專利名稱：一種中和劑反饋控制底物濃度生產(chǎn)l-乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化工原料生產(chǎn)領(lǐng)域，涉及一種生產(chǎn)L-乳酸的方法，具體涉及一種通 過中和劑的消耗量反饋控制底物(碳源)濃度的生產(chǎn)方法。
技術(shù)背景L-乳酸是一種有機酸，分子量為90.08，是一種重要的工業(yè)原料，可廣泛用于醫(yī) 藥、食品、化工、釀造、香料、皮革、巻煙和印染等多種工業(yè)。美國約60%的乳酸用 于食品工業(yè)，其它主要用于制備乳酸鹽、乳酸酯類及醫(yī)藥工業(yè)；日本60%用于食品， 30%用于工業(yè)，醫(yī)藥和化妝品占10%。近年來，隨著"白色污染"、化石資源的大量 消耗和不可再生資源價格的節(jié)節(jié)攀升，發(fā)展環(huán)境友好型的替代產(chǎn)品是保證生態(tài)鏈良 性循環(huán)、經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的必然要求。在眾多可生物降解聚合物中，聚乳酸以其優(yōu) 異的機械性能、廣泛的應用領(lǐng)域、顯著的社會效益，贏得了全球塑料行業(yè)的矚目。 以乳酸為原料制取聚乳酸，作為生物可降解材料引起世界各國的廣泛重視，被認為 是最具發(fā)展前途的高分子材料之一。2000年全球塑料消費量約1. 15億噸，如果10-20 年后全球范圍內(nèi)生物基塑料能夠替代石油基塑料消費量的10-20%，聚乳酸的年需求 量將達到1150-2300萬噸。目前世界乳酸生產(chǎn)企業(yè)有荷蘭的PURAC公司，美國的ADM公司、Ecochem公司、 斯特林化學公司。日本有武藏野化學公司和日本大賽路化學公司。國內(nèi)乳酸生產(chǎn)廠 主要包括河南金丹乳酸有限公司；安徽豐原-格拉特乳酸有限公司(與比利時合 資)；廣水市民族化工有限公司；江西武藏野生物化工有限公司(與日本合資)和湖 北孝感亞風乳酸集團公司。在L-乳酸的發(fā)酵過程中，幾乎都采用批式發(fā)酵。在這種生產(chǎn)過程中，維持一定 的底物(葡萄糖等)濃度對于L-乳酸的積累非常重要。這是由于發(fā)酵過程中如果底 物(葡萄糖等)濃度過高，則會產(chǎn)生底物抑制，影響微生物生長，因此需要將底物 濃度控制在一個恒定的范圍， 一般都是較低的水平。為了實現(xiàn)以上的目標， 一般采用補料發(fā)酵，即在發(fā)酵開始時加入適量的底物， 然后以某種方式補加底物(葡萄糖、乳糖、半乳糖等)，以維持底物濃度在適宜的范 圍內(nèi)，使之既不產(chǎn)生底物抑制，也不缺乏。補料發(fā)酵按補料方式可以分為程控補料 (動力學模擬方程)和反饋補料，包括間歇補料和連續(xù)補料，連續(xù)補料又可分為恒 速、指數(shù)和變速流加，已經(jīng)廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中。雖然這些補料的方法都是為了 消除底物的抑制或缺乏，控制菌體的比生長速率，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量以及實現(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng)。但是對于程控補料來說，由于發(fā)酵生產(chǎn)的多變性，各批次之間有 差異，所以難以將發(fā)酵過程中底物濃度控制在恒定的范圍內(nèi)。而對于反饋控制，由于沒有底物(葡萄糖、乳糖、半乳糖等)濃度在線監(jiān)測的 電極，都是釆用取樣離線測量，導致底物濃度測量一般都會延遲30 60min。這種方 法很難實時將底物(葡萄糖、乳糖、半乳糖等)濃度準確的控制在一個較小的范圍。 發(fā)明內(nèi)容鑒于現(xiàn)有生產(chǎn)L-乳酸方法在補料時具有延遲性、盲目性、影響生產(chǎn)控制、導致 發(fā)酵產(chǎn)量低的缺陷，本發(fā)明的目的在于克服這些缺陷，提供一種可以實時控制發(fā)酵 過程、提高發(fā)酵產(chǎn)量的生產(chǎn)L-乳酸的方法。本發(fā)明另一目的在于提供使用上述方法生產(chǎn)L-乳酸的流加控制系統(tǒng)。 本發(fā)明提供的一種中和劑反饋補料生產(chǎn)L-乳酸的方法，是在兼性厭氧發(fā)酵過程 中，利用底物消耗量和堿消耗量之間的函數(shù)關(guān)系，通過測定堿消耗量來控制底物的 加入量，從而實時控制發(fā)酵液中底物濃度在一個適宜的范圍內(nèi)，具體包括如下步驟:1) 將菌種制得的種子液接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中開始發(fā)酵；2) 利用pH電極監(jiān)測發(fā)酵液的pH值變化，當體系pH下降到發(fā)酵液的pH設定 值以下，通過一pH控制系統(tǒng)控制堿溶液加入，直至發(fā)酵液的pH回升至設定3) 將堿溶液消耗量傳遞給一底物控制系統(tǒng)，底物控制系統(tǒng)根據(jù)底物消耗量與 堿消耗量函數(shù)關(guān)系計算補底物量，控制補底物加入量，使發(fā)酵液中即時底物 濃度回升至預控恒底物濃度；4) 重復步驟2)和3)，發(fā)酵至L-乳酸產(chǎn)生速度很慢或者不再產(chǎn)酸，停止發(fā)所述的底物消耗量和堿消耗量之間的函數(shù)關(guān)系式為 A=Y/X其中，Y為底物消耗量，X為堿消耗量，A為系數(shù)，A的取值與發(fā)酵菌種和發(fā)酵 初始條件有關(guān)，通過預試驗確定；補底物量=(預控恒底物濃度-即時底物濃衝x即時發(fā)酵液體積， 補底物量=補底物溶液體積x補底物溶液濃度即時底物濃度即時發(fā)酵液體積發(fā)酵液初始體積+堿液密度已補入底物體積x底物濃度 底物溶液密度 其中，所述菌種是干酪乳桿菌^"o力sc/77"s casei;發(fā)酵培養(yǎng)基中接種量為5 20%;發(fā)酵起始底物濃度為90 200g/1，優(yōu)選125g/l;發(fā)酵溫度為35 50°C;發(fā)酵底物為葡萄糖、乳糖、半乳糖或它們的混合物。所述的補底物為葡萄糖、乳糖、半乳糖或它們的混合物，發(fā)酵流加液中底物濃 度為500 1000g/l，優(yōu)選700g/l;預控恒底物濃度為10 30±5g/l。所述的發(fā)酵液的pH設定值在5. 5 7. 0之間；所述的堿為碳酸鈣、氫氧化鈣、 氨水、氫氧化鉀、氫氧化鈉或它們的混合物。所述的堿消耗量和底物的消耗量通過天平稱量，或者通過流量計測量。本發(fā)明利用上述方法生產(chǎn)L-乳酸的流加控制系統(tǒng)，包括發(fā)酵罐、溫度電極、pH 電極、pH控制系統(tǒng)、由堿溶液罐和堿溶液輸送泵組成的堿溶液輸送系統(tǒng)、底物控制 系統(tǒng)、由底物溶液罐和底物溶液輸送泵組成的底物輸送系統(tǒng)，所述的溫度電極和pH 電極感應端置入發(fā)酵罐中發(fā)酵液液面以下，pH電極連接pH控制系統(tǒng)，再連接堿溶液 輸送泵，堿溶液輸送泵的液體吸入端置于堿溶液罐的液面以下，底物溶液輸送泵和 堿溶液輸送泵的液體輸出端置于發(fā)酵罐中發(fā)酵液液面以上，底物溶液輸送泵的液體 吸入端置于底物溶液罐的液面以下，堿溶液輸送系統(tǒng)與底物控制系統(tǒng)信號連接，底 物輸送系統(tǒng)與底物控制系統(tǒng)信號連接。其中，還包括一底物溶液稱量裝置和一堿溶液稱量裝置，所述堿液稱量裝置置 于堿溶液罐的下方，并與底物控制系統(tǒng)信號連接，所述底物溶液稱量裝置置于底物 溶液罐的下方，并與底物控制系統(tǒng)信號連接。所述堿溶液輸送泵和底物溶液輸送泵各裝設流量計，所述流量計分別與底物控 制系統(tǒng)信號連接。所述的pH控制系統(tǒng)和底物控制系統(tǒng)通過單片機、電腦、或者人工實現(xiàn)。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的中和劑反饋補料生產(chǎn)L-乳酸方法的優(yōu)益之處在 于通過監(jiān)測中和劑的消耗量，能夠較準確的反饋控制發(fā)酵液中的底物濃度，從而 消除底物抑制，提高產(chǎn)物L-乳酸的產(chǎn)量。在發(fā)酵過程中可以采用單片機或者電腦控 制，也可以通過人工手動控制(人工在線監(jiān)測，隨時調(diào)控)，投資小，操作簡單，適 合于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明一種中和劑反饋控制底物濃度系統(tǒng)示意圖；圖2為圖1所示系統(tǒng)進行中和劑反饋控制原理示意圖；圖3為本發(fā)明另一種中和劑反饋控制底物濃度系統(tǒng)示意圖4為圖3所示系統(tǒng)中和劑反饋控制原理示意圖； 圖5為實施例1中發(fā)酵體系中底物隨時間補加量圖； 圖6為實施例2中發(fā)酵體系中底物隨時間補加量圖。
具體實施方式
下面的具體方法可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式 限制本發(fā)明。概括而言，本發(fā)明中和劑反饋補料生產(chǎn)L-乳酸的方法，包括常規(guī)制備種子的方 法，然后進行兼性厭氧發(fā)酵。其特征在于在兼性厭氧發(fā)酵時，利用中和劑消耗量 和底物消耗量之間的函數(shù)關(guān)系，通過加入中和劑消耗量反饋聯(lián)動加入底物的量來控 制發(fā)酵過程中的底物濃度，使發(fā)酵液中的底物(葡萄糖等)濃度控制在一定的范圍 內(nèi)。本發(fā)明采用生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)L-乳酸，用干酪乳桿菌制備種子，然后進行兼 性厭氧發(fā)酵。由于發(fā)酵過程中會產(chǎn)生有機酸，從而引起發(fā)酵液pH的下降，為了維持 穩(wěn)定的pH，需要中和劑-堿來中和產(chǎn)生的有機酸，中和劑(堿溶液)的消耗量和底物(葡 萄糖、乳糖、或半乳糖等)的消耗量具有非常好的線性關(guān)系，通過中和劑消耗量反饋 聯(lián)動補加底物的量來控制底物濃度，使發(fā)酵液中的底物濃度在預設的范圍內(nèi)，既不 產(chǎn)生底物抑制，也不缺乏。本發(fā)明中和劑-堿溶液的消耗量和底物(葡萄糖、乳糖、半乳糖等)的消耗量之 間的函數(shù)關(guān)系為A=Y/X 式一 其中，Y為底物消耗量，X為堿消耗量，A為系數(shù)，A的取值與發(fā)酵菌種和發(fā)酵 初始條件有關(guān)，在確定的發(fā)酵菌種和發(fā)酵初始條件下，通過小規(guī)模實驗測定發(fā)酵過 程中底物消耗量和堿消耗量，繪制Y與X的關(guān)系曲線，其斜率數(shù)值即為系數(shù)A; 補底物量=(預控恒底物濃度-即時底物濃衝x即時發(fā)酵液體積 式二 補底物量=補底物溶液體積x補底物溶液濃度 式三即時底物濃產(chǎn)=初底物濃度x初始體積+己補入底物體積x底物濃度-AX
<formula>formula see original document page 7</formula>(發(fā)酵液中原料的消耗體積與產(chǎn)生的新物質(zhì)的體積基本相同) 以上式中，X、 A的含義與前相同。其中，式四和式五中，初底物濃度、體積、 發(fā)酵液初始體積、堿液密度、補加底物濃度等均為預設值，X為操作中實際測量值； 式二中預控恒底物濃度是預設值，通過式四計算得到的即時底物濃度和式五計算得 到的即時發(fā)酵液體積來計算得到補底物的量(重量)，通過稱重控制底物的補加量； 也可以將式二計算的補底物量代入式三中，在補底物溶液濃度已知的情況下，計算 得到補底物溶液的體積，通過流量泵控制底物的補加體積。本發(fā)明生產(chǎn)L-乳酸中的流加控制系統(tǒng)，主要為獲取堿溶液的加入量數(shù)值和控制 底物的加入量。其中一種實施方式請參考圖1及圖2所示包括一發(fā)酵罐l; 一溫度 電極5; — pH電極6及與其相連的pH控制系統(tǒng)7; —堿溶液罐4，與其相連的堿溶液輸送泵9-2，以及堿溶液稱量裝置3-2; —底物溶液罐2，與其相連的底物溶液輸 送泵9-l，底物溶液稱量裝置3-1，以及一底物控制系統(tǒng)8;溫度電極5和pH電極6 分別置入發(fā)酵罐1中伸入其中發(fā)酵液液面以下，pH控制系統(tǒng)7電連接堿溶液輸送泵 9-2，堿溶液稱量裝置3-2和底物溶液稱量裝置3-1分別與底物控制系統(tǒng)8電連接。利用上述系統(tǒng)進行反饋控制的主要過程是將菌種接入發(fā)酵罐1的培養(yǎng)基中開 始發(fā)酵，伴隨著發(fā)酵的進行，通過pH電極6監(jiān)測發(fā)酵液的pH值，將監(jiān)測結(jié)果傳遞 給pH控制系統(tǒng)7。當代謝物有機酸產(chǎn)生，pH低于預設值時，由pH控制系統(tǒng)7啟動 堿溶液輸送泵3-2，將堿溶液罐4中的堿溶液加入到發(fā)酵罐1中，通過堿溶液稱量系 統(tǒng)9-2將減少的堿溶液量(即堿消耗量X)信號傳導給底物控制系統(tǒng)8;底物控制系 統(tǒng)8通過堿的消耗量來計算即時底物濃度(式四)，并將該即時底物濃度與預控恒底 物濃度比較，當?shù)陀陬A控底物濃度時啟動底物溶液輸送泵3-l，將底物溶液罐2中的 底物溶液加入到發(fā)酵罐1中，底物溶液稱量系統(tǒng)9-2將減少的底物溶液量信號連續(xù) 反饋傳導給底物控制系統(tǒng)8，當達到預控底物濃度時通過底物控制系統(tǒng)8關(guān)閉底物溶 液輸送泵3-1來控制補入的底物溶液量(式二)。據(jù)此，可以實時控制發(fā)酵罐中的底 物濃度在一恒定范圍，保證補償發(fā)酵罐中消耗的底物的同時又不過量，從而將發(fā)酵 液中底物濃度控制在預設的水平。本發(fā)明生產(chǎn)L-乳酸的流加控制系統(tǒng)的另一實施方式，請參考圖3及圖4所示 包括一發(fā)酵罐l; 一溫度電極5; —pH電極6及與其相連的pH控制系統(tǒng)7; —堿溶 液罐4，與其相連的堿溶液輸送泵3-2; —底物溶液罐2，與其相連的底物溶液輸送 泵3-1，以及一底物控制系統(tǒng)8;溫度電極5和pH電極6分別置入發(fā)酵罐l中伸入 其中發(fā)酵液液面以下，pH控制系統(tǒng)7電連接堿溶液輸送泵3-2，底物溶液輸送泵3-l 和堿溶液輸送泵3-2分別與底物控制系統(tǒng)8電連接。利用上述系統(tǒng)進行反饋控制的主要過程是將菌種接入發(fā)酵罐1的培養(yǎng)基中開 始發(fā)酵，伴隨著發(fā)酵的進行，通過pH電極6監(jiān)測發(fā)酵液的pH值，將監(jiān)測結(jié)果傳遞 給pH控制系統(tǒng)7。當代謝物有機酸產(chǎn)生，pH低于預設值時，由pH控制系統(tǒng)7啟動 堿溶液輸送泵3-2，將堿溶液罐4中的堿溶液加入到發(fā)酵罐1中，底物控制系統(tǒng)8 獲取堿溶液輸送泵3-2的數(shù)據(jù)(堿消耗體積，即X/堿液密度)計算出減少的堿溶液 量(即堿消耗量X);底物控制系統(tǒng)8通過堿的消耗量進一步計算即時底物濃度(式 四)，并將該即時底物濃度與預控底物濃度比較，當?shù)陀陬A控底物濃度時啟動底物溶 液輸送泵3-1，并計算得到底物溶液的補加量(式二)，啟動底物溶液輸送泵3-1， 將底物溶液罐2中的底物溶液按量加入到發(fā)酵罐1中。當達到預控底物濃度時通過 底物控制系統(tǒng)8關(guān)閉底物溶液輸送泵3-1來控制補入的底物溶液量。據(jù)此，可以實 時控制發(fā)酵罐中的底物濃度在恒定范圍，保證補償發(fā)酵罐中消耗的底物的同時又不 過量，從而將發(fā)酵控制在預設的水平。本發(fā)明中，所用的菌種可以是干酪乳桿菌Zflcto6a"7/M coy"'，包括CGMCC No. 1.29、 1.62、 1.121、 1.539、 1.570、 1.574、 1.575、 1.580、 1.2435;發(fā)酵培養(yǎng) 基中接種量都為5 20X(V/V);發(fā)酵培養(yǎng)溫度為35 50'C;發(fā)酵過程中pH設定值 在5.5 7.0之間；發(fā)酵時間為84 100h;底物為葡萄糖、乳糖、半乳糖等，以及它 們的混合物；起始底物濃度為90 200g/1，優(yōu)選125g/l;發(fā)酵過程中預控恒底物濃 度為10 30士5g/l,補加的底物溶液濃度為500 1000g/l;堿液為氫氧化鈣、氨水、 氫氧化鉀、氫氧化鈉以及它們的混合物。本發(fā)明方法的具體步驟包括1. 斜面保藏不同菌株需選用各自適合的固體培養(yǎng)基，每月轉(zhuǎn)接一次。2. 種子液的制備配制種子培養(yǎng)基，12rC滅菌20min;將斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，在適宜的溫 度下兼性厭氧培養(yǎng)至對數(shù)中期(接種后18 24h至對數(shù)中期)；3. 厭氧發(fā)酵將步驟2制得的種子液接入發(fā)酵罐中經(jīng)12rC滅菌20min的發(fā)酵培 養(yǎng)基，控制適宜的溫度、攪拌，不通氣。發(fā)酵過程中，隨著底物轉(zhuǎn)化為乳酸，從而 導致發(fā)酵液的pH降低，當發(fā)酵液的pH降低至設定值以下時，加入堿溶液調(diào)節(jié)pH回 升至設定值，同時聯(lián)動底物補料泵，加入碳源底物(葡萄糖、乳糖、半乳糖等)，發(fā) 酵至L-乳酸產(chǎn)量最高時，停止發(fā)酵。下面結(jié)合實施例進一步說明實施例l:(中和劑堿600g/lCa(OH)2和氨水，起始底物濃度125g/l，接種量 10%， pH設定值6.25±0.05，底物葡萄糖，發(fā)酵溫度42°C，流加液中底物葡萄 糖的濃度700g/l，反饋控制手段人工)材料微生物菌種干酪乳桿菌k"otoc/〃w owe/, CGMCC No. 1.29
土昔養(yǎng)基1) 斜面固體培養(yǎng)基(g/l):葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨IO，牛肉膏IO，氯化鈉 10，醋酸鈉5，檸檬酸銨2，七水硫酸鎂0.2，七水硫酸錳0.05，瓊脂1.5。2) 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l):葡萄糖30，酵母粉10,蛋白胨15，磷酸二 氫鉀l，硫酸銨5，輕質(zhì)碳酸,丐15。3) 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/0:葡萄糖125，酵母粉IO，大豆蛋白胨IO，玉米漿30，氯 化鈉IO，醋酸鈉5，檸檬酸銨2，七水硫酸鎂0.2，七水硫酸錳0.05。將上述三種培養(yǎng)基各自按成分混合后，用自來水定容，然后用氨水調(diào)pH值為 6.25，于12rC滅菌20min。中和劑600g/l的Ca(OH)2溶液和(以氨氣計25%)氨水溶液； 補加底物700g/l的葡萄糖溶液； 預控恒底物濃度30±5g/L。方法1、 制備種子一級種子將一環(huán)斜面菌種接入裝有10ml種子培養(yǎng)基的大試管中，42°C、 180rpm培養(yǎng)24h，得到一級種子液；二級種子在250mL錐形瓶中裝入lOOmL種子培養(yǎng)基，121。C滅菌20min后， 接入一級種子液10ml，然后在搖床中培養(yǎng)24h，溫度42'C 、轉(zhuǎn)速180rpm、用碳酸 鈣調(diào)節(jié)pH值為5.8，得到二級種子液；2、 補料分批發(fā)酵培養(yǎng)-1) 將2L發(fā)酵培養(yǎng)基裝入5L發(fā)酵罐中，滅菌后接種二級種子液，接種量為IO %(V/V)，安裝溫度電極、pH電極，連通整個發(fā)酵控制系統(tǒng)，控制發(fā)酵溫度42'C、 pH控制在6.25 ±0.05，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，開始發(fā)酵；按照該發(fā)酵條件進行小規(guī)模實驗，得到該系統(tǒng)中，A=1.1206。2) 啟動圖1、圖2所示的流加控制系統(tǒng)，由pH電極監(jiān)測發(fā)酵液的pH值，當pH 值小于6.20時，由pH控制系統(tǒng)啟動堿溶液輸送泵，將堿溶液罐中的堿溶液按 50ml/min的流速加入到發(fā)酵罐中，此時堿溶液稱量系統(tǒng)將減少的堿溶液量信號傳導 給底物控制系統(tǒng)；底物控制系統(tǒng)計算出即時底物濃度(利用式四)，并將該即時底物 濃度與預控恒底物濃度30士5g/L比較。當?shù)孜餄舛鹊陀?0g/L時，啟動底物溶液輸 送泵(流速40ml/min，本實施例中底物溶液輸送泵第一次工作在第16h)，將底物溶 液罐中的葡萄糖溶液加入到發(fā)酵罐中，底物溶液稱量系統(tǒng)將減少的底物溶液量信號 反饋傳導給底物控制系統(tǒng)，通過底物控制系統(tǒng)關(guān)閉底物溶液輸送泵來控制補入的底 物溶液量。依上述過程連續(xù)操作，發(fā)酵84h，取樣檢測發(fā)酵液中產(chǎn)物L-乳酸。本實
施例發(fā)酵體系中底物補加情況參見圖5所示。 3、發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度的檢測釆用生物傳感分析儀或者高效液相法進行檢測。其中，釆用HPLC (日本島津)檢 測，配備有機酸柱(BIORAD HPX-87H， USA)，流動相為5 mM H2S04，流速0.6 ml.min"。采用UV檢測器(日本島津)，檢測波長為210nm，柱溫為室溫。結(jié)果，對照樣品一(不反饋流加分批發(fā)酵，參見丁紹峰等，過程工程學報，6(1)， 77-81 (2006)介紹的方法同步實驗，發(fā)酵材料與條件與本例相同。)107h發(fā)酵至L-乳酸濃度最高117.5g/1，對照樣品二 (間歇測樣補料控制糖濃度發(fā)酵，參見Shaofeng Ding禾Q Tianwei Tan. Process Biochemistry, 41 (6)， 1451-1454 (2006))介紹的方法 同步實驗，發(fā)酵材料與條件與本例相同)84h發(fā)酵至L-乳酸濃度最高150g/1，而本實 施例步驟2樣品中L-乳酸濃度達到180g/l，是對照樣品一濃度的1.53倍，發(fā)酵時間 為84h，時間縮短23h;在同樣發(fā)酵時間中是對照樣品二濃度的1.2倍。本發(fā)明實施例中，對照樣品一均為采用不反饋流加分批發(fā)酵產(chǎn)物，是與實施例 的同步實驗，方法參考丁紹峰等，過程工程學報，6 (1)， 77-81 (2006)的介紹，發(fā) 酵材料與條件均與對照實施例相同。對照樣品二為采用間歇測樣補料控制糖濃度發(fā) 酵產(chǎn)物，是與實施例的另一同步實驗，方法參見Shaofeng Ding和Tianwei Tan. Process Biochemistry," (6)， 1451-1454 (2006))的介紹，發(fā)酵材料與條件與對照實施例相 同。實施例2:材料除下述特別指明的外，其余與實施例l中所用相同。微生物菌種干酪乳桿菌L3"oZ^w77^ case/, CGMCCNo. 1.62中和劑純氨水；補加底物850g/l的葡萄糖溶液；培養(yǎng)基和實施例l基本相同，其中葡萄糖為90g/L。預控恒底物濃度10土5g/l葡萄糖。本例中，A= 1.4261。 方法1、 制備種子與實施例l相同。2、 補料分批發(fā)酵培養(yǎng)1) 將2 L發(fā)酵培養(yǎng)基裝入5 L發(fā)酵罐中，連接pH電極，滅菌后接種二級種子 液，接種量為5%，安裝溫度電極，連通整個發(fā)酵控制系統(tǒng)，控制發(fā)酵溫度5(TC、 轉(zhuǎn)速150r/min，開始發(fā)酵；2) 啟動流加控制系統(tǒng)(如圖3和圖4所示)，pH電極監(jiān)測發(fā)酵液的pH值，當 pH值小于6. 2吋，由pH控制系統(tǒng)啟動堿溶液輸送泵，將堿溶液罐中的氨水溶液加入 (例如按50ml/min的流速)到發(fā)酵罐中，持續(xù)加入；底物控制系統(tǒng)根據(jù)堿溶液輸送 泵的流量計算出即時底物濃度，并將該即時底物濃度與預控恒底物濃度10土5g/L比 較，啟動底物溶液輸送泵(流速例如為40ml/min)，將底物溶液罐中的葡萄糖溶液加 入到發(fā)酵罐中，持續(xù)加入，通過底物控制系統(tǒng)關(guān)閉底物溶液輸送泵來控制補入的底 物溶液量。依上述過程連續(xù)操作，發(fā)酵94h，取樣檢測發(fā)酵液中產(chǎn)物L-乳酸濃度。 本實施例發(fā)酵體系中具體底物補加情況參見圖6所示。 3、發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度的檢測-. 方法同實施例1。結(jié)果對照樣品一 (不反饋流加分批發(fā)酵)107h發(fā)酵至L-乳酸濃度最高117.5g/1， 對照樣品二 (間歇測樣補料控制糖濃度發(fā)酵)94h發(fā)酵至與L-乳酸濃度最高140g/l; 本例樣品中發(fā)酵94h， L-乳酸濃度達到155g/l，是對照樣品一濃度的L32倍，時間縮 短13h;是對照樣品二濃度的1.1倍。實施例3:材料及操作同實施例l，其中變化因素 微生物菌種干酪乳桿菌Za"oZ^w77iw casei， CGMCC No, 1.121 中和劑10 mol/1的NaOH; 補加底物500g/l的葡萄糖溶液； 起始底物濃度200g/l;培養(yǎng)基和實施例l基本相同，其中葡萄糖為200g/L。發(fā)酵過程中，接種量為20%，發(fā)酵溫度為35'C， pH值控制在7.0，預控恒底物濃 度葡萄糖20土5g/L 。 本例中，A=1.25檢測發(fā)酵72h發(fā)酵液中產(chǎn)物L-乳酸濃度，方法同實施例1。對照樣品一 (不補料 分批發(fā)酵)107h發(fā)酵至L-乳酸濃度最高125.5g/l (用不同菌株，發(fā)酵產(chǎn)物濃度應有 所不同，請變動一下數(shù)據(jù))，本例樣品中發(fā)酵100h， L-乳酸濃度達到150g/l，是對照 樣品濃度的1.20倍，時間縮短7h。對照樣品二 (間歇測樣補料控制糖濃度發(fā)酵)100h 發(fā)酵至與L-乳酸濃度最高B5g/1，是對照樣品二濃度的1.11倍。實施例4:材料及操作同實施例2，其中變化因素 微生物菌種干酪乳桿菌Zacz^6acil/ys casei， CGMCC No. 1.539
中和劑1Omol/1的KOH;補加底物1000g/l的乳糖和半乳糖溶液混合物；培養(yǎng)基和實施例l基本相同，其中使用90g/L的乳糖和半乳糖代替葡萄糖。發(fā)酵過程中，接種量為5%，發(fā)酵溫度為5(TC， pH值控制在5.5，預控恒底物濃度 30±5g/L 。 本例中，A=1.34檢測發(fā)酵72h發(fā)酵液中產(chǎn)物L-乳酸濃度，方法同實施例1。對照樣品一 (不補料 分批發(fā)酵)107h發(fā)酵至L-乳酸濃度最高110g/1，對照樣品二 (間歇測樣補料控制糖 濃度發(fā)酵)100h發(fā)酵至L-乳酸濃度最高120g/l，本例樣品發(fā)酵88h， L-乳酸濃度達 到135g/1，是對照樣品一最高產(chǎn)量的1.23倍，發(fā)酵時間縮短19h;和對照樣品二比較 產(chǎn)量提高12.5%，發(fā)酵時間縮短12h。
權(quán)利要求
1.一種中和劑反饋補料生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于在兼性厭氧發(fā)酵過程中，利用底物消耗量和堿消耗量之間的函數(shù)關(guān)系，通過測定堿消耗量來控制底物的加入量，從而實時控制發(fā)酵液中底物濃度在一個適宜的范圍內(nèi)，具體包括如下步驟5)將菌種制得的種子液接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中開始發(fā)酵；6)利用pH電極監(jiān)測發(fā)酵液的pH值變化，當體系pH下降到發(fā)酵液的pH設定值以下，通過一pH控制系統(tǒng)控制堿溶液加入，直至發(fā)酵液的pH回升至設定值；7)將堿溶液消耗量傳遞給一底物控制系統(tǒng)，底物控制系統(tǒng)根據(jù)底物消耗量與堿消耗量函數(shù)關(guān)系計算補底物量，控制補底物加入量，使發(fā)酵液中即時底物濃度回升至預控恒底物濃度；8)重復步驟2)和3)，發(fā)酵至L-乳酸產(chǎn)生速度很慢或者不再產(chǎn)酸，停止發(fā)酵。
2. 如權(quán)利要求1所述的反饋補料生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于所述的底物 消耗量和堿消耗量之間的函數(shù)關(guān)系式為A=Y/X其中，Y為底物消耗量，X為堿消耗量，A為系數(shù)，A的取值與發(fā)酵菌種和發(fā)酵 初始條件有關(guān)，通過預試驗確定；補底物量=(預控恒底物濃度-即時底物濃衝x即時發(fā)酵液體積， 補底物量=補底物溶液體積x補底物溶液濃度印R卄矻物、欲許一初底物濃度x初始體積+已補入底物體積x底物濃度-AX 即時底物濃度—發(fā)酵液初始體積+ ^ + ，，^/|物濃度堿液密度 底物溶液密度即時發(fā)酵液體積=發(fā)酵翻始體積+ +己補入^g二，勿濃度堿液密度 底物溶液密度
3. 如權(quán)利要求1或2所述的反饋補料生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于所述菌 種是干酪乳桿菌"c"力aw77"s cssei;發(fā)酵培養(yǎng)基中接種量為5 20%;發(fā)酵起始 底物濃度為90 200g/1，優(yōu)選125g/l;發(fā)酵溫度為35 5(TC;發(fā)酵底物為葡萄糖、 乳糖、半乳糖或它們的混合物。
4. 如權(quán)利要求l或2所述的反饋補料生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于所述的 補底物為葡萄糖、乳糖、半乳糖或它們的混合物，發(fā)酵流加液中底物濃度為500 1000g/l，優(yōu)選700g/l;預控恒底物濃度為10 30±5g/l。
5. 如權(quán)利要求4所述的反饋補料生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于所述的發(fā)酵 液的pH設定值在5.5 7.0之間；所述的堿為碳酸鈣、氫氧化鈣、氨水、氫氧化鉀、 氫氧化鈉或它們的混合物。
6. 如權(quán)利要求1或2或5所述的反饋補料生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于 所述的堿消耗量和底物的消耗量通過天平稱量，或者通過流量計測量。
7. —種利用權(quán)利要求1至6任一所述方法生產(chǎn)L-乳酸的流加控制系統(tǒng)，包括發(fā) 酵罐、溫度電極、pH電極、pH控制系統(tǒng)、由堿溶液罐和堿溶液輸送泵組成的堿溶液 輸送系統(tǒng)、底物控制系統(tǒng)、由底物溶液罐和底物溶液輸送泵組成的底物輸送系統(tǒng)， 所述的溫度電極和pH電極感應端置入發(fā)酵罐中發(fā)酵液液面以下，pH電極連接pH控 制系統(tǒng)，再連接堿溶液輸送泵，堿溶液輸送泵的液體吸入端置于堿溶液罐的液面以 下，底物溶液輸送泵和堿溶液輸送泵的液體輸出端置于發(fā)酵罐中發(fā)酵液液面以上， 底物溶液輸送泵的液體吸入端置于底物溶液罐的液面以下，堿溶液輸送系統(tǒng)與底物 控制系統(tǒng)信號連接，底物輸送系統(tǒng)與底物控制系統(tǒng)信號連接。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的流加控制系統(tǒng)，其特征在于還包括一底物溶液稱量 裝置和一堿溶液稱量裝置，所述堿液稱量裝置置于堿溶液罐的下方，并與底物控制 系統(tǒng)信號連接，所述底物溶液稱量裝置置于底物溶液罐的下方，并與底物控制系統(tǒng) 信號連接。
9. 如權(quán)利要求7所述的流加控制系統(tǒng)，其特征在于所述堿溶液輸送泵和底物 溶液輸送泵各裝設流量計，所述流量計分別與底物控制系統(tǒng)信號連接。
10. 如權(quán)利要求7或8或9所述的流加控制系統(tǒng)，其特征在于所述的pH控制 系統(tǒng)和底物控制系統(tǒng)通過單片機、電腦、或者人工實現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種中和劑反饋補料生產(chǎn)L-乳酸的方法及系統(tǒng)，包括常規(guī)制備種子的方法，然后進行兼性厭氧發(fā)酵，在兼性厭氧發(fā)酵時，利用中和劑消耗量和底物消耗量之間的函數(shù)關(guān)系，通過加入中和劑消耗量反饋聯(lián)動加入底物的量來控制發(fā)酵過程中的底物濃度，使發(fā)酵液中的底物(葡萄糖等)濃度控制在一定的范圍內(nèi)。該方法通過監(jiān)測中和劑的消耗量，能夠較準確的反饋控制發(fā)酵液中的底物濃度，從而消除底物抑制，提高產(chǎn)物L-乳酸的產(chǎn)量。在發(fā)酵過程中可以采用單片機或者電腦控制，也可以通過人工手動控制(人工在線監(jiān)測，隨時調(diào)控)，投資小，操作簡單，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P7/56GK101153296SQ200710122000
公開日2008年4月2日 申請日期2007年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月19日
發(fā)明者丁紹峰, 吳家鑫, 政 李, 譚天偉 申請人:北京化工大學