專(zhuān)利名稱(chēng)：用于細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的組合物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明也涉及無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)方法，其中可在不含動(dòng)物蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)、增殖和傳代細(xì)胞。這些方法在培養(yǎng)細(xì)胞，如重組細(xì)胞或用病毒感染的細(xì)胞中是有用的，且可用于生產(chǎn)經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)所得的生物制品。
背景技術(shù)：
對(duì)于細(xì)胞的培養(yǎng)，特別是真核細(xì)胞，更特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，常需要使用特殊的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和為細(xì)胞有效生長(zhǎng)和生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)或病毒所必需的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)基配方已經(jīng)補(bǔ)充有大量的添加物，包括不確定的組分，如胎牛血清(FCS)、幾種動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)和/或牛來(lái)源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
一般而言，血清或血清來(lái)源的物質(zhì)，如清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素，可能含有會(huì)污染培養(yǎng)物和由培養(yǎng)物獲得的生物制品的多余的介質(zhì)。此外，必須檢測(cè)人血清來(lái)源的添加物的所有已知的病毒，包括能通過(guò)血清傳遞的肝炎和HIV。而且，牛血清和牛血清來(lái)源的產(chǎn)物，例如胰蛋白酶，有承受BSE污染的危險(xiǎn)。另外，所有血清來(lái)源的產(chǎn)物可能被未知的介質(zhì)污染。細(xì)胞培養(yǎng)中，在來(lái)源于人或其它動(dòng)物源的血清或蛋白質(zhì)添加物的情況下，特別是如果細(xì)胞用于生產(chǎn)施用于人的藥劑或疫苗存在許多問(wèn)題(例如，不同批次的質(zhì)量和成分變化，以及存在受支原體、病毒或BSE因子污染的危險(xiǎn))。
因此，為提供有效的宿主系統(tǒng)和不需要血清或其它動(dòng)物蛋白質(zhì)化合物的培養(yǎng)條件，已經(jīng)做了許多嘗試。簡(jiǎn)單的無(wú)血清培養(yǎng)基一般包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、維生素、氨基酸、有機(jī)和無(wú)機(jī)鹽，以及使培養(yǎng)基變?yōu)闋I(yíng)養(yǎng)復(fù)雜化的可能的附加成分。然而，這種培養(yǎng)基經(jīng)常是營(yíng)養(yǎng)不足的，且必須補(bǔ)充動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)補(bǔ)充物或用于細(xì)胞培養(yǎng)的重組的蛋白質(zhì)如胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子或其它生長(zhǎng)因子。
為避免在無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中使用動(dòng)物蛋白質(zhì)補(bǔ)充物，已經(jīng)做了幾種嘗試以提供完全沒(méi)有蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基。
Cinatl等人，Cell Biology International 17885-895(1993)公開(kāi)了一種特別用于在聚乙烯醇縮甲醛(PVF)培養(yǎng)表面上使VERO細(xì)胞連續(xù)增殖的培養(yǎng)基(PFK-1)的開(kāi)發(fā)。
WO 96/15231公開(kāi)了由合成的極限必需培養(yǎng)基和酵母提取物組成的無(wú)血清培養(yǎng)基用于增殖脊椎動(dòng)物細(xì)胞和病毒的生產(chǎn)方法。
在WO 98/15614中公開(kāi)了一種由包含水稻肽和酵母提取物或酶解產(chǎn)物的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，和/或植物脂質(zhì)組成的培養(yǎng)基配方用于動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)。
在WO 01/23527中公開(kāi)了一種包含純化的大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)重組細(xì)胞。
WO 00/03000公開(kāi)了一種包含大豆水解產(chǎn)物和酵母提取物的培養(yǎng)基，但也需要存在重組形式的動(dòng)物蛋白質(zhì)，如生長(zhǎng)因子。
為有效生產(chǎn)生物制品，如病毒或重組蛋白質(zhì)，達(dá)到最佳的細(xì)胞密度以獲得最大的產(chǎn)物產(chǎn)量是重要的。
因此，目前的需求在于增加細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝活性和密度，以及提供完全沒(méi)有動(dòng)物蛋白質(zhì)的理想的細(xì)胞培養(yǎng)基用于生產(chǎn)生物制品，如用作人的藥物或疫苗。此外，如果培養(yǎng)基中不存在動(dòng)物蛋白質(zhì)，則下游加工，例如來(lái)自培養(yǎng)基中的所需產(chǎn)物的純化可以是更加經(jīng)濟(jì)和省時(shí)的。另外，實(shí)施本發(fā)明可避免不必要的免疫原性動(dòng)物蛋白質(zhì)可能誘導(dǎo)的有害免疫學(xué)反應(yīng)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。為實(shí)現(xiàn)該目的和其它目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基。大豆水解產(chǎn)物可以至少0.05％(w/v)的濃度存在，酵母水解產(chǎn)物以至少0.05％(w/v)的濃度存在。可選擇地，大豆水解產(chǎn)物可以小于1.0％(w/v)的濃度存在，而酵母水解產(chǎn)物可以小于0.3％(w/v)的濃度存在?？蛇x擇地，大豆水解產(chǎn)物能以介于約0.2％(w/v)至約0.6％(w/v)之間的濃度存在，而酵母水解產(chǎn)物能以介于約0.05％(w/v)至約0.2％(w/v)之間的濃度存在?？蛇x擇地，大豆水解產(chǎn)物能以介于約0.25％(w/v)至約0.35％(w/v)之間的濃度存在，而酵母水解產(chǎn)物能以介于約0.05％(w/v)至約0.15％(w/v)之間的濃度存在?？蛇x擇地，大豆水解產(chǎn)物能以約0.3％(w/v)的濃度存在，而酵母水解產(chǎn)物能以約0.1％(w/v)的濃度存在?？蛇x擇地，培養(yǎng)基包含相對(duì)于1重量份的酵母水解產(chǎn)物3重量份的大豆水解產(chǎn)物。酵母水解產(chǎn)物可以是超濾純化的酵母水解產(chǎn)物，其中至少40％的所述酵母水解產(chǎn)物的分子量小于或等于500道爾頓。同樣地，大豆水解產(chǎn)物可以是超濾純化的大豆水解產(chǎn)物，其中至少40％的所述大豆水解產(chǎn)物的分子量小于或等于500道爾頓。
本發(fā)明也提供培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，該方法包括提供包含約0.05％(w/v)至約1％(w/v)濃度的大豆水解產(chǎn)物和約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)濃度的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基；以及在培養(yǎng)基中增殖細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物。如上所述，本發(fā)明中也可以使用其它濃度的水解產(chǎn)物。細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞，如昆蟲(chóng)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞，以及優(yōu)選用于體外生產(chǎn)病毒的細(xì)胞。細(xì)胞也可以是重組細(xì)胞。代表性的細(xì)胞包括選自下述的細(xì)胞BSC-1細(xì)胞、LLC-MK細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS-細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、RAF細(xì)胞、RK-細(xì)胞、TCMK-1細(xì)胞、LLC-PK細(xì)胞、PK15細(xì)胞、LLC-RK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、CHO細(xì)胞、NS-1細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、BHK細(xì)胞、293細(xì)胞和RK-細(xì)胞。
本發(fā)明也提供一種無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)細(xì)胞的匯合的方法，該方法包括提供包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基；使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，來(lái)傳代和移種生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中的細(xì)胞同時(shí)與非動(dòng)物來(lái)源的蛋白酶接觸以獲得培養(yǎng)細(xì)胞的匯合。細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞、重組細(xì)胞和/或病毒感染的細(xì)胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細(xì)胞類(lèi)型在這里也是適用的。
而且，本發(fā)明提供在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)基包含約0.05％(w/v)至約1％(w/v)濃度的大豆水解產(chǎn)物和約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)濃度的酵母水解產(chǎn)物。如上所述的，本發(fā)明也可以使用其它濃度的水解產(chǎn)物。細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞、重組細(xì)胞和/或病毒感染的細(xì)胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細(xì)胞類(lèi)型在這里也是適用的。
另外，本發(fā)明提供生產(chǎn)病毒的方法，該方法包括提供一種已生長(zhǎng)在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物；用病毒感染細(xì)胞；以及培養(yǎng)感染的細(xì)胞以繁殖病毒。細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞和/或重組細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細(xì)胞類(lèi)型在此也是適用的。在培養(yǎng)的細(xì)胞上待生產(chǎn)的病毒可選自已知的感染培養(yǎng)細(xì)胞的類(lèi)型。例如，當(dāng)利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，病毒可選自以下屬正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒和腺病毒。使用的病毒可以是野生型病毒、減毒病毒、重排列病毒或重組病毒。另外，代替用于以病毒感染細(xì)胞的實(shí)際病毒顆粒，根據(jù)病毒學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的感染性克隆的轉(zhuǎn)染方法，可以利用感染性的核酸克隆。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)痘病毒(包括牛痘病毒)的方法，該方法包括提供一種已生長(zhǎng)在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物；用痘病毒感染細(xì)胞；以及培養(yǎng)感染的細(xì)胞以繁殖痘病毒。細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或重組細(xì)胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細(xì)胞類(lèi)型在此也是適用的。
此外，本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)冠狀病毒(包括嚴(yán)重急性呼吸綜合癥體相關(guān)的的冠狀病毒)的方法，該方法包括提供一種已生長(zhǎng)在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物；用冠狀病毒感染細(xì)胞；以及培養(yǎng)感染的細(xì)胞以繁殖冠狀病毒。細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或重組細(xì)胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細(xì)胞類(lèi)型在此也是適用的。
此外，本發(fā)明提供生產(chǎn)正粘病毒的方法，該方法包括提供一種已生長(zhǎng)在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物；用正粘病毒感染細(xì)胞；以及培養(yǎng)感染的細(xì)胞以繁殖正粘病毒。正粘病毒可以是流感A、B或C病毒。細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或重組細(xì)胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細(xì)胞類(lèi)型在此也是適用的。
本發(fā)明另外提供生產(chǎn)羅斯河病毒(Ross River Virus)的方法，該方法包括提供一種已生長(zhǎng)在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物；用羅斯河病毒感染細(xì)胞；以及培養(yǎng)感染的細(xì)胞以繁殖羅斯河病毒。細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或重組細(xì)胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細(xì)胞類(lèi)型在此也是適用的。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)黃病毒的方法，該方法包括提供一種已生長(zhǎng)在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物；用黃病毒感染細(xì)胞；以及培養(yǎng)感染的細(xì)胞以繁殖黃病毒。黃病毒可以選自黃熱病毒、及其衍生的嵌合病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、西尼羅河病毒(West nile Virus)和丙型肝炎病毒。細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞和/或重組細(xì)胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細(xì)胞類(lèi)型在此也是適用的。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)包含病毒或病毒抗原的免疫原性組合物的方法，其中該方法包括提供一種已生長(zhǎng)在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物；用病毒感染細(xì)胞；培養(yǎng)感染的細(xì)胞以繁殖病毒；收獲產(chǎn)生的病毒或病毒抗原；由收獲的病毒或病毒抗原制備免疫原性組合物。細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞和/或重組細(xì)胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細(xì)胞類(lèi)型在此也是適用的。收獲的病毒或病毒抗原可以是經(jīng)過(guò)純化的。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)包含病毒或病毒抗原的免疫原性組合物的方法，該方法包括提供一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中該細(xì)胞選自已生長(zhǎng)在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的猴腎細(xì)胞、牛腎細(xì)胞、狗腎細(xì)胞、豬腎細(xì)胞、小鼠腎細(xì)胞、大鼠腎細(xì)胞、羊腎細(xì)胞、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和人細(xì)胞；用選自正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒和腺病毒的病毒感染細(xì)胞；培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物以繁殖病毒；收獲如此產(chǎn)生的病毒或病毒抗原；以及由收獲的病毒或病毒抗原制備免疫原性組合物。
另外，本發(fā)明提供用正粘病毒、痘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒或腺病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中將細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中，其中該培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。大豆水解產(chǎn)物可以是約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的濃度，酵母水解產(chǎn)物可以是約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的濃度。如上述舉例的，根據(jù)本發(fā)明也可以使用其它濃度的水解產(chǎn)物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供來(lái)自培養(yǎng)基的沒(méi)有動(dòng)物蛋白質(zhì)，包括重組蛋白質(zhì)的正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒或腺病毒的制劑，其中在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中通過(guò)培養(yǎng)用流感病毒感染的細(xì)胞來(lái)獲得所述制劑，其中所述培養(yǎng)基中包括大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。大豆水解產(chǎn)物的濃度可以為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)，酵母水解產(chǎn)物的濃度可以為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)。如上所述，根據(jù)本發(fā)明也可使用其他濃度的水解產(chǎn)物。在進(jìn)一步處理之后，這些病毒制劑適合用于生產(chǎn)病毒抗原和疫苗。
鑒于以下述說(shuō)明和數(shù)據(jù)，本發(fā)明的這些和其它方面對(duì)于技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
發(fā)明詳述以各種語(yǔ)法形式表示的術(shù)語(yǔ)“無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基”是指一種沒(méi)有添加來(lái)自高等的多細(xì)胞非植物真核生物(即脊椎動(dòng)物)的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組分的培養(yǎng)基，該細(xì)胞具有如天然存在的蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)特征。要避免的典型蛋白質(zhì)是存在于血清和血清來(lái)源的物質(zhì)如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和其它生長(zhǎng)因子的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明也要避免可含有免疫原性細(xì)菌成分的重組生產(chǎn)的動(dòng)物蛋白質(zhì)，它們不存在于本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中。動(dòng)物蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組分不同于可獲自植物，如大豆(通常長(zhǎng)度為約10-30個(gè)氨基酸)以及獲自較低等的真核生物，如酵母的非動(dòng)物蛋白質(zhì)，小的多肽和寡肽。當(dāng)然，一旦用增殖的細(xì)胞接觸或接種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基就會(huì)含有由那些細(xì)胞流出或分泌的動(dòng)物蛋白質(zhì)，包括在培養(yǎng)遺傳修飾的細(xì)胞時(shí)由這些細(xì)胞表達(dá)的任何重組蛋白質(zhì)。因此，術(shù)語(yǔ)無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，及由其生產(chǎn)的生物材料和制劑，不解釋成要求不存在由培養(yǎng)基中增殖的細(xì)胞流出或分泌的蛋白質(zhì)，而是指不用動(dòng)物來(lái)源或重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)成分直接添加到培養(yǎng)基中。
以各種語(yǔ)法形式表示的術(shù)語(yǔ)“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”，是合成的培養(yǎng)基，如DMEM、HAM′s F12、培養(yǎng)基199或RPMI，或其組合，及文獻(xiàn)中已知的或商業(yè)上可獲得的其他培養(yǎng)基。依照本發(fā)明，每種不含動(dòng)物蛋白質(zhì)的合成培養(yǎng)基均可與大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物組合物結(jié)合使用?；A(chǔ)培養(yǎng)基可以包含許多成分，包括氨基酸、維生素、有機(jī)和無(wú)機(jī)鹽、碳源，每一成分以可維持體外細(xì)胞培養(yǎng)的量存在。例如，可以使用DMEM/HAM′s F12(1∶1)培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以含有輔助物質(zhì)，如緩沖物質(zhì)，像碳酸氫鈉、氧化穩(wěn)定劑、抵消機(jī)械應(yīng)力的穩(wěn)定劑，或蛋白酶抑制劑。如果需要，可以加入非離子表面活性劑，如聚丙二醇(PLURONIC F-61、PLURONIC F-68、SYNPERONIC F-68、PLURONIC F-71或PLURONIC F-108)到培養(yǎng)基中作為消泡劑。若沒(méi)有添加表面活性劑，上升并爆裂的氣泡會(huì)導(dǎo)致破壞位于這些氣泡表面的那些細(xì)胞(“飛濺”)，這些試劑通常用于保護(hù)細(xì)胞避免曝氣的負(fù)效應(yīng)。非離子表面活性劑的量?jī)?yōu)選介于約0.05和約10g/L之間，一般介于約0.1和約5g/L之間。另外，培養(yǎng)基也可以含有環(huán)糊精或其衍生物，一般介于約0.001g/L和約1g/L之間。
根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)基包含可加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“水解產(chǎn)物”包括大豆蛋白胨或酵母提取物的酶解產(chǎn)物。水解產(chǎn)物可以分別獲自大量的大豆蛋白胨或酵母提取物制劑，其可以進(jìn)一步通過(guò)自分解、熱分解和/或質(zhì)壁分離酶促消化(例如，通過(guò)木瓜蛋白酶)和/或形成。水解產(chǎn)物也可以以商業(yè)上獲得的，如Hy-Soy、Hy-Yeast 412和Hi-Yeast 444，其可獲自如QuestInternational，Norwich，紐約，OrganoTechnie，S.A.法國(guó)；或Deutsche Hefewerke股份有限公司，德國(guó)。在WO 98/15614中也公開(kāi)了酵母提取物的來(lái)源。在WO 00/03000中也公開(kāi)了酵母提取物和大豆水解產(chǎn)物的來(lái)源。
用于本發(fā)明培養(yǎng)基中的水解產(chǎn)物優(yōu)選是由天然組分純化的，因?yàn)樵谠摷兓陂g優(yōu)選地除去會(huì)干擾有效培養(yǎng)的雜質(zhì)，從而改善水解產(chǎn)物的一致性。純化可以通過(guò)超濾或交聯(lián)葡聚糖層析，例如使用SephadexG25或Sephadex G10或等同物、離子交換層析、親和層析、大小排阻層析或“反相”層析。這些方法是本領(lǐng)域已知的。使用這些方法，可以選擇含有限定分子量為優(yōu)選≤1000道爾頓，更優(yōu)選≤500道爾頓，還更優(yōu)選≤350道爾頓的大豆或酵母水解產(chǎn)物組分。優(yōu)選至少90％的水解產(chǎn)物的分子量≤1000道爾頓。大豆和酵母水解產(chǎn)物的平均分子量?jī)?yōu)選為介于約220到375道爾頓之間。大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的pH值范圍應(yīng)在約6.5和7.5之間?？偟暮繎?yīng)介于約8和11％之間，優(yōu)選介于9.0和10.0％之間且灰分含量≤18％。有益的水解產(chǎn)物的特點(diǎn)在于游離氨基酸的含量介于約5和30％之間。內(nèi)毒素(如果存在)含量應(yīng)為＜500U/g。
根據(jù)本發(fā)明的一種培養(yǎng)基具有以下組分合成的基本培養(yǎng)基(DMEM/HAM′s F12(1∶1)培養(yǎng)基(1-25g/L)、大豆水解產(chǎn)物(0.5-10g/L)和酵母水解產(chǎn)物(0.5-3g/L)、L-谷氨酰胺(0.05-1g/L)、NaHCO3(0.1-10g/L)。培養(yǎng)基的pH介于pH 6.8到7.6之間，優(yōu)選介于pH 7.0到7.3之間。
對(duì)于技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，上下文的數(shù)值和范圍中的術(shù)語(yǔ)“約”是指近似或接近所列值或范圍的值或范圍，以使得本發(fā)明能如預(yù)期的實(shí)施，如具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的所需要的程度，如從這里含有的教導(dǎo)所顯而易見(jiàn)的，且應(yīng)用于所有值。因此，該術(shù)語(yǔ)包括除由系統(tǒng)錯(cuò)誤產(chǎn)生的那些值以外的值。
已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充了本發(fā)明范圍內(nèi)的酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中描述的培養(yǎng)基更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的速度、細(xì)胞代謝活動(dòng)和細(xì)胞終密度。相對(duì)于WO 98/15614顯示較高的植物肽濃度是較為不佳的教導(dǎo)，這甚至是更加令人驚訝的。如這里描述的，相對(duì)于單獨(dú)包含大豆水解產(chǎn)物或酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基，甚或單獨(dú)加入培養(yǎng)基中的酵母水解產(chǎn)物或大豆水解產(chǎn)物的終濃度等同于組合的水解產(chǎn)物濃度的總和用包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基，細(xì)胞顯示了更高的生長(zhǎng)速度、更高的生物量的終細(xì)胞密度和增加的代謝活動(dòng)(用％每分鐘氧消耗表示)。例如，培養(yǎng)基中單獨(dú)的終濃度約為0.4％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞密度具有抑制作用。包含0.4％(w/v)或更高濃度的大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基與包含0.3％(w/v)的培養(yǎng)基相比并不能達(dá)到更高的細(xì)胞密度。然而，包含最后總水解產(chǎn)物濃度為0.4％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物組合的培養(yǎng)基顯示了顯著增加的細(xì)胞代謝活動(dòng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和終細(xì)胞密度。
依照本發(fā)明，培養(yǎng)基中大豆和酵母水解產(chǎn)物的總量應(yīng)介于約0.2％(w/v)和約0.6％(w/v)之間，其中培養(yǎng)基中大豆水解產(chǎn)物的比率相對(duì)于酵母水解產(chǎn)物更高。大豆和酵母水解產(chǎn)物之間的最佳比率應(yīng)分別為約3∶1(大豆/酵母)。
如這里描述的本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞是特別有用的。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”指普通術(shù)語(yǔ)且包含培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞、組織、器官、昆蟲(chóng)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞系、干細(xì)胞和/或遺傳工程化的細(xì)胞，如表達(dá)異源多肽或蛋白質(zhì)的重組細(xì)胞。重組細(xì)胞包括，例如表達(dá)異源多肽或蛋白質(zhì)，如生長(zhǎng)因子或血液因子的CHO細(xì)胞或BHK細(xì)胞。經(jīng)常用于增殖病毒的細(xì)胞包括VERO細(xì)胞和CV-1細(xì)胞。
適合在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人源的細(xì)胞，其可以是源自組織樣品的原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或已建立的細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以包括人和類(lèi)似的非人細(xì)胞。非人源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是猴腎細(xì)胞、牛腎細(xì)胞、狗腎細(xì)胞、豬腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞、小鼠腎細(xì)胞、大鼠腎細(xì)胞、羊腎細(xì)胞、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或源自任何組織的動(dòng)物細(xì)胞。特別地，能培養(yǎng)在培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是BSC-1細(xì)胞、LLC-MK細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS-細(xì)胞、COS-1細(xì)胞、COS-3細(xì)胞、COS-7細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、RAF細(xì)胞、RK-細(xì)胞、TCMK-1細(xì)胞、LLC-PK細(xì)胞、PK15細(xì)胞、LLC-RK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、NS-1細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、W1-38細(xì)胞、BHK細(xì)胞、293細(xì)胞和RK細(xì)胞。實(shí)例或重組細(xì)胞包括表達(dá)因子VIII、FII、FIX、FX、vWF例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有因子的CHO細(xì)胞。
以其各種語(yǔ)法形式表示的術(shù)語(yǔ)“傳代細(xì)胞”或“傳代細(xì)胞系”(CCL)，意為無(wú)限制復(fù)制且能在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)或在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞。CCLs的非限制性生長(zhǎng)允許從標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞培養(yǎng)基、低成本地進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可以選自CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、LLK-MK2細(xì)胞、NS-1細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、BHK細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、兔腎(RK)細(xì)胞，和如由Butler等人BIOS Scientific Publisher第1-24頁(yè)(1992)公開(kāi)的其它細(xì)胞系，其在此引入作為參考。優(yōu)選檢測(cè)CCLs沒(méi)有外來(lái)因子，如細(xì)菌、真菌、支原體、原生動(dòng)物和病毒。
以其各種語(yǔ)法形式表示的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)物”，是指細(xì)胞在懸液、搖瓶、培養(yǎng)瓶等中生長(zhǎng)。大規(guī)模的方法，如包括在攪拌發(fā)酵罐中附著于微載體生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞的生物反應(yīng)器也包括在內(nèi)。此外，可能不僅培養(yǎng)表面依賴(lài)性細(xì)胞，還可使用含本發(fā)明培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)技術(shù)。如果細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)，則該微載體選自基于葡聚糖、膠原、塑料、明膠和纖維素的微載體，及如Butler，Spier和Griffiths，Animalcell Biotechnology 3283-303(1988)中描述的其它微載體。多孔載體，例如Cytoline或Cytopore，以及基于葡聚糖的載體，如DEAE-葡聚糖(Cytodex 1)、季胺包被的葡聚糖(Cytodex 2)或基于明膠的載體，如明膠包被的葡聚糖(Cytodex 3)是合適的。這些載體可從Pharmacia獲得。
在細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)物生產(chǎn)過(guò)程中，細(xì)胞優(yōu)選生在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中在培養(yǎng)基條件下由的安瓿到生物量。優(yōu)選使用已適應(yīng)于培養(yǎng)基的細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)，使用這樣預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞不但獲得增加的產(chǎn)量，而且通過(guò)使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，它們的培養(yǎng)穩(wěn)定性也明顯地得到改善。
以其各種語(yǔ)法形式表示的術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”，是指在允許生長(zhǎng)和延續(xù)的生存力的條件下體外維持細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般培養(yǎng)在約37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基的最佳pH范圍約為6.8至7.6，優(yōu)選介于7.0和7.3之間。如果需要，分批培養(yǎng)的細(xì)胞可每隔約2至3天，或更多或更少頻度地更換完全培養(yǎng)基。灌流培養(yǎng)的細(xì)胞(例如在生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐中)可以連續(xù)再循環(huán)為基礎(chǔ)而更換新鮮的培養(yǎng)基。依據(jù)上下文和需要，培養(yǎng)方法可以包括細(xì)胞的移種、傳代和增殖。
因此本發(fā)明提供培養(yǎng)細(xì)胞的方法，該方法包括細(xì)胞在包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的步驟。優(yōu)選地，細(xì)胞生長(zhǎng)在包含濃度為0.05％(w/v)至1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為0.05％(w/v)至0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，細(xì)胞在本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中從小規(guī)模生長(zhǎng)到大規(guī)模的生物量。為獲得細(xì)胞培養(yǎng)生物量，細(xì)胞的傳代和移種優(yōu)選用非動(dòng)物來(lái)源的蛋白酶，如鏈霉蛋白酶或其純化的組分進(jìn)行。一種蛋白酶是如美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)10/006,223中描述的灰色鏈霉菌屬(SGT)的純化胰蛋白酶樣組分，其在此全部引入作為參考。在細(xì)胞培養(yǎng)期間，特別是在附著于載體生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)期間，為避免動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì)，載體優(yōu)選為合成載體，或用非動(dòng)物來(lái)源物質(zhì)包被的微載體。例如DEAE-葡聚糖或包被季胺的葡聚糖微載體。
本發(fā)明也提供無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中細(xì)胞在缺乏動(dòng)物蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)、移種和傳代。該方法包括以下步驟提供包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基，使細(xì)胞在所述的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，使用非動(dòng)物來(lái)源的蛋白酶?jìng)鞔鸵品N所述的生長(zhǎng)在該培養(yǎng)基中的細(xì)胞，進(jìn)一步生長(zhǎng)移種的細(xì)胞以達(dá)到匯合的細(xì)胞密度，以及重復(fù)細(xì)胞的移種和生長(zhǎng)步驟直到達(dá)到所需要的最終細(xì)胞培養(yǎng)生物量。該方法包括在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)，使用非動(dòng)物來(lái)源的蛋白酶，優(yōu)選純化的灰色鏈霉菌屬(SGT)的胰蛋白酶樣組分，來(lái)移種和傳代細(xì)胞。在附著于載體生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，載體優(yōu)選為合成載體，或非動(dòng)物來(lái)源物質(zhì)包被的微載體。通過(guò)組合這些步驟，可以避免使用動(dòng)物蛋白質(zhì)。
適合在本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞包括，但不限于BSC-1細(xì)胞、LLC-MK細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、RAF細(xì)胞、TCMK-1細(xì)胞、LLC-PK細(xì)胞、PK15細(xì)胞、LLC-RK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、RK-細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、293細(xì)胞和/或MRC-5細(xì)胞。這些細(xì)胞可以用病毒，如正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒、腺病毒和技術(shù)人員已知的其它病毒感染。更特別地，用于感染細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒可以是流感病毒、牛痘病毒和天花、禽痘病毒、牛痘病毒、蜱傳腦炎病毒(TBE)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、羅斯河病毒、黃熱病毒及其衍生的嵌合病毒、西尼羅河病毒、日本腦炎病毒、風(fēng)疹病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、腮腺炎病毒、麻疹病毒measles virus、呼吸道合胞體病毒(RSV)、皰疹單純病毒(HSV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、輪狀病毒、口蹄疫病毒(FMDV)。在本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)知的范圍內(nèi)選擇病毒和用于繁殖病毒的細(xì)胞。在用各種病毒分別感染之前，細(xì)胞可以培養(yǎng)在本發(fā)明的培養(yǎng)基中且生長(zhǎng)達(dá)到最佳的細(xì)胞密度。令人驚訝地，在本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和增殖的細(xì)胞培養(yǎng)物顯示了病毒產(chǎn)率的顯著增加。繁殖病毒的實(shí)施例已經(jīng)顯示與單獨(dú)包含酵母提取物的培養(yǎng)基相比在用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)和生長(zhǎng)的細(xì)胞上繁殖的不同病毒有2至5倍增加的病毒產(chǎn)量。這使該系統(tǒng)比現(xiàn)有技術(shù)中描述的系統(tǒng)更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和病毒的生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)胞是VERO細(xì)胞且病毒是選自流感病毒、TBE-病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、羅斯河病毒、黃熱病及其衍生的嵌合病毒、西尼羅河病毒、日本腦炎病毒、風(fēng)疹病毒、HCV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞體病毒、HSV、CMV、EBV、輪狀病毒。也可以使用已知生長(zhǎng)在VERO細(xì)胞中的其它病毒。
本發(fā)明也提供牛痘病毒的生產(chǎn)，通過(guò)提供在包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，用牛痘病毒感染所述細(xì)胞，以及培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物以繁殖牛痘病毒。優(yōu)選地，細(xì)胞生長(zhǎng)在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明的這方面，細(xì)胞可以是VERO細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、RK-細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞，或牛痘病毒能生長(zhǎng)的任何細(xì)胞。牛痘病毒可以是天然存在的牛痘病毒、天花病毒疫苗株、有毒牛痘株、減毒牛痘株和重組牛痘病毒。
本發(fā)明也提供正粘病毒的生產(chǎn)，其是通過(guò)下述方式進(jìn)行的，即提供在由包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)和生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，用正粘病毒感染細(xì)胞，以及培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物以繁殖正粘病毒。優(yōu)選地，細(xì)胞生長(zhǎng)在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。細(xì)胞可以是BSC-1細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞，或能使正粘病毒繁殖的任何細(xì)胞。正粘病毒可以是流感病毒，如流感A、B或C。
本發(fā)明也提供羅斯河病毒的生產(chǎn)，其是通過(guò)下述方式進(jìn)行的，即提供在由包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，用羅斯河病毒感染所述細(xì)胞，以及培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物以繁殖羅斯河病毒。優(yōu)選地，細(xì)胞生長(zhǎng)在包含濃度為約0.05％(w/v)至1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。細(xì)胞可以是BSC-1細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞或能使羅斯河病毒繁殖的任何細(xì)胞。
另外，本發(fā)明提供黃病毒的生產(chǎn)，其是通過(guò)下述方式進(jìn)行的，即提供在由包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，用黃病毒感染細(xì)胞，以及培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物以繁殖黃病毒。優(yōu)選地，細(xì)胞生長(zhǎng)在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。黃病毒可以是黃熱病毒，或其嵌合衍生物的重組體、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、西尼羅河病毒和丙型肝炎病毒。這里鑒定的細(xì)胞類(lèi)型可以用于繁殖黃病毒。
本發(fā)明還提供細(xì)小核糖核酸病毒的生產(chǎn)，其是下述方式進(jìn)行的通過(guò)提供在由包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，用細(xì)小核糖核酸病毒感染細(xì)胞，以及培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物以繁殖細(xì)小核糖核酸病毒。優(yōu)選地，細(xì)胞生長(zhǎng)在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。細(xì)小核糖核酸病毒可以是脊髓灰質(zhì)炎病毒或甲型肝炎病毒。這里鑒定的細(xì)胞類(lèi)型可以用于繁殖細(xì)小核糖核酸病毒。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)包含病毒或病毒抗原的免疫原性組合物的方法，該方法包括以下步驟提供動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中細(xì)胞是選自已在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的猴腎細(xì)胞、牛腎細(xì)胞、狗腎細(xì)胞、豬腎細(xì)胞、小鼠腎細(xì)胞、大鼠腎細(xì)胞、羊腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和人細(xì)胞；用選自正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒和腺病毒的病毒感染細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物以繁殖病毒，收獲產(chǎn)生的病毒且由收獲的病毒制備免疫原性組合物。生產(chǎn)和收獲的病毒可以用本領(lǐng)域中已知的方法純化，如離子交換或凝膠過(guò)濾。
現(xiàn)在已概括地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考以下實(shí)施例同樣會(huì)得到進(jìn)一步理解，這里提供的實(shí)施例是用于闡明目的而不以任何方式加以限制。
實(shí)施例實(shí)施例1培養(yǎng)基的配制用添加有無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素和其它成分的基礎(chǔ)DMEM/HAM′sF12(1∶1)培養(yǎng)基制備無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。也加入碳酸氫鈉(1-3g/L)、L-谷氨酰胺(0.1-1g/L)和不同濃度的大豆水解產(chǎn)物(QuestTechnologies，紐約)或酵母水解產(chǎn)物(Deutsche Hefewerke，德國(guó))或其組合物。
實(shí)施例2在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞增殖無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的VERO細(xì)胞VERO細(xì)胞(非洲綠猴，Cercopthecus aethiops，腎)用作細(xì)胞系。細(xì)胞獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland，登記號(hào)為ATCC CCL 81，傳代數(shù)為124。使細(xì)胞生長(zhǎng)在如這里所述的各種培養(yǎng)基中。
將工作細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞以分離比為1∶6-1∶8在T-培養(yǎng)瓶、搖瓶和微載體系統(tǒng)中擴(kuò)增。細(xì)胞在37℃下生長(zhǎng)6-8天。氧飽和度為20％+/-10％和pH為7.1+/-0.35的培養(yǎng)條件保持恒定。當(dāng)細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到匯合生長(zhǎng)生物量生產(chǎn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定細(xì)胞密度和耗氧率。
在生物量生產(chǎn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的生物量的細(xì)胞數(shù)，如Schrfe等人Biotechnologie in LaborPraxis 101096-1103(1988)描述的，通過(guò)胰蛋白酶消化細(xì)胞和用CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)計(jì)數(shù)(方法A)，或如Sanford等人，J.Nat′l Cancer Inst.11773-795(1951)描述的，通過(guò)檸檬酸和結(jié)晶紫處理后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)計(jì)數(shù)(方法B)。
將VERO細(xì)胞培養(yǎng)和生長(zhǎng)在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含濃度為0.05％、0.1％、0.2％、0.3％或0.4％、0.5％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物，或濃度為0.05％、0.1％、0.2％、0.3％或0.4％、0.5％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物，或酵母與大豆的濃度比(酵母/大豆)為0.05％/0.05％(w/v)、0.1％/0.2％(w/v)、0.1％/0.3％(w/v)、0.2％/0.2％(w/v)、0.3％/0.2％(w/v)或0.2％/1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。通過(guò)方法A和B計(jì)算在包含不同濃度的大豆水解產(chǎn)物、酵母水解產(chǎn)物或其組合的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中生物量生產(chǎn)結(jié)束時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞密度。
結(jié)果證明單獨(dú)的酵母和大豆水解產(chǎn)物支持細(xì)胞生長(zhǎng)。在酵母水解產(chǎn)物濃度為0.1％時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)到約11.8×105個(gè)細(xì)胞/ml，然而增加酵母水解產(chǎn)物的濃度至高于0.3％(w/v)時(shí)，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和隨后的細(xì)胞密度具有負(fù)效應(yīng)。單獨(dú)的大豆水解產(chǎn)物的濃度介于0.1％(w/v)至0.2％(w/v)，顯示了比0.3％(w/v)和0.4％(w/v)的大豆?jié)舛扔懈俚募?xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞密度。不過(guò)，培養(yǎng)在包含0.3％(w/v)或0.4％(w/v)大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度和細(xì)胞的耗氧沒(méi)有顯著不同，且約1％w/v高濃度的大豆水解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不具有正效應(yīng)。單獨(dú)的大豆水解產(chǎn)物的最佳濃度確定為介于0.2％w/v和1.0％w/v之間。相對(duì)于包含單獨(dú)的大豆或酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基，將用大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的組合添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基，達(dá)到的最終細(xì)胞密度顯著地增加。用濃度為0.05％(w/v)的大豆和0.05％(w/v)的酵母時(shí)，達(dá)到的細(xì)胞密度約為12.1×105個(gè)細(xì)胞/ml，且相對(duì)于生長(zhǎng)在單獨(dú)包含0.1％(w/v)大豆水解產(chǎn)物(10×105個(gè)細(xì)胞/ml)或0.1％(w/v)酵母水解產(chǎn)物(11.8×105個(gè)細(xì)胞/ml)的培養(yǎng)基中的細(xì)胞，具有更高的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞密度。生長(zhǎng)在包含濃度為0.2％(w/v)酵母和1.0％(w/v)大豆的培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞密度，與在包含0.05％(w/v)大豆和0.05％酵母(w/v)的培養(yǎng)基中獲得的密度相似。
對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)最顯著的作用是在大豆水解產(chǎn)物濃度相對(duì)于酵母水解產(chǎn)物高約2-3倍的培養(yǎng)基中。生長(zhǎng)在包含濃度約為0.3％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和約為0.1％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞，達(dá)到約為21.0×105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度，因此顯示相對(duì)于單獨(dú)生長(zhǎng)在約0.4％(w/v)大豆水解產(chǎn)物中的細(xì)胞高約2倍的細(xì)胞密度，而相對(duì)于培養(yǎng)在單獨(dú)包含約0.4％(w/v)酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞高約2.5倍的細(xì)胞密度。培養(yǎng)在包含酵母和大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞的代謝活動(dòng)也高于生長(zhǎng)在單獨(dú)包含酵母或大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞。包含0.1％(w/v)酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中耗氧率為1.5(％每分鐘)，單獨(dú)包含0.4％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物或大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的小于1.0(％每分鐘)。在包含0.1％(w/v)酵母水解產(chǎn)物和0.3％(w/v)大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中，耗氧約為2.9(％每分鐘)，其比培養(yǎng)在單獨(dú)包含大豆或酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞高出約2倍。
另外細(xì)胞周期，其在補(bǔ)充有單獨(dú)的酵母或大豆水解產(chǎn)物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中為7天，在水解產(chǎn)物組合(大豆和酵母)的培養(yǎng)基中減至6天。
實(shí)施例3重組細(xì)胞的增殖重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如rFVIII-CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物在10L的攪拌罐中灌流培養(yǎng)。使用實(shí)施例1中的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)和生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將細(xì)胞固定在多孔微載體上(Cytopore，Pharmacia)且培養(yǎng)至少6周。灌流速度為每天變化4體積；pH為6.9至7.2；O2濃度約為20-50％且溫度為37℃。測(cè)定細(xì)胞密度。
實(shí)施例4生長(zhǎng)在添加有酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的VERO細(xì)胞上病毒抗原生產(chǎn)的比較a.細(xì)胞培養(yǎng)生物量的生產(chǎn)限定傳代數(shù)的VERO細(xì)胞從液氮中解凍且在roux和搖瓶中傳代以生產(chǎn)足夠的細(xì)胞接種在1.5升的生物反應(yīng)器中。如實(shí)施例1和2中描述的，使細(xì)胞生長(zhǎng)在添加有酵母水解產(chǎn)物或酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。在以最終細(xì)胞密度1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml達(dá)到匯合之后，用純化的鏈霉蛋白酶組分，如美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)10/006,223中描述的灰色鏈霉菌屬胰蛋白酶(SGT)，從微載體中釋放細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到10升的生物反應(yīng)器中。這依次用作具有3.0g/l微載體濃度的100升生物反應(yīng)器的接種物。從含有107個(gè)細(xì)胞的工作細(xì)胞庫(kù)安瓿開(kāi)始，需要約30代以在最后的發(fā)酵容器中達(dá)到最終匯合的VERO細(xì)胞生物量。細(xì)胞在37℃下生長(zhǎng)。在病毒繁殖過(guò)程期間，氧飽和度為20％+/-10％和pH為7.1+/-0.35的培養(yǎng)條件保持恒定。
將VERO細(xì)胞的工作細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞在T-培養(yǎng)瓶和搖瓶中以1∶6的分離比進(jìn)行擴(kuò)增。在作為生物反應(yīng)器的1.5、10和501攪拌發(fā)酵罐中，使用Cytodexl微載體作為附著基底，進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞增殖。細(xì)胞在37℃下生長(zhǎng)。在病毒繁殖過(guò)程期間，氧飽和度為20％+/-10％和pH為7.1+/-0.35的培養(yǎng)條件保持恒定。
b.流感病毒的增殖用兩種不同的流感毒株New Caledonia A/H1N1和Panama A/H3N2感染VERO細(xì)胞，并在各自的培養(yǎng)基中繁殖。在病毒繁殖過(guò)程結(jié)束時(shí)，通過(guò)超速離心法純化含有病毒的澄清的上清液。根據(jù)容量抗原產(chǎn)率(總SRD，單向放射免疫擴(kuò)散)和操作結(jié)束時(shí)上清液的抗原含量(密度梯度純化的抗原)，對(duì)用單獨(dú)含酵母水解產(chǎn)物或含酵母和大豆水解產(chǎn)物的VERO細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲物進(jìn)行比較。比較兩種培養(yǎng)基配方的產(chǎn)量并總結(jié)于表1中。
表1.
在不同的培養(yǎng)基組合物中VERO流感病毒產(chǎn)率的比較
酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的組合顯示比單獨(dú)的酵母水解產(chǎn)物有顯著的改善。
c.痘病毒的生產(chǎn)用適合在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的VERO細(xì)胞中繼續(xù)傳代生長(zhǎng)的天花疫苗生產(chǎn)株(Dryvax，Wyeth疫苗，獲自Acambis，Inc.，適合在永久細(xì)胞系中生長(zhǎng)的小牛淋巴疫苗株)，以0.1-0.3的感染復(fù)數(shù)(m.o.i)，感染VERO細(xì)胞。在37℃下培養(yǎng)2-4天時(shí)間后，收獲細(xì)胞并從細(xì)胞回收病毒。
表2顯示了在添加有單獨(dú)的酵母水解產(chǎn)物或酵母和大豆水解產(chǎn)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞中獲得的病毒產(chǎn)量的結(jié)果。
表2生物反應(yīng)器系統(tǒng)中在生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí)牛痘病毒效價(jià)的測(cè)定
酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的組合顯示比單獨(dú)的酵母水解產(chǎn)物有顯著的改善。
d.羅斯河病毒的生產(chǎn)用羅斯河病毒以感染復(fù)數(shù)(m.o.i)為0.1-0.3感染此處所述的VERO細(xì)胞培養(yǎng)物。在37℃下培養(yǎng)2-4天時(shí)間后，收獲細(xì)胞并從細(xì)胞回收病毒。表3顯示了在補(bǔ)充有單獨(dú)的酵母水解產(chǎn)物或酵母和大豆水解產(chǎn)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞中獲得的病毒產(chǎn)量的結(jié)果。
表3生物反應(yīng)器系統(tǒng)中在生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí)羅斯河病毒效價(jià)的測(cè)定
酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的組合顯示比單獨(dú)的酵母水解產(chǎn)物有顯著的改善。
可以理解的是，在示例性的實(shí)施方案中，給出的描述、特定的實(shí)例和數(shù)據(jù)，只是說(shuō)明性的而不作為對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本申請(qǐng)論述、公開(kāi)的內(nèi)容和數(shù)據(jù)，在本發(fā)明范圍內(nèi)的各種變化和改進(jìn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，因此被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，該方法包括提供包括濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基；以及在該培養(yǎng)基中增殖細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是選自昆蟲(chóng)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是重組細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞選自BSC-1細(xì)胞、LLC-MK細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS-細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、RAF細(xì)胞、RK-細(xì)胞、TCMK-1細(xì)胞、LLC-PK細(xì)胞、PK15細(xì)胞、LLC-RK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、CHO細(xì)胞、NS-1細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、BHK細(xì)胞和RK-細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含源自大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的非動(dòng)物來(lái)源肽組合物的無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明也提供一種無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)方法，其中在不含動(dòng)物來(lái)源成分的條件下培養(yǎng)、增殖和傳代細(xì)胞。該方法對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，如重組細(xì)胞或經(jīng)病毒感染的細(xì)胞，以及對(duì)于在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)成分的條件下，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程生產(chǎn)生物制品是有用的。
文檔編號(hào)C12N5/02GK101058800SQ20071010190
公開(kāi)日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2003年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月9日
發(fā)明者M·賴(lài)特, W·蒙德特, L·格里爾伯格, B·克勞斯 申請(qǐng)人:巴克斯特國(guó)際有限公司, 巴克斯特健康護(hù)理股份有限公司