專利名稱：：利用逆向基因工程技術開發(fā)蛋白質疫苗與禽流感疫苗的方法
技術領域：
：本發(fā)明是關于一種具功能性蛋白質或疫苗的制造方法，尤其是指一種適用于預防或抑制流行疾病的蛋白質次單位疫苗或疫苗病毒株的制備方法。
背景技術：
：近幾年在分子生物學領域中持續(xù)不斷的突破性研究，以及各種高效能的實驗儀器、方法的研發(fā)，使得研究者可輕易，快速的取得各物種的基因序列，并由象征著生命密碼的基因序列，進行各種可增進人類健康的研究，其中最主要的部分，就是具功能性的蛋白質制劑或疫苗的研發(fā)。傳統(tǒng)型流行疾病疫苗的開發(fā)程序本來就相當繁復，對于新型流行病疫苗開發(fā)更不容易，一般而言此種高危險性傳染疾病的研發(fā)工作大多需要在重重防護下，自病體中取得的樣品分離及培養(yǎng)出野生型病毒株后，才能進行鑒定、分類、藥物抗性分析等研究。然而，高流行性的病毒株一旦操作失當，很容易自實驗單位擴散，進而引發(fā)大流行，對于研究人員，甚至整個社會，都具有非常大的危險性。為了要防止該流行病的繼續(xù)傳布，開發(fā)疫苗是唯一良方，要實時馴化、弱化成為疫苗株，可能要有一段長久的研發(fā)時間，對于有可能快速傳布造成全球大流行的疾病，時間將是人類一大考驗。同樣的，由于高危險性新型病原的各種限制因素，無形中阻礙了人類去抵御這些疾病危害的積極性。流行病一但大爆發(fā)后，疫區(qū)的人們急于處理患者疾病問題，急待疫苗藥物的救助是斷然的，根本無暇進行藥物或疫苗的研發(fā)，而疫區(qū)的人們，恐于與病原接觸下，只能給予有限的救助。為了抵御此種可能爆發(fā)全球性流感大流行的危機，發(fā)展一套既安全又有效的疫苗產(chǎn)制是非常重要的。就疫苗大量產(chǎn)制的安全考慮，唯有使用近來發(fā)展的ReverseGenetics型病毒株為目前可以被期待的疫苗產(chǎn)制方向。ReverseGenetics型病毒株是以固有疫苗株為基礎下，將其所有基因轉殖成為含有H1N1PA、PB1、PB2、NP、M、NS2、HA、以及NA基因的八個質體，如果共同轉殖入細胞后，可以產(chǎn)生H1N1病毒體，并于適當?shù)呐囵B(yǎng)下大量產(chǎn)制H1N1疫苗。HoffmannE.于2002年則利用再組合法，將含H3N2、H6N1、與H9N2的HA及NA結構蛋白基因質體，與含有H1N1的PA、PB1、PB2、NP、與M質體進行組合而產(chǎn)生新型疫苗株，此發(fā)明固然可行，但是整個基因的置換可能會有人工誘發(fā)委危險病毒株的危險性。根據(jù)過去免疫學研究發(fā)現(xiàn)，抗原可以刺激那些具有特定抗原受體的淋巴球，引起增生以合成免疫力，以便之后消滅這些抗原，這也是免疫系統(tǒng)具抗原特異性(antigenspecificity)的緣故?？乖豢贵w辨識或結合的地方叫抗原決定位(antigenicdeterminant或epitope)?？乖系臎Q定位通常含68個胺基酸，它可以是三度空間的構造(conformationstmcture)。T-細胞所辨認的抗原決定位，便是此種一連串胺基酸組成的抗原決定位勝肽，它和主要組織兼容抗原(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)上的class1/1I在一起，而與T-細胞上的T-細胞受器(Tcellreceptor,TCR)結合。一個抗原通常有好幾個抗原決定位，構造越復雜，分子量越大，它的抗原決定位愈多。因此，如能由任何發(fā)表的數(shù)據(jù)中獲得抗原決定位勝肽的胺基酸序列，直接于體外進行抗原決定位勝肽的轉錄，將對于研究工作有關鍵性影響。同時，為了使抗原決定位勝肽可高度表現(xiàn)于宿主細胞的放大系統(tǒng)中，宿主細胞是否可辨識標的抗原決定位勝肽所帶的編碼(codon)，亦為主要關鍵。而要由宿主在體外進行蛋白質的合成，除前置步驟之外，后續(xù)操作亦必須先利用一些手段，以順利進行量產(chǎn)、純化、分離與產(chǎn)制。除了抗原決定位外，病原中和力價區(qū)的發(fā)現(xiàn)是疫苗開發(fā)成功的重要條件。疫苗一但可以誘發(fā)較高中和力價血清時就能有效抑制病毒的感染以及繁殖。人類疫苗除了考慮以上因素外，疫苗成份具備安全性、不具毒性、不造成免疫失調、不造成免疫毒性或過敏反應等皆非常重要。
發(fā)明內容基于以上種種困難，本發(fā)明的目的在于提供一種利用逆向基因工程技術開發(fā)蛋白質疫苗與禽流感疫苗的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的蛋白質疫苗或新型病毒疫苗株的制備方法，包括(a)取得一標的抗原蛋白質至少一抗原決定位勝肽的胺基酸序列，并對應轉碼出該勝肽的野生型核酸序列；(b)將該抗原決定位勝肽的野生型核酸序列，改質為于一宿主細胞中可辨識，編碼有該抗原決定位勝肽的一合成型核酸序列；(c)合成該合成型核酸序列的復數(shù)個引子，該等引子為與該合成型核酸序列具部分片段相同或互補的5-80個核酸序列，且該等引子中，正向引子的3，端與反向引子的3，端有5-10個互補的核酸序列；(d)利用該等引子，于體外合成該合成型核酸；(e)將該合成型核酸結合一帶有結合與移位功能的核酸序列，與一羧基終端核酸序列的質體，形成一合成質體；(f)將該合成質體轉形入該宿主細胞，以生產(chǎn)該合成型核酸所編碼的該抗原決定位勝肽；以及(g)收集并純化該抗原決定位勝肽。所述的制備方法，其中該抗原決定位勝肽的胺基酸序列為非自然存在的序列。所述的制備方法，其中該抗原決定位勝肽為該標的抗原蛋白質結構的親水部位。所述的制備方法，其中該抗原決定位勝肽為該標的抗原蛋白質結構的疏水部位。所述的制備方法，其中該宿主細胞為微生物細胞、植物細胞或動物細胞。所述的制備方法，其中該宿主細胞為大腸桿菌細胞或酵母菌細胞。所述的制備方法，其中該標的抗原蛋白質的野生型核酸序列與該合成型核酸序列編碼出同一勝肽。所述的制備方法，其中該合成型核酸是以聚合酶連鎖反應(polymerasechainreaction,PCR)方法進行體外合成。所述的制備方法，其中該結合與移位功能的核酸序列來自假單胞菌屬夕卜毒素(pseudomonasexotoxin)的第一部位(domainI)與第二部位(domain11)。所述的制備方法，其中該標的抗原基因可崁入疫苗株相似基因的等位區(qū)利用逆向遺傳學及類似流感病毒八質體系統(tǒng)技術產(chǎn)生一種對抗新型病原的疫苗株。所述的制備方法，其中該假單胞菌屬外毒素的第一部位是配體部位(ligand)。所述的制備方法，其中該配體部位與一標的細胞的接受體結合。所述的制備方法，其中該標的細胞是至少一選自以下細胞所組成的群組T細胞、B細胞、樹突細胞、單核細胞以及巨噬細胞。所述的制備方法，其中該接受體是至少一選自以下接受體所組成的群組TGF受體、IL2受體、IL4受體、IL6受體、1GF1受體、CD4受體、IL18受體、IL12受體、EGF受體、LDL受體、a2巨球蛋白受體、熱休克蛋白。所述的制備方法，其中該羧基終端部分的核酸序列來自假單胞菌屬外毒素的一部分。所述的制備方法，其中該羧基終端部分包括KDEL的胺基酸序列或對應的核酸序列。本發(fā)明提供的抑制禽類流行性感冒病毒(AvianInfluenzavirus)的蛋白質疫苗，其結構包括一禽類流行性感冒病毒蛋白質的抗原決定位勝肽；一具有結合與移位功能的勝肽；以及一羧基終端勝肽。所述的蛋白質疫苗，其中該編碼有禽類流行性感冒病毒蛋白質的抗原決定位勝肽是人工合成。所述的蛋白質疫苗，其中該禽類流行性感冒病毒是正黏液病毒科H5N1(oW/zom，oW"'(iaeH5N1)。所述的蛋白質疫苗，其中該禽類流行性感冒病毒蛋白質的抗原決定位的核酸序列經(jīng)過改質。所述的蛋白質疫苗，其中該禽類流行性感冒病毒蛋白質的抗原決定位，至少一選自以下抗原決定位所組成的群組H5N1-NS1、H5N1-NP、H5N1-HA、H5Nl隱eM2、以及H5N1-NA。所述的蛋白質疫苗，其中該結合與移位功能的勝肽來自假單胞菌屬外毒素(pseudomonasexotoxin)的第一部位(domainI)與第二部位(domain11)。所述的蛋白質疫苗，其中該假單胞菌屬外毒素的第一部位是配體部位(ligand)。所述的蛋白質疫苗，其中該配體部位與一標的細胞的接受體結合。所述的蛋白質疫苗，其中該標的細胞是至少一選自以下細胞所組成的群組T細胞、B細胞、樹突細胞、單核細胞以及巨噬細胞。所述的蛋白質疫苗，其中該接受體是至少一選自以下接受體所組成的群組TGF受體、IL2受體、IL4受體、IL6受體、1GF1受體、CD4受體、IL18受體、IL12受體、EGF受體、LDL受體、a2巨球蛋白受體、熱休克蛋白。所述的蛋白質疫苗，其中該羧基終端勝肽來自假單胞菌屬外毒素的一部分。所述的蛋白質疫苗，其中該羧基終端勝肽包括KDEL的胺基酸序列。換言之，本發(fā)明提供一種平臺技術，利用新一代的基因工程技術，結合了核酸合成技術、蛋白質工程學、或逆向遺傳學等而發(fā)展出的一種平臺技術，稱之為「逆向基因工程平臺技術」(reversegeneticengineeringplatform)o利用此平臺技術，可在不需要具感染性以及可能危害生命的生物材料存在，而是經(jīng)由學術網(wǎng)絡系統(tǒng)獲得相關信息下，即可設計及完成一疫苗抗原，或任何標的蛋白的基因修飾型態(tài)的DNA序列。此DNA序列可依設計的限制酵素切點，架接到公知或已經(jīng)含有傳輸系統(tǒng)(如，綠膿桿菌外毒素蛋白質)，或可誘發(fā)高抗體表現(xiàn)的序列(如KDEL家族序列)的DNA質體上，而形成融合型基因。此質體上的融合基因，在適當寄主下可以產(chǎn)生具功能性的蛋白質或次單位疫苗；除此，亦可衍生出「逆向遺傳學產(chǎn)制新型疫苗RNA病毒體」技術，產(chǎn)生一種既安全而又具免疫功效性的新型疫苗病毒株。此疫苗株乃參考學術信息后，將具有高傳染性及高危險性的病毒基因序列中，具中和力價或特殊功能的決定位，插換到原疫苗株相同基因的相對位置，并選殖于產(chǎn)制疫苗用的八質體系統(tǒng)中相似基因屬性的質體上，再與其它含疫苗基因的七個質體共同轉殖于寄主細胞或胚體中，則這些復合質體在寄主細胞內可以合成新型的疫苗株。對于高致病性高危害性的疾病，由以上「逆向基因工程平臺技術」發(fā)明，可快速的發(fā)展出同時具有抗體誘發(fā)效果，又具安全性的疫苗，使更多的研究人員在無危害顧慮下，全力投入各種新型流行疾病的疫苗開發(fā)，有效的防御疾病的蔓延，對于危害人類的疾病災禍，提供一項快速而有效的疫苗發(fā)明技術。本發(fā)明所揭示的平臺技術方法主要有以下重點(a)先將標的胺基酸序列對應的核苷酸對應序列整理出一條標的核酸序列。由于胺基酸序列對應的核苷酸序列會有好多對，可以由學術數(shù)據(jù)(如http:〃www.kazusa.or.jp/codon)知道在大腸桿菌(五.co/0寄主系統(tǒng)比較適合的核苷酸對應序列，避開大腸桿菌不容易辨識、表現(xiàn)的核苷酸對應序列。同理，如果這序列要在酵母菌表現(xiàn)，則亦要選擇適于酵母菌系統(tǒng)(iS^cc/z"ramyces,or/^c/w'a)表達的序歹廿。(b)利用計算機軟件(如DNAstrider)，分析標的核酸序列的限制酵素的圖譜。根據(jù)圖譜再于標的核酸序列兩邊安裝往后進行剪接時所用的限制酵素切位序列，對于標的核酸序列內不該含有的限制酵素切位序列，必須利用相同胺基酸序列對應的不同核苷酸序列改換，使該序列不再有限制酵素切位。(c)根據(jù)報告有關標的蛋白有可能具有毒性、造成免疫失調、造成免疫毒性或過敏反應的部位，如果經(jīng)由某胺基酸序列點的突變或刪除，可以改善時，則給予修改；例如堿性胺基酸存于流感病毒結構蛋白所導致的流感病毒超強毒力，可由突變改換成其它非堿性胺基酸后，使毒力明顯下降，利用給予任何定位的修改而完成該標的蛋白的修正，可以有效的提供一種抑制流行性病毒的蛋白質疫苗的設計。(d)當然修改設計后尚須檢視胺基酸改換，并轉換成核酸序列后整個標的基因的限制酵素的圖譜，如果該修飾后的標的基因中出現(xiàn)新的限制酵素切位，而且會影響往后基因剪接或植入質體的困難度時，可以相同胺基酸轉錄的其它三核苷酸基因譯碼改換，而去除此限制酵素切位。將以上步驟要點以禽流感病毒(AvianInfluenzavirus,或Birdflu)為例說明。禽流感病毒屬于A型流感(InfluenzaA)的一支，流感病毒的粒徑大小約為0.080.12pm，為RNA病毒，通常依據(jù)病毒表面紅血球凝集素(HA/hemagglutinin)與神經(jīng)胺酵素(NA/neuraminidase)兩種蛋白質的類型作為分類，有15種HA亞型與9種NA亞型。人類流感的病毒一般是H1N1與H3N2型，流行已久，大多數(shù)人有抵抗力。通常禽流感病毒在基因上和人類流感病毒有區(qū)隔，少數(shù)如H9、H7和H5已有由動物傳染人的病例。A型流感病毒外套的三個蛋白即紅血球凝集素(hemagglutinin;HA醣蛋白)，神經(jīng)胺酸酶(neuraminidase;NA醣蛋白)及蛋白M2，是宿主抗體或抗病毒藥物如oseltamivir(NA)禾口rimantadine(M2)主要辨識的標的物。HA醣蛋白在病毒表面形成凸出物，調控附著寄主細胞受器(sialosidereceptors)的過程，再進一步由細胞膜融合進入細胞。NA在病毒分子表面形成球狀凸出物，并催化病毒自被感染的細胞內釋出，以進行病毒的擴散。M2是一個膜蛋白，負責在膜上形成一個離子信道，使得病毒基因得以釋出并進行表現(xiàn)。A/H5N1新型禽流感病毒亦稱為「H5N1病毒」，是一種主要存在于鳥類的A型新型流感病毒亞型。禽流感病毒在鳥類中持續(xù)散播，而此病毒具有容易產(chǎn)生變異的能力，加上禽鳥類與家畜、人類的活動范圍接近，病毒極易跨物種而感染另一物種，如豬、人即可能因獲得不同病毒基因，例如患者同時受到人類流感病毒及禽流感病毒感染，而有可能成為病毒的「混合管道j，產(chǎn)生基因重組，成為新品種病毒。當此病毒有能力傳染給人，并引起嚴重疾病時，即已具備流感大流行病毒株的特質?，F(xiàn)今可能出現(xiàn)的危機是由于該類病毒極易產(chǎn)生基因漂移(geneflow)現(xiàn)象，若經(jīng)過突變、替換再感染人類后，則可能會演變成人傳人的大流行。在人類體內還沒有被引發(fā)出任何抗體情況下，預估將造成極重大疫情。本發(fā)明在新型流感疫苗研制上可衍生兩種形式疫苗的開發(fā)及應用。其一，應用前人所發(fā)展的流感八質體(eight-plasmidflusystem)逆向遺傳學技術，先將H1N1病毒體的HA結構蛋白基因改造成一個中和力價區(qū)可置換的HA質體，接著將H5N1或其它新型高致病性流感基因屬，與中和力價區(qū)標的序列，以核酸合成法制造該片段后，再將其插入H1N1疫苗株可置換的HA質體中。此種抗原組成不包括新型流感高致病性株H5N1的紅血球凝集素(HA/hemagglutinin)的全長蛋白質，而只置換了H5N1-HA中和力價區(qū)，因此該病毒特性比較類似H1N1疫苗株，要演變成高致病性病毒的機會較少，在疫苗生產(chǎn)制程上比較安全，而且該新型流感疫苗注射后可以產(chǎn)生的具備H5N1-HA中和力價抗體。利用上述，將H5N1-HA中和力價區(qū)的標的抗原基因，崁入疫苗株相似基因的等位區(qū)，再利用逆向遺傳學及類似流感病毒八質體系統(tǒng)技術，產(chǎn)生一種對抗新型病原的疫苗株，將是往后人類對抗新型流型病最佳的策略。除了中和力價區(qū)外，應用H5N1-HA非中和力價區(qū)的特異抗體反應的ELISA檢驗，依然可以區(qū)別H5N1病毒自然感染的種別性抗體，因此此類疫苗注射再利用此特異抗體反應的ELISA檢驗系統(tǒng)分析，當然不會千擾到現(xiàn)有防疫檢測系統(tǒng)區(qū)分新型流感傳播時況。本發(fā)明另一種疫苗制備方法為標的型次單位疫苗的制備方法，包括(a)取得一標的抗原蛋白質至少一抗原決定位勝肽的胺基酸序列，并對應轉碼出勝肽的野生型核酸序列；(b)將抗原決定位勝肽的野生型核酸序列，改質為于一宿主細胞中可辨識，編碼有抗原決定位勝肽的一合成型核酸序列；(c)合成此合成型核酸序列的復數(shù)個引子，此引子為與合成型核酸序列具部分片段相同或互補的5-80個核酸序列，且這些引子中，正向引子的3'端與反向引子的3'端有5-10個互補的核酸序列；(d)利用這些引子，于體外合成此合成型核酸；(e)將此合成型核酸結合一帶有結合與移位功能的核酸序列，與一羧基終端核酸序列的質體，形成一合成質體；(f)將此合成質體轉形入宿主細胞，以生產(chǎn)合成型核酸所編碼的抗原決定位勝肽；以及(g)收集并純化抗原決定位勝肽。在本領域的公知技術中，已知取蛋白質中的一小段胺基酸順序，拿來制造對抗此勝肽鏈的抗體，則此抗體也可以認識原來完整的蛋白質。因此，本發(fā)明的次單位疫苗制備方法所揭示的，是選擇抗原決定位序列上的某一片段，作為標的的合成勝肽，而毋須使用全長序列。因此，適用于本方法的序列無限制，可依功能性片段序列為主，例如激發(fā)B-細胞或T細胞免疫的蛋白質決定位，也可依結構的親水性或疏水性來決定欲取的片段。由于蛋白質結構中，具有高親水性的部位一般與細胞內各單元產(chǎn)生較佳反應，因此本發(fā)明較佳的抗原決定位勝肽，是取標的抗原蛋白質結構的親水部位。而所使用的片段不限，可將選擇的數(shù)個片段合成后再行接合為一大段勝肽，也可以于一抗原決定位序列中只挑單一片段，亦可將激發(fā)B-細胞或T細胞免疫的蛋白質決定位聯(lián)結成一融合蛋白。由于本發(fā)明的抗原蛋白質結構或序列并非直接分離自自然界的細菌或病毒株，因此必須由一宿主細胞進行標的蛋白質的合成與生產(chǎn)。適用的宿主細胞不限，較佳為微生物細胞，植物細胞或動物細胞，更佳的宿主細胞為大腸桿菌細胞或酵母菌細胞。此外，由宿主所生產(chǎn)的標的勝肽(帶有合成型核酸序列)，必須與野生型核酸序列編碼出同一標的蛋白質的抗原決定位勝肽，才可發(fā)揮利用本發(fā)明方法所制備得的抗原的專一性效果，除利于實驗室中制備高安全性的抗原疫苗的外，亦可達到如同野生型病毒株抗原的專一性。但是，有些病原的蛋白具有免疫毒性或造成免疫失調，經(jīng)由某胺基酸序列點的突變或刪除可以去除該毒性時，也可給予修改。修改后，該抗原則具備安全性及免疫保護性。于本發(fā)明中，根據(jù)野生型的標的蛋白質抗原決定位勝肽所改質的合成型核酸，其體外合成方法不限，較佳是以聚合酶連鎖反應(polymerasechainreaction,PCR)方法進行體外合成。本發(fā)明中合成型核酸序列中所帶有的羧基終端部分的核酸序列來源不限，較佳是來自假單胞菌屬外毒素的一部分，更佳者，適用的羧基終端部分系包括KDEL的胺基酸序列或其對應的核酸序列。本發(fā)明標的型次單位疫苗的制備方法，包括一種次單位蛋白質疫苗發(fā)明，它可以誘發(fā)保護力價，有效抑制禽類流行性感冒病毒(AvianInfluenzavims)的感染，此蛋白質疫苗結構包括一禽類流行性感冒病毒蛋白質的抗原決定位勝肽；一具有結合與移位功能的勝肽；以及一羧基終端KDEL類型勝肽。于本發(fā)明中，編碼有禽類流行性感冒病毒蛋白質的抗原決定位勝肽是人工合成，非來自自然界禽類流行性感冒病毒株中分離及研制，不會直接與侵害人體的病原接觸，因此可提高研究者工作環(huán)境的安全性，加速相關疫苗或藥物研發(fā)的速度。本發(fā)明方法中，禽類流行性感冒病毒是正黏液病毒科H5N1(oW/w/^;coWn^^H5N1)。而適用的禽類流行性感冒病毒蛋白質的抗原決定位的核酸序列是經(jīng)過改質，其所編碼出的抗原決定位勝肽與自然界存在的病毒株相同，但是可于指定使用的宿主細胞中獲得高度表現(xiàn)的效果。同時，于標的型次單位疫苗中所使用的合成抗原標的抗原，較佳是將某一野生型病毒蛋白質的決定位勝肽的全長轉碼為核苷酸后，根據(jù)功能需求擇取其中一段核苷酸序列，或將數(shù)段核苷酸序列進行結合，并以體外合成方式完成合成型核苷酸序列，同時以微生物生產(chǎn)所對應的病毒蛋白質決定位勝肽(合成型勝肽)。根據(jù)本發(fā)明方法所制備出的合成型勝肽具有誘發(fā)活體內抗體的功效，但不會導致該活體在免疫過程中被感染，因此亦可為相對安全的良好疫苗或抗體組成物。于本發(fā)明中所涵蓋的標的型次單位疫苗，適用的禽類流行性感冒病毒蛋白質的抗原決定位不限制，較佳是至少一選自以下抗原決定位所組成的群組H5N1-NS1，H5N1-NP，H5N1-HA中和力價區(qū)，H5N1-M2，以及H5N1-NA酵素反應區(qū)。本發(fā)明標的型次單位疫苗中，除了與抗原的相互作用外，此標的型次單位疫苗更與疫苗傳輸系統(tǒng)功能相關，亦同時具有與抗原呈現(xiàn)細胞的結合與移位等功能。此結合與移位功能的核酸序列來源不限，較佳是來自假單胞菌屬外毒素(pseudomonasexotoxin)的第一部位(domainI)與第二部位(domain11)。此假單胞菌屬外毒素的第一部位是配體部位(ligand)，此配體部位的功能在與一標的細胞的接受體結合，適用的標的細胞可為公知的任何一種，較佳是至少一選自以下細胞所組成的群組T細胞，B細胞，樹突細胞，單核細胞以及巨噬細胞。適用的接受體是至少一選自以下接受體所組成的群組TGF受體，IL2受體，IL4受體，IL6受體，1GF1受體，CD4受體，IL18受體，IL12受體，EGF受體，LDL受體，a2巨球蛋白受體，或熱休克蛋白。本發(fā)明標的型次單位疫苗中，標的抗原基因的位置可崁入與疫苗株相似基因的等位區(qū)，并利用本發(fā)明所揭示的逆向遺傳學的技術平臺，或是公知的類似流感病毒八質體系統(tǒng)技術，來產(chǎn)生制出對抗新型病原的疫苗株。本發(fā)明融合蛋白的概念，另可開發(fā)出保留共通抗原(conservedcommonimmimogen)如M2抗原類的疫苗。換言之，便是含本發(fā)明融合蛋白的疫苗所誘發(fā)的免疫反應，可辨識泛型的流感病毒(如H5N1、H5N2、及H1N1等)，此可因應病毒突變過于快速，而不需如傳統(tǒng)方法每隔一年必須更換成另一種疫苗。此種想法在流感疫苗開發(fā)上是未來潮流，因此并非如一般傳統(tǒng)制造疫苗的方法，只注重抗體中和力價(neutralizingantibodytiter)的保護效果，但待來年該型病毒出現(xiàn)另一突變株，此公知方式所制造的疫苗面對于新突變株病毒時，便不具其原有的效用。然而本發(fā)明所發(fā)展含融合蛋白的疫苗，可針對泛型病毒皆具有其效果。圖l為PCR合成出H5Nl-NSl片段的電泳圖(396bp)。圖2a-2d為PCR合成出H5Nl-NP片段的電泳圖，其中圖2a為a段256bp、圖2b為b段365bp、圖2c為c段464bp、圖2d為d段488bp。圖3為PCR合成出H5Nl-HA片段的電泳圖(486bp)。圖4為PCR合成出H5Nl-NA片段的電泳圖(501bp)。圖5為H5N1-NS1的質體圖譜。圖6a-6d為H5Nl-NP的質體圖譜，其中圖6a為a段、圖6b為b段、圖6c為c段、圖6d為d段。圖7為H5N1-HA的質體圖譜。圖8為H5Nl-eM2的質體圖譜。圖9為H5N1-NA的質體圖譜。圖10為PE-H5Nl-NP-a-K3PE-H5Nl-NP-d-K3質體的蛋白質表現(xiàn)結果圖，其中a-d段結果分別表示于圖上。圖11為PE-H5N1-HA-K3質體的蛋白質表現(xiàn)結果圖。圖12為PE-H5Nl-eM2-K3質體的蛋白質表現(xiàn)結果圖。圖13為PE-H5N1-NA-K3質體的蛋白質表現(xiàn)結果圖。圖14為實施例6中，以各種不同劑量的PE-H5Nl-eM2-K3疫苗免疫小鼠后，其M2抗體力價改變情形。圖15為實施例7中，免疫來亨雞后其蛋黃中IgY抗體改變情形。圖16為實施例8中，攻毒14天后，小鼠肺臟的病理解剖圖。圖17為實施例9中，免疫期間蛋雞的死亡率。圖18為實施例9中，免疫期間蛋雞的產(chǎn)蛋率。圖19為實施例9中，免疫期間蛋雞所產(chǎn)雞蛋的抗體效價轉變情形。圖20為實施例9中，免疫期間蛋雞所產(chǎn)雞蛋的抗體經(jīng)500倍稀釋后，針對H5N1-M2抗原的ELISA測試結果。圖21為實施例9中，免疫期間蛋雞所產(chǎn)雞蛋的抗體經(jīng)500倍稀釋后，針對H5N1-HA抗原的ELISA測試結果。.上述生物材料保藏單位德國微生物與細胞培養(yǎng)收集所保藏單位地址德國布倫瑞克市38124茵霍芬街7B保藏日期2007年3月29日；分類命名plasmid質粒保藏編號DSM19253、DSM19254、DSM19255、DSM19256、DSM19257、DSM19258、DSM19259、DSM19260具體實施例方式本發(fā)明所揭示的標的型次單位疫苗的制備技術平臺可以在取得標的蛋白質的序列后，經(jīng)過轉碼與改質，即可利用含有一結合與移位功能的勝肽序列，以及一羧基終端KDEL類型勝肽的載體，完成可體外制備標的蛋白質的質體。以下實施例以禽類流行性感冒病毒H5N1亞型的數(shù)個蛋白質片段作為抗原標的。由于上述已知的病毒感染機轉，本發(fā)明實施例利用其中數(shù)個具冇誘發(fā)免疫的關鍵蛋白質(即抗原決定位，epitope)中具高度保留(highlyconserved)的區(qū)段進行測試，以達成誘發(fā)活體免疫效果，卻不會因疫苗研發(fā)過程或施打疫苗時發(fā)生該病毒的感染為第一要務。本例中所選定的數(shù)個標的蛋白質為下列五種H5N1-NS1，H5N1-NP，H5N1-HA，H5N1-M2，以及H5N1-NA。其中，實驗過程發(fā)現(xiàn)H5N1-M2標的型次單位質體，在寄主大腸桿菌體內誘導生合成蛋白質的效率不佳，此原因可能因M2蛋白本身具有毒性，因此將M2中屬于親脂性部位去除，而只留下屬于親水性部位的蛋白質。因此在修改后另命名為H5Nl-eM2，且經(jīng)此修改，則可以在大腸桿菌被大量表現(xiàn)，由序列比對又證實所編碼出的胺基酸不受影響，而且將高免疫抗原區(qū)域皆保留下，因此本例中有關H5Nl-M2抗原皆以H5Nl-eM2為主耍代表抗原。實施例l、標的序列片段的選擇自美國國立生物技術數(shù)據(jù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中找到H5N1-NS1，:H5N1-NP，H5N1-HA，H5N1-M2，以及H5N1-NA的DNA序列及其對應的胺基酸序列。根據(jù)疫苗制備的理論，抗原蛋白質的勝肽鏈序列中，不是全部都能誘發(fā)出對整個抗原蛋白質具有反應的抗體，最起碼要位在蛋白質的表面，且能與水分子接觸。因此，本實施例中將上述DNA序列一一輸入一用來判定蛋白質結構的親水疏水區(qū)域的軟件(DNAstriderV1.0)中，再依分析出的圖譜，選擇所欲進行合成的片段。于本例中挑選親水性區(qū)域進行合成型勝肽的制備，然需注意的是，本例說明并非選定區(qū)域的限制條件，即，疏水區(qū)等其它具有可能誘發(fā)類似效果的區(qū)域亦在本發(fā)明的主張范圍中。根據(jù)上述軟件分析的結果，本實施例中各標的蛋白質各挑選數(shù)個親水片段，其胺基酸序列包括H5N1-NS1—1段(SEQ.ID.NO.l)，H5N1-NP—取a，b，c，d共4段(SEQ.ID.NO.2,3,4,5)，H5N1-HA—l段(SEQ.ID.N0.6)'H5Nl-eM2—l段(SEQ.ID.N0.7)'以及H5N1-NA—l段(SEQ.ID.N0.8)。由于產(chǎn)生出來的標的物須進行限制酵素的剪接，因此最好在標的DNA序列內不要再出現(xiàn)剪接用所須的限制酵素切位，因此還須利用常用的軟件分析DNA序列中是否有這些切位(restrictionmap)，如果有，必須再找胺基酸訊碼相同的另一組核酸碼來取代；而利用該類軟件亦可了解本DNA兩端是否確實存在如設計的限制酵素切位，往后才利于進行剪接。實施例2、標的序列的體外合成利用中國臺灣專利申請?zhí)?2126644所揭示的方法，根據(jù)野生型胺基酸所編碼的核苷酸序列進行改質，以使上述蛋白質可由大腸桿菌系統(tǒng)大量表現(xiàn)出來；改質的重點主要在將野生病毒株的核苷酸片段，以在不影響其原本表現(xiàn)出的胺基酸，而又能有效的在大腸桿菌宿主系統(tǒng).中表現(xiàn)的狀況下，進行單一核苷酸的改質。此改質后的核苷酸序列，可分別利用多對引子，以聚合酶連鎖反應(polymerasechainreaction,PCR)進行合成，所有引子對的對應編號請見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>首先利用無DNA模板的聚合方式，利用正向以及反向引子進行酵素反應的核苷酸片段聚合，其中各引子的3'端部分各有10-15個堿基是設計為彼此互補的結合，以經(jīng)由聚合酵素的讀寫及補足成為一條雙股的DNA模板聚合產(chǎn)物。完成第一次PCR后，取0.01lpl的聚合產(chǎn)物作為第二次PCR的模板DNA，同時加入適量的第二組引子對引子，連同所需的dNTPs、反應試劑以及Pfo聚合酶等，開始進行第二次PCR;接著依照相同方式，分次加入不同弓i子對進行PCR后，即可分別合成出改質后的核苷酸序列。所分別合成出的核苷酸片段經(jīng)電泳試驗后，可確認其產(chǎn)物的片段大小與預期相符。H5Nl-NSl—l段(396Mb)，如圖l;H5Nl-NP—取a，b，c，d共4段(a段256bp、b段365bp、c段464bp、d段488bp)，如圖2a-2d;H5N1-HA—1段(486bp)，如圖3;H5Nl-eM2—l段；以及H5Nl-NA—l段(501bp)，如圖4。實施例3、含標的序列的質體構筑將上述合成出的序列共八段(其中NP-ad共四段序列)，分別以限制酵素EcoRl、Xhol修飾后接入已帶有一結合與移位功能的勝肽序列，以及一羧基終端勝肽的大腸桿菌質體中。完成的質體分別為1.pPE-H5Nl-NSl-K3質體構筑于含T7啟動子及具抗生素(Ampicilin)抗性片段的pET15質體系統(tǒng)，可表現(xiàn)H5N1-NS1的融合蛋白。(質體圖譜如圖5)2.pPE-H5Nl-NP,a，b,c，d-K3質體pET15質體系統(tǒng)，可表現(xiàn)H5N1-NP1AH5N1-NP1D的融合蛋白。(質體圖譜如圖6a-6d)3.pPE-H5Nl-HA-K3質體pET15質體系統(tǒng)，可表現(xiàn)H5N1-HA的融合蛋白。(質體圖譜如圖7)4.pPE-H5Nl-eM2-K3質體pET15質體系統(tǒng)，可表現(xiàn)H5Nl-eM2的融合蛋白。(質體圖譜如圖8)5.pPE-H5Nl-NA-K3質體pET15質體系統(tǒng)，可表現(xiàn)H5N1-NA的融合蛋白。(質體圖譜如圖9)最后分別將上述質體轉染于不同的菌株細胞中。實施例4、標的蛋白質的表現(xiàn)與分析經(jīng)確定含有以上質體的菌種，90%以上細菌均含有質體及特殊基因NS1、NP-ad、HA、M2、或NA后，個別以甘油保存法于2ml分裝瓶中保存于-70。C。在無菌室下，將以上保存菌苗取2ml接種于滅菌的500ml三角瓶，其內含有200mlLB(+500ng/mlAmp)，于37"C回轉式培養(yǎng)箱以150rpm轉速下培養(yǎng)1012小時，完成種菌培養(yǎng)。該菌苗的OD600應達到1.0士0.3。在無菌室下，將50ml菌種液各別接種于滅菌的3000ml三角瓶共八瓶，該三角瓶內含有1250mlLB(+500(ig/mlAmp+50ml10%Glucose),于37。C回轉式培養(yǎng)箱以150rpm轉速下培養(yǎng)23小時，檢測OD600在0.3士0.1時，注入最終濃度為50ppm的IPTG蛋白質誘導劑后，于37。C回轉式培養(yǎng)箱以150rpm轉速下培養(yǎng)2小時，即完成蛋白生產(chǎn)步驟。接著，利用8M尿素法萃取及溶出包涵體(inclusionbodies)內的抗原蛋白質片段，如PE-H5N1-NS1-K3、PE-H5Nl-NP-a-K3PE-H5Nl陽NP陽d-K3(圖10)、PE-H5N1-HA-K3(圖11)、PE-H5Nl-eM2隱K3(圖12)、以及PE-H5N1-NA-K3(圖13)等抗原蛋白質片段，各以十公升細菌液(一小批量，lot)萃取，可得到300400mg抗原量?？傆?，各300mg抗原可以獲得三九千劑量以上的針劑。禾U用西方墨點法(Western-blottingmethod)、coomasieblue染色法、SDS-PAGE電泳分析法，并以密度計(densitometer)量測電泳條帶的密度，以進行各抗原溶液的蛋白質定量。將上述抗原蛋白質各取0.03士0.003mg，作為針劑高劑量的主成份(總抗原的蛋白量為0.12±0.01mg)。各取O.Ol土O.OOOlmg作為針劑低劑量的主成份(總抗原的蛋白量為0.04士0.004mg)。實施例5、禽流感疫苗的制備于潔凈度100級的無菌操作臺內，將各抗原溶液添加8M尿素至40c.c.，添加40c.c.的佐劑ISA206，在無菌攪拌桶以50rpm攪拌十分鐘后，徐徐注入無菌水至400c.c.，加快攪拌速度至100rpm后再攪拌一小時。將攪拌桶直接送入分裝室進行l(wèi)c.c.一劑量的已滅菌針劑瓶，進行分裝、加蓋、貼標簽，可得100劑禽流感疫苗針劑。實施例6、小鼠模式下疫苗的免疫試驗以PE-H5Nl-eM2-K3抗原為例，各取0.3士0.03mg為針劑超高劑量(VH)，O.l士O.Olmg作為針劑高劑量(H)，0.03士0.003mg為針劑中劑量(M)，O,Ol士O.OOlmg為針劑低劑量(L)，與不同劑量佐劑(SepecISA206)混合后，分別免疫六周的Balc/C小鼠，每一組共12只，免疫后兩星期內再免疫一次，共免疫三至四次。免疫后兩星期內采血，并進行ELISA的免疫檢測。由M2anti-specificIgG而言，抗eM2-ELISA的十倍稀釋終點力價檢測可知，小鼠在免疫第二次后開始可測出IgG抗體力價，高劑量(H)(O.l士O.Olmg)與超高劑量(VH)(0.3士0.03mg)可誘發(fā)力價指數(shù)相似，免疫第三次后可達高峰，第四次后力價就不再增加。中劑量(M)及低劑量(L)則誘發(fā)抗體力價較低些，但是在第四次免疫后皆可達十萬倍的力價。結果圖請參見圖14。實施例7、產(chǎn)蛋來亨雞只模式下疫苗的免疫試驗以PE-H5Nl-eM2-K3的抗原蛋白質為例，將此融合抗原0.1土0.01mg作為針劑劑量與適當?shù)淖魟┱{配，免疫注射于產(chǎn)蛋期的來亨雞，經(jīng)三至四次免疫后，其蛋黃即能積蓄抗禽流感的高力價IgY抗體，ELISA十倍稀釋終點力價大于十萬倍。但是若免疫抗原為無KDEL序列的PE-H5Nl-eM2或次單位eM2蛋白抗原時，其IgY力價甚低，約只無免疫的空白組的十至一百倍。結果圖請參見圖15。實施例8、利用ICR小鼠進行疫苗免疫及攻毒試驗由于本發(fā)明所表現(xiàn)的融合蛋白為H5N1型禽流感病毒的共通免疫抗原(conservedcommonimmunogen)。本領域中具通常知識者皆知H1N1型有H5N1型的N1特性，而H5N2型有H5N1型的H5特性，所以本發(fā)明所表現(xiàn)的融合蛋白雖為H5N1型禽流感病毒的抗原，但含本發(fā)明融合蛋白的疫苗對于H1N1型、或H5N2型也應具有效性。由于H5N1型流感病毒為人體極強的病毒株，不適合以此病毒進行實驗，因此本實施例使用本發(fā)明的疫苗免疫后，分別用H1N1型或H5N2型禽流感病毒進行攻毒，因H1N1型或H5N2型病毒分別具H5N1型病毒的N1型及H5型的特性，故可以證明本發(fā)明的疫苗對于H5N1型流感病毒有效。A.H1N1型人類流感病毒攻毒首先將ICR小鼠分為五個群組，每個群組為六只ICR小鼠。將抗原蛋白質依其分別的針劑劑量與適當?shù)淖魟┱{配如下群組I注射抗原蛋白質PE-H5Nl-eM2匿K3(H，0,l土0.01mg)、群組II注射抗原蛋白質PE-H5Nl-NP-(a+b+c+d)-K3(H，0.1士0.01mg)、群組III注射抗原蛋白質PE-H5N1-HA-K3(H，0.1土0.01mg)、群組IV注射抗原蛋白質PE-H5N1-NS1-K3(L，O.Ol士O.OOlmg)、及群組V作為空白組。經(jīng)三至四次免疫后，使用H1N1型病毒對已免疫的ICR小鼠進行攻毒，于攻毒四天后，測試各組ICR小鼠口沫是否有病毒存在，以及觀察各組ICR小鼠的健康狀況，其結果如表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>由表2來看，經(jīng)過本發(fā)明的抗原蛋白質免疫后的ICR小鼠，受到H1N1型人類流感病毒攻毒四天后，其口沫分泌病毒的ICR小鼠數(shù)量較空白組少。并且以高劑量的PE-H5Nl-eM2-K3及PE-H5Nl-NP-K3兩種抗原蛋白質效果最佳，可減少ICR小鼠分泌病毒和生病的的ICR小鼠數(shù)量。其它抗原蛋白質的效果雖沒有達上述兩種抗原蛋白質的效果，但也較空白組佳。B.H5N2型禽流感病毒攻毒首先將ICR小鼠分為六個群組，每個群組為五只ICR小鼠。將抗原蛋白質依其分別的針劑劑量與適當?shù)淖魟┱{配如下群組I注射抗原蛋白質PE-H5Nl-eM2-K3(H，O.l土O.Olmg)、群組II注射抗原蛋白質PE-H5Nl-NP-(a+b+c+d)-K3(H，O.l士O.Olmg)、群組III注射抗原蛋白質PE-H5N1-HA-K3(L，O.Ol士O.OOlmg)、群組IV注射抗原蛋白質PE-H5N1-NS1-K3(L，O.Ol士O.OOlmg)、群組V注射抗原蛋白質PE-H5N1-NA-K3(H，O.l士O.Olmg)、及群組VI作為空白組。經(jīng)三至四次免疫后，使用H5N2型病毒對已免疫的ICR小鼠進行攻毒，于攻毒四天后，測試各組ICR小鼠口沫是否有病毒存在，以及觀察各組ICR小鼠的健康狀況，其結果如表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>由表3來看，相較于空白組，經(jīng)過本發(fā)明的抗原蛋白質免疫后的ICR小鼠，受到H5N2型禽流感病毒攻毒四天后，不論使用何種抗原蛋白質做為疫苗，皆可減少口沫分泌病毒的ICR小鼠數(shù)量。并且各種抗原蛋白質的效果皆明顯優(yōu)于空白組。此外，并于攻毒14天后，將PE-H5Nl-eM2-K3免疫的ICR小鼠進行解咅lJ，取其肺臟進行病理組織切片，與未免疫受攻毒及未免疫未攻毒的小鼠比較同時，判斷肺臟發(fā)生間質性肺炎的嚴重性，其結果分別如圖16及表4。4<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>※計分標準最低為l、輕微為2、中度為3、及嚴重為4，除此若為多處性則加l、為擴散性則加2、及為亞急性則加l，最嚴重總分為7分，間質性肺炎輕微狀態(tài)為3分。由圖16及表4可知，經(jīng)過PE-H5Nl-eM2-K3免疫的組別，相較于沒有受免疫但受H5N2病毒感染的組別，可將間質性肺炎的癥狀減至輕微狀態(tài)，并接近未受攻毒組別的小鼠狀態(tài)。實施例9、雞場田間試驗于已爆發(fā)H5N2型禽流感病毒的雞場進行田間試驗，使用的復合疫苗每劑量內包含0.05mg的PE-H5Nl-eM2-K3、0.01mg的PE-H5Nl-NP-a陽K3、O.Olmg的PE-H5Nl-NP陽b-K3、O.Olmg的PE陽H5Nl隱NP畫c陽K3、O.Olmg的PE陽H5Nl-NP-d陽K3、0.05mg的PE-H5N1-HA-K3、0.05mg的PE-H5N1-NA-K3、以及10。/。的ISA206，其制作方式如實施例5。針對該雞場的雞只進行預防注射，并且每隔兩周再次注射一次，直到免疫過四至五次。相較于沒有進行預防注射的空白組雞只，如圖17所示，經(jīng)過上述復合疫苗預防注射的免疫組雞只，免疫組的雞只死亡率降至5%以下，但沒有進行預防注射的空白組雞只的死亡率，卻隨時間逐漸提高至6070%。另外，免疫組的母雞產(chǎn)蛋率，亦隨著多次免疫有逐漸上升的趨勢，其結果請參見圖18。另外，取經(jīng)過三、四、及五次免疫組母雞所產(chǎn)的雞蛋，測試其蛋黃所產(chǎn)的IgY抗體效價，進行10倍序列稀釋終點力價測試(ten-foldserialend-pointdiffosiontest)。如圖19所示，發(fā)現(xiàn)不論針對HA、NA、M2、PE或大腸桿菌，其效價隨著多次免疫后逐漸上升。并且，取五次免疫組母雞所產(chǎn)的雞蛋，使用ELISA方式測試其蛋黃所產(chǎn)IgY對于H5Nl-M2及H5N1-HA的抗體效價，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過500倍稀釋，有明顯正反應出現(xiàn)，其結果請分別參考圖20及圖21。綜上所述，本發(fā)明所提供的疫苗制備方法，可不需要與高危險性的生物樣品及病毒材料接觸，而是直接透過網(wǎng)絡獲得該標的基因的胺基酸編碼后，就可以讓研究人員在試管中完成一個安全又有效的疫苗。建立此平臺技術，對于傳染性疾病具高危險性的非疫區(qū)國家，進行疫苗的準備是非常重要的技術。并且本發(fā)明融合蛋白的概念可開發(fā)出保留共通抗原(conservedcommonimmunogen)。換言的，便是含本發(fā)明融合蛋白的疫苗所誘發(fā)的免疫反應，可辨識泛型的流感病毒，所以可因應病毒突變過于快速，而不需傳統(tǒng)方法每隔一年必須更換成另一種疫苗。此種想法在流感疫苗開發(fā)上是未來潮流，因此并非如一般傳統(tǒng)制造疫苗的方法，只注重抗體中和力價的保護效果，但待來年病毒出現(xiàn)另一突變株，此種公知方法所制造的疫苗便會對突變株無效。不過，由上述的實施例可知，含本發(fā)明融合蛋白的疫苗，針對泛型病毒皆具有其效果。上述實施例僅為了方便說明而舉例而已，本發(fā)明所主張的權利范圍自應以權利要求范圍所述為準，而非僅限于上述實施例。本發(fā)明可輕易的由本領域技術人員了解本發(fā)明必要的特征，且在不背離本發(fā)明的范疇下，能夠對本發(fā)明有種種改變及修飾，以適用于種種用途與情況。因此其它具體實施例亦在本發(fā)明的權利要求范圍內。序列表<110>生寶生物科技股份有限公司<120>利用逆向基因工程技術開發(fā)蛋白質疫苗與禽流感疫苗的方法<130>P9718/0613<160>112<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>120<212>PRT<213>禽流感病毒<400>1MetAspSerAsnThrValSerSerPheGinValAspCysPheLeuTrp151015ArgValArgLysArgPheAlaAspGinGluLeuGlyAspAlaProPhe202530LeuAspArgLeuArgArgAspGinLysSerLeuArgGlyArgGlySer354045ThrLeuGlyLeuAsplieArgThrAlaThrArgGluGlyLysHislie505560ValGluArglieLeuGluGluGluSerAspGluAlaLeuLysMetThr65707580lieAlaSerValProAlaProArgTyrLeuThrGluMetThrLeuGlu85卯95GluMetSerArgAspTrpLeuMetLeulieProLysGinLysValThr100105110GlySerLeuCyslieArgMetAsp115120<210>2<21I>70<212>PRT<213>禽流感病毒<400>2MetAlaSerGinGlyThrLysArgSerTyrGluGinMetGluThrGly151015GlyGluArgGinAsnAlaThrGlulieArgAlaSerValGlyArgMet202530lieSerGlyHeGlyArgPheTyrlieGinMetCysThrGluLeuLys354045LeuSerAspTyrGluGlyArgLeulieGinAsnSerLysLysAspGlu505560LeuArgAspGluLeuLys6570<210>3<211>107<212>PRT<213>禽流感病毒<400>3ArgMetValLeuSerAlaPheAspGluArgArgAsnArgTyrLeuGlu151015GluHisProSerAlaGlyLysAspProLysLysThrGlyGlyProlie202530TyrArgArgArgAspGlyLysTrpValArgGluLeulieLeuTyrAsp354045LysGluGlulieArgArglieTrpArgGinAlaAsnAsnGlyGluAsp505560AlaThrAlaGlyLeuThrHisLeuMetHeTrpHisSerAsnLeuAsn65707580AspAlaThrTyrGinArgThrArgAlaLeuValArgThrGlyMetAsp85卯95ProArgMetCysSerLysLysAspGluLeuLys100105<210>4<211>140<212>PRT<213>禽流感病毒<400>4ThrLeuProArgArgSerGlyAlaAlaGlyAlaAlaValLysGlyVal15015GlyThrMetValMetGluLeuHeArgMetHeLysArgGlyHeAsp202530AspArgAsnPheTrpArgGlyGluAsnGlyArgArgThrArglieAla354045TyrGluArgMetCysAsnlieLeuLysGlyLysPheGinThrAlaAla505560GinArgAlaMetMetAspLysLysAspGluLeuLeuliePheLeuAla65707580ArgSerAlaLeulieLeuArgGlySerValAlaHisLysSerCysLeu859095ProAlaCysValTyrGlyLeuAlaValAlaSerGlyTyrAspPheGlu100105110ArgGluGlyTyrSerLeuValGlylieAspProPheArgLeuLeuGin115120125AsnSerGinValPheSerLeuArgAspGluLeuLys130135140<210>5<211>148<212>PRT<213>禽流感病毒<400>5PhelieArgGlyThrArgValValProArgGlyGinLeuSerThrArg151015GlyValGinlieAlaSerAsnGluAsnMetGluAlaMetAspSerAsn202530ThrLeuGluLeuArgSerArgTyrTrpAlalieArgThrArgSerGly354045GlyAsnLeuGluAspLysLysThrPheSerValGinArgAsnLeuPro505560PheGluArgAlaThrlieMetAlaValPheThrGlyAsnThrGluGly65707580ArgThrSerAspMetArgThrGlulielieArgMetMetGluSerAla859095ArgProGluAspValSerPheGinGlyArgGlyValPheGluLeuSer100105110AspGluLysAlaThrAsnProlieValProSerPheAspMetAsnAsn115120125GluGlySerTyrPhePheGlyAspAsnAlaGluGluTyrTyrAsnArg130135140AspGluLeuLys145<210>6<211>150<212>PRT<213>禽流感病毒<400>6AlaAsnAspLeuCysTyrProGlyAspPheAsnAspTyrGluGluLeu151015LysHisLeuLeuSerArglieAsnHisPheGluLyslieGinlielie202530ProLysSerSerTrpSerAsnHisGluAlaSerSerGlyValSerSer354045AlaCysProTyrLeuGlyLysSerSerPhePheArgAsnValValTrp505560LeulieLysLysAsnAsnAlaTyrProThrlieLysArgSerTyrAsn65707580AsnThrAsnGinGluAspLeuLeuValLeuTrpGlylieHisHisPro85卯95AsnAspAlaAlaGluGinThrLysLeuTyrGinAsnProThrThrTyr100105110lieSerValGlyThrSerThrLeuAsnGinArgLeuValProLyslie115120125AlaThrArgSerLysValAsnGlyGinSerGlyArgMetGluPhePhe130135140TrpThrlieEeuLysPro145150<210>7<211>70<212>PRT<213>禽流感病毒<400>7MetSerLeuLeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrpGlu151015CysArgCysSerAspSerSerAspProlieTyrArgArgLeuLysTyr202530GlyLeuLysArgGlyProSerThrAlaGlyValProGluSerMetArg354045GluGluTyrArgGinGluGinGinSerAlaValAspValAspAspGly505560HisPheValAsnlieGlu6570<210>8<211>155<212>PRT<213>禽流感病毒<400>8GlyTyrlieCysSerGlyValPheGlyAspAsnProArgProAsnAsp151015GlyThrGlySerCysGlyProMetSerLeuAsnGlyAlaTyrGlyVal202530LysGlyPheSerPheLysTyrGlyAsnGlyValTrpHeGlyArgThr354045LysSerThrAsnSerArgSerGlyPheGluMetlieTrpAspProAsn505560GlyTrpThrGlyThrAspSerSerPheSerValLysGinAsplieVal65707580AlalieThrAspTipSerGlyTyrSerGlySerPheValGinHisPro859095GluLeuThrGlyLeuAspCysHeArgProCysPheTrpHeGluLeu100105110lieArgGlyArgProLysGluSerThrlieTrpThrSerGlySerSer115120125HeSerPheCysGl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