專利名稱：檢測乙型肝炎病毒DNA的A₁₇₆₂T-G₁₇₆₄A雙突變的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測乙型肝炎病毒DNA Am2T-Gn64A雙突變的方法，特別是涉 及一種使用分子信標(biāo)熒光探針技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測方法。本發(fā)明還進(jìn)一步涉 及用于該臨床檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
病毒性乙型肝炎(HB， hepatitis B)是一種世界性的傳染性疾病(Lok AS, Heathcote EJ， Hoofoagle JH. Gastroenterology 2001; 120:1828-1853)。我國是HBV 感染的高發(fā)區(qū)，約50-70%的人群受過HBV的感染，約8-12%的人群為慢性HBV 感染者。目前全世界每年約有120萬人死于HBV感染引起的疾病。乙型肝炎病 毒感染不僅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且還與肝硬化(livercirrhosis, LC) 和肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma, HCC)的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。
臨床上HBeAg轉(zhuǎn)陰以及HBeAb陽性常常被認(rèn)為是HBV病毒復(fù)制減少、 肝損傷和肝癌危險(xiǎn)性減輕以及治療可以終止的指標(biāo)。然而，近期發(fā)現(xiàn)，許多患者 盡管HBeAg是陰性的，但病毒仍大量復(fù)制，肝損傷程度也很嚴(yán)重(即所謂的 HBeAg陰性慢性乙型肝炎)。近年來的臨床與基礎(chǔ)研究均表明，HBeAg陰性慢 性乙型肝炎在慢性乙型肝炎患者中所占的比例逐年增大，其在臨床表現(xiàn)、預(yù)后、 抗病毒治療方案與應(yīng)答等諸多方面與HBeAg陽性慢性乙型肝炎存在著顯著差 異。研究表明，HBeAg陰性慢性乙型肝炎是由于HBV基因組發(fā)生變異引起的。
HBV基因組共含有4個基因區(qū)，分別為S， C， P， X基因區(qū)，每個基因 區(qū)構(gòu)成一個獨(dú)立的開放閱讀框(ORF， open reading frame)。 C基因區(qū)又包括兩 部分前C (pre-C)區(qū)和C區(qū)。HBeAg是C基因區(qū)的表達(dá)產(chǎn)物，該基因區(qū)的5' 端發(fā)生突變常導(dǎo)致HBeAg分泌量的減少，且最常見的突變有兩種 一是C基因 啟動子處的1762 (A—T， A1762T)和1764 (G— A， G1764A)雙突變(Okamoto H, Tsuda F, Akahane Y, Sugai Y, Yoshiba M， Moriyama K， et al. J Virol 1994; 68:
8102-8110)，該突變導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的改變(Buckwold VE， Xu Z, Chen M, Yen TS， Ou JH. J Virol 1996; 70: 5845-5851 and Li J, Buckwold VE, Hon MW, Ou JH. J. Virol. 1999; 73: 1239-1244.)，以至于前C區(qū)mRNA的減少，從而減少了 HBeAg的合成；二是前C (pre-C)區(qū)的1896位點(diǎn)(G^A， G1896A)發(fā)生的突 變，該突變導(dǎo)致該區(qū)第28個密碼子成為終止密碼子，使得HBeAg的翻譯提前終 止，從而也減少了 HBeAg的合成(Carman WF, Jacyna MR， Hadziyannis S, Karayi纖is P, McGarvey MJ, Makris A, et al. Lancet 1989; 2: 588-591)。
近期研究又發(fā)現(xiàn)，約有70-90%的乙型肝炎患者(不管HBeAg是否是陰性) 都發(fā)生了 Ai762T-G1764A雙突變(Grandjacques C, Pradat P, Stuyver L, Chevallier M, Chevallier P, Pichoud C， et al. J Hepatol 2000; 33:430-439 and Yoo BC, Park JW, Kim HJ, Lee DH, Cha YJ, Park SM. J Hepatol 2003; 38:98-103 )。更有數(shù)據(jù)表明， A1762T-G1764A雙突變增加了病毒的復(fù)制能力(Buckwold VE, Xu Z, Chen M, Yen TS, Ou JH. J Virol 1996; 70: 5845-5851 )，并且使得患者發(fā)展成肝癌的風(fēng)險(xiǎn)性加大 (Kao JH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS. Gastroenterology 2003; 124: 327-334)。然而 不管A1762T-G1764A雙突變是導(dǎo)致HBeAg合成的減少，還是增加病毒復(fù)制以及增 加肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，該雙突變的檢測對乙型肝炎病毒的診療及預(yù)后都起著重要的指導(dǎo) 意義。
A1762T-G1764A雙突變常常是通過PCR擴(kuò)增后測序確定，或者通過線性探針 檢領(lǐng)!l(Stuyver L, De Gendt S, Cadranel JF, Van Geyt C， Van Reybroeck G Dorent R, et al. Hepatology 1999; 29: 1876-1883);更近的方法有通過TaqMan-MGB探針來 檢測(Annie Pang, Man-Fung Yuen, He-Jun Yuan, Ching-Lung Lai， Yok-Lam Kwong. Journal ofHepatology 2004; 40: 1008-1017)。然而測序方法比較麻煩，而且對突變 檢測的靈敏度沒有實(shí)時(shí)熒光PCR高；而線性探針的特異性又相對沒有分子信標(biāo) 好(Marras S.A.E， Kramer F.R., Tyagi S. The Humana Press Inc. 2003; 212: 111-128)。所以，本發(fā)明利用一種相對短的分子信標(biāo)熒光探針技術(shù)，高溫退火低 溫檢測熒光的實(shí)時(shí)PCR檢測方法；同時(shí)利用一種不標(biāo)記熒光基團(tuán)的野生型分子 信標(biāo)探針，試圖靈敏且特異地檢測出臨床血液標(biāo)本中A1762T-G1764A雙突變的乙 型肝炎病毒DNA。
發(fā)明目的
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測臨床血液標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA A1762T-G1764A雙突變的方法，特別是提供了一種使用分子信標(biāo)熒光探針技術(shù)的實(shí) 時(shí)PCR檢測方法。
本說明書中使用的術(shù)語"A1762T-G1764A雙突變"是指乙型肝炎病毒DNA序列 的第1762和1764位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生了突變，其中前者從堿基A變成堿基T，后者從 堿基G變成堿基A。
本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟(1)從待檢血液標(biāo)本中提取病毒DNA; (2) 使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針，對提取的病毒DNA進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR以擴(kuò)增包含1762和1764雙位點(diǎn)的靶DNA片段，并對A1762T-G1764A雙突變 進(jìn)行檢測；(3)根據(jù)實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增曲線，分析并判斷標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA 的A1762T-G1764A雙突變是否存在及其相對量。該方法的特征在于聚合酶鏈反應(yīng) 體系中使用的正向和反向引物分別是
(1) 5'陽CAACGACCGACCTTGAGGCATACTT-3， (SEQ ID NQ: 1)
(2) 5 ，-AAGTTGCATGGTGCTGGTGAACAGA-3 ， (SEQ K) NO:2)
并且實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中所用的分子信標(biāo)探針序列為
(3) 5，-FAM-CGCGTTAATGATCTTTGTAATCGCG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的待檢血液標(biāo)本是指含有乙型肝 炎病毒DNA的血液標(biāo)本。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的分子信標(biāo)探針是用來檢測血液 標(biāo)中含A1762T-G1764A雙突變的乙型肝炎病毒DNA,其中前者5'端標(biāo)記有FAM 熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有DABCYL淬滅基團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增所用的程序是 50°C 120秒(l個循環(huán))—95°C 180秒(l個循環(huán))~*95°C 10秒，58°C 30秒， 35。C30秒(40個循環(huán))。其中58'C是退火溫度，35。C是檢測熒光的溫度。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測乙型肝炎病毒DNA A1762T-G1764A雙突 變的試劑盒，該試劑盒包括(1)血液標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA提取試劑；(2) 聚合酶鏈反應(yīng)混合液；(3)酶混合液；(4)陽性對照；(5)野生型對照；(6)陰
性對照。
其特征在于聚合酶鏈反應(yīng)體系中使用的正向和反向引物分別是
(1) 5'-CAACGACCGACCTTGAGGCATACTT-3， (SEQ ID NO:l)
(2) 5,-AAGTTGCATGGTGCTGGTGAACAGA-3， (SEQ ID NO:2)
并且實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中所用的相對短的分子信標(biāo)探針序列為
(3) 5'-FAM-CGCGTTAATGATCTTTGTAATCGCG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的DNA提取試劑由提取液A、 提取液B和提取液C組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的聚合酶鏈反應(yīng)混合液10xPCR buffer、 dUTPs、正反向兩條引物、分子信標(biāo)探針等組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的酶混合液由普通Taq酶和UNG 酶組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的陽性對照是經(jīng)過測序確認(rèn)過的 含A1762T-G1764A雙突變的HBV DNA片段的質(zhì)粒；野生型對照是經(jīng)過測序過的 含1762、 1764位點(diǎn)都不發(fā)生突變的野生型HBV DNA片段的質(zhì)粒；陰性對照是 高壓滅菌水。
根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于用于聚合酶鏈反應(yīng)的正向和反向 引物分別是
(1) 5，-CAACGACCGACCTTGAGGCATACTT-3， (SEQIDN。:1) (2 ) 5 ,-AAGTTGCATGGTGCTGGTGAACAGA-3 ， (SEQ ID NO:2)
并且實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中所用的相對短的分子信標(biāo)探針為
(3) 5 ，-FAM-CGCGTTAATGATCTTTGTAATCGCG-DABCYL-3' (SEQ ID NO:3)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測臨床血液標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA A1762T-G1764A雙突 變的方法，特別是提供了一種使用分子信標(biāo)熒光探針技術(shù)，實(shí)時(shí)PCR檢測方法。 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了用于檢測臨床血液標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA A1762T-G1764A雙突變的試劑盒。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一個適于檢測乙型肝炎病 毒DNA中An62T-Gne4A雙突變的方法，該方法包括(1)從待檢血液標(biāo)本中提 取病毒DNA; (2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針，對提取的病毒
DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR以擴(kuò)增包含1762和1764雙位點(diǎn)的靶DNA片段，并對 Am2T-Gn64A雙突變進(jìn)行檢領(lǐng)lj; (3)根據(jù)實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增曲線，分析并判斷標(biāo) 本中乙型肝炎病毒DNA的A1762T-G1764A雙突變是否存在及其相對量。該方法的 特征在于聚合酶鏈反應(yīng)體系中使用的正向和反向引物分別是
(1) 5，-CAACGACCGACCTTGAGGCATACTT-3， (SEQIDNO:l)
(2) 5，-AAGTTGCATGGTGCTGGTGAACAGA-3， (SEQIDNO:2)
并且實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中所用的分子信標(biāo)探針為
(3) 5，-FAM-CGCGTTAATGATCTTTGTAATCGCG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3) 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的待檢血液標(biāo)本是指含有乙型肝炎
病毒DNA的血液標(biāo)本。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的分子信標(biāo)探針是用來檢測血液 標(biāo)本中含A1762T-G1764A雙突變的乙型肝炎病毒DNA。其中前者5'端標(biāo)記有FAM 熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有DABCYL淬滅基團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增所用的程序是 50°C 120秒(1個循環(huán))"~ 95°C 180秒(1個循環(huán)) 95°C IO秒，58°C 30秒，35°C 30秒(40個循環(huán))。其中58'C是退火溫度，35'C是檢測熒光的溫度。
簡單地說，為了完成本發(fā)明的方法，首先提取待檢臨床血液標(biāo)本中乙型肝炎 病毒DNA，然后以提取的DNA為模板，使用合成的正向和反向寡核苷酸引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增時(shí)以FAM和DABCYL修飾的分子信標(biāo)熒光探針檢測乙型肝 炎病毒DNA的A1762T-G1764A雙突變。最后再根據(jù)PCR的擴(kuò)增曲線判斷標(biāo)本中 是否含有乙型肝炎病毒DNA的A1762T-G1764A雙突變。現(xiàn)針對本發(fā)明的幾個主要 步驟，分別詳述如下
1. 乙型肝炎病毒DNA的提取
本發(fā)明采用的是優(yōu)化后的乙型肝炎病毒DNA的提取方法。首先是在約50M1 的臨床血液標(biāo)本中加入PEG8000以沉淀病毒，離心后去掉上清；再加入NaOH 并在95'C下使病毒完全裂解；最后再加入Tris-HCl以中和裂解液，離心后取5/d 上清用于PCR擴(kuò)增。
2. 引物的設(shè)計(jì)和合成
為了特異、高效地?cái)U(kuò)增待檢臨床血液標(biāo)本中包含1762和1764雙位點(diǎn)的靶 DNA片段，我們從GeneBank中調(diào)出乙型肝炎病毒各亞型的盡可能多的全基因
組DNA序列，然后通過DNAStar軟件進(jìn)行各亞型序列比較，并把序列比較后的 Consensus序列輸出。接著從Consensus序列中找出含1762-1764雙位點(diǎn)的長約 200bp( 1762-1764雙位點(diǎn)處在中間)的一段序列用Beacon5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。 最后再把Beacon5.0軟件找好的引物序列到比較好的各亞型序列中去核對其保守 性，若保守就可發(fā)到引物合成公司(主要是上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司) 進(jìn)行合成。本發(fā)明中設(shè)計(jì)的一條正向和一條反向引物的序列分別是-
(1) 5，-CAACGACCGACCTTGAGGCATACTT-3， (SEQ ID NO: 1)
(2) 5，畫AAGTTGCATGGTGCTGGTGAACAGA-3 ， (SEQ ID NO:2)
3. 探針的合成和標(biāo)記
分析An62T-Gn64A雙位點(diǎn)上下游序列的保守性，我們合成了一條環(huán)為17個 堿基臂為4個堿基的分子信標(biāo)熒光探針，該探針5'端標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)，3' 端標(biāo)記有DABCYL淬滅基團(tuán)，用來檢測含A1762T-G1764A雙突變的臨床血液標(biāo)本 中的乙型肝炎病毒DNA。具體序列如下 (3) 5，-FAM-CGCGTTAATGATCTTTGTAATCGCG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
4. 核酸擴(kuò)增體系的優(yōu)化
為了增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的效果(主要是曲線的光滑度和熒光強(qiáng)度)，并且提高 A1762T-G1764A雙突變檢測的靈敏度和特異性，我們首先對PCR擴(kuò)增程序的各個 參數(shù)(主要是退火溫度和時(shí)間以及檢測溫度和時(shí)間)進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇的運(yùn)行 程序是50°C 120秒(l個循環(huán))—95°C 180秒(l個循環(huán))—95°C 10秒，58°C 30秒，35°C 30秒(40個循環(huán))。其中58'C是退火溫度，35"C是檢測熒光的溫度。 然后在這個PCR擴(kuò)增程序的基礎(chǔ)上再對MgC12濃度、Taq酶、dUTPs、 Tris-HCl、 KC1、引物和探針的用量進(jìn)行優(yōu)化。
5. 擴(kuò)增結(jié)果的分析和判斷
熒光明顯比熒光域值(在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在 熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍)高，擴(kuò)增曲線光滑且明顯呈S型趨勢的 才能判斷為陽性(即八17621^31764八雙突變)；否則為陰性。每個實(shí)驗(yàn)的陽性對照 的擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)確定是陽性，非特異性對照和陰性對照的擴(kuò)增結(jié)果都應(yīng)是確定的陰 性才可以。
如前所述，由于本發(fā)明采用了分子信標(biāo)熒光探針，使得Am2T-Gr764A雙突變
檢測的靈敏度和特異性都完全可以符合臨床需求。另外，本發(fā)明采用高溫退火低 溫檢測熒光的方法，再對MgCb濃度、Taq酶、dUTPs、 Tris-HCl、 KC1、引 物和探針的用量進(jìn)行優(yōu)化，使得FAM標(biāo)記的相對短的分子信標(biāo)探針的檢測結(jié)果 更加美觀和穩(wěn)定，從而使得檢測結(jié)果更加可靠。此外，本發(fā)明只檢測一種最通用 的熒光——FAM熒光，適用于所有熒光PCR儀檢測，而且也大大減少了檢測成 本，利于推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測乙型肝炎病毒DNAA1762T-G1764A雙突 變的試劑盒，該試劑盒包括(1)血液標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA提取試劑；(2) 聚合酶鏈反應(yīng)混合液；(3)酶混合液；(4)陽性對照；(5)野生型對照；(6)陰 性對照。其特征在于聚合酶鏈反應(yīng)體系中使用的正向和反向引物分別是
(1) 5，-CAACGACCGACCTTGAGGCATACTT-3， (SEQ ID NO: 1)
(2) 5，-AAGTTGCATGGTGCTGGTGAACAGA-3 ， (SEQ ID NO:2)
并且實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中所用的分子信標(biāo)探針序列為
(3) 5'-FAM扁CGCGTTAATGATCTTTGTAATCGCG-DABCYL-3， (SEQE) NO:3)
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的DNA提取試劑由提取液A (40%PEG8000)、提取液B (0.25MNaOH)和提取液C (0.4M Tris-HCl， pH6.4)組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的聚合酶鏈反應(yīng)混合液(每人份) 由2.5/d 10xPCR buffer ( 850rnM KC1， 400 mM Tris-Cl， pH8.9， 50%v/v甘油)、 0.2/xl dUTPs (dATP、 dUTP、 dGTP、 dCTP各25mM)、正反向兩條引物(都是 100/xM)各0.1/xl、分子信標(biāo)探針(100/iM) O.ljid和不標(biāo)記熒光基團(tuán)的野生型探 針(100/xM) O.l;zl、 2.5ptlMgCl2 (25mM)等組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的酶混合液由普通Taq酶(5U//^1) 和UNG酶(lU/pd)按v/v-5:l組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的陽性對照是經(jīng)過測序確認(rèn)過的 含An62T-Gn64A雙突變的HBV DNA片段的質(zhì)粒；野生型對照是測序確認(rèn)過的 含1762、 1764位點(diǎn)都不發(fā)生突變的野生型HBV DNA片段的質(zhì)粒；陰性對照是 高壓滅菌水。
根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于聚合酶鏈反應(yīng)的正向和反向引物 分別是
(1) 5，-CAACGACCGACCTTGAGGCATACTT-3， (SEQIDNO:l)
(2) 5 ，-AAGTTGCATGGTGCTGGTGAACAGA-3' (SEQ ID NO:2)
并且實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中所用的分子信標(biāo)探針序列為
(3)5'-FAM-CGCGTTAATGATCTTTGTAATCGCG陽DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
本發(fā)明的試劑盒不但能非常特異地檢測到乙型肝炎病毒DNA的 A,762T-Gn64A雙突變，而且其檢測靈敏度遠(yuǎn)大于測序，能檢測到野生型和突變型 雜合模板中大于等于5%以上的突變型模板(雜合模板的乙型肝炎病毒DNA的 濃度是1.0X107copies/ml);引物和探針序列都非常保守，所以試劑盒檢測的準(zhǔn)確 性極高，幾乎無漏檢現(xiàn)象。所以本發(fā)明的方法和試劑盒特別適用于臨床血液標(biāo)本 中乙型肝炎病毒DNA的A1762T-G1764A雙突變的確認(rèn)。


圖1顯示乙型肝炎病毒DNAAn62T-Gn64A雙突變的靈敏度檢測結(jié)果。所用 的模板都是經(jīng)過測序確認(rèn)過的含A1762T-G1764A雙突變的HBV DNA片段的質(zhì)粒， 其中濃度最高的模板濃度約為1.0xl06cOpieS/ml，濃度最低的模板濃度約為 1.0xl02copies/ml。
圖2顯示乙型肝炎病毒DNA A1762T-G1764A雙突變的特異性檢測結(jié)果。所用 的模板都是經(jīng)過測序確認(rèn)過的含1762、 1764位點(diǎn)都不發(fā)生突變的野生型HBV DNA片段的質(zhì)粒。
圖3顯示乙型肝炎病毒DNA野生型和An62T-Gn64A雙突變型雜合模板的靈 敏度檢測結(jié)果。所用的雜合模板是把血清中乙型肝炎病毒DNA濃度都為 1.0xl0、叩ies/ml的Al762T-G1764A雙突變的模板和1762、 1764位點(diǎn)都不發(fā)生突變 的野生型模板按v/v分別為50:50、 40:60、 30:70、 20:80、 10:90和5:95的比例混 合而成，各雜合比例的模板擴(kuò)增曲線依次是圖中按從左到右順序排列。
圖4顯示33例含乙型肝炎病毒DNA的臨床血清的A1762T-G1764A雙突變 的熒光PCR檢測結(jié)果和測序結(jié)果的比較。所用血清的HBVDNA拷貝數(shù)是用英 科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司的HBV DNA熒光PCR定量檢測試劑盒定量的。 具體拷貝數(shù)如"3.65E+08"實(shí)際上是指被檢標(biāo)本中含3.65xl08copies/ml的HBV
DNA。
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:臨床血液標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA的提取
從臨床血液標(biāo)本中取出50pl血清到一高壓過的1.5ml的離心管中，加入25/d 提取液A (40%PEG-8000)，振蕩混勻5s， 12，500g離心5min;棄上清，加25/d 提取液B (0.25M NaOH)，振蕩15s,使沉淀盡量溶解，96'C裂解10min;加提 取液C (0.4M Tris-HC1緩沖液，pH6.4) 25/xl，混勻，96°C lOmiti; 12，500g離 心15min，取5^1上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
實(shí)施例2:靶核酸的PCR擴(kuò)增
在一 PCR反應(yīng)管中加入單人份的PCR反應(yīng)混合液，再加入0.2/d的酶混合液， 最后再加入5/xl模板(待檢模板或陰陽性對照品)，充分混勻后稍稍離心(約5 秒)。然后將反應(yīng)管放入PCR儀(能檢測到FAM的PCR儀)，按下列條件擴(kuò)增 50°C 120秒(l個循環(huán))—95°C 180秒(l個循環(huán))—95°C 10秒，58°C 30秒， 35'C30秒(40個循環(huán))。其中58'C是退火溫度，35'C是檢測熒光的溫度。
所使用的PCR擴(kuò)增體系中包括2.5ptl 10x PCRbuffer(850mMKCl，400mM Tris-Cl， pH8.9， 50。/。v/v甘油)、0.2/d酶混合液、0.2/xl dUTPs (含dATP、 dUTP、 dGTP、dCTP各25mM)、正反向兩條引物(SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2， 100/iM) 各0.1jd、分子信標(biāo)探針和不標(biāo)記熒光基團(tuán)的野生型探針(SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4， 100/xM)各0.1/d、 25 mM MgCl2 和模板，最后補(bǔ)水到25^1。
實(shí)施例3:乙型肝炎病毒DNAA1762T-G1764A雙突變的靈敏度和特異性檢測
以含A1762T-G1764A雙突變的乙型肝炎病毒DNA片段的質(zhì)粒(l.OxlO6 copies/ml-1.0xl02copy/ml)為模板，使用本發(fā)明的試劑對乙型肝炎病 毒DNA An62T-Gn64A雙突變的靈敏度進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果參見附圖1。從圖1 的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的方法和試劑盒至少可以檢測到模板濃度僅為 1.0xl02a)py/ml的A1762T-G1764A雙突變的乙型肝炎病毒DNA。換句話說，就是 本發(fā)明的靈敏度完全可以符合臨床的需求。
以10個含有1762、 1764位點(diǎn)都不發(fā)生突變的野生型的乙型肝炎病毒DNA 片段的質(zhì)粒(約1.0xl06COpieS/ml)為模板，使用本發(fā)明的試劑對乙型肝炎病毒 DNAA^2T-Gm4A雙突變的特異性進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果參見附圖2。從圖2的結(jié) 果可以看出，本發(fā)明的方法和試劑盒對1762、 1764位點(diǎn)都不發(fā)生突變的野生型 乙型肝炎病毒DNA的檢測結(jié)果為陰性。
實(shí)施例4:野生型和突變型雜合模板的靈敏度檢測
把血清中乙型肝炎病毒DNA濃度都為1.0xl07copies/ml的A1762T-G1764A雙 突變的標(biāo)本和1762、 1764位點(diǎn)都不發(fā)生突變的野生型模板按v/v分別為50 : 50、 40 : 60、 30 : 70、 20 : 80、 10 : 90禾卩5 : 95的比例混合，再以各比例的混合好 的標(biāo)本為模板，用本發(fā)明的試劑進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果參見附圖3。從圖3的結(jié)果 可以看出，本發(fā)明的方法和試劑盒至少可檢測到野生和突變雜合模板中只占5% 的A1762T-G1764A雙突變的模板，靈敏度遠(yuǎn)大于測序(測序?qū)﹄s合模板的檢測靈 敏度一般是20%以上)。
實(shí)施例5:臨床血清標(biāo)本的檢測
使用本發(fā)明的方法和試劑盒，對33份含乙型肝炎病毒DNA的臨床血清標(biāo) 本進(jìn)行檢測，其中23例為突變，IO例為野生。為了進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明方法的準(zhǔn) 確性，對上面33份標(biāo)本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明，使用本發(fā)明的試 劑盒檢測的結(jié)果和測序結(jié)果完全吻合(具體結(jié)果參照圖4)。可見本發(fā)明的方法 和試劑盒完全可以滿足臨床檢測的需要。
序列表
<110>英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司
<120>乙型肝炎病毒DNAA1762T-G17MA雙突變檢測方法及試劑盒
<140>
<141>
<160>2
<210> 1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 1
CAACGACCGA CCTTGAGGCA TACTT
<210> 2 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 2
AAGTTGCATG GTGCTGGTGA ACAGA
<210> 3 <211>25 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。 <400> 2
CGCGTTAATGATCTTTGTAA TCGCG
權(quán)利要求
1.一種檢測臨床血液標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA A1762T-G1764A雙突變的方法，該方法包括以下步驟(1)從待檢血液標(biāo)本中提取病毒DNA；(2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針，對提取的病毒DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR以擴(kuò)增包含1762和1764雙位點(diǎn)的靶DNA片段，并對A1762T-G1764A雙突變進(jìn)行檢測；(3)根據(jù)實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增曲線，分析并判斷標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA的A1762T-G1764A雙突變是否存在及其相對量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中待檢DNA擴(kuò)增所用的正向和反向引物分別是(1) 5， -CAACGACCGACCTTGAGGCATACTT-3，(SEQ ID NO:l)(2) 5， -AAGTTGCATGGTGCTGGTGAACAGA-3，(SEQ ID NO:2) 并且實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中所用的分子信標(biāo)探針序列為(3) 5， -FAM-CGCGTTMTGATCTTTGTAATCGCG-DABCYL-3' (SEQ ID N0:3)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增所用的程序是5(TC 120 秒(l個循環(huán))—95°C 180秒(l個循環(huán))—95°C 10秒，58°C 30秒，35°C 30秒(40個循環(huán))。其中58。C是退火溫度，35。C是檢測熒光的溫度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說的待檢血液標(biāo)本是指含有乙型肝炎病毒DNA 的血液標(biāo)本。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的分子信標(biāo)探針是用來檢測血液標(biāo)本中含 A17e2T-G1764A雙突變的乙型肝炎病毒DNA，其中前者5'端標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)， 3'端標(biāo)記有DABCYL淬滅基團(tuán)。
6. —種用于檢測乙型肝炎病毒DNA A1762T-G1764A雙突變的試劑盒，該試劑盒包括(l)血液標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA提取試劑；(2)聚合酶鏈反應(yīng)混合液；(3)酶混合液；(4)陽性對照；(5)野生型對照；(6)陰性對照。其中(1)由提取液A、提取液B和提取液C組成；(2)由10XPCR buffer、 dUTPs、正反向 兩條引物、分子信標(biāo)探針和不標(biāo)記熒光基團(tuán)的野生型探針等組成；(3)由普 通Taq酶和UNG酶組成；(4)為經(jīng)過測序確認(rèn)過的含A1762T-G e4A雙突變的HBV DNA片段的質(zhì)粒；(5)是經(jīng)過測序確認(rèn)過的含1762、 1764位點(diǎn)都不發(fā)生突變 的野生型HBV DNA片段的質(zhì)粒；(6)為高壓滅菌水。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中用于聚合酶鏈反應(yīng)的正向和反向引物分別是:(1) 5' -CAACGACCGACCTTGAGGCATACTT-3， (SEQ ID N0:1)(2) 5， -AAGTTGCATGGTGCTGGTGAACAGA-3， (SEQ ID NO:2)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中用于聚合酶鏈反應(yīng)的分子信標(biāo)探針序列為(3) 5， -FAM—CGCGTTAATGATCTTTGTAATCGCG-DABCYL-3，(SEQ ID NO:3)°
全文摘要
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒DNA A₁₇₆₂T-G₁₇₆₄A雙突變檢測方法和試劑盒，特別是涉及使用分子信標(biāo)熒光探針技術(shù)和實(shí)時(shí)PCR方法檢測乙型肝炎病毒DNA序列中的A₁₇₆₂T-G₁₇₆₄A雙突變方法及用于完成該檢測的試劑盒。本發(fā)明的方法可以特異且靈敏地檢測出臨床血液標(biāo)本中A₁₇₆₂T-G₁₇₆₄A雙突變的乙型肝炎病毒DNA。
文檔編號C12Q1/70GK101338344SQ20071012956
公開日2009年1月7日 申請日期2007年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者宋慶濤, 蔡劍英 申請人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司