專利名稱：：表達(dá)具有免疫激活功能的發(fā)夾rna的dna疫苗載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因免疫領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用于提高DNA疫苗免疫原性的表達(dá)載體、具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：DNA疫苗又稱基因疫苗、核酸疫苗或裸露的DNA。該類疫苗通過(guò)把抗原基因?qū)塍w內(nèi)表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防或治療疾病的目的，因此也被稱為基因免疫。DNA疫苗既可以誘導(dǎo)抗原特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)，又可以誘導(dǎo)抗原特異的體液免疫反應(yīng)，具有安全、模擬天然抗原呈遞過(guò)程、構(gòu)建周期短、生產(chǎn)簡(jiǎn)單、成本低、載體本身無(wú)免疫原性、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單、無(wú)需冷鏈等諸多優(yōu)點(diǎn)。作為一種新的疫苗形式，DNA疫苗的前景已經(jīng)逐步得到肯定，不但在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出非常好的潛力(HaigwoodNL，Immunollett，1999，66(1-3):183-188;ShiverJM，JPharmSci.1996，85(16):1317-1324)，而且在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出很好的安全性，受試者對(duì)DNA疫苗的耐受性也非常好。目前DNA疫苗面臨的主要問(wèn)題是免疫原性較弱。多年來(lái)，疫苗學(xué)家一直在嘗試不同的策略，期望能夠提高DNA疫苗的免疫效果，并為此進(jìn)行了許多努力和嘗試。DNA疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)需要抗原呈遞細(xì)胞獲取足夠的抗原并將其有效呈遞，在這一過(guò)程中，協(xié)同刺激信號(hào)、炎癥信號(hào)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生是誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)所必需的。研究表明，來(lái)源于病毒的一些特征能夠提供這類信號(hào)。很多病毒(尤其是RNA病毒)可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生重疊的RNA或是在RNA復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生雙鏈RNA中間體，而這些dsRNA分子可以作為一種病原相關(guān)分子特征(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMP)被免疫細(xì)胞內(nèi)的Toll樣受體(Toll-likeReceptor,TLR)3所識(shí)別(MatsumotoM，MicrobiolImmunol，2004，48(3):147-154)，通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)，并能促進(jìn)DC的成熟從而激活獲得性免疫應(yīng)答。另外，dsRNA分子還可以在胞內(nèi)激活依賴于雙鏈RNA的蛋白激酶PKR途徑和2'-5'-寡聚腺苷酸合成酶/RNaseL途徑(BarberGN，CellDeathDiffer,2001，8(2):113-126)，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以交叉提呈(Cross-presentation)的方式激活特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此如何將這種來(lái)源于病毒的特征應(yīng)用于DNA疫苗載體中以激活更廣泛的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制成為提高DNA疫苗免疫原性的關(guān)鍵之一。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的發(fā)夾RNA(hairpinRNA)的DNA序列。在另一方面，本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒包含一種表達(dá)載體和編碼抗原的外源基因，其中所述載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的發(fā)夾RNA的DNA序列。在另一方面，本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含如上所述的本發(fā)明的表達(dá)載體或者本發(fā)明的重組質(zhì)粒。在另一方面，本發(fā)明提供一種具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗，其包含如上所述的本發(fā)明的重組質(zhì)粒。在另一方面，本發(fā)明提供一種提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含將編碼抗原的外源基因克隆到本發(fā)明的表達(dá)載體中以構(gòu)建DNA疫苗。此外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的表達(dá)載體在制備具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗中的應(yīng)用。圖1為載體pDRVI3.1(A)、pDS40(B)結(jié)構(gòu)示意圖。Pcmv表示巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，BGHpA表示牛生長(zhǎng)激素(BGH)polyA信號(hào)，Amp表示氨芐青霉素抗性基因，Ori表示復(fù)制起始區(qū)，MCS表示供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，DS40表示一段具有反向互補(bǔ)重復(fù)的片段，可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成發(fā)夾RNA分子。圖2為pDRVI3.1-env，pDS40-env，pDRVI3.1-nef和pDS40隱nef結(jié)構(gòu)示意圖。載體元件說(shuō)明同圖1。圖3為PCR擴(kuò)增BGHpA片段及CMV啟動(dòng)子片段電泳圖，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BGHpA片段，2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物CMV啟動(dòng)子片段，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖4為PCR擴(kuò)增BGHpA-CMV啟動(dòng)子聯(lián)合片段電泳圖，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BGHpA-CMV啟動(dòng)子聯(lián)合片段，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖5為pDRVI3.1的酶切鑒定圖，1為pDRVI3.0的尸vmII酶切產(chǎn)物。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)lkbDNA梯帶(ladder);圖6為PCR擴(kuò)增熒光素酶(Luciferase)基因電泳圖，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熒光素酶基因，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000。圖7為PCR擴(kuò)增"e/基因電泳圖，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物"e/基因，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖8為pDRVI3.1-luc和pDS40-luc的iVcoI酶切鑒定圖，1為pDRVI3.0-luc的A^I酶切產(chǎn)物，2為pDS40-luc的A^coI酶切產(chǎn)物，M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)lkbDNA梯帶。圖9為pDRVI3.1-env禾QpDS40-env的TVcoI酶切鑒定圖，1為pDRVI3.0-env的TVcoI酶切產(chǎn)物，2為pDS40-env的TVcoI酶切產(chǎn)物，M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)lkbDNA梯帶。圖10為pDRVI3.1-nef和pDS40-nef的iVcoI酶切鑒定圖，1為pDRVI3.0-nef的iVcoI酶切產(chǎn)物，2為pDS40-nef的iVcol酶切產(chǎn)物，M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)lkbDNA梯帶。圖11為PCR擴(kuò)增DS40片段電泳圖，l為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DS40片段，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖12為DNA質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞48小時(shí)后，AnnexinV-FITC染色進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析(細(xì)胞凋亡)結(jié)果。A為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的Hda細(xì)胞，B為pDRVI3.1-luc轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，C為pDS40-luc轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞。圖13為熒光素酶表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果。A圖為不同DNA質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hda細(xì)胞48小時(shí)后檢測(cè)到的熒光素酶表達(dá)的情況。B圖為不同DNA質(zhì)粒肌肉注射于小鼠72小時(shí)后脛骨前肌中檢測(cè)到的熒光素酶表達(dá)的情況。圖14為ELISPOT法檢測(cè)HIV-1CN54Env抗原或Nef抗原特異性細(xì)胞免疫的結(jié)果。圖15為ELISA法檢測(cè)HIV-1CN54Env抗原或Nef抗原特異性結(jié)合抗體滴度的結(jié)果。圖16為DS40片段序列(SEQIDNO:ll)及轉(zhuǎn)錄后形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的發(fā)夾RNA(hairpinRNA)的DNA序列。術(shù)語(yǔ)"可操縱地連接"在本發(fā)明中是指兩種核苷酸序列是物理上或功能上相關(guān)聯(lián)的，例如一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域與一個(gè)核苷酸序列以這種方式連接，由此核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄由該啟動(dòng)子區(qū)域控制和調(diào)節(jié)。術(shù)語(yǔ)"具有免疫激活功能"在本發(fā)明中是指物質(zhì)能夠激活免疫系統(tǒng)或使免疫系統(tǒng)活性提高的功能，例如，與常規(guī)的DNA疫苗相比較，本發(fā)明的載體所表達(dá)的發(fā)夾RNA能夠引發(fā)免疫系統(tǒng)對(duì)DNA疫苗所產(chǎn)生的抗原產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的發(fā)夾RNA可用作分子佐劑，用于DNA疫苗，以增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性。例如，可在現(xiàn)有的DNA疫苗載體上插入發(fā)夾RNA表達(dá)盒，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可在抗原表達(dá)細(xì)胞中產(chǎn)生發(fā)夾RNA分子，由此誘導(dǎo)廣泛的免疫激活機(jī)制。本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒，其包含本發(fā)明的表達(dá)載體和編碼抗原的外源基因。本發(fā)明的重組質(zhì)粒中的"外源基因"包括但不限于編碼微生物例如病毒或者細(xì)菌的抗原性蛋白質(zhì)或者多肽的基因、以及編碼腫瘤抗原的基因。例如，所述外源基因是HIV-1CN54的e"v基因或"e/基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組質(zhì)粒中的外源基因是來(lái)自保藏號(hào)為CGMCCNo.2113的HIV-1CN54"e/基因或來(lái)自于保藏號(hào)為CGMCCNo.2112的HIV-1CN54em;基因。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組質(zhì)粒是pDS40-env和pDS40-nef重組質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的表達(dá)載體或者重組質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌，例如ToplO。本發(fā)明還提供了一種具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗，其包含本發(fā)明的重組質(zhì)粒，其中在現(xiàn)有的DNA疫苗載體上插入了發(fā)夾RNA表達(dá)盒。此類DNA疫苗經(jīng)接種于動(dòng)物后可在靶細(xì)胞中產(chǎn)生發(fā)夾RNA分子并表達(dá)DNA疫苗所編碼的抗原，由此通過(guò)發(fā)夾RNA分子誘導(dǎo)廣泛的免疫激活機(jī)制而增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)所述抗原而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明同時(shí)提供了一種提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含將編碼抗原的外源基因克隆到本發(fā)明的表達(dá)載體中以構(gòu)建DNA疫苗。此外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的表達(dá)載體在制備具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗中的應(yīng)用。以下將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，下述實(shí)施例的意圖是解釋本發(fā)明，而不應(yīng)以任何形式理解為意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒pcDNA3.1為Irwitrogen公司產(chǎn)品；攜帶熒光素酶熒光素酶基因的質(zhì)粒pGL2-Promoter為Promega公司產(chǎn)品；攜帶遺傳密碼優(yōu)化的"e/基因的大腸桿菌(Eyc/^n'c/z/aco//)ToplO/pDS-nef于2007年7月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)，北京)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2113;攜帶遺傳密碼優(yōu)化的e"v基因的大腸桿菌(&c/2m'c/n'aco//)ToplO/pDRVI3.1-env于2007年7月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)，北京)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2112;PyrobestDNAPolymerase高可信度擴(kuò)增酶為Takara公司產(chǎn)品；堿性磷酸酶、T4DNA連接酶為NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶均為Takara公司或NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品。DNA分子量Marker為Takara公司或北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司產(chǎn)品；瓊脂糖(Agarose)為GIBCOBRL公司產(chǎn)品。酵母粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品；Tris堿、X-gal、高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為Promega公司產(chǎn)品；其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；質(zhì)粒小量提取試劑盒E.Z.N.A.PlasmidMiniprepKitI質(zhì)粒、凝膠回收試劑盒E.Z.N.A.GelExtractionKit、純化試劑盒E.Z.N.ACycle-PureKit為Omega公司產(chǎn)品，制備無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA的EndofreePlasmidGigaKit為Qiagen公司產(chǎn)品；Lipofectamine2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；MouseIFN-YELISPOT檢測(cè)試劑盒為U-CyTech公司產(chǎn)品。大腸桿菌Topl0貝勾自Invitrogen公司；pGEM-T-easyVectorSystemI購(gòu)自Invitrogen公司；HeLa細(xì)胞株(ATCCCat.No.CCL-2)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心病毒免疫室保存，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、ly。青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中37i:、5%(]02培養(yǎng)，培養(yǎng)液均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所配液室提供。培養(yǎng)胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中山公司；來(lái)源于BVC重組亞型HIV-1CN54毒株的erw和nrf的合成肽庫(kù)分別用于Env和Nef抗原特異的IFN-y分析，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院艾滋病研究參比試劑項(xiàng)目(NIHAIDSResearch&ReferenceReagentProgram)饋贈(zèng)；ELISA檢測(cè)所用HIV-1env抗原和ne纖亢原由性病艾滋病預(yù)防控制中心病毒免疫室在大腸桿菌中表達(dá)并純化；凋亡檢測(cè)試劑AnnexinV-FITC為Pharmingen公司產(chǎn)品；Laborzentriftigen臺(tái)式冷凍離心機(jī)為Sigma公司產(chǎn)品，BeckmanJ2-MC高速冷凍離心機(jī)為BeckmanCoulter公司產(chǎn)品；GeneAmpPCRSystem9700PCR儀為PE公司產(chǎn)品；9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠產(chǎn)品；HPS280恒溫生化培養(yǎng)箱HZQX100振蕩培養(yǎng)箱為哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司產(chǎn)品；JY92II型超聲波破碎儀為寧波新技術(shù)公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱為SANYO公司產(chǎn)品；ReporterTM微孔板熒光發(fā)光計(jì)為TurnerDesigns公司產(chǎn)品；ELISA讀板機(jī)為DENLEY公司產(chǎn)品；ELISPOT讀板儀為BIOSIS公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6-8周齡BALB/cH-2d雌性小鼠體重18-25克購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物繁殖中心，清潔級(jí)飼養(yǎng)。實(shí)施例l:DNA疫苗載體pDRVI3.1的構(gòu)建為了使DNA疫苗質(zhì)粒能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生發(fā)夾RNA分子以起到增強(qiáng)免疫原性的效果，我們首先構(gòu)建了一攜帶有兩套啟動(dòng)子和polyA信號(hào)等基因表達(dá)調(diào)控元件的DNA疫苗載體pDRVI3.1，在該載體中，一套調(diào)控元件用于表達(dá)外源目的蛋白，另一套調(diào)控元件用于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有免疫佐劑效應(yīng)的發(fā)夾RNA分子。(1)PCR擴(kuò)增獲得BGHpA片段及CMV啟動(dòng)子片段引物設(shè)計(jì)引物名稱_引物序列_BGHpA陽(yáng)up5'-gCTCTAgATgCTgTgCCTTCTAgTTgCCAg-3'(SEQIDNO:1)BGHpA-dn5'-CTATgAACTAATgACCCCgTAATTAggTTTggTTTggTgggCTgATg-3'(SEQIDNO:2)Pcmv-up5'-ATTACggggTCATTAgTTCATAg-3'(SEQIDNO:3)Pcmv-dn5'陽(yáng)CgggATCCTCgggCCCTCTgACggTTCACTAAACgAg-3'(SEQIDNO:4)反應(yīng)體系無(wú)菌ddH2037.5jil，10xPCR緩沖液(含MgCl2)5|il，2.5mMdNTP4pl，引物BGHpA-up、BGHpA-dn(50iiM)各lpl(或引物Pcmv-up、Pcmv-dn各lpl)，質(zhì)粒pcDNA3.1模板(50ng/nl)l|il，PyrobestDNA聚合酶0.5^1，混勻后95'C變性3min，按下列循環(huán)條件進(jìn)行基因擴(kuò)增95°C變性30sec，55。C退火30sec，72。C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；72°。延伸8min。結(jié)果獲得了特異的擴(kuò)增產(chǎn)物BGHpA片段及CMV啟動(dòng)子片段(圖3)。(2)PCR擴(kuò)增獲得BGHpA-CMV啟動(dòng)子聯(lián)合片段借助BGHpA片段下游引物BGHpA-dn中的CTATgAACTAATgACCCCgTAAT序列與CMV啟動(dòng)子片段上游引物Pcmv-up中的ATTACggggTCATTAgTTCATAg序列為反向互補(bǔ)序列，再通過(guò)PCR的方法將CMV啟動(dòng)子片段置于BGHpA序列的下游。反應(yīng)體系無(wú)菌ddH2075nl，10xPCR緩沖液(含MgCl2)lOpl，2.5mMdNTP8|il，引物BGHpA-up、Pcmv-dn(50nM)各2|il，將擴(kuò)增出的BGHpA片段和CMV啟動(dòng)子片段混合作為模板共2pl，PyrobestDNA聚合酶1^1，混勻后95。C變性3min，按下列循環(huán)條件進(jìn)行基因擴(kuò)增95。C變性30sec，68。C退火及延伸2min，共35個(gè)循環(huán);72。C延伸10min。結(jié)果獲得了特異的擴(kuò)增產(chǎn)物BGHpA-CMV啟動(dòng)子聯(lián)合片段(圖4)。(3)DNA疫苗載體pDRVI3.1的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增出來(lái)的BGHpA-CMV啟動(dòng)子聯(lián)合片段切膠回收，^kzl和雙酶切后與相同酶切的DNA質(zhì)粒載體pcDNA3.1進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)，以J^"I和^al雙酶切篩選出陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒命名為pDouble。以尸wII酶切載體pDouble，膠回收大片段的載體，直接自身連接后轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)，以酶切后篩選陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒命名為pDRVI3.1。酶切反應(yīng)體系(制備)10x緩沖液5|il內(nèi)切酶各1^1質(zhì)?；蚱?5)^1ddH20補(bǔ)足至50)il。酶切反應(yīng)體系(鑒定)10x緩沖液2|il內(nèi)切酶各IN質(zhì)粒5^1ddH20補(bǔ)足至20pl。結(jié)果DNA疫苗載體pDRVI3.1構(gòu)建正確(圖5)。實(shí)施例2:重組質(zhì)粒pDRVI3.1-luc、pDRVI3.1-env及pDRVI3.1-nef的構(gòu)建G)PCR擴(kuò)增獲得熒光素酶基因引物設(shè)計(jì)引物名稱_引物序列_Luc-F5，-Cggg^rCCATggAAgACgCCAAAAACAT隱3，(SEQIDNO:5)Luc-R5，-Cggg^rCCTCACACggCgATCTTTCCgC-3，(SEQIDNO:6)反應(yīng)體系無(wú)菌ddH2037.5|il，10xPCR緩沖液(含MgCl2)5nl，2.5mMdNTP4^1，引物L(fēng)uc-F、Luc-R(50pM)各lpl，質(zhì)粒pGL2-Promoter模板(50ng/nl)lnl，PyrobestDNA聚合酶0.5pl，混勻后在GeneAmp2400PCR擴(kuò)增儀中95i:變性5min，按下列循環(huán)條件進(jìn)行基因合成95°C變性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。結(jié)果獲得了特異的擴(kuò)增產(chǎn)物熒光素酶基因片段(圖6)。(2)PCR擴(kuò)增獲得w/基因引物設(shè)計(jì)引物名稱引物序列Nef-up5，-CAg"K4rCACCATeATCgAggAgCTgATCTACAgC-3，(SEOIDNO:7、Nef-dn5，-CA一7^rcrCZ4a4TCAgCCgCCCTTCTCCTTCAsgAAg-3，(SEOIDNO:8)反應(yīng)體系無(wú)菌ddH2075|il，10xPCR緩沖液(含MgCl2)10pl，2.5mMdNTP8pl，引物Nef-up、Nef-dn(50pM)各2pl，質(zhì)粒pCRScript-gpnef模板(50ng/^1)2^1，PyrobestDNA聚合酶1^1，混勻后95°。變性5min，按下列循環(huán)條件進(jìn)行基因擴(kuò)增95"C變性30sec，60°C退火30sec，72。C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。結(jié)果獲得了特異的擴(kuò)增產(chǎn)物^/基因片段(圖7)。(3)重組質(zhì)粒pDRVI3.1-luc，pDRVI3.1-env及pDRVI3.1-nef的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增出來(lái)的熒光素酶基因片段以S"mHI單酶切，同樣用B"mHI單酶切DNA質(zhì)粒載體pDRVI3.1后用堿性磷酸酶CIP進(jìn)行去磷酸化，將熒光素酶基因片段與去磷酸化后的線性化載體pDRVI3.1進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T叩10感受態(tài)，以A^I單酶切篩選出正向的重組子，重組質(zhì)粒命名為pDRVI3.1-luc。e"v基因片段來(lái)源于HIV-1DNA疫苗質(zhì)粒pCRScript-GP140，以和￡coRV雙酶切載體pGP140，切膠回收ew基因片段并用T4DNA聚合酶進(jìn)行補(bǔ)平，以EcoRV單酶切載體pDRVI3.1并去磷酸化，將兩者連接后轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)，以A^I單酶切篩選出正向的重組子，重組質(zhì)粒命名為pDRVI3.1-env。將PCR擴(kuò)增出來(lái)的we/基因片段以EcoRV和A^al雙酶切，并與相同酶切的DNA質(zhì)粒載體pDRVI3.1進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)，以A^oI單酶切篩選出正向的重組子，重組質(zhì)粒命名為pDRVI3.1-nef。酶切反應(yīng)體系(制備)10x緩沖液5pl內(nèi)切酶各1^1質(zhì)?；蚱?5plddH20補(bǔ)足至50pl。酶切反應(yīng)體系(鑒定)10x緩沖液2^1內(nèi)切酶各lpl質(zhì)粒5^1ddH20補(bǔ)足至20pl。去磷酸化反應(yīng)體系10x緩沖液5^1堿性磷酸酶CIP1^1線性化的質(zhì)粒3(^1ddH20補(bǔ)足至50pl。DNA末端平端化反應(yīng)體系10x緩沖液T4DNA聚合酶5(^13(^1dNTP酶切后帶粘性末端的質(zhì)粒ddH20補(bǔ)足至50[xl。結(jié)果重組質(zhì)粒pDRVI3.1-luc，pDRVI3.1-env及pDRVI3.1-nef的構(gòu)建正確。pDRVI3.1-luc酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖8，pDRVI3.1-erw酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖9，pDRVI3.1-nef酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖10。攜帶基因的質(zhì)粒Top10/pDRVI3.1-env保藏號(hào)為CGMCCNo.2112。實(shí)施例3:重組質(zhì)粒pDS40-luc，pDS40-env及pDS40-nef的構(gòu)建(1)PCR擴(kuò)增獲得含40bp回文結(jié)構(gòu)的序列(DS40序列)引物設(shè)計(jì)引物名稱_引物序列_Ds40-up5，-TTgggCCCgCCgggAgATAgTgATgAAgTACATCCATTATAAgCTgTCgTTCAAgAgACgACAg-3，(SEQIDNO:9)Ds40-dn5,-TTggg￡￡￡CCgggAgATAgTgATgAAgTACATCCATTATAAgCTgTCgTCT反應(yīng)體系無(wú)菌ddH2038.5^1，10xPCR緩沖液(含MgCl2)5pl，2.5mMdNTP4(il，引物Ds40-up、Ds40-dn(50nM)互為模板各l|il，PyrobestDNA聚合酶0.5^1，混勻后95'C變性3min，按下列循環(huán)條件進(jìn)行基因擴(kuò)增95。C變性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸15sec，共5個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。結(jié)果獲得了特異的擴(kuò)增產(chǎn)物DS40片段(圖11)。CTTgAACgACAg-3，(SEQIDNO:10)(2)重組質(zhì)粒pDS40-luc，pDS40-env及pDS40-nef的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增出來(lái)的DS40片段以單酶切，同樣用j;^1分別單酶切DNA質(zhì)粒pDRVI3.1-luc，pDRVI3.1-env及pDRVI3.1-nef，用堿性磷酸酶CIP進(jìn)行去磷酸化，將DS40片段與去磷酸化后的線性化載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)，以A^oI單酶切篩選出正確的重組子，重組質(zhì)粒分別命名為pDS40-luc，pDS40-env及pDS40-nef。結(jié)果重組質(zhì)粒pDS40畫(huà)luc，pDS40-env及pDS40隱nef構(gòu)建正確。pDS40-luc酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖8，pDS40-env酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖9，pDS40-nef酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖10。攜帶"e/基因的質(zhì)粒ToplO/pDS40-nef保藏號(hào)為CGMCCNo.2113。實(shí)施例4.細(xì)胞凋亡檢測(cè)質(zhì)粒pDRVI3.1-luc、pDS40-luc轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，A皿exinV-FITC染色后流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞比例。步驟l:質(zhì)粒pDRVI3.1-luc、pDS40-luc用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染24孔板中的Hela細(xì)胞，質(zhì)粒用量2(ag/L，以DMEM維持液(2%FBS、1%PS、l%Gln)在5%0)2、37X:條件下培養(yǎng)48小時(shí)，并用不含質(zhì)粒的PBS作為陰性對(duì)照。步驟2:清洗并收集細(xì)胞，以結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞(結(jié)合緩沖液10mMHepes、140mMNaCl、2.5mMCaCl2，PH7.4)，1000rpm離心5min收集細(xì)胞。步驟3:用100pl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5plAnnexinV-FITC(25pg/ml)(BDPharmingen公司)，37。C避光放置20min。步驟4:以結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，1000rpm離心5min收集細(xì)胞。結(jié)合緩沖液重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)數(shù)10000點(diǎn)，分析凋亡細(xì)胞比例(％)。結(jié)果(圖12):質(zhì)粒pDRVI3.1-luc、pDS40-luc誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的比例分別為23.89%和30.48%;陰性對(duì)照的細(xì)胞凋亡比例為5.65%。結(jié)果表明，與不攜帶發(fā)夾RNA表達(dá)盒的質(zhì)粒pDRVI3.1-luc相比，攜帶發(fā)夾RNA表達(dá)盒的質(zhì)粒pDS40-luc未誘導(dǎo)更高水平的細(xì)胞凋亡。實(shí)施例5.熒光素酶表達(dá)水平檢測(cè)(1)體外細(xì)胞表達(dá)水平分析質(zhì)粒pDRVI3.1-luc及pDS40-luc轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，培養(yǎng)48小時(shí)，LucifemseAssaySystem分析熒光素酶的表達(dá)水平。步驟l:質(zhì)粒pDRVI3.1-luc及pDS40-luc用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染24孔板中的Hela細(xì)胞，質(zhì)粒用量2jig/L，以DMEM維持液(2%FBS、1%PS、l%Gln)在5%(302、37""C條件下培養(yǎng)48小時(shí)，并用不含質(zhì)粒的PBS作為空白對(duì)照。步驟2:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后倒去細(xì)胞培養(yǎng)液，用lxPBS洗兩遍細(xì)胞，加入500pl的lxLuciferaseCellCultureLysis溶液(Promega公司)于室溫培養(yǎng)30min。步驟3:混勻，吸取5^的細(xì)胞裂解液加入95pl的lxPBS中。按LuciferaseAssaySystem(Promega公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的操作，將樣品加入檢測(cè)專用96孔板，100pl/孔，迅速于每孔中加入100nl的LuciferaseAssayReagent,一次可以檢測(cè)16個(gè)樣品，馬上在ReporterTM微孔板熒光發(fā)光計(jì)上讀數(shù)。熒光素酶體外細(xì)胞表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示(圖13A):與對(duì)照的DNA質(zhì)粒pDRVI3.1-luc(熒光素酶活性平均為502862RLU)相比較，pDS40-luc(熒光素酶活性平均為414510RLU)在表達(dá)水平上并無(wú)顯著差異(PX).05)。(2)小鼠體內(nèi)表達(dá)水平分析將大量制備的無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒pDRVI3.1-luc及pDS40-luc(濃度均為1)ig/Vl)分別注射小鼠，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)2只小鼠，左右后肢各注射l次，注射量為50jal。用不含質(zhì)粒的PBS作為空白對(duì)照，設(shè)2只小鼠。步驟l:在注射小鼠72小時(shí)后，處死小鼠，取雙后肢注射部位肌肉，分別剪碎后置于含有250^1無(wú)菌ddH20的細(xì)胞凍存管內(nèi)，放入液氮中迅速冷凍30min，然后室溫緩慢融化，反復(fù)兩次。步驟2:加入250^1的2xLuciferaseCellCultureLysis混勻，室溫1小時(shí)，凍融物轉(zhuǎn)移至EP管中3000rpm離心5min，移出細(xì)胞裂解上清，進(jìn)行檢測(cè)或-8(TC保存。熒光素酶活性檢測(cè)同上。小鼠肌肉中熒光素酶的檢測(cè)結(jié)果顯示(圖13B):與對(duì)照的DNA質(zhì)粒pDRVI3.1-luc(熒光素酶活性平均為5630RLU)相比較，pDS40-luc(熒光素酶活性平均為5462RLU)在表達(dá)水平上并無(wú)顯著差異(PX).05)。實(shí)施例6.DNA疫苗免疫小鼠Env組Balb/c雌性小鼠分為6個(gè)免疫組和1個(gè)空白對(duì)照組。6個(gè)免疫組又分為高劑量3針組、高劑量2針組及低劑量3針組。其中高劑量3針組以40嗎的質(zhì)粒免疫小鼠3次；高劑量2針組以40pg的質(zhì)粒免疫小鼠2次；低劑量3針組以4嗎的質(zhì)粒免疫小鼠3次。將大量制備的無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒pDRVI3.1-env及pDS40-env稀釋為400ng4il(適用于高劑量組的注射)與40ngl(適用于低劑量組的注射)，空白對(duì)照組3只小鼠，不注射質(zhì)粒。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>Nef組Balb/c雌性小鼠分為2個(gè)免疫組和1個(gè)空白對(duì)照組。免疫組分別用大量制備的無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒pDRVI3.1-nef及pDS40-nef以40pg的劑量免疫3次?？瞻讓?duì)照組不注射質(zhì)粒。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>免疫方式與程序采用雙側(cè)后肢脛骨前肌注射方法。3針免疫組的免疫程序?yàn)榈?、2、4周各免疫一次，2針免疫組的免疫程序?yàn)榈?、4周各進(jìn)行一次免疫，所有的小鼠均在第6周眼眶采血分離血清，處死小鼠后分離脾淋巴細(xì)胞。實(shí)施例7.細(xì)胞免疫檢測(cè)(1)脾淋巴細(xì)胞的制備1)小鼠眼眶采血，血樣標(biāo)記后4。C過(guò)夜，第二天收集血清-2(TC保存。2)處死小鼠后取脾，在5mlHanks洗液中以紗布研磨分散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，1000rpm離心5min。3)棄上清，利用約100nl殘留液體重懸細(xì)胞后，加入2ml紅細(xì)胞裂解液，從第一管開(kāi)始計(jì)時(shí)，作用4min后，每管加入5mlRPMI-1640洗液終止裂解，1000rpm離心5min。4)棄上清，重懸細(xì)胞后，每管加入5mlRPMI-1640洗液洗細(xì)胞，1000rpm離心5min。5)棄上清，重懸細(xì)胞后，每管加入2mlRPMI-1640完全培養(yǎng)液，混勻后取5(^1細(xì)胞懸液以PBS稀釋10倍后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度到lxi()7/ml。(2)ELISPOT檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞反應(yīng)水平1)包被:在ELISPOT板中每孔加入包被抗體50pl，用PBS補(bǔ)充體積至每孔100^1，37。C2h。2)ELISPOT板的封閉3)取出已包被過(guò)的ELISPOT板，吸棄每孔中的包被抗體溶液。4)用300plPBST洗滌6次。5)在ELISPOT板中，每孔加入200^1含1%BSA的PBS，37°Clh。6)取出37。C下封閉lh的ELISPOT板，吸棄每孔中的封閉液。(不要洗板。)7)在ELISPOT板中，加入lOOpl多肽(先加肽再加細(xì)胞)，最后加入lOOpl淋巴細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)為lx106)，總體積到20(^1(每條多肽的終濃度為5|ag/ml，細(xì)胞的終濃度為lxl07/ml，即每孔細(xì)胞總數(shù)為lx106)。陰性對(duì)照不加多肽，力[U0(^1RPMI-1640完全培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照不加多肽，加入PMA2.5(il(25ng/ml)，Innomycin1^1(l嗎/ml)。免疫組各設(shè)2個(gè)復(fù)孔。8)蓋好ELISPOT板，于5%0)2、37'C條件下培養(yǎng)30小時(shí)。9)培養(yǎng)30h后，取出ELISPOT板。甩去細(xì)胞后，每孔加入200^冰冷的去離子水。把ELISPOT板放置在冰浴中10分鐘。10)用PBST洗板8次。11)每孔加入100pl生物素化的檢測(cè)抗體(detectorAb)。用膜封住ELISPOT板后，把ELISPOT板放置在37°C孵箱中孵育lh。12)取出ELISPOT板，倒去檢測(cè)抗體溶液，用PBST洗滌8次。13)每孔加入50plGABA溶液。用膜封住ELISPOT板后，把ELISPOT板放置在37。C孵箱中孵育lh。14)取出ELISPOT板，倒去GABA溶液。用PBST洗滌8次。洗滌完畢后，在吸水紙上輕輕拍干ELISPOT板。15)每孔加入30pl顯色溶液。在暗處、室溫下孵育(1540分鐘)。16)出現(xiàn)斑點(diǎn)后，用蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)。17)室溫下避光干燥，讀板儀檢測(cè)。小鼠的細(xì)胞免疫檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖14)用Eiw抗原或Nef抗原特異肽庫(kù)剌激小鼠脾細(xì)胞后分泌IFN-Y的細(xì)胞數(shù)量表示。A圖為DNA疫苗質(zhì)粒pDRVI3.1-env和pDS40-env在40jig劑量免疫小鼠3針后的結(jié)果，與質(zhì)粒pDRVI3.1-env所誘導(dǎo)的Env蛋白特異的分泌IFN-y的脾淋巴細(xì)胞數(shù)(102SFU/百萬(wàn)細(xì)胞)相比，攜帶發(fā)夾RNA的質(zhì)粒pDS40-env可以顯著地提高Env蛋白特異的分泌IFN-Y的脾淋巴細(xì)胞數(shù)(243SFU/百萬(wàn)細(xì)胞)(P<0.05)。B圖為DNA疫苗質(zhì)粒pDRVI3.1-env和pDS40-env在40|ig劑量免疫小鼠2針后的結(jié)果，相比較于質(zhì)粒pDRVI3.1-env(61SFU/百萬(wàn)細(xì)胞)，DNA疫苗質(zhì)粒pDS40-env可以顯著地提高Env蛋白特異的分泌IFN-y的脾淋巴細(xì)胞數(shù)(150SFU/百萬(wàn)細(xì)胞)(PO.05)。C圖為DNA疫苗質(zhì)粒pDRVI3.1-env和pDS40-env在4嗎劑量免疫小鼠3針后的結(jié)果，相比較于質(zhì)粒pDRVI3.1-env(43SFU/百萬(wàn)細(xì)胞)，DNA疫苗質(zhì)粒pDS40-env可以顯著地提高Env蛋白特異的分泌IFN-y的脾淋巴細(xì)胞數(shù)(103SFU/百萬(wàn)細(xì)胞)(PO.05)。D圖為DNA疫苗質(zhì)粒pDRVI3.1-nef和pDS40-nef在40(ig劑量免疫小鼠3針后的結(jié)果，與質(zhì)粒pDRVI3.1-nef所誘導(dǎo)的Nef蛋白特異的分泌IFN-y的脾淋巴細(xì)胞數(shù)(71SFU/百萬(wàn)細(xì)胞)相比，攜帶發(fā)夾RNA的質(zhì)粒pDS40-env可以顯著地提高Nef蛋白特異的分泌IFN-y的脾淋巴細(xì)胞數(shù)(263SFU/百萬(wàn)細(xì)胞)(P<0.05)。實(shí)施例8.體液免疫檢測(cè)ELISA方法檢測(cè)Env與Nef特異性IgG結(jié)合抗體滴度。步驟l:用純度大于90。/。的重組Erw抗原蛋白包被酶標(biāo)板(lpg/ml)，用純度大于85。/。的重組Ne航原蛋白包被酶標(biāo)板(3pg/ml)，每孔加0.1ml，4°C過(guò)夜。次日洗滌緩沖液(PBST)洗滌3次，甩盡殘余液體。以抗體稀釋液封閉60min，洗滌緩沖液洗滌3次，甩干后作檢測(cè)，或晾干后4t:保存。步驟2:加抗體稀釋液系列稀釋的待檢樣品(從1:50或1:100開(kāi)始，倍比稀釋)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37"C孵育60min，洗滌8次(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)。步驟3:于反應(yīng)孔中，加入新鮮h5000抗體稀釋液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗O.lml,37t:孵育60min，洗滌8次，最后一遍用雙蒸水洗滌。步驟4:加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入TMB底物溶液O.lml，37°C避光反應(yīng)10min。終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入50pl2M的硫酸。步驟5:結(jié)果判定在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm處(630nm為參考波長(zhǎng))，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。小鼠體液免疫反應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)圖15。A圖為DNA疫苗質(zhì)粒pDRVI3.1-erw和pDS40-env在40pg劑量免疫小鼠3針后的結(jié)果，與質(zhì)粒pDRVI3.1-env所誘導(dǎo)結(jié)合抗體滴度水平(l:7184)相比，攜帶發(fā)夾RNA的質(zhì)粒pDS40-eiw不能顯著地提高抗體滴度水平(h6400)(P>0.05)。B圖為DNA疫苗質(zhì)粒pDRVI3.1-env禾卩pDS40-env在40嗎劑量免疫小鼠2針后的結(jié)果，相比較于質(zhì)粒pDRVD.l-env(l:1008)，DNA疫苗質(zhì)粒pDS40-env不能顯著地提高結(jié)合抗體滴度水平(l:1131)(P>0.05)。C圖為DNA疫苗質(zhì)粒pDRVI3.1-env和pDS40-env在4嗎劑量免疫小鼠3針后的結(jié)果，相比較于質(zhì)粒pDRVI3.1-env(l:898)，DNA疫苗質(zhì)粒pDS40-env不能顯著地提高結(jié)合抗體滴度水平(l:800)(P>0.05)。D圖為DNA疫苗質(zhì)粒pDRVI3.1-nef和pDS40-ne贓40昭劑量免疫小鼠3針后的結(jié)果，與質(zhì)粒pDRVI3.1-ne0f誘導(dǎo)結(jié)合抗體滴度水平(l:5701)相比，攜帶發(fā)夾RNA的質(zhì)粒pDS40-nef顯著地降低了抗體滴度水平(l:1008)(P<0.05)。綜合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖14、圖15)，發(fā)夾RNA表達(dá)盒元件對(duì)于體液免疫應(yīng)答水平的提高沒(méi)有顯著的效果，但其可以顯著增強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，可以作為優(yōu)化DNA疫苗的元件。<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心〈120〉表達(dá)具有免疫激活功能的發(fā)夾RNA的DNA疫苗載體及其用途〈130〉1200701717c〈160〉11〈170>Patentlnversion3.3<210>1<211>30〈212〉隨<213>Artificial<220〉〈223〉primer<、1gctctagatgctgtgccttctagttgccag30<210〉2<211〉47〈212〉腿〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223〉primer〈400〉2ctatgaactaatgaccccgtaattaggtttgg"tggtgggctgatg47<210>3〈211〉23<212>DNA<213〉A(chǔ)rtificial<220><223〉primer<400>3attacggggtcattagttcatag23〈210〉4〈211〉37〈212〉瞧〈213>Artificial<220>〈223〉primer〈400〉4cgggatcctcgggccctctgacggttcactaaacgag37〈210〉5<211〉28〈212〉腿〈213〉A(chǔ)rtificial<220〉<223〉primer<400〉5cgggatccatggaagacgccaaaaacat28〈210〉6〈211>28<212〉腿〈213〉A(chǔ)rtificial<220〉<223〉primer<400〉6cgggatcctcacacggcgatctttccgc28<210〉了<211〉36〈212〉鵬〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉<223〉primer<400〉7caggatatcaccatgatcgaggagctgatctacagc36〈210〉8〈211〉40<212〉DMA<213>Artificial<220〉〈223〉primer<柳>8caggatatctctagatcagccgcccttctccttcaggaag40〈210〉9<211〉64〈212〉麗〈213〉A(chǔ)rtificial<220><223>primer<400〉9ttgggcccgccgggagatagtgatgaagtacatccattataagctgtcgttca卿gacg60acag64〈210〉10<211>63〈212〉鵬〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223〉primer〈400>10ttgggcccccgggagatagtgatgaagtacatccattataagctgtcgtctcttgaacga60cag63<210〉11〈211〉90〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificial<220〉<223〉hairpinRNAcodingsequence<400>11gccgggagatagtgatgaagtacatccattat貼gctgtcgttcaagagacgacagctta60taatggatgtacttcatcactatctcccgg90權(quán)利要求1.一種表達(dá)載體，其包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的發(fā)夾RNA的DNA序列。2.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。3.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中編碼所述發(fā)夾RNA的DNA序列具有SEQIDNO:13所示的序列。4.權(quán)利要求3的表達(dá)載體，其是圖1B所示的pDS40。5.—種重組質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的表達(dá)載體和編碼抗原的外源基因。6.權(quán)利要求5的重組質(zhì)粒，其中所述外源基因選自HIV-1CN54的，基因禾口"e/基因。7.權(quán)利要求6的重組質(zhì)粒，其中HIV-1CN54e"v基因來(lái)自保藏號(hào)為CGMCCNo.2112的ToplO/pDRVI3.1-env，HIV-1CN54"e/基因來(lái)自保藏號(hào)為CGMCCNo.2113的Top10/pDS40-nef。8.權(quán)利要求7的重組質(zhì)粒，其選自圖2所示的pDS40-env和pDS40-nef。9.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的表達(dá)載體或者權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)的重組質(zhì)粒。10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌。11.一種具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗，其包含權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)的重組質(zhì)粒。12.—種提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含將編碼抗原的外源基因克隆到權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的表達(dá)載體中以構(gòu)建DNA疫苗。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述編碼抗原的外源基因選自HIV-1CN54的ewv基因和"e/基因。14.權(quán)利要求13的方法，其中HIV-lCN54e"v基因來(lái)自保藏號(hào)為CGMCCNo.2112的Top10/pDRVB.1-env，HIV-1CN54"e/基因來(lái)自保藏號(hào)為CGMCCNo.2113的ToplO/pDS40誦nef。15.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的表達(dá)載體在制備具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種用于提高DNA疫苗免疫原性的表達(dá)載體，該載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼具有免疫激活功能的發(fā)夾RNA(hairpinRNA)的DNA序列。本發(fā)明還公開(kāi)了一種重組質(zhì)粒，其包含上述表達(dá)載體和編碼抗原的外源基因。本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了具有增強(qiáng)的免疫原性的DNA疫苗及其制備方法。文檔編號(hào)C12N15/63GK101353665SQ20071012978公開(kāi)日2009年1月28日申請(qǐng)日期2007年7月26日優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日發(fā)明者勇劉,張玉偉,李鼎鋒,邵一鳴申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心