專利名稱：：一種熒光標記的寡核苷酸探針及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種熒光標記的寡核苷酸探針及其應用。技術背景核酸檢測隨著其在基因分型、遺傳病診斷、病源微生物檢測等領域的廣泛應用正變得越來越重要，而基于聚合酶鏈式反應(PCR)的核酸擴增技術為這些應用提供了強大的工具[ChanYR,MorrisA.CurrOpinInfectDis.2007;20(2):157-64;MalinowskiDP.ExpertRevMolDiagn.2007;7(3):269-80.]。而且，隨著實時熒光PCR技術的出現，使得核酸檢測不再依賴擴增后的凝膠電泳檢測，而變得更加方便和實用[ParasharD.etal.IndianJMedRes.2006;124(4):385-98;ValasekMA,RepaJJ.AdvPhysiolEduc.2005;29(3):151-9.]。上個世紀90年代美國PerkinElmer(PE)公司開發(fā)出了Taqman熒光探針技術(WO96/15270)，極大地拓展了熒光定量PCR的應用范圍。其工作原理是熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET):—對合適的熒光物質可以構成一個能量供體(donor)和能量受體(acc印tor)對，其中供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，當它們在空間上相互接近到一定距離(l10nm)時，激發(fā)供體而產生的熒光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發(fā)射的熒光強度衰減，受體熒光分子的熒光強度增強。能量傳遞的效率與供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等有關系。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5'末端，淬滅基團在3'末端。當探針完好時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅劑接近而被淬滅。當探針與靶序列配對時，由于DNA聚合酶具有5'外切酶活性，隨著延伸反應的進行探針被聚合酶分解，使得熒光基團與淬滅基團分離，熒光基團發(fā)射熒光。體系中有一分子的PCR產物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環(huán)數的增加，擴增產物也不斷增加，釋放出來的熒光基團就不斷積累。通過對熒光信號的檢測，就可以達到對PCR擴增產物進行實時定量檢測的目的。為了保證檢測的靈敏度和特異性，在采用T叫Man探針的PCR體系中一般采用基因序列特異性引物進行目的基因擴增，同時加入序列特異性的TaqMan探針對靶序列進行檢測。在反應初始階段TaqMan探針結構完整，此時系統(tǒng)激發(fā)探針上的供體產生的熒光信號被臨近的淬滅基團所吸收，因而檢測不到熒光信號，隨著PCR擴增的進行當有目的基因片段產生時，TaqMan探針就會與模版進行配對雜交，當TaqDNA聚合酶擴增到模版上探針結合的位置時，其5'-3'核酸外切酶的活性(也就是切口平移)切割掉探針5'端的報告基團使其游離到反應體系中去，游離的報告基團由于遠離淬滅基團，打破了供體和受體之間能量共振平衡，此時激發(fā)報告基團產生的熒光信號就可以被熒光檢測系統(tǒng)檢測到。這樣每擴增一個目的基因分子，就產生一個對應的游離熒光分子，而且熒光分子的累積是與PCR產物的生成等比例的，這樣通過對熒光信號的檢測就可以達到實時監(jiān)控PCR產物擴增的過程。當PCR產物的產生進入快速的指數增長階段時，熒光信號的強度也呈指數增強。由于熒光信號和PCR產物的量保持嚴格的比例關系，從而就可以通過作標準曲線達到準確定量PCR的起始模版拷貝數的目的。為了保證在PCR擴增過程中，T叫Man探針與模版的結合效率，一般所設計的探針的Tm值(解鏈溫度)必須比擴增引物的Tm值要高(一般高51(TC)，而引物的長度一般在1825個堿基，所以TaqMan探針的長度一般為2040個堿基，其中多為2030個堿基。而Perkin-Elraer公司于1995年申請的Taqman探針專利(W096/15270)中認為探針的長度應該在1560堿基之間。但在實際使用過程中，當探針較長時使得探針兩端的熒光供體和受體基團距離較遠，導致熒光淬滅效率降低，而且淬滅基團本身有的也會產生熒光信號，這都會使得反應的本底偏高，降低檢測的靈敏度。而如果為了增加淬滅效果縮短探針的長度，則會由于探針的Tm值太低影響與模版的結合，從而降低檢測的效率。因而，需要設計一種探針，在保證探針具有合適長度的前提下，有效縮短熒光基團和淬滅基團之間的距離，以提高淬滅的效果，同時為了獲得更好的熒光信號強度，可以考慮增加探針上標記的熒光報告基團的數量。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種淬滅效果較好的熒光標記的寡核苷酸探針。本發(fā)明所提供的熒光標記的寡核苷酸探針，是一段標記了一個或兩個熒光報告基團，和一個可以淬滅所述熒光報告基團所發(fā)出的熒光的熒光淬滅基團的由1560個核苷酸組成的寡核苷酸序列；所述熒光淬滅基團位于所述寡核苷酸序列的中部，所述熒光報告基團位于所述寡核苷酸序列的端部。探針優(yōu)選為2030個核苷酸組成的寡核苷酸序列，且所述熒光報告基團與熒光淬滅基團之間的距離在120個核苷酸之間為宜。當所述探針上的熒光報告基團標記為一個時，標記在探針的5'末端，當所述探針上的熒光報告基團標記為兩個時，標記在探針的5'末端和3'末端；熒光淬滅基團標記在除了5'末端和3'末端以外的任一個核苷酸上。探針上的熒光報告基團和熒光淬滅基團的選擇范圍是非常廣泛的，例如熒光報告基團可以為FAM、TET、VIC、JOE或HEX，熒光淬滅基團可以為TAMRA、ECLIPSE、DABCYL、BHQ-1或朋Q-2。本發(fā)明探針的應用領域非常廣泛，凡是用到探針的領域均可適用，例如可以應用于實時熒光PCR反應和生物芯片檢測。本發(fā)明一改傳統(tǒng)Taqman探針中把熒光報告基團和熒光淬滅基團分別放在探針兩端的設計方法，把熒光淬滅基團設計在探針的中部，同時在熒光淬滅基團兩端各修飾一個熒光報告基團。這樣既縮短了熒光報告基團和熒光淬滅基團之間的距離，提高了淬滅的效果，又保證了探針的長度。同時，由于傳統(tǒng)Taqman探針一分子探針被水解只釋放一分子熒光，而本發(fā)明的探針一分子探針被水解時可以釋放兩分子熒光，可以增強熒光信號強度，提高檢測的靈敏度。圖1為本發(fā)明的探針P2與傳統(tǒng)Taqman探針的對比實驗結果。圖2為本發(fā)明的探針Pl與傳統(tǒng)Taqman探針的對比實驗結果。具體實施方式為了驗證本發(fā)明的可行性，針對臨床上非常重要的結核分枝桿菌的檢測采用了本發(fā)明的探針(P2、Pl)與Taqraan傳統(tǒng)探針的對比實驗。以下實施例不具有限制性。實施例1、1、引物、探針的設計及合成以結核分枝桿菌特有的基因序列IS6110為檢測靶標，設計引物和探針。引物序列Forwardprimer:5'-AAGCCCGCAGGACCACGATC-3'Reverseprimer:5，-ACACATAGGTGAGGTCTGCTACCC-3'探針序列5，-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3，普通Taqraan探針FAM-5,-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3，-ECLIPSE本發(fā)明的探針P2:熒光淬滅基團標在距離5'末端第10個堿基上，兩端均標記熒光報告基團。P2:FAM-5'-CCACAGCCCG(ECLIPSE)TCCCGCCGATCTCG-3，-FAM以上引物和探針由Takara公司合成。2、反應體系2xbuffer10/4Forwardprimer(10MM)0.4MlReverseprimer(10PM)0.糾Probe(IOHM)0.8(47^《polymerase0.3Mltemplate(lng/W)Total2014上述反應體系中，除加入的探針(傳統(tǒng)探針和本發(fā)明的探針)不同外，其余均相同。3、反應條件95°C3min95。C15sec40circles58°C30sec50°C30sec4、本發(fā)明的探針與傳統(tǒng)探針的對比實驗結果對本發(fā)明的探針與傳統(tǒng)探針的檢測效果進行對比(表l)。實驗結果表明，采用本發(fā)明的探針在信號強度上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)探針，提高了檢測的靈敏度。表1本發(fā)明的探針P2與傳統(tǒng)探針的對比實驗結果探針Ct值P213.2113.21傳統(tǒng)探針13.2413.29實施例2、1、引物、探針的設計及合成以結核分枝桿菌特有的基因序列IS6110為檢測革E標，設計引物和探針。引物序列Forwardprimer:5'-AAGCCCGCAGGACCACGATC-3'Reverseprimer:5'-ACACATAGGTGAGGTCTGCTACCC-3'探針序列5'-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3，普通Taqman探針FAM-5，-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3，-ECLIPSE本發(fā)明的探針P1:熒光淬滅基團標在距離5'末端第10個堿基上，5'端標記熒光報告基團。PI:FAM-5，—CCACAGCCCG(ECLIPSE)TCCCGCCGATCTCG—3，2、反應體系2xbuffer鄭lForwardprimer(IOPM)0.4MlReverseprimer(IOmM)0.4m!Probe(IO幽)0.Tagpolymerase0.3Mltemplate(lng/W)Total20W上述反應體系中，除加入的探針(傳統(tǒng)探針和本發(fā)明的探針)不同外，其余均相同。3、反應條件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4、本發(fā)明的探針與傳統(tǒng)探針的對比實驗結果對本發(fā)明的探針與傳統(tǒng)探針的檢測效果進行對比(表2)。實驗結果表明，采用本發(fā)明的探針在信號強度上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)探針，提高了檢測的靈敏度。表2本發(fā)明的探針Pl與傳統(tǒng)探針的對比實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>序列表<160>1<210〉1<211〉1165〈212〉DNA<213>結核分枝桿菌(MtoZ^cw/oy/j)〈220〉<223><400〉1gga^gcatcacgcgttgggagctctcccatatggtcgacctgcaggcggccgcgaattc602LCt3gtg3ttgCC3gC3CgCt33tt朋Cggttcatcgccg3tC3tC3gggccaccgcgag120ggccccgatggtttgcggtggggtgtCg￡Lgtcgatctgcacacagctgaccgagctgggt180gtgccgatcgccccatcgacctactacgaccaca_tcaaccggg3gCCC3gccgccgcgag240ctgcgcgatggcgaactcaagg3gC3C3tCagccgcgtccacgccgccaactacggtgtt300tacggtgcccgC肌3gtgtggctaaccctgaaccgtgagggcatcgaggtggccEigatgc360accgtcgaacggctgatgaccaaactcggcctgtccgggaccacccgcgacaaagcccgc420aggaccacgatcgctgatccggccacagcccgtcccgccgatctcgtccagcgccgcttc■ggaccacca_gcaccta3ccggctgtgggtagcagacctcacctatgtgtcgacctgggca540gggttcgcctacgtggcctttgtcaccgacgcctacgctcgcaggatcctgggctggcgg600gtcgcttccacgatggccacctccatggtccaatcgaattcccgcggccgccatggcggc660cggga_gcatgcgacgtcgggcccaattcgccctateigtg3gtcgtattacaattcactgg720ccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttg780cagcsceitccccctttcgccagctggcgta3t3gCg肪g8ggcccgca_ccgatcgccctt840cccaacagttgcgcagcctgaMggcga^tggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgc■gcgtttgtgtgtttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctc960ctttcgctttcttcccttctttctcgcacgttcgccggctttccccgtcagctctaatcg1020gggctcccgttaagggtcgattaatgctttacggcaccctcg3cc朋aactgaa恤ggg1080tgatggtcacggtatggcatcgctgatgacggttacgcccatgactgatcagtcttgaag1140tgaactctgtstcgaaactggcaac116權利要求1、一種寡核苷酸探針，是一段標記了一個或兩個熒光報告基團，和一個可以淬滅所述熒光報告基團所發(fā)出的熒光的熒光淬滅基團的由15～60個核苷酸組成的寡核苷酸序列；所述熒光淬滅基團位于所述寡核苷酸序列的中部，所述熒光報告基團位于所述寡核苷酸序列的端部。2、根據權利要求1所述的探針，其特征在于所述熒光報告基團為兩個，分別位于所述寡核苷酸序列的兩端。3、根據權利要求1所述的探針，其特征在于所述熒光報告基團為一個，其位于探針的5'末端。4、根據權利要求1或2或3所述的探針，其特征在于所述熒光報告基團與熒光淬滅基團之間的距離在120個核苷酸之間。5、根據權利要求l、2或3所述的探針，其特征在于所述熒光淬滅基團標記在除了5，末端和3，末端以外的任一個核苷酸上。6、根據權利要求l、2或3所述的探針，其特征在于所述探針是由1540個核苷酸組成的寡核苷酸序列。7、根據權利要求l、2或3所述的探針，其特征在于所述熒光報告基團為FAM、TET、VIC、JOE或HEX。8、根據權利要求1、2或3所述的探針，其特征在于所述熒光淬滅基團為TAMRA、ECLIPSE、DABCYL、BHQ-1或BHQ-2。9、權利要求l、2或3所述的探針在實時熒光PCR反應中的應用。10、權利要求l、2或3所述的探針在生物芯片檢測中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種熒光標記的寡核苷酸探針及其應用。本發(fā)明的探針一改傳統(tǒng)Taqman探針中把熒光報告基團和熒光淬滅基團分別放在探針兩端的設計方法，把熒光淬滅基團設計在探針的中部，同時在熒光淬滅基團兩端各修飾一個熒光報告基團。這樣既縮短了熒光報告基團和熒光淬滅基團之間的距離，提高了淬滅的效果，又保證了探針的長度。同時，由于傳統(tǒng)Taqman探針一分子探針被水解只釋放一分子熒光，而本發(fā)明的探針一分子探針被水解時可以釋放兩分子熒光，可以增強熒光信號強度，提高檢測的靈敏度。本發(fā)明可廣泛應用于實時熒光PCR反應，也可以用于生物芯片檢測。文檔編號C12Q1/68GK101157953SQ20071012237公開日2008年4月9日申請日期2007年9月24日優(yōu)先權日2007年9月24日發(fā)明者偉侯,王思賢,京程,高華方申請人:博奧生物有限公司;清華大學