專利名稱：一株產(chǎn)苝醌化合物的竹黃菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一株產(chǎn)茈醌化合物的竹黃菌株，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種 高產(chǎn)茈醌化合物的竹黃菌株，該菌株對(duì)于茈醌化合物的工業(yè)化生產(chǎn)有著重要意 義。
背景技術(shù)：
在自然界中不同種屬的許多真菌都能產(chǎn)生具有茈醌骨架的代謝產(chǎn)物(李聰,
謝金倫.肉座菌科三種藥用真菌的化學(xué)成分分析比較.中草藥.2000， 31(4):250.)，
而近年來(lái)研究工作多集中在竹紅菌素，尾孢素和金絲桃蒽酮等的光動(dòng)力學(xué)和立 體化學(xué)上。其中竹紅菌素具有穩(wěn)定性好，口服無(wú)明顯副作用，代謝快，溶于眾 多有機(jī)溶劑而不溶于水等一系列特點(diǎn)。作為一種重要的天然光敏色素，竹紅菌 素在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域等有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。在野生的竹黃菌和竹紅菌等 子實(shí)體中均含有竹紅菌素。竹紅菌素包括如下結(jié)構(gòu)式所示的竹紅菌甲素和竹紅 菌乙素。
OH O
竹紅菌甲素 竹紅菌乙素
專利CN01135155.l介紹了 一種采用竹紅菌Hypocrella bambusae產(chǎn)菲醌類化 合物的方法。劉為忠(《茈醌類化合物產(chǎn)生菌固態(tài)發(fā)酵工藝研究》，云南大學(xué)學(xué) 報(bào)，2000， 225 (5) 389-391)和李聰(《一株產(chǎn)茈醌類化合物的真菌成分分析》， 菌物系統(tǒng)，2000， 19 (1): 122-127)等報(bào)導(dǎo)了產(chǎn)茈醌類化合物的真菌。
陳佳佳(《竹黃無(wú)性株的液態(tài)發(fā)酵工藝研究》，中藥材，2005，(12).1049-1051)、 石貴陽(yáng)(《竹黃菌液體培養(yǎng)條件下生成竹紅菌素的研究》藥物生物技術(shù),2004,(5)， 299-301)、李達(dá)旭(《一種竹寄生真菌的分離鑒定及其有效成分發(fā)酵的初步研究》 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,(1)， 139-143)和發(fā)明人(《竹黃菌固態(tài)發(fā)酵竹
紅菌素條件的研究》生物技術(shù),2004,(4)， 46-47)也曾采用野生竹黃菌進(jìn)行了竹 紅菌素的發(fā)酵研究。
但已報(bào)導(dǎo)的菌種竹紅菌素產(chǎn)量低而不穩(wěn)定，這些報(bào)導(dǎo)均未開(kāi)展后續(xù)的進(jìn)一 步的研究，無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)化的生產(chǎn)。本發(fā)明經(jīng)過(guò)從天然的竹黃菌子實(shí)體中篩 選得到了性狀穩(wěn)定，產(chǎn)芘醌類化合物的竹黃菌新菌株幼/ra^w. SUPER-H168。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)茈醌化合物的竹黃菌株，得到了性狀穩(wěn)定，產(chǎn)茈醌 類化合物的竹黃菌菌株，可通過(guò)固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)茈醌化合物。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種產(chǎn)茈醌化合物的竹黃菌株，其分類命名為竹黃菌
(5T2/raz'a w. )SUPER-H168，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M207104。
該菌株的分子生物學(xué)18SrDNA序列，其核苷酸序列為SEQ IDNO: 1。 該菌株的分子生物學(xué)ITS 5.8S rDNA序歹U，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。 該菌株經(jīng)過(guò)生物學(xué)手段改造后的18S rDNA和ITS 5.8S rDNA與出發(fā)菌株
CCTCC M 207104同源性達(dá)95%以上的菌株,仍可產(chǎn)竹紅菌素，仍視為該菌株
的權(quán)利范圍。
該菌株其主要代謝產(chǎn)物為竹紅菌甲素和竹紅菌乙素。 該菌株還產(chǎn)生幼/ra/a v. SUPER-H168代謝物母核的茈醌化合物。 該菌株可利用的碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳
糖、乳清、木薯、玉米、甜菜、纖維素或大米。
該菌株可利用的氮源為無(wú)機(jī)銨鹽、無(wú)機(jī)硝酸鹽、蛋白胨、酵母膏、尿素、
玉米漿或豆餅粉。
清明前后采集江蘇無(wú)錫馬山地區(qū)著生于短蕙竹上的竹黃子實(shí)體。要求個(gè)體 肥大，表面呈淺粉紅色，沒(méi)有龜裂、無(wú)膠質(zhì)分泌的幼嫩子實(shí)體作為分離材料。 將大小合適的竹黃子實(shí)體首先用無(wú)菌水洗滌干凈，然后用預(yù)先配置好的75%濃 度的酒精溶液浸泡1一2分鐘，待酒精揮發(fā)干后，將竹黃子實(shí)體進(jìn)行表面滅菌， 然后用無(wú)菌的解剖刀將其內(nèi)部組織切割成綠豆大小的顆粒植于分離瓊脂平板表 面，在無(wú)菌條件下將其輕輕壓入瓊脂中培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)后真菌以植入點(diǎn)為中心向 四周擴(kuò)散生長(zhǎng)而分離。分離用培養(yǎng)基為馬鈴薯200g、葡萄糖10g、瓊脂20g、 水1000mL、青霉素20mg，竹葉汁20g， pH值自然。26'C恒溫，培養(yǎng)4-5天。 初篩后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)竹紅菌素的能力相差很大。選擇菌落色澤較深的菌落進(jìn)行復(fù)篩 培養(yǎng)。最終得到產(chǎn)竹紅菌素能力最強(qiáng)的竹黃新菌株S/^m'a^. SUPER-H168。
本發(fā)明涉及到的菌種有如下特征
1.竹黃菌(57w'ra^s;^ SUPER-H168培養(yǎng)條件
該菌種的培養(yǎng)常規(guī)條件是好氣培養(yǎng)。用于培養(yǎng)菌種的糖質(zhì)原料碳源可以是
葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清、木薯、玉米、甜 菜、纖維素或大米等材料。培養(yǎng)用氮源可以是無(wú)機(jī)銨鹽、無(wú)機(jī)硝酸鹽或蛋白胨、
酵母膏、尿素、玉米漿、豆餅粉等有機(jī)氮源。該菌種的生長(zhǎng)溫度范圍為15°C-32 °C,最佳生長(zhǎng)溫度為26。C-28t:。 pH范圍為5-8，最佳pH范圍為5.5-7.3。在菌 種培養(yǎng)過(guò)程中還可添加磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、硫酸錳、 硫酸鈣、氯化鈉等無(wú)機(jī)鹽類。培養(yǎng)后竹紅菌素產(chǎn)量可達(dá)20mg/g (干菌體)
2. 竹黃菌(57H'ra/a^J SUPER-H168的形態(tài)描述
平板培養(yǎng)形態(tài)S/z/ra/a ^p. SUPER-H168在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,培養(yǎng)4d， 菌落呈圓形，干燥，疏松,邊緣較平整，直徑平均為3.8cm;氣生菌絲白色,絨毛狀,中間 的氣生菌絲較邊緣發(fā)達(dá);菌落基部培養(yǎng)基呈紅色,外緣白色;菌落邊緣較平整;背面 培養(yǎng)基中間部分呈紅色，系菌體分泌的色素。色素在培養(yǎng)基上呈暗紅色，可形成環(huán) 狀同心圓(有時(shí)不形成同心圓),中間顏色較深，邊緣顏色較淺。色素圈的直徑約占 菌落直徑的1/3-2/3。顯微鏡下可見(jiàn)菌絲有隔,間距不等，呈管狀,直徑3 4.5 P m, 有分支。孢子約lum左右。
3. 竹黃菌新菌株5Tz/ra^ w. SUPER-H168的分子生物學(xué)特征見(jiàn)序列表。
4. 竹黃菌0S7w'ra/a)SUPER-H168的產(chǎn)物說(shuō)明
57 >"& w. SUPER-H168的主要代謝產(chǎn)物為以如下所示的三種母核為基本結(jié) 構(gòu)的茈醌類化合物。其中主要以竹紅菌甲素和竹紅菌乙素為主。同時(shí)該菌可產(chǎn) 生以此三種母核結(jié)構(gòu)進(jìn)行基團(tuán)修飾的多種茈醌類化合物?？稍?,3,6，7,11,12,17，18， 26,28,29，30，32,36,37,45，46,53,55，56，58,62,63，71,72位置修飾上各種化學(xué)基團(tuán)，如 CH3，OCH3，COCH3，CH(OH)CH3 ，CHO， OH，H等，這些化學(xué)基團(tuán)之間還可以進(jìn)一 步形成更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。隨著發(fā)酵條件的不同，各茈醌類化合物的產(chǎn)量的比例 會(huì)有所不同。
<formula>formula see original document page 5</formula>SWra/a w. SUPER-H168代謝物母核 5.竹黃菌(幼z'ra&平)SUPER-H168的生物工程改造后的性質(zhì) 該菌經(jīng)500-800GY6QCo輻射、紫外誘變、N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NG)等常 規(guī)誘變的手段處理后，與出發(fā)菌株18S rDNA相似度達(dá)95%或ITS 5.8S rDNA相
似度達(dá)95%以上的菌株仍有良好的產(chǎn)竹紅菌素的能力。經(jīng)原生質(zhì)體融合得到的 菌株同樣具有很好的產(chǎn)茈醌類化合物的能力。
6可采用常規(guī)的固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵方法，利用上述菌種產(chǎn)生茈醌類化合物。培 養(yǎng)基可用含有不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子等普通培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基中也添加適量的對(duì)所使用的微生物生長(zhǎng)特別需要的營(yíng)養(yǎng)物。 一般情 況，這些營(yíng)養(yǎng)物存在于上述的天然營(yíng)養(yǎng)源中。'
該菌株固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，1天后開(kāi)始產(chǎn)茈醌類化合物，10天后產(chǎn)量達(dá)最高 峰。液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，1天后開(kāi)始產(chǎn)茈醌類化合物，3天后產(chǎn)量達(dá)最高峰。
本發(fā)明的有益效果幼/ra&平SUPER-H168的主要代謝產(chǎn)物為以如下所示 的三種母核為基本結(jié)構(gòu)的茈醌類化合物。寞中主要以竹紅菌甲素和竹紅菌乙素 為主。同時(shí)該菌可產(chǎn)生以此三種母核結(jié)構(gòu)進(jìn)行基團(tuán)修飾的多種茈醌類化合物。 該菌經(jīng)500-800GY^Co輻射、紫外誘變、N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NG)等常 規(guī)誘變的手段處理后，與出發(fā)菌株18S rDNA相似度達(dá)95%或ITS 5.8S rDNA相 似度達(dá)95%以上的菌株仍有良好的產(chǎn)竹紅菌素的能力。經(jīng)原生質(zhì)體融合得到的 菌株同樣具有很好的產(chǎn)茈醌類化合物的能力。
培養(yǎng)基中也添加適量的對(duì)所使用的微生物生長(zhǎng)特別需要的營(yíng)養(yǎng)物。 一般情 況，這些營(yíng)養(yǎng)物存在于上述的天然營(yíng)養(yǎng)源中。
該菌株固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，1天后開(kāi)始產(chǎn)茈醌類化合物，10天后產(chǎn)量達(dá)最高 峰。液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，1天后開(kāi)始產(chǎn)茈醌類化合物，3天后產(chǎn)量達(dá)最高峰。 生物材料祥品保藏
幼z'ra^平SUPER-H168野生型，巳保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱 CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM 207104，保藏日期為2007年7月12日。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
發(fā)酵菌株為竹黃菌CS/Wraz'"平)SUPER-H168，采用固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)基組成(重 量％):60目的玉米粉68.7,麩皮10，米糠20，葡萄糖l，KH2PO40.25，MgSO47H2O 0.05;加水拌料潤(rùn)濕，裝入廣口瓶中，O.lMPa滅菌45-60min，冷卻后接入液體 種子拌均。發(fā)酵溫度3(TC， pH6， IO天發(fā)酵結(jié)束后，茈醌類化合物產(chǎn)量達(dá)0.8% 左右，其中竹紅菌甲素為40%,竹紅菌乙素為55%。
實(shí)施例2
發(fā)酵菌株為竹黃菌(幼z'ra^^.)SUPER-H168，采用液態(tài)發(fā)酵，采用標(biāo)準(zhǔn)察氏 培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度28'C，發(fā)酵過(guò)程溶氧量為25%。 3天發(fā)酵結(jié)束后，茈醌類化 合物產(chǎn)量達(dá)0.07%左右，其中竹紅菌甲素為48%,竹紅菌乙素為43%。
序歹'J 表
SEQIDNO: 1:
gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataag caattatacc 60
gtgaaactgc gaatggctca ttaaatcagt tatcgtttat ttgatagtac cttactactt 120
ggataaccgt ggtaattcta gagctaatac atgcttacaa ccccgacttc ggaaggggtg 180
tatttattag ataaaaaacc aacgcccttc ggggcttctt ggtgattcat gataacttta 240
cggatcgcat ggccttgcgc cggcgacggt tcattcaaat ttctgcccta tcaactttcg 300
atggtaaggt attggcttac catggtttca acgggtaacg gggaattagg gttcgattcc 360
ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac 420
ccaatcccaa tacggggagg tagtgacaat aaatactgat acagggctct tttgggtctt 480
gtaattggaa tgagtacaat ttaaacctct taacgaggaa caattggagg gcaagtctgg 540
tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt gcagttaaaa 600
agctcgtagt tgaaccttgg gtctggctgg caggtccgcc tcaccgcgtg tacttgtccg 660
gccgggcctt ccttctggag aacctcatgc ccttcactgg gcgtgttggg gaccaggact 720
tttactttga aaaaattaga gtgttcaaag caggcctttg ctcgaatacg ttagcatgga 780
ataatagaat aggacgtgcg gtcctatttt gttggtttct aggaccgccg taatgattaa 840
tagggacagt cgggggcatc agtattcaat tgtcagaggt gaaattcttg gatttattga 900
agactaacta ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcagtg aacgaaagtt 960
aggggatcga agacgatcag ataccgtcgt agtcttaacc gtaaactatg ccgactaggg 1020
atcgggcgat gttatttttc tgactcgctc ggcaccttac gagaaatcaa agtttttggg 1080
ttctgggggg agtatggtcg caaggctgaa acttaaagaa attgacggaa gggcaccacc 1140
aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc aacacgggga aactcaccag gtccagatga 1200
aataaggatt gacagattga gagctctttc ttgatttttc aggtggtggt gcatggccgt 1260
tcttagttgg tggagtgatt tgtctgctta attgcgataa cgaacgagac cttaacctgc 1320
taaatagcca ggctagcttt ggctggtcgc cggcttctta gagggactat cggctcaagc 1380
cgatggaagt ttgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc 1440
gcgctacact gacagagcca acgagttctt caccttggcc ggaaggtctg ggtaatcttg 1500
ttaaactctg tcgtgctggg gatagagcat tgcaattatt gctcttcaac gaggaatgcc 1560
tagtaagcgc gtgtcatcag catgcgttga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc 1620
gtcgctacta ccgattgaat ggctcagtga ggcgtccgga ctggcttaga gaagttggca 1680
acgactactt tgagttggaa agttcgtcaa actcggtcat ttagaggaag taaaagtcgt 1740
aacaaggttt ccgtaggtga acctgcgga 1769
SEQIDNO: 2:
ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attacctagt 60
agtacggggt tatagcaata tagcccccgt ctgcacccat gtttatgcgt actacatgtt 120
tcctcggctg gttctccagc cgataggatc tcttaaactc attgtaattg caatcagcgt 180
ctgaaaaaat caatatttac aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa 240
gaacgcagcg aaatgcgata agtagtgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt 300
tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattcca tggggcatgc ctgttcgagc gtcatttgta 360
ccctcaagct atgcttggtg ttgggtgttt gtcctatcca ttgcgactgg actcgcctta 420
aagatattgg cagccggcat tttggccttg gagcgcagca caatttgcga gtccaagccg 480
gaatactgac gtccagataa gctttttacc acgtttgacc tcggatcagg tagggatacc 540
cgctgaactt aagcatatca ataagcggag ga 57權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)苝醌化合物的竹黃菌株，其分類命名為竹黃菌(Shiraiasp.)SUPER-H168，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M207104。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹黃菌株，其特征在于分子生物學(xué)18SrDNA序 列，其核苷酸序列為SEQIDNO: 1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹黃菌株，其特征在于分子生物學(xué)ITS 5.8S rDNA 序列，其核苷酸序列為SEQIDNO: 2。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹黃菌株，其特征在于經(jīng)過(guò)生物學(xué)手段改造后18S rDNA和ITS 5.8S rDNA與出發(fā)菌株CCTCC M 207104同源性達(dá)95%以上的菌 株。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹黃菌株，其特征在于其主要代謝產(chǎn)物為竹紅菌 甲素和竹紅菌乙素。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹黃菌株，其特征在于還產(chǎn)生幼/ra/" SUPER-H168代謝物母核的茈醌化合物。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹黃菌株，其特征在于可利用的碳源為葡萄糖、 果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清、木薯、玉米、甜菜、纖維 素或大米。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹黃菌株，其特征在于可利用的氮源為無(wú)機(jī)銨鹽、 無(wú)機(jī)硝酸鹽、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿或豆餅粉。
全文摘要
一株產(chǎn)苝醌化合物的竹黃菌株，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明菌株分類命名為竹黃菌(Shiraia sp.)SUPER-H168，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 207104。該菌株由通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)于江蘇無(wú)錫馬山短蕙竹上的竹黃子實(shí)體進(jìn)行分離篩選，得到了性狀穩(wěn)定，產(chǎn)苝醌類化合物的竹黃菌菌株，可通過(guò)固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)苝醌化合物。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101168728SQ200710132510
公開(kāi)日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日
發(fā)明者丁彥蕊, 強(qiáng) 孟, 廖祥儒, 張大兵, 梁曉輝, 蕾 王, 蔡宇杰, 金大勇 申請(qǐng)人:江南大學(xué)