-47(2005)；Altuvia，Y.等人，Nucleic Acids Res.33:2697-2706(2005))。
使用200個(gè)最可變的微小RNA的分級(jí)聚類的非監(jiān)督分析，證實(shí)了共同的微小RNA表達(dá)模式，其可以將胰腺內(nèi)分泌和腺泡腫瘤與正常胰腺區(qū)分開(kāi)(圖1A-1E)。值得注意地，PACC落入作為包括所有PET的更寬簇的一部分的獨(dú)特簇中，而胰島素瘤和NF-PET之間沒(méi)有特征譜。
類對(duì)比分析證實(shí)了PACC或PET和正常組織之間幾種微小RNA的差異表達(dá)，而更小數(shù)目的微小RNA在PET和PACC之間差異表達(dá)，以及在PET的WDEC亞組和PACC之間差異表達(dá)。更具體地，PET表現(xiàn)出相對(duì)于正常胰腺87個(gè)增量調(diào)節(jié)的和8個(gè)減量調(diào)節(jié)的微小RNA(表3)，而PACC具有30個(gè)增量調(diào)節(jié)的和7個(gè)減量調(diào)節(jié)的微小RNA(表4)。僅10個(gè)微小RNA在PET和PACC之間差異表達(dá)(表5)，相對(duì)于PACC，4個(gè)是WDEC獨(dú)有的(表6)。














共同的微小RNA表達(dá)模式將胰腺內(nèi)分泌和腺泡腫瘤與正常胰腺區(qū)分開(kāi)。
在PET相對(duì)于正常組織中也發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)在PACC相對(duì)于正常組織中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的微小RNA。更具體地，發(fā)現(xiàn)在PACC中過(guò)表達(dá)的30個(gè)微小RNA中的28個(gè)(93％)也在PET中增量調(diào)節(jié)。類似地，7個(gè)表達(dá)不足的微小RNA中的5個(gè)(71％)在兩種腫瘤亞型中都減量調(diào)節(jié)。該重疊，以及僅有限組的微小RNA在PET和PACC之間或在PET亞型中差異表達(dá)的事實(shí)，暗示著腺泡和胰島-衍生的腫瘤共有的微小RNA表達(dá)模式。
在PET中增量調(diào)節(jié)的微小RNA(也是PACC共有的)中，通過(guò)RNA印跡分析驗(yàn)證了7個(gè)。更具體地，miR-103是正常胰腺、腺泡細(xì)胞癌和胰腺內(nèi)分泌腫瘤的所有配對(duì)比較的最佳區(qū)分鑒別因子(圖2A和2B)。miR-107的表達(dá)與它的高度同源的miR-103的表達(dá)平行，也證實(shí)了腫瘤中相對(duì)于正常而言miR-23a，miR-26b，miR-192和miR-342的顯著過(guò)表達(dá)(圖6A-6C)。
在PET中減量調(diào)節(jié)的微小RNA中，miR-155的RNA印跡分析表明了PET和PACC中都缺乏可檢測(cè)的表達(dá)(圖2A和2B)。盡管miR-155不在以上列出的在PACC中減量調(diào)節(jié)的基因(表4)中，通過(guò)微陣列也檢測(cè)到它在該腫瘤類型中的低表達(dá)，如圖2A的方框和細(xì)線圖所示。
有限組的微小RNA將胰腺內(nèi)分泌腫瘤與腺泡腫瘤區(qū)分開(kāi) PET和PACC的直接對(duì)比，顯示了僅10個(gè)增量調(diào)節(jié)的微小RNA(表5)，它們也都在PET中相對(duì)正常組織過(guò)表達(dá)。相比之下，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微小RNA在PACC中特異性地增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)。
miR-204的過(guò)表達(dá)是胰島素瘤特異性的，且與胰島素的免疫組織化學(xué)表達(dá)相關(guān)聯(lián) 胰島素瘤與NF-PET的對(duì)比，鑒別出僅3個(gè)在胰島素瘤中顯著過(guò)表達(dá)的微小RNA，包括miR-204、它的同系物miR-211和miR-203(表7)。值得注意地，如通過(guò)免疫組織化學(xué)染色所測(cè)得的，胰島素蛋白的表達(dá)與miR-204表達(dá)的關(guān)聯(lián)性比與胰島素mRNA表達(dá)的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)(圖3A-3C)。實(shí)際上，基于陰性或陽(yáng)性ICH染色的對(duì)數(shù)回歸分析表明，通過(guò)胰島素mRNA和miR-204表達(dá)兩者都預(yù)測(cè)了胰島素蛋白表達(dá)(p<0.001)；但是，在一個(gè)多變量模型中，僅miR-204表達(dá)保持統(tǒng)計(jì)顯著性(p<0.001)。
由于有人提出miR-375在小鼠胰島中特異性地表達(dá)，且起胰島素胞吐作用的負(fù)調(diào)節(jié)劑的功能(Poy，M.N.等人，Nature432:226-30(2004))，我們通過(guò)RNA印跡研究了它在正常人組織和我們的樣品中的表達(dá)。使用幾種人成年組織的集合，僅在正常胰腺中檢測(cè)到miR-375(圖7A)。在腫瘤中的miR-375的表達(dá)水平通常高于在正常胰腺中，但是顯示在胰島素瘤和無(wú)功能的腫瘤之間沒(méi)有差異(圖7B和7C)。
miR-21的表達(dá)與增殖指數(shù)和肝轉(zhuǎn)移的存在強(qiáng)烈相關(guān) 評(píng)價(jià)表達(dá)譜以鑒定基于轉(zhuǎn)移狀態(tài)或增殖指數(shù)區(qū)分PET的微小RNA，僅將miR-21鑒別為顯著的(圖4A-4C和表8)。這不是令人驚奇的，因?yàn)檫@2種腫瘤特征是相關(guān)的。實(shí)際上，所有轉(zhuǎn)移性PET都具有>2％的增殖指數(shù)，而沒(méi)有具有更低增殖評(píng)分的腫瘤是轉(zhuǎn)移性的。此外，miR-21也在具有高(Ki-67>2％)和低(Ki-67≤2％)增殖指數(shù)的NF-PET或WDEC之間區(qū)分開(kāi)。另一個(gè)令人感興趣的觀察是，相對(duì)于正常胰腺，miR-21也在PACC中過(guò)表達(dá)(表4)。
差異表達(dá)的微小RNA的推定的mRNA靶的鑒別。
使用3個(gè)不同的程序(miRanda，TargetScan，PicTar，分別從www.microrna.org/mammalian/index.html；www.genes.mit.edu/targetscan/；和www.pictar.bio.nyu.edu獲得)來(lái)鑒別選定的微小RNA的預(yù)測(cè)靶物，所述選定的微小RNA即miR-103/miR-107，miR-155，miR-204/miR-211和miR-21。為了增加分析的嚴(yán)格性，我們僅僅考慮了從所有3種算法發(fā)現(xiàn)的靶基因(表9)。因?yàn)檫€已經(jīng)用定制的EST微陣列評(píng)價(jià)了為微小RNA表達(dá)分析的相同腫瘤樣品和5個(gè)正常胰腺的基因表達(dá)譜(數(shù)據(jù)未顯示)，我們嘗試評(píng)價(jià)PET和正常組織中、以及具有不同臨床病理學(xué)特征的PET中的預(yù)測(cè)的mRNA靶的狀態(tài)。雙樣品-t-檢驗(yàn)分析鑒別了減量調(diào)節(jié)的或增量調(diào)節(jié)的幾個(gè)推定的靶基因，即對(duì)于miR-103/107為28個(gè)增量調(diào)節(jié)的和7個(gè)減量調(diào)節(jié)的基因，對(duì)于miR-155或miR-204/211為2個(gè)增量調(diào)節(jié)的和2個(gè)減量調(diào)節(jié)的基因，和對(duì)于miR-21為1個(gè)增量調(diào)節(jié)的和1個(gè)減量調(diào)節(jié)的基因(表10)。值得注意地，發(fā)現(xiàn)PDCD4基因(miR-21的一種推定靶物)的mRNA表達(dá)在肝轉(zhuǎn)移性PET3中以及在具有高增殖指數(shù)的腫瘤中減量調(diào)節(jié)，表明與miR-21表達(dá)的負(fù)相關(guān)(圖5)。
討論 正常胰腺、胰腺內(nèi)分泌腫瘤和腺泡癌中的微小RNA表達(dá)譜的觀察測(cè)量結(jié)果可總結(jié)如下: i)共同的微小RNA表達(dá)譜將內(nèi)分泌和腺泡腫瘤與正常胰腺區(qū)分開(kāi)； ii)伴隨miR-155的表達(dá)缺失的miR-103和miR-107的表達(dá)，將腫瘤與正常區(qū)分開(kāi)； iii)有限組的微小RNA是內(nèi)分泌腫瘤特異性的，且可能與內(nèi)分泌分化或腫瘤發(fā)生相關(guān)； iv)miR-204表達(dá)主要發(fā)生在胰島素瘤中，且與胰島素的免疫組織化學(xué)表達(dá)相關(guān)；和 v)miR-21的表達(dá)與增殖指數(shù)和肝轉(zhuǎn)移強(qiáng)相關(guān)。
表達(dá)譜的非監(jiān)督分級(jí)聚類表明，這2個(gè)腫瘤類型與正常胰腺區(qū)分開(kāi)。盡管PACC落入獨(dú)特簇中，這是包括所有PET的更寬簇的一部分。雖然與腺泡癌相對(duì)于正常相比，我們?cè)赑ET相對(duì)于正常中鑒別出了許多更為差異表達(dá)的微小RNA，絕大多數(shù)在PACC中差異表達(dá)的微小RNA在PET中類似地改變。值得注意的是，胰腺本體主要由腺泡形成，因此代表著腺泡細(xì)胞癌分析的理想正常對(duì)應(yīng)物，而胰島細(xì)胞代表著胰腺內(nèi)分泌腫瘤的正常對(duì)應(yīng)物。不幸地，我們沒(méi)有可得到的這些細(xì)胞的制品。但是，發(fā)現(xiàn)腺泡和胰島腫瘤之間差異表達(dá)的微小RNA的很大程度上一致的模式，包括28個(gè)增量調(diào)節(jié)的和5個(gè)減量調(diào)節(jié)的基因，暗示著這2種腫瘤類型共有的該組可能與胰腺致瘤性轉(zhuǎn)化相關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在這2種腫瘤類型中差異表達(dá)的幾種微小RNA在乳房、結(jié)腸和B-細(xì)胞白血病中差異表達(dá)，這為該斷言提供了附加的支持(Caldas，C等人，Nat.Med.11:712-14(2005)；Croce，CM.，和G.A.Calin，Cell122:6-7(2005)；Iorio，M.V.等人，Cancer Res.65:7065-70(2005))。另外，在我們的腫瘤中差異表達(dá)的微小RNA中的至少20種已經(jīng)被鑒別為在肺A549或?qū)m頸HeLa癌細(xì)胞系中具有生長(zhǎng)相關(guān)的或細(xì)胞凋亡的效應(yīng)(Cheng，A.M.等人，Nucleic Acids Res.53:1290-97(2005))。
此外，我們?cè)赑ACC和PET中觀察到miR-17、miR-20和miR-92-1的協(xié)同過(guò)表達(dá)，它們包含在多順?lè)醋哟刂小Ｒ呀?jīng)描述該miR-17-92簇作為與c-MYC基因有關(guān)的癌基因起作用(He，L.等人，Nature455:828-33(2005))。值得注意地，已經(jīng)在胰腺內(nèi)分泌腫瘤中、也在增生性胰島中報(bào)道了c-MYC的過(guò)表達(dá)，這暗示著它在胰島腫瘤發(fā)生早期中的參與(Pavelic，K.等人，Anticancer Res.76:1707-17(1996))。另外，體外或體內(nèi)模型中小鼠胰島或腺泡細(xì)胞中MYC的誘導(dǎo)，會(huì)分別產(chǎn)生內(nèi)分泌腫瘤(Katic，M.等人，Carcinogenesis 20:1521-27(1999)；Lewis，B.C.等人，Genes Dev.17:3127-38(2003))或混合的腺泡/導(dǎo)管腺癌(Sandgren，E.P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:93-97(1991))，而對(duì)MYC-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制導(dǎo)致胰島細(xì)胞癌(Pelengaris，S.等人，Cell 109:321-34(2002))。
2種高度同源的miR-103和miR-107微小RNA的表達(dá)以及miR-155的表達(dá)的缺失，是腫瘤區(qū)別于正常胰腺樣品的特征。有趣地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-103/107在幾種腫瘤類型中過(guò)表達(dá)(與主題申請(qǐng)同日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)朹_____；標(biāo)題“Micro-RNA-Based Methods andCompositions for the Diagnosis and Treatment of Solid Cancers”，Stefano Volinia，George A.Calin和Carlo M.Croce；代理人案卷號(hào)_____；其教導(dǎo)通過(guò)參考引用整體并入本文)。鑒于已經(jīng)在淋巴瘤(Caldas，C.等人，Nat.Med.11:712-14(2005)；Croce，C.M.，和G.A.Calin，Cell 122:6-7(2005))和乳腺癌(Iorio，M.V.等人，Cancer Res.65:7065-70(2005))中觀察到miR-155的過(guò)表達(dá)(該發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致miR-155可能是致癌微小RNA的推測(cè)(Croce，C.M.，和G.A.Calin，Cell 122:6-7(2005))，miR-155在正常胰腺中表達(dá)、但是在PET和PACC中表達(dá)不足或不表達(dá)的發(fā)現(xiàn)是相當(dāng)有趣的。這可能不是意料之外的，因?yàn)樵诔赡耆酥斜磉_(dá)的微小RNA是組織-特異性的(Babak，T.等人，RNA 10:1813-19(2004))，微小RNA錯(cuò)誤表達(dá)的結(jié)果高度依賴于微小RNA調(diào)節(jié)的mRNA的細(xì)胞-特異性的表達(dá)模式(Cheng，A.M.等人，Nucleic Acids Res.33:1290-97(2005))。
10種微小RNA在PET中特有地過(guò)表達(dá)，并將該腫瘤與PACC和正常胰腺區(qū)分開(kāi)。它們包括miR-99a，miR-99b，miR-100，miR-125a，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-129-2，miR-130a，miR-132，和miR-342。這些微小RNA可以是內(nèi)分泌分化或內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生所特征性的。另一方面，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微小RNA在PACC中特異性地增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)，盡管有限數(shù)目的PACC樣品可能影響分析能力。
盡管胰島素瘤和無(wú)功能的內(nèi)分泌腫瘤之間的微小RNA譜幾乎不可區(qū)分，2種密切相關(guān)的微小RNA(即miR-204和miR-211)的過(guò)表達(dá)很大程度上限于胰島素瘤。很有意思的是，miR-204表達(dá)與胰島素的免疫組織化學(xué)表達(dá)相關(guān)聯(lián)。在這方面，最近已經(jīng)報(bào)道m(xù)iR-375在小鼠胰島中特異性表達(dá)，并起胰島素胞吐作用的負(fù)調(diào)節(jié)物的功能(Poy，M.N.等人，Nature 432:226-30(2004))。我們的數(shù)據(jù)表明，該微小RNA在人正常胰腺以及腺泡細(xì)胞和內(nèi)分泌腫瘤中表達(dá)。但是，發(fā)現(xiàn)在胰島素瘤和無(wú)功能的內(nèi)分泌腫瘤之間其表達(dá)水平?jīng)]有差異。
我們還測(cè)定了微小RNA表達(dá)是否與PET的臨床特征相關(guān)聯(lián)。我們的結(jié)果表明，miR-21過(guò)表達(dá)與增強(qiáng)的Ki-67增殖指數(shù)和肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。已經(jīng)在幾種癌癥中觀察到miR-21過(guò)表達(dá)，包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌(Caldas，C.等人，Nat.Med.11:712-14(2005)；Croce，C.M.，和G.A.Calin，Cell 122:6-7(2005))。在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的擊倒(knockdown)實(shí)驗(yàn)也支持了miR-21的癌癥相關(guān)功能，表明該微小RNA具有抗細(xì)胞凋亡功能(Chan，J.A.等人，Cancer Res.65:6029-33(2005))。在這方面，發(fā)現(xiàn)推定地被miR-21靶向的程序性細(xì)胞死亡4(PDCD4)基因在轉(zhuǎn)移性和高增殖性PET樣品中顯著減量調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出與miR-21表達(dá)的負(fù)相關(guān)。已經(jīng)報(bào)道該基因通過(guò)激活p21wafl和抑制轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1來(lái)起腫瘤抑制基因的作用；所述轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1控制已經(jīng)參與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)展的基因(Jansen，A.P.等人，Mol.Cancer Ther.3:103-10(2004))。此外，PDCD4表達(dá)在肺、乳房、結(jié)腸和前列腺癌的進(jìn)展性癌中喪失(Goke，R.等人，Am.J.Physiol.Cell Physiol.287:C1541-46(2004))，值得注意地，還已經(jīng)在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞模型中報(bào)道了PDCD4的腫瘤抑制基因作用(Goke，R.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:220-21(2004))。
PET中差異表達(dá)的微小RNA表現(xiàn)出在染色體臂中非隨機(jī)分布，大多數(shù)位于染色體臂5q，7q，13q和19p的微小RNA是過(guò)表達(dá)的。該發(fā)現(xiàn)可能是由于多順?lè)醋哟刂形⑿NA的頻繁結(jié)合(Baskerville，S.和D.P.Bartel，RNA 11:241-47(2005)；Altuvia，Y.等人，NucleicAcids Res.33:2697-2706(2005))或含有這些微小RNA的染色體臂的擴(kuò)增。我們的分析表明，在PET中這2種現(xiàn)象都可能涉及。實(shí)際上，在簇內(nèi)微小RNA對(duì)之間測(cè)得的相關(guān)系數(shù)與在簇外微小RNA對(duì)之間測(cè)得的相關(guān)系數(shù)顯著不同。這些數(shù)據(jù)證實(shí)在PET中分組微小RNA基因顯示出協(xié)同表達(dá)的普遍觀察結(jié)果(Baskerville，S.和D.P.Bartel，RNA11:241-47(2005)；Altuvia，Y.等人，Nucleic Acids Res.33:2697-2706(2005))。
微小RNA通過(guò)靶向特異性mRNA進(jìn)行降解或翻譯抑制，發(fā)揮它們的生物學(xué)作用。為了了解在胰腺腫瘤中表現(xiàn)出改變的表達(dá)的最令人感興趣的微小RNA(例如miR-103/miR-107，miR-155，miR-204/miR-211和miR-21)的生物學(xué)牽涉，我們搜索了在通過(guò)3種不同算法鑒別出的靶物中共有的預(yù)測(cè)靶物(參見(jiàn)結(jié)果)。然后，為了評(píng)價(jià)微小RNA的表達(dá)和它們的預(yù)測(cè)靶物的表達(dá)之間是否存在關(guān)聯(lián)，我們利用了相同腫瘤和正常樣品的EST表達(dá)譜。在我們的EST微陣列中含有的選擇的靶物中，我們發(fā)現(xiàn)了幾種增量調(diào)節(jié)的和減量調(diào)節(jié)的基因。令人感興趣地，miR-103/107的預(yù)測(cè)的靶基因比預(yù)期更頻繁地過(guò)表達(dá)。該發(fā)現(xiàn)與Babak等人的發(fā)現(xiàn)一致，Babak等人報(bào)道了在一組17種不同小鼠組織中微小RNA表達(dá)和它們的預(yù)測(cè)mRNA靶物之間的低關(guān)聯(lián)(Babak，T.等人，RNA10:1813-19(2004))。這支持了目前偏好的模型，即大多數(shù)微小RNA更可能通過(guò)翻譯抑制起作用，而不發(fā)生mRNA降解(Bartel，D.P.，Cell116:281-97(2004))。
總之，本文所述的結(jié)果暗示，微小RNA表達(dá)的改變與內(nèi)分泌和腺泡致瘤性轉(zhuǎn)化和惡性進(jìn)展有關(guān)。
未明確引作參考的本文引述的所有出版物的相關(guān)教導(dǎo)通過(guò)參考引用整體并入本文。另外，在本文中通過(guò)特定登記號(hào)標(biāo)識(shí)的核苷酸序列(例如微小RNA核苷酸序列)也通過(guò)參考引用整體并入本文。盡管參考其優(yōu)選實(shí)施方案已具體地顯示和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其中可進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的不同變化，而不偏離所附權(quán)利要求包括的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.診斷受試者是否患有胰腺癌或處于發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著受試者患有胰腺癌或處于發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103，miR-107和其組合。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-23a，miR-26b，miR-192，miR-342和其組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-155。
9.權(quán)利要求1的方法，其中:
所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-103，與對(duì)照樣品相比，它在測(cè)試樣品中被增量調(diào)節(jié)；
所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-107，與對(duì)照樣品相比，它在測(cè)試樣品中被增量調(diào)節(jié)；和/或
所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-155，與對(duì)照樣品相比，它在測(cè)試樣品中被減量調(diào)節(jié)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述胰腺癌選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)，胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)和胰島素瘤。
11.診斷受試者是否患有胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)或處于發(fā)生胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著受試者患有PACC或處于發(fā)生PACC的風(fēng)險(xiǎn)中。
12.權(quán)利要求11的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-25，miR-200c，miR-335，miR-21，miR-103-1，miR-92-1，miR-181b-2，miR-191，miR-93，miR-26a-1，miR-17，miR-20，miR-107，miR-26b，miR-215，miR-92-2，miR-192，miR-342，miR-100，miR-3p21-v，miR-106a，miR-15a，miR-23a，miR-181b-1，miR-128b，miR-106b，miR-194-1，miR-219-1，miR-242和其組合。
14.權(quán)利要求11的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-218-2，miR-339，miR-326，miR-34c，miR-152，miR-138-2，miR-128a和其組合。
16.診斷受試者患有的胰腺癌的類型的方法，其包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中的所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著胰腺癌的類型。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述胰腺癌的類型選自:胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)和胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述胰腺癌的類型是胰腺內(nèi)分泌腫瘤(PET)，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其組合。
20.權(quán)利要求17的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述胰腺癌的類型是胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其組合。
22.權(quán)利要求16的方法，其中所述胰腺癌的類型選自:分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)和胰腺腺泡細(xì)胞癌(PACC)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述胰腺癌的類型是分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125a，miR-99a，miR-132和其組合。
25.權(quán)利要求22的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述胰腺癌的類型是分化良好的內(nèi)分泌癌(WDEC)，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-148a。
27.權(quán)利要求16的方法，其中所述胰腺癌的類型選自:胰島素瘤和無(wú)功能的胰腺內(nèi)分泌腫瘤(NF-PET)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述胰腺癌的類型是胰島素瘤，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-204，miR-203，miR-211和其組合。
30.確定患胰腺癌的受試者的預(yù)后的方法，其包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中:
所述miR基因產(chǎn)物與胰腺癌的不良預(yù)后有關(guān)；且
與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著不良預(yù)后。
31.權(quán)利要求30的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述胰腺癌伴隨著轉(zhuǎn)移和/或高增殖指數(shù)。
34.確定受試者的胰腺癌是否是轉(zhuǎn)移性的方法，其包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中:
所述miR基因產(chǎn)物與轉(zhuǎn)移有關(guān)；且
與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著轉(zhuǎn)移。
35.權(quán)利要求34的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
37.確定受試者的胰腺癌是否具有高增殖指數(shù)的方法，其包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中:
所述miR基因產(chǎn)物與高增殖指數(shù)有關(guān)；且
與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著高增殖指數(shù)。
38.權(quán)利要求37的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
40.確定患胰腺癌的受試者的預(yù)后的方法，其包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的測(cè)試樣品中PDCD4的水平，其中與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中PDCD4的水平的改變，指示著不良預(yù)后。
41.權(quán)利要求40的方法，其中測(cè)試樣品PDCD4的水平小于對(duì)照樣品中PDCD4的水平。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述胰腺癌伴隨著轉(zhuǎn)移和/或高增殖指數(shù)。
43.診斷受試者是否患有胰腺癌或處于發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括:
(1)從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸；
(2)使靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜；和
(3)對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜，
其中至少一種miRNA的信號(hào)的改變指示著受試者患有胰腺癌或處于發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
44.權(quán)利要求43的方法，其中與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)相比，至少一種miRNA的信號(hào)被增量調(diào)節(jié)。
45.權(quán)利要求43的方法，其中與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)相比，至少一種miRNA的信號(hào)被減量調(diào)節(jié)。
46.權(quán)利要求43的方法，其中所述微陣列包含對(duì)于選自以下的一種或多種miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375，miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
47.診斷受試者是否患有不良預(yù)后的胰腺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括:
(1)從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸；
(2)使靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供所述測(cè)試樣品的雜交譜；和
(3)對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜，
其中信號(hào)的改變指示著受試者患有不良預(yù)后的胰腺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
48.權(quán)利要求47的方法，其中miR-21信號(hào)的變化指示著受試者患有不良預(yù)后的胰腺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
49.治療患有胰腺癌的受試者的胰腺癌的方法，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，受試者癌細(xì)胞中的至少一種miR基因產(chǎn)物被減量調(diào)節(jié)或增量調(diào)節(jié)，其包括:
(1)當(dāng)所述至少一種miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被減量調(diào)節(jié)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，條件是，所述miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-1，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖；或
(2)當(dāng)所述至少一種miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被增量調(diào)節(jié)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖。
50.權(quán)利要求49的方法，其中步驟(1)中所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
51.權(quán)利要求49的方法，其中步驟(2)中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。
52.治療受試者的胰腺癌的方法，其包括:
(1)測(cè)定與對(duì)照細(xì)胞相比，胰腺癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量；和
(2)通過(guò)下述方式，改變?cè)谝认侔┘?xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量:
(i)如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量小于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，條件是，所述miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-1；或
(ii)如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量大于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物。
53.權(quán)利要求52的方法，其中步驟(i)中所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
54.權(quán)利要求52的方法，其中步驟(ii)中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。
55.用于治療胰腺癌的藥物組合物，其包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，和藥學(xué)上可接受的載體。
56.權(quán)利要求55的藥物組合物，其中所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞在胰腺癌細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)的miR基因產(chǎn)物。
57.權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述分離的miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
58.用于治療胰腺癌的藥物組合物，其包含至少一種miR表達(dá)抑制劑化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
59.權(quán)利要求58的藥物組合物，其中所述至少一種miR表達(dá)抑制劑化合物是對(duì)相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞在胰腺癌細(xì)胞中增量調(diào)節(jié)的miR基因產(chǎn)物特異性的。
60.權(quán)利要求59的藥物組合物，其中所述至少一種miR表達(dá)抑制劑化合物是對(duì)選自下述的miR基因產(chǎn)物特異性的:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。
61.鑒定抗胰腺癌劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，并測(cè)量與胰腺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的增加，指示著測(cè)試試劑是抗胰腺癌劑。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述miR基因產(chǎn)物選自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其組合。
63.鑒定抗胰腺癌劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，并測(cè)量與胰腺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的降低，指示著測(cè)試試劑是抗胰腺癌劑。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于胰腺癌的診斷、預(yù)后和治療的新的方法和組合物。本發(fā)明也提供了鑒定抗胰腺癌劑的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/58GK101384273SQ200780005791
公開(kāi)日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2007年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日
發(fā)明者C·M·克羅斯, G·A·卡林 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì)