專利名稱：一種重組抗ctla4單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體藥物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種新的重組抗溶細胞性T細胞相關(guān)抗原4單克隆抗體，及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
T淋巴細胞的激活需要至少2個信號，第一信號為T細胞抗原受體(TCR)和抗原提呈細胞(APC)表面MHC/抗原肽復(fù)合物結(jié)合所產(chǎn)生，這兩種配體的結(jié)合需要特異性識別，與免疫反應(yīng)的特異性有密切關(guān)系。第二信號為T細胞表面的其它輔助分子與抗原提呈細胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合產(chǎn)生，該信號又稱為共刺激信號，為抗原非特異性。
T細胞、抗原提呈細胞表面參與產(chǎn)生共刺激作用的分子統(tǒng)稱為共刺激分子。目前公認最重要的共刺激通路為B7-CD28通路。B7位于抗原提呈細胞，與T細胞表面的CD28分子結(jié)合可以產(chǎn)生共刺激。當T細胞激活后，其細胞表面會出現(xiàn)另一種可與B7結(jié)合的分子——細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic TLymphocyte associate Antigen-4，CTLA4)，它是維持體內(nèi)T細胞穩(wěn)態(tài)的負調(diào)控因子。細胞內(nèi)CTLA4的表達受到嚴格的調(diào)控。在靜止T細胞表面檢測不到該蛋白，只有在T細胞活化轉(zhuǎn)錄增高時才可測到其mRNA。即使是活化的T細胞，也僅部分T細胞表面表達該蛋白。CTLA4與B7的親和力是CD28的500-2500倍。CTLA4分子與B7結(jié)合，可以誘導(dǎo)T細胞凋亡，它是在T細胞激活后發(fā)揮免疫調(diào)控作用的重要分子。
1991年由Linsley等利用基因工程的方法將細胞膜表面CTLA4分子與免疫球蛋白Fc片段組合起來，形成一種人工構(gòu)建的融合蛋白分子CTLA4-Fc，它與B7的親和力大大高于CD28，可以封閉APC上的B7，阻斷共刺激通路，抑制T細胞的激活。
CTLA4-Fc的N-末端含有人CTLA4的細胞外段，即N-末端的1-125號氨基酸殘基，隨后是人IgG1的重鏈鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。上述基因序列裝入適當?shù)谋磉_載體后，轉(zhuǎn)入動物細胞(如CHO工程細胞)，可以表達出DNA序列對應(yīng)的蛋白分子。由于保留了鉸鏈區(qū)的2個半胱氨酸殘基，CTLA4-Fc以等二聚體的形式分泌。另外，每條肽鏈上有2個N-糖基化位點，CTLA4和Ig部分各有1個。它的分子量大約為97KDa。
CTLA4-Fc的免疫抑制機理由于CTLA4-Fc保留了與配體B7結(jié)合的CTLA4膜外區(qū)，它在與表達有B7分子的抗原提呈細胞接觸后，可以與B7結(jié)合，從而使T細胞表面的CD28分子無法與B7結(jié)合。此時TCR僅接受了來自抗原提呈細胞MHC的第一信號，由于沒有輔助信號的共刺激作用，而造成T細胞凋亡。在體內(nèi)可以造成該克隆的T細胞被清除，造成克隆無反應(yīng)性和免疫耐受。但它對于未受到第一信號刺激的T淋巴細胞無影響。相比之下，其它免疫抑制劑往往會沒有選擇地殺傷所有的T細胞克隆，造成明顯的全身反應(yīng)和毒副作用。
在CTLA4-Fc進行臨床前研究及臨床研究的過程中，以及將來成為藥物后患者應(yīng)用的過程中，均需要檢測受試者(動物或人)或患者的血清CTLA4-Fc濃度，在某些造血系統(tǒng)的惡性疾患中，CTLA4可能會異常高表達，因此，在這類患者的診療過程中，也需要檢測患者血清中CTLA4濃度。所以迫切需要一種能有效、快速檢測CTLA4-Fc類藥物及CTLA4的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的需要解決的技術(shù)問題之一是提供一種重組抗溶細胞性T細胞相關(guān)抗原4單克隆抗體，該抗體用于體外檢測CTLA4的濃度。
本發(fā)明需要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種編碼上述抗溶細胞性T細胞相關(guān)抗原4單克隆抗體的DNA分子。
本發(fā)明需要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種表達載體。
本發(fā)明需要解決的第四個技術(shù)問題是提供一種真核宿主細胞。
本發(fā)明需要解決的第五個技術(shù)問題是提供一種上述單克隆抗體的用途。
本發(fā)明需要解決的第六個技術(shù)問題是提供一種該單克隆抗體的制備方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明一方面提供了一種重組的抗溶細胞性T細胞相關(guān)抗原4抗體，該抗體含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明另一方面提供了編碼上述單克隆抗體的DNA分子。該DNA分子含有SEQ ID NO3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ IDNO4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
本發(fā)明第三方面提供了一種表達載體，該表達載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列。
本發(fā)明第四方面提供了一種宿主細胞，其特征在于，它被上述表達載體轉(zhuǎn)化。在一個較佳的實例中，該宿主細胞是CHO細胞。
本發(fā)明第五方而提供了一種抗溶細胞性T細胞相關(guān)抗原4抗體檢測CTLA4濃度的的方法，其特征在于，所述的方法為ELISA法。
本發(fā)明第六方面提供了一種制備上述單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；c)在適合所述單克隆抗體表達的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明的單克隆抗體能在CTLA4-Fc進行臨床前研究及臨床研究的過程中，以及將來成為藥物后患者應(yīng)用的過程中，快速檢測受試者(動物或人)或患者的血清CTLA4-Fc濃度；同時在某些造血系統(tǒng)的惡性疾患中，異常高表達CTLA4，本發(fā)明提供的單克隆抗體在這類患者的診療過程中，也能快速檢測患者血清中CTLA4濃度。本發(fā)明抗體用ELISA法檢測CTLA4-Fc融合蛋白特異性強、靈敏度高，顯著優(yōu)于市售抗體。


圖1載體pMG18，并且標明了其中的元件及酶切位點，其中，hCMV pro為人巨細胞病毒主要早期啟動子；Ck為人κ輕鏈恒定區(qū)基因；IgG1恒定區(qū)為人γ1重鏈恒定區(qū)基因；pA為多聚腺苷化信號；DHFR為二氫葉酸還原酶基因；AmpR為氨芐青霉素抗性基因。
圖2本發(fā)明所構(gòu)建的pM載體，其中，Ck仍為人κ鏈(輕鏈)恒定區(qū)基因，IgG1 constant為小鼠γ1重鏈恒定區(qū)基因。
圖3本發(fā)明所構(gòu)建的pM(H+L)載體，含有重組抗CTLA4抗體重鏈全長和輕鏈全長基因。
圖4本發(fā)明抗CTLA4單克隆抗體與市售抗體分別用于檢測CTLA4-Fc融合蛋白的靈敏度比較結(jié)果(■為本發(fā)明的單克隆抗體，○為市售抗體)。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及一種重組的抗CTLA4單克隆抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來制得。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)制得。單克隆抗體也可用例如Clackson等，Nature，3 52624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離獲得。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明重組抗CTLA4單克隆抗體的DNA分子。在一個較佳的實例中，該DNA分子含有SEQ ID NO3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
在獲得編碼本發(fā)明重組抗CTLA4單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核昔酸序列后，通?？赏ㄟ^以下方法來制備本發(fā)明的單克隆抗體。
首先，提供含有編碼本發(fā)明單克隆抗體的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列的表達載體。
編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段來制得。例如，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列人工合成或用PCR法擴增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。然后，用本領(lǐng)域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切位點將這些核苷酸序列插入合適的表達載體中，使它們分別在表達載體所攜帶的重鏈恒定區(qū)編碼序列和輕鏈恒定區(qū)編碼序列之前，并使它們在同一讀框內(nèi)。
本發(fā)明中所用的表達載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種市售的表達載體，例如購自Qiagen和Promega公司的表達載體，以及可購得的表達載體pMG 18(《根據(jù)INCP-9質(zhì)粒序列進行環(huán)境監(jiān)測的工具的開發(fā)》(DEVELOPMENT OFTOOLS FORENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScoring Av.4，Minsk 220080 Belarus)。
隨后，用上述獲得的表達載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞?！八拗骷毎币话惆ㄔ思毎驼婧思毎３Ｓ玫脑怂拗骷毎睦影ù竽c桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。在本發(fā)明中，較佳的宿主細胞是CHO細胞。用表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法有很多種，所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核昔酸導(dǎo)入哺乳動物細胞中的力一法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發(fā)明中，較佳的方法是電穿孔法或脂質(zhì)體介導(dǎo)法等。例如可采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒來轉(zhuǎn)染CHO細胞。
然后，在適合本發(fā)明單克隆抗體表達的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細胞。然后用常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose，輕基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的重組抗CTLA4單克隆抗體。
所得單克隆抗體可用常規(guī)手段來鑒定。單克隆抗體的結(jié)合特異性可用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA))來測定。單克隆抗體的結(jié)合親和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析來測定。
下面將結(jié)合實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。
實施例中未標明來源的均為市售。
實施例1從抗體庫中篩選溶細胞性T細胞相關(guān)抗原4抗體基因可變區(qū)1)鼠源抗體庫的構(gòu)建CTLA4-Fc融合蛋白(R&D，325-CT/CF)與弗氏佐劑免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，小鼠血清1∶500稀釋后與CTLA4顯強陽性反應(yīng)，取免疫后小鼠脾臟，按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597.Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227，381-388.Haidaris CG等人J Immunol Methods.2001 Nov1；257(1-2)185-202，Griffiths，A.D.等人EMBO J.，13，3245-3260(1994).Nissim，A.等人EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法，構(gòu)建鼠源抗體庫。
2)篩選將復(fù)蘇的抗體庫菌株1毫升加入新鮮LB培養(yǎng)基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培養(yǎng)16小時。
12000rpm高速離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至無菌的50毫升離心管中，保存?zhèn)溆?。確保其滴度應(yīng)在2×1011以上。首先用人IgG1作為抗原，常規(guī)方法包被25毫升細胞培養(yǎng)瓶。包被后的細胞瓶中加入不少于3×1010噬菌體，37℃溫育1小時。收集培養(yǎng)瓶中的上清液，備用。CTLA4-Fc融合蛋白作為抗原，用常規(guī)方法包被25毫升細胞培養(yǎng)瓶。包被后的細胞瓶中加入上步收集的上清液，37℃溫育1小時。倒掉瓶中的液體，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗滌培養(yǎng)瓶10次。在培養(yǎng)瓶中加入1毫升對數(shù)期的TG1細胞，37℃溫育震蕩培養(yǎng)16小時。
重復(fù)上段所述步驟4次。
將上述獲得的細胞稀釋至105細胞/毫升后在加有0.1氨芐青霉素的1.5％瓊脂平板上培養(yǎng)，獲得單克隆。
取上述平板上的克隆在96孔深孔板上進行培養(yǎng)，每孔一個克隆，共作960個克隆(10塊96孔板)。
將上述深孔板在96孔板離心機上5000RPM離心20分鐘后，將上清轉(zhuǎn)移到新的無菌深孔板，封口后保藏于4度備用。
取96孔板10塊，每孔中加入CTLA4(10微克/毫升)10微升常規(guī)包被后，分別加入上述保存的上清10微升，37℃溫育1小時后用含有1％Tween-20的PBS洗滌20次。加入1微升HRP標記的羊抗M13單抗(購自Pharmacia公司)，37℃溫育30分鐘后用1％Tween-20的PBS洗滌10次。
加入含有0.025％DAB顯色劑的PBS 200微升和1微升1％的H2O237℃溫育顯色20分鐘后在讀板機上讀取595納米處的光吸收。
根據(jù)光吸收讀數(shù)確定顯色反應(yīng)強的孔，這些孔相對應(yīng)的克隆即為親和力較強的抗體可變區(qū)克隆。本試驗結(jié)果共篩選出357個陽性克隆，根據(jù)其讀數(shù)確定其中5個親和力最強的克隆，用于下一步的研究。
3)抗體可變區(qū)編碼序列向表達載體的克隆使上述5個克隆的菌株在100毫升LB培養(yǎng)基中擴增，然后按照生產(chǎn)商說明書用Promega公司的質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒(WizardPlus SV Minipreps DNAPurification System)純化質(zhì)粒DNA。
用XbaI和NheI限制性酶酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取363bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為重鏈可變區(qū)。PCR擴增后，進行序列測定。用XbaI和BsiWI限制性酶酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取336bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為輕鏈可變區(qū)。PCR擴增后，進行序列測定。確定正確序列后，化學合成法合成輕鏈全長序列，5’端設(shè)計XbaI酶切位點，3’端設(shè)計BamHI酶切位點，恒定區(qū)為小鼠κ輕鏈恒定區(qū)序列。
PCR法自小鼠脾細胞擴增IgG1重鏈恒定區(qū)序列，并將CH1起始氨基酸突變?yōu)锳la-Ser，同時含有了NheI酶切位點，3’端設(shè)計BamHI酶切位點，擴增后測序驗證無誤后，NheI和BamHI雙酶切IgG1恒定區(qū)片段和pMG18，將IgG1恒定區(qū)連入pMG18，構(gòu)建的新載體命名為pM，如圖2所示。
用XbaI和NheI限制性酶酶切表達載體pM。該表達載體的酶切圖譜如圖2所示。然后將上述重鏈可變區(qū)插入該表達載體的XbaI/NheI位點中。同樣，利用XbaI和BamHI限制性酶將抗體輕鏈全長cDNA插入到pM載體的XbaI/BamHI位點中，從而構(gòu)建得到分別含有重組抗CTLA4抗體重鏈全長和輕鏈全長基因的表達載體pM(H+L)，如圖3所示。
4)CHO細胞的轉(zhuǎn)染與重組克隆的篩選上述構(gòu)建的帶有抗體基因的表達載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株中接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進行擴增，用Qiagen公司的超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提純化質(zhì)粒DNA。采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒(lipofectamine 2000 transfection reagent，11668-027)，將上述純化的質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染CHO細胞，操作參照廠家的說明書進行。
轉(zhuǎn)化的CHO細胞在MTX選擇培養(yǎng)基上進行連續(xù)9周的選擇，最后在96孔板上進行極限稀釋培養(yǎng)，連續(xù)進行3次，進行單克隆化。
挑出的單克隆細胞系在RPMI 1640培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，對上清進行Western印跡試驗，根據(jù)染色反應(yīng)判斷表達強度，挑選出12個表達強的克隆作為候選細胞株。
5)單克隆抗體的純化用Protein A親和層析柱從細胞培養(yǎng)上清中直接分離純化出上述單克隆抗體，經(jīng)SDA-PAGE電泳證明，所得產(chǎn)物純度大于90％。親和層析的產(chǎn)物再次經(jīng)過分子篩層析，獲得了純度＞98％的樣品。將這些樣品用于以下的進一步分析與研究中。
實施例2抗體基因在CHO細胞中的表達強度將上述篩選得到的12個高表達候選克隆培養(yǎng)于10cm的組織培養(yǎng)皿中，如下所述用ELISA法測定抗體的表達量。將羊抗鼠IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃過夜，經(jīng)2％BSA于37℃封閉2小時，加入待測的培養(yǎng)上清和標準品(鼠IgG1)，37℃孵育2小時，加入HRP-羊抗鼠IgG(κ))進行結(jié)合反應(yīng)，37℃孵育1小時，加入TMB于37℃作用10分鐘，最后用H2SO4終止反應(yīng)，測A450值。下表1中顯示了上述篩選獲得的12個候選克隆的表達量。
表1候選克隆在CHO細胞中的表達量

從上表1可以看出，3C4，1A2和8H6具有很高的表達水平。
實施例3抗CTLA4單克隆抗體基因的DNA測序根據(jù)系譜，對上述獲得的8H6細胞株的抗CTLA4抗體基因進行DNA測序。結(jié)果如下SEQ ID NO3顯示了8H6輕鏈可變區(qū)基因序列(5′到3′)336bp其推測的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO1中；SEQ ID NO4顯示了8H6重鏈可變區(qū)基因序列((5′到3′)363bp)，其推測的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO2中。
實施例4單克隆抗體親和力研究按以下方法對各克隆的細胞培養(yǎng)液進行純化。10000rpm離心除去細胞和細胞碎片，100Kd截留分子量的濾膜超濾濃縮至1/10體積，超濾緩沖液是100mMTris-HCl，pH7.5。過SPA-sepharose親和層析柱，上樣液為100mM Tris-HCl，pH7.5，洗脫液為20mM檸檬酸，pH3.0，100mM NaCl。分子篩(Sephadex G200)層析。洗脫液為100mM Tris-HCl，pH7.5，得純品。
親和力測定采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107220)進行。結(jié)果表明，8H6、3C4和1A2三種單抗的親和力分別達到5.5×10-10，8.5×10-9和8×10-8。
實施例5抗CTLA4抗體檢測CTLA4Fc融合蛋白以及與市售抗體的比較1.試劑和材料1.1抗CTLA4抗體構(gòu)建的工程細胞(8H6)經(jīng)無血清發(fā)酵，proteinA親和層析純化獲得。
1.2市售抗CTLA4單抗，R&D，MAB325。
1.3重組人CTLA4-Fc融合蛋白，R&D，325-CT/CF。
1.4羊抗人IgG(H+L)多抗，HRP標記，稀釋度1∶1000-4000，Southern Biotech。
1.5HRP顯色底物TMB，上?？迫A公司，分A液及B液，臨用前，兩者等體積混合。
1.6終止液0.5mol/L硫酸。
1.7pH＝7.2的PBS稱取KH2PO40.21g，NaCl 9.0g，Na2HPO4.12H2O 0.97g，加注射用水溶解至1000ml。
1.8包被緩沖液20mmol/l pH＝9.6的碳酸鈉緩沖液。
1.9封閉緩沖液稱取3g牛血清白蛋白，加入pH7.2的PBS溶解至100ml。
1.10洗滌緩沖液取1ml Tween20，加入PBS至1升。
2.方法夾心ELISA法2.1重組抗CTLA4抗體及市售同類抗體稀釋于包被緩沖液中，濃度1μg/ml，包被96孔酶標板，0.1ml/well，37℃ 2h。
2.2洗滌洗滌緩沖液洗滌2遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.3封閉封閉緩沖液加滿孔后37℃ 2h。
2.4洗滌洗滌緩沖液洗滌3遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.5加抗原加入用封閉緩沖液稀釋至25，12.5，6.25，3.1，1.55，(ng/mL)的CTLA4-Fc，0.1ml/well，設(shè)2復(fù)孔。
2.6 37℃ 2h。
2.7洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.8加入HRP標記的羊抗人IgG二抗加入用PBS 1∶2000稀釋的二抗，37℃ 1h。
2.9洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.10顯色加顯色底物100μL/孔，避光顯色5～20min(顯色時間視顯色情況而定)，加終止液50μL/孔。
2.11酶標儀讀數(shù)測量450nm光吸收，以630nm為參考波長。
2.12用標準品濃度(對數(shù))與A450/630nm值做直線回歸方程。
本發(fā)明抗體用該法檢測CTLA4-Fc靈敏度高，可以達到2ng/mL，特異性強，而市售同類抗體檢測CTLA4-Fc靈敏度只有20ng/ml。本發(fā)明抗體的靈敏度為市售抗體的10倍，如圖4所示。
本發(fā)明抗體具有特異性強、親和力高等優(yōu)點，作為檢測抗體，靈敏度高于市售抗體，與市售抗體比較具有明顯進步，因此，本發(fā)明抗體可以替代市售抗體用于制備檢測CTLA4濃度的試劑。
此外，市售的檢測試劑盒通常是利用ELISA雙抗體夾心法原理，預(yù)先將抗體包被于試劑盒中，用于檢測相應(yīng)的抗原物質(zhì)，這種方法更加簡便、快速。因此，本發(fā)明抗體也可以替代現(xiàn)有檢測試劑盒中的包被抗體，用于制備檢測CTLA4濃度的試劑盒。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
序列表<110>上海中信國健藥業(yè)有限公司<120>一種重組抗CTLA4單克隆抗體及其制備方法和用途<150>CN200610026639.2<151>2006-05-17<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(112)<223>輕鏈可變區(qū)氨基酸序列<400>1Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Gln Ser20 25 30Lys Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Pro Ala Val Cys Leu Cys Thr His Ser85 90 95Ile His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110
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<222>(1)...(336)<223>輕鏈可變區(qū)核苷酸序列<400>3gatattgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60atctcttgca gatctagtca gagccttgca cagagtaagg caaacaccta tttacattgg120tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaacgcttc caaccgattt180tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc240agcagagtgg aggctgagga tccggcagtt tgtttatgca ctcacagtat acatgttccg300tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336<210>4<211>363<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(363)<223>重鏈可變區(qū)核苷酸序列<400>4gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60tcctgcaagg cttctggcta cacctttacc agctactggg tgccctgggt aaaacagagg120cctggacagg gtctggaatg gattggcact atttctcctg gaaatggtgc tactcgctac180aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catctgccag cactgcctac240atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctacggtct attactgttc aagaggcaac300gactatcgtt accacagatc ggctgacagg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca360gcc 36權(quán)利要求
1.一種重組抗CTLA4單克隆抗體，它包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。
2.一種DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有SEQ ID NO3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
4.一種表達載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列。
5.一種真核宿主細胞，其特征在于，它被權(quán)利要求4所述的表達載體轉(zhuǎn)化。
6.權(quán)利要求5所述的真核宿主細胞，其特征在于，所述及的真核宿主細胞是CHO細胞。
7.一種利用權(quán)利要求1所述的抗體檢測CTLA4濃度的方法，其特征在于，所述的方法為ELISA法。
8.一種制備權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有權(quán)利要求2所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達載體轉(zhuǎn)化真核宿主細胞；c)在適合所述單克隆抗體表達的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的真核宿主細胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
9.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測CTLA4濃度的試劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測CTLA4濃度的試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗CTLA4單克隆抗體，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了編碼該抗體的DNA分子，表達該抗體的載體以及被該表達載體轉(zhuǎn)化的真核宿主細胞。本發(fā)明提供的抗CTLA4單克隆抗體能在CTLA4－Fc用藥過程中快速檢測受試者血清中CTLA4－Fc濃度，同時也能快速檢測患有某些造血系統(tǒng)的惡性疾患的患者血清中CTLA4的濃度。
文檔編號C12N15/85GK101074264SQ200710101490
公開日2007年11月21日 申請日期2007年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月17日
發(fā)明者郭亞軍, 錢衛(wèi)珠, 寇庚, 候盛 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司 被以下專利引用 (1),