專利名稱：丙型肝炎病毒(hcv)一步熒光定量rt-pcr檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速定量檢測不同基因分型丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV) 血清RNA的一步熒光定量RT-PCR檢測方法及其試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景丙型肝炎病毒(HCV)為黃病毒科丙型肝炎病毒屬，通過血液、腎移植、靜脈注射毒 品、性、母嬰等途徑傳播。HCV主要的復制部位是肝臟，慢性感染可導致肝臟慢性炎癥壞死 和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌(HCC)，嚴重危害患者的生命健康。在被 特異性檢測之前，HCV—直被稱為輸血后非甲非乙型肝炎因子，直到1989年才應(yīng)用分子克 隆技術(shù)首次得以確認。HCV為單股正鏈RNA病毒，大小為30 38nm，有脂質(zhì)包膜，目前， 其復制的分子機制尚不完全清楚，對HCV引起急性肝損傷的機制也知之甚少。由于HCV感 染的嚴格宿主限制性，僅感染人和黑猩猩，動物感染模型較難建立。在細胞培養(yǎng)時，變異快， 病毒的產(chǎn)量非常低。同時HCV似乎具有很強的躲避免疫攻擊的能力。因此，目前尚未能開發(fā) 出有效的疫苗和治療方案。由HCV病毒引起的肝臟疾病，在全球分布廣泛，慢性丙型肝炎患 者超過1.7億，接近全球人口大得3%，許多患者長期無癥狀直至嚴重肝損害后才出現(xiàn)臨床表 現(xiàn)，丙型肝炎已成為威脅人類身體健康的世界性醫(yī)學難題。應(yīng)引起社會各界的高度重視，必 須加強預(yù)防，減少發(fā)病，控制流行。近幾年的臨床經(jīng)驗表明，干擾素對抗HCV病毒效果顯著優(yōu)于HBV，因此，準確檢測丙 型肝炎患者血清中HCVRNA的含量變化，對臨床療效的觀察顯得非常重要。HCV的基因組 長9.4Kb，含一個大的開放閱讀框(ORF)幾乎占據(jù)整個基因組，其5'端為非編碼序列，高 度保守，因此可作為靶序列應(yīng)用PCR技術(shù)擴增以檢測HCV含量。丙型肝炎病毒傳統(tǒng)的檢測方法一般為酶聯(lián)免疫法(ELISA)，但該方法工作量大、耗時 長，給丙型肝炎病毒的檢測帶來諸多不便。隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，人們已經(jīng)將實 時熒光定量PCR技術(shù)(real-time fluorescence polymerase chain reaction)廣泛應(yīng)用于臨床檢驗， 包括病毒、細菌等多種病原微生物的檢測以及多種病毒、細菌耐藥性的檢測等。實時熒光定 量PCR (real-time fluorescence polymerase chain reaction)是通過熒光染料或熒光標記的特異性 的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，在一適當波長下實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，利用探針在無特 異性PCR發(fā)生時，熒光信號不變，當有特異性PCR發(fā)生時，探針會在PCR過程中被切斷而 引起熒光信號的增長。熒光信號伴隨著PCR的過程進行，伴隨PCR產(chǎn)物增長而增長，當熒 光強度達到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的依據(jù)，再結(jié)合相應(yīng)的軟件可 對結(jié)果進行分析,計算出待測樣品的初始模板量。實時熒光定量PCR技術(shù)具有以下優(yōu)點(1)PCR的高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性；(2)儀器自動分析，效率高、 無后續(xù)處理；(3)獨特的定量原理，即時反映擴增過程，塀棄終點數(shù)據(jù)，更適用于定量，定 量范圍寬，無須稀釋樣品，結(jié)果重現(xiàn)性好；(4)所有試劑均是一次擴增，毋須開蓋，不產(chǎn)生 污染。由于試劑盒的靈敏度問題，目前尚無法對獻血員處于窗口期的HCV感染者采用PCR 法檢測，這是值得完善的環(huán)節(jié)。而臨床所用的試劑盒大多為兩步法，耗時長，不利于臨床操 作。由于細胞、組織和血清中含有較難去除的RNA酶，因此HCVRNA提取的純度對檢測 結(jié)果影響較大。目前常用方法有Trizol裂解法、Si02吸附法及純化層析法。Trizol裂解法和 Si02吸附法步驟煩瑣，易受外界環(huán)境污染，而國外主要采用Qiagene層析柱的方法進行提取， 但由于其成本太高，僅限于科研。結(jié)合市場需求，本發(fā)明采用改進的Trizol法結(jié)合特異性硅基質(zhì)核酸吸附柱來提取HCV RNA，同時，利用一步熒光定量RT-PCR技術(shù)對丙型肝炎病毒進行檢測。在核酸提取結(jié)束后 直接在體系中加入RT-PCR反應(yīng)液，cDNA的合成與PCR擴增反應(yīng)在同一管中進行，不用增 加額外的步驟。該操作在不影響靈敏度、準確度的情況下，不僅縮短了操作時間、減少了污 染、降低了勞動強度，而且也直接降低了臨床樣品PCR診斷的成本，延續(xù)了熒光定量PCR 檢測方法的快速簡便性能，不僅可用于HCV定量檢測，也可作為臨床實驗室對HCV感染的 輔助診斷方法和臨床治療效果的監(jiān)測手段，具有潛在的應(yīng)用價值。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在提供一種精確簡便的用于定量檢測丙型肝炎病毒血清RNA含量的方 法；另一目的在于提供一種用于該方法的試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)特征在于在對現(xiàn)有各個亞型HCVRNA序列分析的基礎(chǔ)上，選取保守基因 序列設(shè)計出一對特異性引物和一條特異性熒光探針，采用Trizol法結(jié)合特異性硅基質(zhì)核酸吸 附柱來提取HCVRNA，同時，利用一步熒光定量RT-PCR技術(shù)對丙型肝炎病毒進行檢測。在 核酸提取結(jié)束后直接在體系中加入RT-PCR反應(yīng)液，cDNA的合成與PCR反應(yīng)在同一管中進 行，不用增加額外的步驟。該操作在不影響靈敏度、準確度的情況下，不僅縮短了操作時間、 減少了污染、降低了勞動強度，而且也直接降低了臨床樣品PCR診斷的成本，延續(xù)了熒光定 量PCR檢測方法的快速簡便性能，不僅可用于HCV定量檢測，也可作為臨床實驗室對HCV 感染的輔助診斷方法和臨床治療效果的監(jiān)測手段，具有潛在的應(yīng)用價值。本發(fā)明的技術(shù)特征在于，在按下述方法設(shè)計的探針和相應(yīng)引物存在下，在熒光定量PCR 儀中，對從血清樣品提取的丙型肝炎病毒RNA進行RT-PCR擴增，實現(xiàn)丙型肝炎病毒基因分型檢測1. 所述的探針和特異性引物設(shè)計方法如下1) 同源性比對從GeneBank數(shù)據(jù)庫中調(diào)出丙型肝炎病毒各亞型基因序列。2) 通過比對選取高度保守序列。3) 以保守序列為基準設(shè)計一對特異性引物及一條熒光探針。2. 引物和熒光探針設(shè)計原則1) 特異性引物和熒光探針的長度每條引物長度為18 25個堿基，熒光探針長度為20 30個堿基。2) 特異性引物和熒光探針中GC^要求在40 60y。，理論Tm〉50'C。3) 特異性引物和熒光探針自身、引物和探針之間的3'端盡可能避免堿基配對。4) 引物和熒光探針自身、引物和探針之間盡可能避免6對以上的連續(xù)堿基配對。5) 選用的引物和熒光探針要求設(shè)計在人丙型肝炎病毒(HCV)基因中的保守區(qū)，只對人 丙型肝炎病毒特異，和其他物種無交叉反應(yīng)。熒光探針位于一對引物之間的區(qū)域。 擴增目的基因長度最好介于50 150bp。3. 丙型肝炎病毒特異性擴增基因序列為ccatggcgtt agtatgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc cccctcccgg 132 gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gta' 165 丙型肝炎病毒熒光檢測試劑盒擴增序列全長83 bp，位于GeneBank中HCV DNA序 列的第83-165位，屬5，端非編碼區(qū)，為單拷貝序列。 針對丙型肝炎病毒特異性擴增序列設(shè)計的引物與探針序列為PHCV1上游引物 5' ccatggcgttagtaygagtgtcg 3， 23bp PHCV2下游引物 5'tactcaccggttccgcagac 3' 20bpFPHCV熒光探針5'FAM"Cccdcccggg3gagpcatag-TAMARA3，21 bp4. 試劑盒組成一對特異性引物PHCV、 一條特異性熒光探針FPHCV、 Taq酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、 RNA酶抑制劑、丙型肝炎病毒強陽性對照、陰性對照、臨界陽性指控品對照血清、HCV 定量標準品、核酸提取裂解液(LB)、漂洗液(WB)、核酸吸附柱、洗脫液(EB)、和實時 熒光定量RT-PCR反應(yīng)液(mix)。5. 丙型肝炎病毒核酸裂解液LB的配制異硫腈酸胍 60g鹽酸胍 20g十二垸基肌胺酸鈉 0.66g0.5M檸檬酸鈉 34ul1M醋酸鈉 122ulTriton X—100 200ulDEPC水定容至50mL， 45°C、超聲助溶，0.44um過濾除菌。加入lOOmL重蒸酚， 調(diào)節(jié)pH至6.5 。 6、漂洗液WB的配制分析純異丙醇，需RNA專用。5. 洗脫液EB的配制pH為8.0的DEPC水。6. —步熒光定量RT-PCR Buffer的配制Tris-HCl (pH 8.4)30 mMKC150 mMMgCl22mM甲酰胺1.5 %DTT5mMdNTP0.5 mMPHCV1 /2各0.3 pMFPHCV0.5 pM配制成RT-PCR反應(yīng)液，每人份23.5ul，于一2(TC保存。7.丙型肝炎病毒核酸RNA的提取a) 取血清樣品lOOul，加入裂解液LB 500ul，溫和顛倒混勻，靜置5min。b) 加入氯仿100ul，溫和顛倒混勻至白色靡狀液體。c) 室溫離心12,000rpm， 3min。d) 在內(nèi)套管中加入等體積(約250^1)漂洗液WB。小心吸取離心后的上層液體約25(Hil(注意不要攪動界面層)至內(nèi)套管中，立即吹打混勻數(shù)次，靜置2min。e) 13,000rpm離心30s，棄廢液。f) 在內(nèi)套管中直接加入漂洗液WB250pl，靜置lmin， 13,000rpm離心2min，棄廢液。g) 加入500ul75。/。乙醇漂洗離心柱，靜置lmin。h) 13，000rpm離心30s，棄廢液。i) 13，000rpm離心2min。(如吸附柱內(nèi)仍有殘留液體，可加大轉(zhuǎn)速，延長離心時間。)j) 將離心柱置于一干凈無RNase污染的離心管中，并加入適量洗脫液EB，靜置2min， 13,000rpm離心30s，所得液體即為目的產(chǎn)物，可用于下一步實驗。 8.逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR擴增(每人份30ul體系)取5ul提取的核酸作為RT-PCR反應(yīng)模板，同時加入25 ul RT-PCR反應(yīng)液至八聯(lián)管中 進行RT-PCR擴增。 a) —步實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)液的配制 一步RT-PCR BufferTaq酶(2.5U/pl)RNA酶抑制齊IJ(40U 1)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶23.5ul0.5 nl 0.5 pi0.4ulb)④⑦⑧⑨40 min 5 min 45 s 1 min30 s 45 s反應(yīng)液體積 25^1步實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序① 42 。C② 96 。C③ 93 。C 60 。CGo to 2， 15 cycles 93 °C 60 °CGo to 530 cycles,在第七步采集熒光。 EndC)檢測本發(fā)明使用ABI Prism 7300實時熒光定量PCR儀進行檢測。 d)結(jié)果判斷 定性分析檢測探針FPHCV標記的熒光染料度，Ct值0或大于27:丙型肝炎病毒陰性；Ct值小于26:丙型肝炎病毒陽性，病人丙型肝炎病毒感染。 定量分析對于lxlO^測定拷貝數(shù)〈lxl()S拷貝/ml的樣本，報告相應(yīng)的測定結(jié)果。對于測定拷貝數(shù)^lxl08拷貝/ml的樣本，所測結(jié)果僅供參考。(報告上注明2lxl0S拷貝/ml，如需確定量，可根據(jù)所測結(jié)果將該標本用陰性血清稀釋至105 106 拷貝/ml后復測。)對于測定拷貝數(shù)〈lx103拷貝/ml的樣本，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明< lxl()S拷貝/ml或低于試劑盒檢測下限。對于HCV擴增陰性的標本(Ct值無數(shù)值)，報告上注明〈lxl(^拷貝/ml或低于 試劑盒檢測下限。
具體實施例方式實施例1…-丙型肝炎病毒一步實時熒光定量RT-PCR檢測方法及其試劑盒1、 丙型肝炎病毒一步實時熒光定量RT-PCR診斷試劑盒組成一對特異性引物PHCV、 一條特異性熒光探針FPHCV、 Taq酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、丙型肝炎病毒強陽性對照、陰性對照、臨界陽性指控品對照血清、HCV 定量標準品、核酸提取裂解液(LB)、漂洗液(WB)、核酸吸附柱、洗脫液(EB)、和一步實 時熒光定量RT-PCR Buffer。2、 丙型肝炎病毒特異性擴增基因序列為ccatggcgtt agtatgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc cccctcccgg gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gta通過基因序列分析，我們選擇其中的保守序列設(shè)計出熒光探針。 一對引物設(shè)計的Tm值接近，相差不到2'C。針對丙型肝炎病毒特異性擴增序列設(shè)計的引物與探針序列為PHCV1上游引物 5'ccatggcgttagtaygagtgtcg 3， 23bpPHCV2下游引物 5'tactcaccggttccgcagac 3， 20bpFPHCV熒光探針5' FAM"Cccctcccgggagagocalag-TAMARA3 ， 21 bp 丙型肝炎病毒熒光檢測試劑盒擴增序列全長83 bp,位于GeneBank中HCV DNA序 列的第83-165位，屬5'端非編碼區(qū)，為單拷貝序列。3、 丙型肝炎病毒核酸裂解液LB的配制異硫腈酸胍 60g鹽酸胍 20g十二垸基肌胺酸鈉 0.66g11132 165一對特異性引物和一條特異性0.5M檸檬酸鈉 34ul 1M醋酸鈉 122ul Triton X—100 200ul DEPC水定容至50mL， 45°C、超聲助溶，0.44um過濾除菌。加入lOOmL重蒸酚， 調(diào)節(jié)pH至6.5 。4. 漂洗液WB的配制含有分析純異丙醇，需RNA專用。5. 洗脫液EB的配制-含有pH為8.0的DEPC水。6. —步RT-PCR Buffer的配制Tris-HCl (pH 8.4)30 mMKC150 mMMgCl22mM甲酰胺1.5%DTT5 mMdNTP0.5 mMPHCV1 /2各0.3 pMFPHCV0.5 pM配制成RT-PCR反應(yīng)液，每人份23.5ul，于一20'C保存。 丙型肝炎病毒核酸RNA的提取a) 取血清樣品100ul，加入裂解液LB 500ul，溫和顛倒混勻，靜置5min。b) 加入氯仿100ul，溫和顛倒混勻至白色靡狀液體。c) 室溫離心12，000rpm， 3min。d) 在內(nèi)套管中加入等體積(約250W)漂洗液WB。小心吸取離心后的上層液體約250W(注意不要攪動界面層)至內(nèi)套管中，立即吹打混勻數(shù)次，靜置2min。e) 13，000rpm離心30s，棄廢液。f) 在內(nèi)套管中直接加入漂洗液WB250)al，靜置lmin， 13，000rpm離心2min，棄廢液。g) 加入500ul75。/。乙醇漂洗離心柱，靜置lmin。h) 13,000rpm離心30s，棄廢液。i) 13，000rpm離心2min。(如吸附柱內(nèi)仍有殘留液體，可加大轉(zhuǎn)速，延長離心時間。)j)將離心柱置于一干凈無RNase污染的離心管中，并加入適量洗脫液EB，靜置2min，13,000rpm離心30s，所得液體即為目的產(chǎn)物，可用于下一步實驗。 8.逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR擴增(每人份30ul體系)取5ul提取的核酸作為RT-PCR反應(yīng)模板，同時加入25 ul RT-PCR反應(yīng)液至八聯(lián)管中 進行RT-PCR擴增。 c) 一步實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)液的配制 一步RT-PCR BufferTaq酶(2.5U/pl)RNA酶抑制劑(40U/[il)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶23.5ul0.5 pi 0.5 nl0.4uld)反應(yīng)液體積 -步實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序:⑨⑩ ⑩ ⑩42 °C 96 °C 93 °C 60 °CGo to 2， 15 cycles 93 °C 60 °CGo to 530 cycles,在第七步采集熒光。 End25^140 min 5 min 45 s 1 min30 s 45 sC)檢測本發(fā)明使用ABI Prism 7300實時熒光定量PCR儀進行檢測。 d)結(jié)果判斷定性分析檢測探針FPHCV標記的熒光染料度，Ct值0或大于27:丙型肝炎病毒陰性；Ct值小于26:丙型肝炎病毒陽性，病人丙型肝炎病毒感染。 定量分析對于lxlO、測定拷貝數(shù)〈lxl()S拷貝/ml的樣本，報告相應(yīng)的測定結(jié)果。 對于測定拷貝數(shù)2lx108拷貝/ml的樣本，所測結(jié)果僅供參考。(報告上注明 Slxl()S拷貝/ml，如需確定量，可根據(jù)所測結(jié)果將該標本用陰性血清稀釋至105 106拷貝/ml后復測。)對于測定拷貝數(shù)<^103拷貝/1111的樣本，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明< lxl()S拷貝/ml或低于試劑盒檢測下限。對于HCV擴增陰性的標本(Ct值無數(shù)值)，報告上注明<1><103拷貝/1111或低于 試劑盒檢測下限。實施例2-…臨床檢測用上述方法對136例臨床樣品進行檢測，其中丙肝患者29例，檢出陽性率22.1%,準確率 96.7%，并且能夠?qū)Ρ透窝撞《具M行準確定量分析，遠遠優(yōu)于酶聯(lián)免疫。本發(fā)明具有特異性 好，靈敏度高，定量精確，快速簡便，可重復性高，可對丙型肝炎病毒進行快速定性定量檢 測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)診斷方法。采用硅基質(zhì)核酸吸附柱 提取RNA，保證了模板的純度。同時，利用一步熒光定量RT-PCR技術(shù)對丙型肝炎病毒進行 檢測。在核酸提取結(jié)束后直接在體系中加入RT-PCR反應(yīng)液，cDNA的合成與PCR反應(yīng)在同 一管中進行，不用增加額外的步驟。該操作在不影響靈敏度、準確度的情況下，不僅縮短了 操作時間、減少了污染、降低了勞動強度，而且也直接降低了臨床樣品PCR診斷的成本，延 續(xù)了熒光定量PCR檢測方法的快速簡便性能，不僅可用于HCV定量檢測，也可作為臨床實 驗室對HCV感染的輔助診斷方法和臨床治療效果的監(jiān)測手段，具有潛在的應(yīng)用價值。序列表<110>揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司〈120丙型肝炎病毒一步實時熒光定量RT-PCR檢測方法及其試劑盒 <160>4<210>1<211>83<212>RNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus) <400>1ccatggcgtt agtatgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc cccctcccgg 132gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gta 165<210>2<211>23<212〉DNA<213>人工合成<220><221 >misc_feature <222>(1)... (23)<223>根據(jù)丙型肝炎病毒核苷酸序列比較設(shè)計，用于檢測丙型肝炎病毒的特異性引物序列; <400>2ccatggcgtt agtaygagtg tcg 23<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成 <220><221 >misc_feature <222>(1)... (20)<223>根據(jù)丙型肝炎病毒核苷酸序列比較設(shè)計，用于檢測丙型肝炎病毒的特異性引物序列； <400>3tactcaccgg ttccgcagac 20<210>4 <211>21 <212>DNA <213>人工合成<220><221 >mi sc—feature <222>(1)... (21)<223>根據(jù)丙型肝炎病毒核苷酸序列比較設(shè)計，用于檢測丙型肝炎病毒的特異性熒光探針序列 5'端連有熒光基團FAM， 3'端連有泯滅基團TAMARA<400>4cccctcccgg gagagccata g 2權(quán)利要求
1、一種丙型肝炎病毒一步實時熒光定量RT-PCR檢測方法以及試劑盒。本法考察了人體丙型肝炎病毒基因組全序列，并對檢索所得HCV各個亞型序列進行同源性比較，針對其保守基因序列設(shè)計出一對特異性引物和一條特異性熒光探針，采用實時熒光定量PCR方法擴增目的基因。在一適當波長下檢測反應(yīng)始終熒光強度，Ct值為0或大于27丙型肝炎病毒呈陰性；Ct值小于26則呈陽性，病人丙型肝炎病毒感染。本發(fā)明具有特異性好，靈敏度高，定量精確，快速簡便，可重復性高，可對丙型肝炎病毒進行快速定性定量檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)診斷方法。
2、 本試劑盒采用改進的Trizol法結(jié)合特異性硅基質(zhì)核酸吸附柱來提取HCVRNA，同時，利 用一步熒光定量RT-PCR技術(shù)對丙型肝炎病毒進行檢測。在核酸提取結(jié)束后直接在體系中 加入RT-PCR反應(yīng)液，cDNA的合成與PCR擴增反應(yīng)在同一管中進行，不用增加額外的 步驟。該操作在不影響靈敏度、準確度的情況下，不僅縮短了操作時間、減少了污染、降 低了勞動強度，而且也直接降低了臨床樣品PCR診斷的成本，延續(xù)了熒光定量PCR檢測 方法的快速簡便性能，從而實現(xiàn)對丙型肝炎病毒的定性定量檢測。按照權(quán)利要求l所述的 丙型肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR擴增基因序列的反應(yīng)體系為
3、 丙型肝炎病毒核酸裂解液LB的配制異硫腈酸胍 60g 鹽酸胍 20g十二烷基肌胺酸鈉 0.66g0.5M檸檬酸鈉 34ul1M醋酸鈉 122ul Triton X—100 200ulDEPC水定容至50mL， 45°C、超聲助溶，0.44um過濾除菌。加入100mL重蒸酚， 調(diào)節(jié)pH至6.5 。
4、 漂洗液WB的配制含有分析純異丙醇，需RNA專用。
5、 洗脫液EB的配制含有pH為8.0的DEPC水。
6、 一步熒光定量RT-PCR Buffer的配制DEPC水Tris國HCl (pH 8.4) 30 mMKC1 50 mMMgCl2 2 mM甲酰胺 1.5%DTT 5 mMdNTP 0.5 mMPHCV1/2 各0.3pMFPHCV 0.5 pM配制成RT-PCR反應(yīng)液，每人份23.5ul，于一2(TC保存。
7、 丙型肝炎病毒核酸RNA的提取a) 取血清樣品100ul，加入裂解液LB 500ul，溫和顛倒混勻，靜置5min。b) 加入氯仿100ul，溫和顛倒混勻至白色靡狀液體。c) 室溫離心12,000rpm， 3min。d) 在內(nèi)套管中加入等體積(約25(^1)漂洗液WB。小心吸取離心后的上層液體約25(^1(注意不要攪動界面層)至內(nèi)套管中，立即吹打混勻數(shù)次，靜置2min。e) 13,000rpm離心30s，棄廢液。f) 在內(nèi)套管中直接加入漂洗液WB 250^1，靜置lmin， 13，000rpm離心2min，棄廢液。g) 加入500ul75。/。乙醇漂洗離心柱，靜置lmin。h) 13，000rpm離心30 s，棄廢液。i) 13,000rpm離心2min。(如吸附柱內(nèi)仍有殘留液體，可加大轉(zhuǎn)速，延長離心時間。)j)將離心柱置于一干凈無RNase污染的離心管中，并加入適量洗脫液EB，靜置2min， 13，000rpm離心30s，所得液體即為目的產(chǎn)物，可用于下一步實驗。
8. 逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR擴增(每人份30ul體系)取5ul提取的核酸作為RT-PCR反應(yīng)模板，同時加入25 ul RT-PCR反應(yīng)液至八聯(lián)管中 進行RT-PCR擴增。 a) —步實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)液的配制一步RT-PCR Buffer 23.5ulTaq酶(2.5U/nl) 0.6 piRNA酶抑制劑(40U/nl) 0.5 piM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 0.4ul反應(yīng)液體積 25^1b) —步實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序:①42 。C40 min②96 。C5 min③93 °C45 s 60 °C1 minGo to 2, 15 cycles⑥93 °C30 s⑦60°C45 s⑧Go to 530 cycles,在第七步采集熒光?！駿ndC)檢測本發(fā)明使用ABI Prism 7300實時熒光定量PCR儀進行檢測。 d)結(jié)果判斷 定性分析-檢測探針FPHCV標記的熒光染料度，Ct值0或大于27:丙型肝炎病毒陰性； Ct值小于26:丙型肝炎病毒陽性，病人丙型肝炎病毒感染。定量分析對于lxl0^測定拷貝數(shù)〈lxl()8拷貝/ml的樣本，報告相應(yīng)的測定結(jié)果。 對于測定拷貝數(shù)2lxl0S拷貝/ml的樣本，所測結(jié)果僅供參考。(報告上注明^lxl()S拷貝/ml，如需確定量，可根據(jù)所測結(jié)果將該標本用陰性血清稀釋至105 106拷貝/ml后復測。)對于測定拷貝數(shù)〈lx103拷貝/ml的樣本，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明< lxl()S拷貝/ml或低于試劑盒檢測下限。對于HCV擴增陰性的標本(Ct值無數(shù)值)，報告上注明〈lxl(^拷貝/ml或低于 試劑盒檢測下限。
9、 按照權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于試劑盒 包括以下成分 一對特異性引物PHCV、 一條特異性熒光探針FPHCV、 Taq酶、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、丙型肝炎病毒強陽性對照、陰性對照、臨界陽性指控品對照 血清、HCV定量標準品、核酸提取裂解液(LB)、漂洗液(WB)、核酸吸附柱、洗脫液(EB)、 和一步實時熒光定量RT-PCR Buffer。
10、 按照權(quán)利要求3所述的丙型肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于丙型肝 炎病毒特異性擴增基因序列為-ccatggcgtt agtatgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc cccctcccgg 132 gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gta 165 丙型肝炎病毒熒光檢測試劑盒擴增序列全長83 bp,位于GeneBank中HCV DNA序 列的第83-165位，屬5'端非編碼區(qū)，為單拷貝序列。
11、 按照權(quán)利要求4所述的丙型肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于針對丙 型肝炎病毒特異性擴增序列設(shè)計的引物與探針序列為PHCV1上游引物 5' ccatggcgttagtaygagtgtcg 3， 23bp PHCV2下游引物 5'tactcaccggttccgcagac 3， 20bpFPHCV熒光探針5'FAM"Cccctcccggga^gccalag-TAMARA3， 21 bp
全文摘要
本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒(HCV)一步實時熒光定量RT-PCR檢測方法以及試劑盒組成。首先，檢索到人體丙型肝炎病毒基因組全序列，并對檢索所得HCV各個亞型序列進行同源性比對，再針對其保守基因序列設(shè)計出一對特異性引物和一條用熒光染料標記的探針，采用實時熒光定量PCR方法擴增目的基因。在一適當波長下檢測反應(yīng)始終擴增產(chǎn)物熒光強度，Ct值為0或大于27丙型肝炎病毒呈陰性；Ct值小于26則呈陽性，病人丙型肝炎病毒感染。此外，本發(fā)明采用改進的Trizol法結(jié)合特異性硅基質(zhì)核酸吸附柱來提取HCV RNA，同時，利用一步熒光定量RT-PCR技術(shù)對丙型肝炎病毒進行檢測。在核酸提取結(jié)束后直接在體系中加入RT-PCR反應(yīng)液，cDNA的合成與PCR反應(yīng)在同一管中進行，不用增加額外的步驟。
文檔編號C12Q1/68GK101250592SQ20071017789
公開日2008年8月27日 申請日期2007年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日
發(fā)明者呂倩倩, 唐先兵, 李曉雯, 段清芬, 石和鵬, 靜 肖, 鄭宜婷 申請人:揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司