專(zhuān)利名稱(chēng)：：農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)在馬鈴薯中引入hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法。技術(shù)背景馬鈴薯是世界第4大重要糧食作物，同時(shí)也是菜、飼、加工和工業(yè)原料作物?，F(xiàn)在全球種植馬鈴薯的國(guó)家有148個(gè)，總產(chǎn)量3億噸。國(guó)際馬鈴薯中心(CIP)的研究表明，在世界范圍內(nèi)對(duì)馬鈴薯的需求到2020年將有望增長(zhǎng)20%，超過(guò)水稻、小麥、玉米的增長(zhǎng)；屆時(shí)發(fā)展中國(guó)家對(duì)馬鈴薯的需求將是2000年的兩倍。我國(guó)在地理氣候條件方面具有生產(chǎn)馬鈴薯的得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。我國(guó)馬鈴薯常年種植面積約470萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量超過(guò)七千萬(wàn)噸。產(chǎn)量和面積分別占全球的五分之一和四分之一，居世界第一位。我國(guó)加入世貿(mào)組織后，水稻、小麥、玉米和大豆等作物的國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力日趨減弱，而馬鈴薯卻以其產(chǎn)量高、成本低等特點(diǎn)顯示出強(qiáng)勁的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿ΑＨ欢?，?yīng)該看到，我國(guó)雖然是馬鈴薯生產(chǎn)大國(guó)之一，但用于加工的馬鈴薯占總產(chǎn)量的比例很低(還不到5%)，而美國(guó)、法國(guó)、荷蘭占60%-80%左右，加工后的馬鈴薯比鮮薯增值10-30倍?，F(xiàn)在用于加工的馬鈴薯品種主要是外國(guó)品種，但這些品種的抗病能力很差，尤其是抗晚疫病能力；而另外一些商品價(jià)值較高的特早熟品種也存在同樣的問(wèn)題。馬鈴薯晚疫病是限制馬鈴薯生產(chǎn)的毀滅性病害之一，全球每年因該病損失約170億美元，我國(guó)約10億美元左右。國(guó)際馬鈴薯中心(CIP)將馬鈴薯晚疫病列為優(yōu)先研究項(xiàng)目，成立了研究協(xié)作網(wǎng)，加強(qiáng)了對(duì)該病的研究。最初，育種學(xué)家從馬鈴薯野生種源中尋找抗病基因。然而馬鈴薯是同源四倍體作物，用常規(guī)育種方法改良品種，由于生殖障礙、育種周期過(guò)長(zhǎng)、過(guò)程復(fù)雜等原因難以直接利用。同時(shí)野生種的垂直抗性基因由于病原小種變異快而易失去抗性；水平抗性基因單獨(dú)不足以有效地抵抗晚疫病的侵襲，并且易受環(huán)境條件的影響而導(dǎo)致晚疫病的大流行。馬鈴薯染病后品質(zhì)降低，薯形差，造成商品薯率低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿(mǎn)足不了加工和市場(chǎng)的需求，同時(shí)影響了經(jīng)濟(jì)效益和薯農(nóng)的積極性，制約了生產(chǎn)和加工能力的發(fā)揮。植物基因轉(zhuǎn)化是近20年來(lái)隨著DNA重組技術(shù)、基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展而來(lái)的生物技術(shù)。近年來(lái)，隨著對(duì)植物抗病反應(yīng)機(jī)制及病原菌致病機(jī)理的深入研究，抗真菌和細(xì)菌病害基因工程取得了一些突破性進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了若干與植物防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的蛋白因子，成為目前通過(guò)遺傳工程手段開(kāi)發(fā)植物抗病新資源的物質(zhì)基礎(chǔ)。在馬鈴薯抗病基因工程育種中也大量使用了與這些病程相關(guān)(PR)的蛋白基因，如LIU等，ZHU等和李汝剛等分別報(bào)道了煙草0smotin蛋白轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株可以推遲晚疫病病斑出現(xiàn)時(shí)間，降低晚疫病的侵染頻率，賦予葉片抗晚疫病的能力。李汝剛等報(bào)道，HarpinEa基因的組成型表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)均賦予轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株抗晚疫病的能力。金紅等人將從非洲甜菊中分離出來(lái)的類(lèi)甜蛋白基因(tip)及其緊密連鎖的抗除草劑bar基因以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入馬鈴薯中，經(jīng)晚疫病菌游離孢子接種離體抗性分析，轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出對(duì)晚疫病的明顯抑制作用并對(duì)癥狀發(fā)生有延遲作用。揚(yáng)希才等人用avrD和elicitin基因分別轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)無(wú)毒基因馬鈴薯植株都具有較明顯的對(duì)晚疫病菌侵染的抗性。1992年WEI等首次從梨火疫歐文氏病菌(Erwiniaamylovora)Ea321hrap基因簇中分離到由hrapN基因編碼的蛋白類(lèi)激發(fā)子harpin。harpins是植物病原細(xì)菌本身的hrap基因家族編碼在寄主上致病和在非寄主上誘導(dǎo)過(guò)敏性反應(yīng)必需的蛋白因子，而過(guò)敏性反應(yīng)是植物與病原互作過(guò)程中，植物抵抗病原浸染的普遍表現(xiàn)形式和有效途徑。hrap(hypersensitiveresponse-assistingprotein)與細(xì)菌的致敏蛋白harpinpss混合接種之后，均能在接種植物的細(xì)胞間隙中促進(jìn)harpinpss所引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)，解離harpinpss的多聚體，降低細(xì)菌性病原菌的致病力，引起更嚴(yán)重的過(guò)敏性細(xì)胞壞死。這種過(guò)敏反應(yīng)促進(jìn)蛋白的序列與已知功能的蛋白或基因序列均不相似，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)hrap含有一段引導(dǎo)其分泌到胞外的信號(hào)肽。hrap能延緩細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌Xanthomonascampestrispv.vesicatoria在甜椒中的繁殖并減輕其病癥，也能延緩番茄野生黃單胞菌Xanthomonascampestrispv.vesicatoria在甜椒中的繁殖并減輕其病癥。Ger等人將hrap基因?qū)霟煵葜校l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)煙草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.Tabaci)禾口軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)存在抗性；Ajay等通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將hrap基因?qū)霐M南芥，轉(zhuǎn)基因植株也表現(xiàn)出了抗軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)的作用。但目前還沒(méi)有hrap基因在馬鈴薯中的轉(zhuǎn)化和抗病性表達(dá)方面的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法，該方法將hrap基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)入馬鈴薯植株中，使馬鈴薯植株具有抗晚疫病和青枯病的能力。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的外植體接種于攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404的菌液中浸染，浸染后的外植體經(jīng)共培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷、誘導(dǎo)生芽和生根培養(yǎng)選擇，選擇根選兩次都能生根的試管苗擴(kuò)繁后轉(zhuǎn)移盆栽得轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化植株用PCR檢測(cè)和Southern雜交檢測(cè)方法篩選陽(yáng)性植株，經(jīng)活體抗病性接種鑒定獲得抗病馬鈴薯植株。上述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法中用到的農(nóng)桿菌菌液是這樣配制的將攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404菌液接種于附加100mg/LKan、100mg/LSm和100mg/LRif的液體LB培養(yǎng)基，在搖床上28。C，中速培養(yǎng)至OD6oo值為0.40.5。前述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法中所用的農(nóng)桿菌LBA4404，攜帶質(zhì)粒pBIhr即，含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTlI和過(guò)敏反應(yīng)促進(jìn)蛋白基因hrap，hrap基因上游為35S啟動(dòng)子，下游為NOS終止子。前述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法，所述外植體的預(yù)培養(yǎng)是取培養(yǎng)34周、生長(zhǎng)健壯的馬鈴薯組培苗葉片剪去邊緣，剪成O.4-0.5cm2的小塊，正面朝下接種于培養(yǎng)基中，在2225。C暗培養(yǎng)2天，所述培養(yǎng)基的組成為MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.2mg/L2，4-D+16g/L蔗糖+6g/L瓊脂。前述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法，所述外植體的浸染采用如下方法預(yù)培養(yǎng)后的外植體接種于制備好的農(nóng)桿菌菌液中，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸820分鐘。前述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法，浸染后外植體是這樣共培養(yǎng)的從農(nóng)桿菌菌液中取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸干，接種于培養(yǎng)基中，在2225'C暗培養(yǎng)23天，所述培養(yǎng)基組成為MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.2mg/L2，4-D+16g/L蔗糖+68幾瓊脂。前述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法，所述外植體的誘導(dǎo)愈傷、誘導(dǎo)生芽和生根培養(yǎng)采用如下的步驟將共培養(yǎng)后的外植體接入組成為MS+22.5mg/L6-BA+0.10.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+50mg/LKan+500mg/LCb，附加0.6%瓊脂，pH5.8的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷；愈傷生長(zhǎng)23周后轉(zhuǎn)接入組成為MS+2.5mg/L6-BA+5.Omg/LGA3+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+50mg/LKan+500mg/LCb的BOA培養(yǎng)基中，在22士1。C、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為12000LX的條件下誘導(dǎo)生芽，34周更換一次B0A培養(yǎng)基；待芽長(zhǎng)至23厘米后，將芽切下接入MS+50mg/LKan的抗性篩選培養(yǎng)基中，在22士1。C、光照強(qiáng)度為12000LX，光照周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)生根。前述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法，所述PCR檢測(cè)為從轉(zhuǎn)化植株葉片中提取DNA，以轉(zhuǎn)化植株為模板，陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌液為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化葉片為陰性對(duì)照，以hrap基因引物I:5'-GTTGGAGTTGGAGGACGAGG-3'和hrap基因引物II:5'-CGCGGATCCATGAAAATGAAGAACCTCTC-3'進(jìn)行PC財(cái)廣增，篩選陽(yáng)性植株。前述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法，所述Southern雜交檢測(cè)方法為所述Southern雜交檢測(cè)方法為從PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株的葉片中提取DNA，用BglII酶切提取的DNA，1%瓊脂糖電泳后，轉(zhuǎn)膜，篩選陽(yáng)性植株。前述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法，具體采用如下步驟(1)菌液制備將保存農(nóng)桿菌LBA4404菌液接種于附加100mg/LKan、100mg/LSm和100mg/LRif的液體LB培養(yǎng)基，在搖床上28。C，中速培養(yǎng)至OD6oo值為0.4，得農(nóng)桿菌菌液，備用；(2)預(yù)培養(yǎng)取培養(yǎng)4周、生長(zhǎng)健壯的馬鈴薯組培苗葉片，正面朝下接種于組成為MS+2.Omg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.2mg/L2，4-D+16g/L蔗糖+6g/L瓊脂的培養(yǎng)基中，在22。C暗培養(yǎng)2天；(3)浸染預(yù)培養(yǎng)后的組培苗葉片接種于步驟(1)制備的攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404的菌液中，使組培苗葉片與農(nóng)桿菌菌液充分接觸8分鐘；(4)共培養(yǎng)取出組培苗葉片，用無(wú)菌濾紙吸干，接種于步驟(2)中的培養(yǎng)基中，在22'C暗培養(yǎng)2天；(5)誘導(dǎo)愈傷、誘導(dǎo)生芽和生根培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的組培苗葉片接入組成為MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+50mg/LKan+500mg/LCb、附加0.6%瓊脂、pH5.8的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷；愈傷生長(zhǎng)3周后轉(zhuǎn)接入組成為MS+2.5mg/L6-BA+5.Omg/LGA3+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+50mg/LKan+500mg/LCb的BOA培養(yǎng)基中，在22。C、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為12000LX的條件下誘導(dǎo)生芽，4周更換一次B0A培養(yǎng)基；待芽長(zhǎng)至3厘米后，將芽切下接入MS+50mg/LKan的抗性篩選培養(yǎng)基中，在22。C、光照強(qiáng)度為12000LX光照周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)生根，選擇根選兩次都能生根的試管苗擴(kuò)繁后轉(zhuǎn)移盆栽得轉(zhuǎn)化植株；(6)PCR檢測(cè)采用SDS微量法從轉(zhuǎn)化植株葉片中提取DNA，以轉(zhuǎn)化植株為模板，陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌液為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化葉片為陰性對(duì)照，以hrap基因引物I:5'-GTTGGAGTTGGAGGACGAGG-3'和hrap基因引物II:5'-CGCGGATCCATGAAAATGAAGAACCTCTC-3'進(jìn)行PC財(cái)廣增，篩選陽(yáng)性植株；PCR反應(yīng)體系是10箬uffer2.5mL、10mMdNTPs0.5mL、2.5U/mLTaq酶0.5mL、10mM基因引物I0.5mL、10mM基因引物II0.5mL禾口模板DNA2mL，用去離子水補(bǔ)至25mL;PCR反應(yīng)條件94°C，7min;94°C，50s;53°C，50s;72°C，lmin;30個(gè)循環(huán)；72°C，7min;4。C終止反應(yīng)；(7)Southern檢測(cè)采用CTAB法從經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株的葉片中提取DNA，用BglII酶切提取的DNA，1%瓊脂糖電泳后，轉(zhuǎn)膜，篩選陽(yáng)性植株；(8)抗病性鑒定Southern陽(yáng)性植株經(jīng)活體接種鑒定獲得抗病馬鈴薯植株。本申請(qǐng)的發(fā)明人做了大量的實(shí)驗(yàn)，研究了浸染時(shí)間、不同品種、不同激素濃度對(duì)誘導(dǎo)愈傷和芽分化的影響、不定芽的生根、移栽條件等，并對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株進(jìn)行了抗kan篩選、PCR檢測(cè)、shouthern雜交和抗病性鑒定，所做實(shí)驗(yàn)詳細(xì)如下一、轉(zhuǎn)基因植株的再生1、供試材料1.1植物材料供試植物材料是購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院蔬菜花卉研究所的馬鈴薯品種"布爾班克"和"大西洋"組培苗，以及南京農(nóng)大惠贈(zèng)的加拿大品種"RussetBurbank"組培苗，三個(gè)品種都易感晚疫病。繼代繁殖使用的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基附加0.6。/。瓊脂和3。/。蔗糖，pH5.8，選取生長(zhǎng)健壯，苗齡4周左右的葉片為外植體。1.2試劑dNTPMixture購(gòu)自上海生工生物公司；TaqDNA聚合酶和MarkerD2000購(gòu)自北京TIANGEN公司；Kan(硫酸卡那霉素)、Sm(硫酸鏈霉素)和Cb(羧芐青霉素)購(gòu)自北京科萌普瑞生物公司；Rif(利福平)膠囊購(gòu)自上海信宜萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司；6-BA購(gòu)自上海麗珠東風(fēng)生物公司；GA3購(gòu)自中科院生化研究所；NAA由上海四聯(lián)化工廠分裝；2，4-D購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司；瓊脂糖購(gòu)自英國(guó)Oxoid;其它常規(guī)試劑均選用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.3hrap基因目的基因hrap是由臺(tái)灣學(xué)者馮騰永研究員的實(shí)驗(yàn)室從被harpinPss引起過(guò)敏反應(yīng)的甜椒中分離得到，由北京大學(xué)林忠平實(shí)驗(yàn)室重新購(gòu)建并提供的。構(gòu)建的農(nóng)桿菌攜帶質(zhì)粒PBIhrap，含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTlI)和過(guò)敏反應(yīng)促進(jìn)蛋白基因hrap，hrap基因上游為35S啟動(dòng)子，下游為NOS終止子，如圖1所示。hrap蛋白的分子量為29kD，等電點(diǎn)8.6，hrap基因cDNA全長(zhǎng)996bp，該基因經(jīng)北京大學(xué)重新構(gòu)建以后，基因cDNA全長(zhǎng)750bp左右。1.4菌液制備將攜帶質(zhì)粒pBIhrap農(nóng)桿菌LBA4404菌液接種于附加100mg/LKan、100mg/LSm和100mg/LRif的液體LB培養(yǎng)基，在搖床上28。C，中速培養(yǎng)至OD6oo值為0.4，得農(nóng)桿菌菌液。2.方法取馬鈴薯品種"布爾班克"、"RussetBurbank"和"大西洋"培養(yǎng)4周、生長(zhǎng)健壯的組培苗葉片剪去邊緣，剪成O.4-0.5ci/的小塊，正面朝下接種于組成為MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.2mg/L2，4-D+16g/L蔗糖+6g/L瓊脂的培養(yǎng)基中，在22i:暗培養(yǎng)2天；然后將組培苗葉片接種于攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404的菌液中，輕輕搖動(dòng)使組培苗葉片與農(nóng)桿菌菌液充分接觸8分鐘；取出組培苗葉片，用無(wú)菌濾紙吸干，接種于組成為MS+2.Omg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.2mg/L2，4-D+16g/L蔗糖+6g/L瓊脂的培養(yǎng)基中，在22。C暗培養(yǎng)2天；然后將組培苗葉片接入表l所列培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷；愈傷約17天后轉(zhuǎn)接入組成為MS+2.5mg/L6-BA+5.Omg/LGA3+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+50mg/LKan+500mg/LCb的BOA培養(yǎng)基中，在22。C、每天光照12小時(shí)候、光照強(qiáng)度為12000LX的條件下誘導(dǎo)生芽，4周更換一次B0A培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-ll周后調(diào)査愈傷誘導(dǎo)率和芽分化率。表l愈傷培養(yǎng)基成分<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注各種培養(yǎng)基均P付加0.6%瓊脂，pH5.8。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.l不同培養(yǎng)基對(duì)"RussetBurbank"品種愈傷誘導(dǎo)和芽分化的影響比較"RussetBurbank"品種誘導(dǎo)愈傷和芽分化情況，結(jié)果如表2所示，不同處理的愈傷誘導(dǎo)率、芽分化率和每塊芽數(shù)有很大差異。愈傷誘導(dǎo)率以BB和BC處理最高，達(dá)100%;芽分化率則是AA處理最高，為64.00%;每塊芽數(shù)最多的是BA處理，約4.33個(gè)芽，出芽最少的是AB處理，約1.33個(gè)芽。這個(gè)結(jié)果表明，在我們的試驗(yàn)中愈傷誘導(dǎo)率、芽分化率和每塊芽數(shù)之間相關(guān)性不大。不同培養(yǎng)基對(duì)"RussetBurbank"品種愈傷誘導(dǎo)和芽分化的影響i昔養(yǎng)基接種出愈分化芽塊分化芽數(shù)愈傷誘導(dǎo)率芽分化率每塊塊數(shù)塊數(shù)數(shù)(%)(%)芽數(shù)AA3425164473.5364.002.75AB211991290.4847.371.33AC312851390.3217.862.60BA423093971.4330.004.33BB31311532100.0048.392.13BC2020410100.0020.002.50注愈傷誘導(dǎo)率(％)=(出愈塊數(shù)/接種塊數(shù))X100%;芽分化率(％)出愈塊數(shù))xioo%;每塊芽數(shù)(％)=分化芽數(shù)/分化芽塊數(shù)(分化芽塊數(shù)3.2、NAA濃度對(duì)"布爾班克"的愈傷誘導(dǎo)率和芽分化率的影響在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表l)中設(shè)置了3個(gè)NAA濃度(0.1、0.3、0.5mg/L)，比較"布爾班克"的誘導(dǎo)愈傷率和芽分化率對(duì)NAA濃度的反應(yīng)，結(jié)果如表3。從表3看，"布爾班克"在三種培養(yǎng)基中的愈傷誘導(dǎo)率在AA中最高，在AE中的最低。表3"布爾班克"對(duì)NAA濃度的反應(yīng)i昔養(yǎng)基不同激素處理中培養(yǎng)16天接種塊數(shù)出愈塊數(shù)愈傷誘導(dǎo)率(％)AA181055.56AC261350.00AE331442.42平均261246.15注愈傷誘導(dǎo)率=(出愈塊數(shù)/接種塊數(shù))X100%;芽分化率=(分化芽塊數(shù)/出愈塊數(shù))X100%3.3、不定芽的生根在植株再生過(guò)程中，試管苗生根也是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。待芽長(zhǎng)至2-3cm后，將芽切下接入MS+50mg/LKan的抗性篩選培養(yǎng)基中，在22。C、光照強(qiáng)度為12000LX，光照周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)生根。盡管整個(gè)轉(zhuǎn)化再生過(guò)程是在含Kan的培養(yǎng)基中進(jìn)行，我們還是對(duì)再生苗進(jìn)行了兩次抗Kan根選。與非轉(zhuǎn)基因不定芽對(duì)照相比，接入含MS+50mg/LKan的培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)基因不定芽大部分能生根，根數(shù)5-6條；而非轉(zhuǎn)基因不定芽對(duì)照在相同的培養(yǎng)基中則全部不能生根，只有少量氣生根，且植株生長(zhǎng)矮小。本試驗(yàn)共得到約100個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，1000多個(gè)轉(zhuǎn)基因單株。表4為不同品種再生芽?jī)纱胃x生根率的比較。不同品種第一次根選的生根率約為65%73%;所有品種第二次生根率都比第一次略高，所以進(jìn)行兩次根選也是必要的。表4轉(zhuǎn)基因植株兩次根選的生根率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注生根率=(生根芽數(shù)/接種芽數(shù))X100%3.4、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的再生過(guò)程將經(jīng)過(guò)與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)兩天的葉盤(pán)外植體接種到含有50mg/LKan、500mg/LCb以及激素6-BA和NAA的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)約2周后，在葉盤(pán)邊緣處可見(jiàn)有瘤狀突起；將其轉(zhuǎn)入芽分化培養(yǎng)基BOA誘導(dǎo)形成不定芽；當(dāng)不定芽長(zhǎng)至2-3cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS+50mg/LKan上生根；將根選兩次生根良好的轉(zhuǎn)化植株的部分繼代試管苗洗去培養(yǎng)基后，栽入營(yíng)養(yǎng)缽中，以腐殖土珍珠巖(3:l)作基質(zhì)，用l:IOOO的地菌靈水溶液做定根水，澆透基質(zhì)。放于陰涼處，覆蓋薄膜保濕。約l周后即可移到露天光線(xiàn)好的地方，定期澆水，l周左右澆一次營(yíng)養(yǎng)液(MS液體培養(yǎng)基)。二、轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)1、轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)1.1方法依目的基因的序列，分別設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成hrap基因引物I:5'-GTTGGAGTTGGAGGACGAGG-3'hrap基因引物II:5'-CGCGGATCCATGAAAATGAAGAACCTCTC-3'采用SDS微量法提取轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株葉片DNA，以轉(zhuǎn)化后再生植株擴(kuò)繁單株葉片為模板，陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌液為陽(yáng)性對(duì)照，相應(yīng)未轉(zhuǎn)化品種植株葉片DNA為陰性對(duì)照，以基因引物I和基因引物II進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系是10箬uffer2.5mL、10mMdNTPs0.5mL、2.5U/mLTaq酶0.5mL、10mM基因引物I0.5mL、10mM基因引物II0.5mL和模板DNA2mL，用去離子水補(bǔ)至25mL;PCR反應(yīng)條件94°C，7min;94°C，50s;53°C，50s;72°C，lmin;30個(gè)循環(huán)；72°C，7min;4"C終止反應(yīng)。1.2結(jié)果將"布爾班克"、"RussetBurbank"、"大西洋"3個(gè)品種的轉(zhuǎn)化再生植株擴(kuò)繁移栽，分別取不同株系的單株葉片提取DNA做PCR檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。3個(gè)品種的株系陽(yáng)性率為83.33%-100.00%，單株陽(yáng)性率為47.22%-65.28%。3個(gè)品種當(dāng)中"大西洋"的株系陽(yáng)性率和單株陽(yáng)性率均最高。在本試驗(yàn)中，從同一株系擴(kuò)繁得到的材料中，有些單株不能擴(kuò)出特異條帶，如"布爾班克"第1號(hào)株系，提取的22個(gè)單株中有15株呈陽(yáng)性，7株呈陰性；"大西洋"第2號(hào)株系的17個(gè)單株中10株顯陽(yáng)性，7株呈陰性等。圖2為部分PCR檢測(cè)的電泳結(jié)果。陽(yáng)性單株與陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌液均可擴(kuò)增出約750bp左右的條帶，而未轉(zhuǎn)化植株不能擴(kuò)增出目的條帶。表5取樣單株數(shù)及陽(yáng)性單株數(shù)品種布爾班克RussetBurbank大西洋株系數(shù)161212陽(yáng)性株系數(shù)151012陽(yáng)性株系率93.75%83.33%100.00%取樣單株數(shù)1573672陽(yáng)性單株數(shù)961747陽(yáng)性率％61.15%47.22%65.28%2、Southern雜交2.1方法采用CTAB法從經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株的葉片中提取DNA，用Bgl11酶切提取的DNA，1%瓊脂糖電泳后，轉(zhuǎn)膜，篩選陽(yáng)性植株得抗病馬鈴薯植株。2.2結(jié)果圖3、圖4和圖5的結(jié)果表明，"布爾班克"檢測(cè)了13個(gè)單株，其中有7個(gè)單株表現(xiàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為53.85%;"大西洋"檢測(cè)了6個(gè)單株，其中有3個(gè)表現(xiàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為50.00%;"RussetBurbank"檢測(cè)了7個(gè)單株，其中有2個(gè)單株表現(xiàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為28.57%;表明目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種中。三、轉(zhuǎn)基因植株的抗病性檢測(cè)(委托云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院進(jìn)行)1、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株青枯病抗性檢測(cè)方法將在TTC平板上培養(yǎng)好的青枯菌株TB48接入TTC培養(yǎng)液中經(jīng)室溫、150r/m搖床培養(yǎng)24h，待用；將培養(yǎng)好的接種液加入裝有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，使培養(yǎng)基的0D5加值為0.200;然后將不同品系的馬鈴薯置于培養(yǎng)瓶，在玻璃溫室中觀察；以最早出現(xiàn)萎蔫葉片的時(shí)間和是否整株萎蔫作為抗感標(biāo)準(zhǔn)。2、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株晚疫病抗性檢測(cè)方法取純化的供試馬鈴薯晚疫病菌株(ZY15、LSX18、XH05-5-4)培養(yǎng)于黑麥番茄汁培養(yǎng)基上，約10-15天菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿，加入少量無(wú)菌水并用小刮鏟輕刮菌絲表面使孢子囊落入水中，270目網(wǎng)曬過(guò)濾，濾液中的孢子囊數(shù)目用血球計(jì)數(shù)器測(cè)定，調(diào)節(jié)濾液濃度，使孢子囊數(shù)目為1000-2000個(gè)/ml;將供試各馬鈴薯品系種薯或試管苗種植于育苗盆內(nèi)，每盆播種l個(gè)薯塊(或莖段)，放于溫室內(nèi)，澆水、施肥，長(zhǎng)到6-9葉齡時(shí)用于接種。將配制好的孢子囊懸浮液噴霧在馬鈴薯植株上，保濕24小時(shí)，觀察發(fā)病情況。3、檢測(cè)結(jié)果經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗病性檢測(cè)(表6)，其結(jié)果顯示抗晚疫病的抗性株率為3.1-9.52%，抗青枯病的抗病株率為50.00-77.78%。轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的抗病能力。表6:3個(gè)品種抗病檢測(cè)陽(yáng)性率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1轉(zhuǎn)基因植株再生目前作為基因轉(zhuǎn)化的外植體材料已經(jīng)研究得非常廣泛，涉及到植物的各個(gè)組織、器官和部位。在馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，以葉片、莖段、塊莖和試管薯為外植體的轉(zhuǎn)化均已獲得成功。薯片可以不經(jīng)愈傷組織階段直接形成再生芽，在適宜的培養(yǎng)基上試管薯可以得到較高轉(zhuǎn)化率的再生芽。馬鈴薯不同品種愈傷誘導(dǎo)和芽分化所需的激素種類(lèi)和濃度不同，再生體系培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)募に亟M配與濃度是影響再生成功與否的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬鈴薯葉片的愈傷誘導(dǎo)率、芽分化率和每塊芽數(shù)之間相關(guān)性不大，既并不是愈傷誘導(dǎo)率高的品種或處理，芽分化率就高；芽分化率最高的品種或處理，每塊芽數(shù)并不一定就很高。2轉(zhuǎn)基因植株的鑒定雖然在整個(gè)再生過(guò)程中都是在含Kan的培養(yǎng)基上進(jìn)行的，我們對(duì)獲得的再生芽仍進(jìn)行了兩次抗Kan選擇生根。在第一次根選中約有23%50%的不定芽不能正常長(zhǎng)根，二次根選時(shí)仍有025%不能長(zhǎng)根，這說(shuō)明通過(guò)兩次根選篩選轉(zhuǎn)化植株還是比較有效的，同時(shí)在轉(zhuǎn)化過(guò)程中還存在較多的假陽(yáng)性，可以考慮將Kan選擇壓濃度提高到75mg/L。將根選后能正常生根的植株提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，3個(gè)品種轉(zhuǎn)hrap基因的261個(gè)單株中，陽(yáng)性率為55.55%-68.11%，平均有一半以上表現(xiàn)PCR陽(yáng)性(62.45%)。李先平等報(bào)道，用HarpinEa基因轉(zhuǎn)化大西洋得到的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR陽(yáng)性率為55.14%，蘇俊峰等將Bt基因?qū)氪笪餮蟮难芯恐校琍CR陽(yáng)性率僅為2.96%。對(duì)26個(gè)PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)hrap基因的單株進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果有12株為陽(yáng)性，3個(gè)品種的平均陽(yáng)性率為46.15%。說(shuō)明目的基因已經(jīng)整合到再生植株中。除了"RussetBurbank"有l(wèi)個(gè)株系為雙拷貝雜交信號(hào)，其余l(xiāng)l株均為單拷貝雜交信號(hào)。轉(zhuǎn)hrap基因植株抗病性鑒定結(jié)果，3個(gè)品種中"布爾班克"抗晚疫病的抗性株率最高，大西洋的抗青枯病的抗性單株率最高。對(duì)3個(gè)品種86個(gè)轉(zhuǎn)hrap基因的單株進(jìn)行抗晚疫病活體接種抗病性檢測(cè)，獲得了7個(gè)抗晚疫病為l-2級(jí)的高抗植株，平均抗性單株率為8.14%。轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的抗病能力。本試驗(yàn)對(duì)各株系的不同單株進(jìn)行的抗病性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)少部分PCR陰性單株也具有抗病性，如PCR檢測(cè)陰性的單株l-2-32、l-4-8出現(xiàn)抗晚疫病，3-18-2高抗青枯病，這說(shuō)明抗性單株的選育是必要的。少部分PCR陰性單株具有抗病性是因?yàn)檗r(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化是通過(guò)組織培養(yǎng)過(guò)程實(shí)現(xiàn)的，在這個(gè)過(guò)程中，由于再生植株是由細(xì)胞發(fā)育而成，而單個(gè)細(xì)胞在誘導(dǎo)過(guò)程中很容易發(fā)生遺傳變異，其中就有可能出現(xiàn)對(duì)晚疫病具有抗性的變異植株。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、首次將過(guò)敏反應(yīng)促進(jìn)蛋白基因hrap導(dǎo)入馬鈴薯，并獲得了抗病植株。2、本發(fā)明提供的農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因的方法，改良了外植體愈傷和生芽的誘導(dǎo)，提高了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的能力。3、建立了以不同品種馬鈴薯葉片為外植體的高效再生體系，篩選到了對(duì)國(guó)外引進(jìn)品種和國(guó)內(nèi)品種均適合的芽再生培養(yǎng)基BOA。4、由于實(shí)驗(yàn)所用的hrap基因能提高與病程相關(guān)的、過(guò)敏性反應(yīng)蛋白harpinPss的效應(yīng)，降低細(xì)菌性病原菌的致病力，引起更嚴(yán)重的過(guò)敏性細(xì)胞壞死，所以通過(guò)農(nóng)桿菌把hrap基因介導(dǎo)入馬鈴薯植株獲得了高抗晚疫病(l-2級(jí))和高抗青枯病的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株(晚疫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)際馬鈴薯抗晚疫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，接種菌液涵蓋了11個(gè)國(guó)際公認(rèn)的R基因小種)。圖l是本發(fā)明所用質(zhì)粒pBIhrap圖譜。圖2是轉(zhuǎn)hrap基因的部分單株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果，圖中正對(duì)照陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌液PC財(cái)廣增產(chǎn)物;Marker:D2000;1-15:品種l的不同轉(zhuǎn)基因單株；16-20:品種2的不同轉(zhuǎn)基因單株；21-38:品種3的不同轉(zhuǎn)基因單株；負(fù)對(duì)照l(shuí):品種l的未轉(zhuǎn)化植株；負(fù)對(duì)照2:品種2的未轉(zhuǎn)化植株；負(fù)對(duì)照3:品種3的未轉(zhuǎn)化植株。圖3是撩級(jí)囁薩轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交結(jié)果，圖中正對(duì)照質(zhì)粒pBIhr即；負(fù)對(duì)照未轉(zhuǎn)基因的布爾班克，1-1，1-8，1-9檢測(cè)的帶極弱，基因未轉(zhuǎn)進(jìn)去；1-2，1-3，1-5帶較弱，可能是非特異性雜交，不能確定基因是否轉(zhuǎn)入；1-4，1-7，1-7-13，1-10，1-11，1-12，1-14-15確定為轉(zhuǎn)基因株系。圖4是"大西洋"轉(zhuǎn)化植株的Southern雜交結(jié)果，圖中正對(duì)照質(zhì)粒pBIhrap;負(fù)對(duì)照:大西洋未轉(zhuǎn)基因植株(3);3-5-12、3-18-l無(wú)帶，基因未轉(zhuǎn)進(jìn)去；3-24-l帶較弱，不能確定基因是否轉(zhuǎn)入；3-3、3-17、3-19-l確定為轉(zhuǎn)基因株系。圖5是"RussetBurbank"轉(zhuǎn)化植株的Southern雜交結(jié)果，圖中正對(duì)照質(zhì)粒pBIhrap;2-1、2-2無(wú)帶；2-3、2-4、2-2-2帶較弱；2-6，2-12確定為轉(zhuǎn)基因株系。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:1、外植體的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)(1)菌液制備將攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404菌液接種于附加100mg/LKan、100mg/LSm和100mg/LRif的液體LB培養(yǎng)基，在搖床上28。C，中速培養(yǎng)至OD6oo值為0.4，得農(nóng)桿菌菌液，備用；(2)預(yù)培養(yǎng)取培養(yǎng)4周、生長(zhǎng)健壯的"布爾班克"組培苗葉片，剪成0.4ci/的小塊，正面朝下接種于組成為MS+2.Omg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.2mg/L2，4-D+16g/L蔗糖+6g/L瓊脂的y2培養(yǎng)基中，在22'C暗培養(yǎng)2天；(3)浸染預(yù)培養(yǎng)后的"布爾班克"組培苗葉片接種于攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404的菌液中，使組培苗葉片與農(nóng)桿菌菌液充分接觸8分鐘；(4)共培養(yǎng)取出組培苗葉片，用無(wú)菌濾紙吸干，接種于步驟(2)中的y2培養(yǎng)基中，在22'C暗培養(yǎng)2天；(5)誘導(dǎo)愈傷、誘導(dǎo)生芽和生根培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的組培苗葉片接入愈傷培養(yǎng)基MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+50mg/LKan+500mg/LCb、附加O.6%瓊脂、pH5.8的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷；愈傷生長(zhǎng)2周后轉(zhuǎn)接入組成為MS+2.5mg/L6-BA+5.Omg/LGA3+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+50mg/LKan+500mg/LCb的BOA培養(yǎng)基中，在22。C、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為12000LX的條件下誘導(dǎo)生芽，4周更換一次B0A培養(yǎng)基；待芽長(zhǎng)至3厘米后，將芽切下接入MS+50mg/LKan的抗性篩選培養(yǎng)基中，在22。C、光照強(qiáng)度為12000LX，光照周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)生根，根選兩次；(6)將生根良好的轉(zhuǎn)化植株的部分繼代試管苗洗去培養(yǎng)基后，栽入營(yíng)養(yǎng)缽中，以腐殖土珍珠巖(3:l)作基質(zhì)，用l:IOOO的地菌靈水溶液做定根水，澆透基質(zhì)。放于陰涼處，覆蓋薄膜保濕。約l周后即可移到露天光線(xiàn)好的地方，定期澆水，1周左右澆一次營(yíng)養(yǎng)液(MS液體培養(yǎng)基)。2、PCR檢測(cè)采用SDS微量法從轉(zhuǎn)化植株葉片中提取DNA，以轉(zhuǎn)化植株為模板，陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌液為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化葉片為陰性對(duì)照，以?xún)蓚€(gè)引物hrap基因引物I:5'-GTTGGAGTTGGAGGACGAGG-3'和hrap基因引物II:5'-CGCGGATCCATGAAAATGAAGAACCTCTC-3'進(jìn)行PC財(cái)廣增，篩選陽(yáng)性植株；PCR反應(yīng)體系是10箬uffer2.5mL、10mMdNTPs0.5mL、2.5U/mLTaq酶0.5mL、10mM基因引物I0.5mL、10mM基因引物II0.5mL禾口模板DNA2mL，用去離子水補(bǔ)至25mL;PCR反應(yīng)條件94°C，7min;94°C，50s;53°C，50s;72°C，lmin;30個(gè)循環(huán)；72°C，7min;4。C終止反應(yīng)；3、Southern檢測(cè)采用CTAB法從經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株的葉片中提取DNA，用BglII酶切提取的DNA，1%瓊脂糖電泳后，轉(zhuǎn)膜，篩選陽(yáng)性植株4、抗病性鑒定經(jīng)活體接種抗病性鑒定獲得抗病馬鈴薯植株。實(shí)施例2:外植體的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)將保存的、攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404菌液接種于附加100mg/LKan、100mg/LSm和100mg/LRif的液體LB培養(yǎng)基，在搖床上28。C，中速培養(yǎng)至0D,值為0.5，得農(nóng)桿菌菌液，備用；將培養(yǎng)3周、生長(zhǎng)健壯的"大西洋"組培苗葉片剪去邊緣，剪成O.5ci/的小塊，正面朝下接種于組成為MS+2.Omg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.2mg/L2，4-D+16g/L蔗糖+6g/L瓊脂的y2培養(yǎng)基中，在22'C暗培養(yǎng)2天；組培苗葉片接種于攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404的菌液中，使組培苗葉片與農(nóng)桿菌菌液充分接觸10分鐘；取出組培苗葉片，用無(wú)菌濾紙吸干，接種于y2培養(yǎng)基中，在22'C暗培養(yǎng)2天；將培養(yǎng)后的組培苗葉片接入組成為MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+30g/L蔗糖+50mg/LKan+500mg/LCb、附加0.6%瓊脂、pH5.8的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷；愈傷生長(zhǎng)3周后轉(zhuǎn)接入B0A培養(yǎng)基中，在21。C、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為12000LX的條件下誘導(dǎo)生芽，4周更換一次B0A培養(yǎng)基；待芽長(zhǎng)至2cm后，將芽切下接入MS+50mg/LKan的抗性篩選培養(yǎng)基中，在22。C、光照強(qiáng)度為12000LX、光照周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)生根，根選兩次；將生根良好的轉(zhuǎn)化植株的部分繼代試管苗洗去培養(yǎng)基后，栽入營(yíng)養(yǎng)缽中，以腐殖土珍珠巖(3:l)作基質(zhì)，用l:IOOO的地菌靈水溶液做定根水，澆透基質(zhì)。放于陰涼處，覆蓋薄膜保濕。約l周后即可移到露天光線(xiàn)好的地方，定期澆水，1周左右澆一次營(yíng)養(yǎng)液(MS液體培養(yǎng)基)。實(shí)施例3:外植體的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)將保存的、攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404菌液接種于附加100mg/LKan、100mg/LSm和100mg/LRif的液體LB培養(yǎng)基，在搖床上28。C，中速培養(yǎng)至OD6oo值為0.5，得農(nóng)桿菌菌液，備用；取培養(yǎng)4周、生長(zhǎng)健壯的"RussetBurbank"馬鈴薯組培苗葉片剪去邊緣，剪成0.4ci/的小塊，正面朝下接種于y2培養(yǎng)基中，在23。C暗培養(yǎng)2天；組培苗葉片接種于攜帶質(zhì)粒PBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404的菌液中，使組培苗葉片與農(nóng)桿菌菌液充分接觸20分鐘；取出組培苗葉片，用無(wú)菌濾紙吸干，接種于y2培養(yǎng)基中，在23。C暗培養(yǎng)2天；將培養(yǎng)后的組培苗葉片接入組成為MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖十50mg/LKan+500mg/LCb、附加0.6%瓊脂、pH5.8的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷；愈傷生長(zhǎng)2周后轉(zhuǎn)接入BOA培養(yǎng)基中，在23。C、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為12000LX的條件下誘導(dǎo)生芽，3周更換一次BOA培養(yǎng)基；待芽長(zhǎng)至3厘米后，將芽切下接入MS+50mg/LKan的抗性篩選培養(yǎng)基中，在23。C、光照強(qiáng)度為12000LX光照周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)生根，根選兩次；將生根良好的轉(zhuǎn)化植株的部分繼代試管苗洗去培養(yǎng)基后，栽入營(yíng)養(yǎng)缽中，以腐殖土珍珠巖(3:l)作基質(zhì)，用l:IOOO的地菌靈水溶液做定根水，澆透基質(zhì)。放于陰涼處，覆蓋薄膜保濕。約l周后即可移到露天光線(xiàn)好的地方，定期澆水，1周左右澆一次營(yíng)養(yǎng)液(MS液體培養(yǎng)基)。權(quán)利要求1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)hrap基因獲得抗病性表達(dá)的方法，其特征在于經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的外植體接種于攜帶質(zhì)粒pBIhrap的農(nóng)桿菌LBA4404的菌液中浸染，浸染后的外植體經(jīng)共培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷、誘導(dǎo)生芽和生根培養(yǎng)選擇，選擇根選兩次都能生根的試管苗擴(kuò)繁后轉(zhuǎn)移盆栽得轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化植株用PCR檢測(cè)和Southern雜交檢測(cè)方法篩選陽(yáng)性植株，經(jīng)活體抗病性接種鑒定獲得抗病馬鈴薯植株。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)hrap基因獲得抗病馬鈴薯植株的方法。該方法與細(xì)菌的致敏蛋白harpin_Pss混合接種之后，均能在接種植物的細(xì)胞間隙中促進(jìn)harpin_Pss所引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng))，解離harpin_Pss的多聚體。因此，其抗病效果更好，能提高馬鈴薯植株的抗病性。將hrap基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)入馬鈴薯植株中，使馬鈴薯植株具有抗晚疫病和青枯病的能力。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是將經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的外植體接種于農(nóng)桿菌菌液中浸染，浸染后的外植體經(jīng)共培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷、誘導(dǎo)生芽和生根培養(yǎng)選擇，選擇根選兩次都能生根的試管苗擴(kuò)繁后轉(zhuǎn)移盆栽得轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化植株用PCR檢測(cè)和Southern雜交檢測(cè)方法篩選陽(yáng)性植株，經(jīng)活體接種抗病性鑒定獲得抗病馬鈴薯植株。本發(fā)明方法改良了外植體愈傷和生芽的誘導(dǎo)，提高了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的能力。對(duì)外植體進(jìn)行兩次根選，剔除了轉(zhuǎn)化過(guò)程中的假陽(yáng)性植株，避免了對(duì)假陽(yáng)性植株的后繼培養(yǎng)，節(jié)省勞動(dòng)力，降低了生產(chǎn)成本。文檔編號(hào)C12N5/04GK101117639SQ20071020092公開(kāi)日2008年2月6日申請(qǐng)日期2007年6月28日優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日發(fā)明者馮騰永,麗李,林忠平,毛堂芬,董穎蘋(píng),蔣敏華,堅(jiān)陳,黃先群申請(qǐng)人:貴州省生物技術(shù)研究所