專利名稱：一種中性β－魔芋甘露聚糖酶制劑的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術和酶工程技術，特別是一種枯草芽孢桿菌CCTCCM207001及其高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶制劑的生產(chǎn)方法。
背景技術：
甘露聚糖酵是一類能夠水解含有甘露糖苷鍵的甘露多糖的內(nèi)切水解酶，它屬于半纖維素酶類。甘露多糖主要存在于魔芋、瓜爾豆膠、田菁膠中，主要有葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖等，它們構成了植物半纖維素的第二大組分，這些物質(zhì)的降解主要依靠的酶就是甘露聚糖酶。自上世紀90年代以來，甘露聚糖酶及其酶法制取低聚糖的研究引起人們極大的關注。中國科學院微生物研究所馬延和等對堿性甘露聚糖酶的產(chǎn)生條件進行研究，該酶條件為70℃，PH9.6，酶活力為160μ/ml。田新玉等對嗜堿芽孢桿菌N16-5總DNA獲得的堿性β-甘露聚糖酶基因(β-mannanase gene)及其制備方法進行了研究，構建了原核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達β-甘露聚糖酶。以該酶水解魔芋精粉等產(chǎn)生一系列寡糖，寡糖的總轉(zhuǎn)化率為80％以上。嗜堿芽孢桿菌N16-5以魔芋粉、大豆粉等為原料，發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶，生產(chǎn)條件簡單，發(fā)酵液的酶活力500μ/ml以上，后提取收率80％以上。該酶的最適反應pH為10.0，最適反應溫度為70℃。
國內(nèi)屈野、楊文博等人也從提高β-甘露聚糖酶活力出發(fā)，對影響地衣芽孢桿菌NK-27-51產(chǎn)酶的幾個主要工藝參數(shù)做了正交設計，在最佳工藝組合條件下，酶活力為327.9μ/ml。
在上述的一些研究中，或是存在酶活力不高，產(chǎn)酶不穩(wěn)定，或者工藝復雜，產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率低，成本高。如用堿性甘露聚糖酶生產(chǎn)，酶解工藝在PH9-10的條件下進行，給后處理帶來困難，影響產(chǎn)品口感，并且不利環(huán)保。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用枯草芽孢桿菌，通過UV(紫外線誘變)和NTG(亞硝基胍誘變)復合誘變，誘導培養(yǎng)能高效表達中性β-甘露聚糖酶的TQS6菌株，及其發(fā)酵生產(chǎn)高活力中性β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)方法，從而能高效經(jīng)濟地轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甘露低聚糖。
使用的微生物本發(fā)明涉及的枯草芽孢桿菌TQS6，它具有高效表達中性β-甘露聚糖酶的特性，該菌株于2007年1月10日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NoM207001(以下簡稱TQS6)TQS6菌株的菌學特性a、形態(tài)特征單個細胞0.7～0.8×2～3微米、著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。
b、生理生化特征菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色、在液體培養(yǎng)基中生長時，形成皺醭；需氧菌；可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉。在魔芋精粉的誘導下產(chǎn)生中性β-甘露聚糖酶，在甘露低聚糖的生產(chǎn)上起到關鍵作用。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。從CICC(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)取得的10164菌株為基礎，通過UV(紫外線誘變)和NTG(亞硝基胍誘變)復合誘變，紫外誘變的條件是紫外燈功率15～30w，照射距離20～50cm，照射時間1～5min。NTG誘變的條件是NTG濃度1～3mg/ml，在pH6.0的tris緩沖液中，處理90～120min。將菌種接種在含有0.1～0.5％的剛果紅平板培養(yǎng)基中，30～35℃，誘導培養(yǎng)24～48小時，可見透明水解圈。培養(yǎng)基配方按質(zhì)量百分比計為1.5～2.5％瓊脂，離心魔芋降解液(糖度10BX)1～3％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，NaCl0.1～0.5％，剛果紅0.1～0.5％。
選取水解圈直徑H/菌落直徑C大的菌株，進行搖瓶復篩，通過DNS法測定酶活。平均酶活力達到1450μ/ml。
選取優(yōu)良菌株進行穩(wěn)定傳代3～8代。最后得到高產(chǎn)中性β-甘露聚糖酶斜面。并將該菌株命名為TQS6，于4℃冰箱中保存。并送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NoM207001(簡稱TQS6)發(fā)酵產(chǎn)酶工藝包括如下步驟1)一級液體培養(yǎng)即從斜面到250ml三角瓶的放大培養(yǎng)，接種量為TQS6斜面菌一環(huán)，在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24小時。培養(yǎng)基配方按質(zhì)量百分比計離心魔芋降解液(糖度10BX)10～30％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，Na2HPO4·12H2O1～3％，KH2PO40.1～0.5％，NaCl 0～0.5％，NH4Cl 0～0.5％，豆粕粉1～5％，玉米渣1～5％，其余為水加水至500ml。
2)小罐發(fā)酵產(chǎn)酶10L發(fā)酵罐進行，接種量2～10％，在30～35℃，PH6.5～7.5，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，連續(xù)培養(yǎng)24～48小時，即可得到高活力中性β-甘露聚糖酶粗酶液。培養(yǎng)基配方按質(zhì)量百分比計為離心魔芋降解液(糖度10BX)10～30％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，Na2HPO4·12H2O1～3％，KH2PO40.1～0.5％，NaCl 0～0.5％，NH4Cl 0～0.5％，豆粕粉1～5％，玉米渣1～5％，全氟化碳1％，吐溫80 0.5～1％，其余為水加水至10L。
在發(fā)酵旺盛時通入純氧，和空氣一起組成富氧空氣，提高發(fā)酵過程中細菌生長及產(chǎn)酶所需的溶氧，采用計算機對發(fā)酵過程中的DO，PH，溫度，轉(zhuǎn)速進行監(jiān)控，并在發(fā)酵過程中采用定時分批補料，滿足細胞生長與產(chǎn)酶需要的營養(yǎng)物質(zhì)。補料時用的培養(yǎng)基為離心魔芋降解液(糖度10BX)1～3％，胰蛋白胨0.1～1％，酵母浸粉0.1～1％，NaCl 0.1～0.5％。
3)發(fā)酵完成后，用沉降式離心機以2800rpm的速度將發(fā)酵液中培養(yǎng)基殘余物及部分菌體除去。用硅藻土過濾機濾除絕大部分菌體。用0.1μm的微濾膜對酶液進行純化處理，進一步除去殘存的微量的菌體，4)用6000分子量的超濾膜對稀酶進行處理，濃縮除去部分水和無機鹽類物質(zhì)。
5)DNS法檢測發(fā)酵液酶活力。在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，酶活可達1500～1600μ/ml6)中性β-甘露聚糖酶酶液低溫下(0～4℃)貯存。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果1)本發(fā)明采用UV(紫外線誘變)和NTG(亞硝基胍誘變)復合誘變，魔芋精粉誘導出TQS6菌株產(chǎn)中性β-魔芋甘露聚糖酶，采用剛果紅平板培養(yǎng)基生成透明水解圈，對產(chǎn)酶菌株進行篩選，方法簡便，效率高。
2)本發(fā)明在發(fā)酵過程中采用不完全魔芋降解液代替部分魔芋精粉誘導產(chǎn)酶，可以降低培養(yǎng)基的粘度，同時在培養(yǎng)基中加入全氟化碳、吐溫80，提高溶氧，定時分批補料滿足細胞在發(fā)酵過程中的營養(yǎng)需求，實現(xiàn)了細胞的高密度培養(yǎng)。發(fā)酵后的粗酶液在50～55℃，PH6.5～7.0條件下，酶活高達1600μ/ml，遠遠高于目前一般的研究水平。
3)酶液用離心，微濾和超濾的方法進行純化后，酶收率達到80％，效果好，得率高。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發(fā)明做進一步地詳細說明。
實施例1產(chǎn)高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶菌種選育1)以CICC協(xié)助篩選的10164菌株為基礎，通過UV誘變，將菌種點種在含有0.3％的剛果紅平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方組成為2.0％瓊脂，1％魔芋精粉，胰蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，NaC10.5％，剛果紅0.3％；30～35℃，培養(yǎng)35小時，可見透明水解圈。
2)選取水解圈直徑H/C菌落直徑值較大的菌株進行搖瓶復篩，搖瓶培養(yǎng)基組成為魔芋降解液(糖度10BX)500ml，胰蛋白胨30g，酵母浸粉50g，Na2HPO412H2O 100g，KH2PO410g，NaCl 20g，NH4Cl 10g，豆粕粉200g，玉米渣100g，PH6.0，35℃培養(yǎng)30h，得到粗酶液，通過DNS法測定酶活。選取優(yōu)良菌株進行穩(wěn)定傳代3～8代。產(chǎn)高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶斜面菌種。并將該菌株命名為TQS6，于4℃冰箱中保存。該菌株保藏號為CCTCC M207001。
實施例2利用菌株TQS6 CCTCC M207001發(fā)酵生產(chǎn)高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶1)一級液體培養(yǎng)從斜面到三角瓶的放大培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為魔芋降解液150ml，酵母浸粉10g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，其余為水加水至1000ml，PH6.5～7.5，接種量為斜面菌一環(huán)，30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24小時。
2)小罐發(fā)酵產(chǎn)酶10L發(fā)酵罐進行，培養(yǎng)基組成魔芋降解液(糖度10BX)500ml，胰蛋白胨100g，酵母浸粉100g，Na2HPO4·12H2O 100g，KH2PO420g，NaCl25g，NH4Cl 5g，豆粕粉250g，玉米渣100g，其余為水加水至5升。接種一級液體種子200ml，在30～35℃，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，連續(xù)培養(yǎng)24～48小時。
3)發(fā)酵完成后，用沉降式離心機以2800rpm的速度將發(fā)酵液中培養(yǎng)基殘余物及部分菌體除去。用硅藻土過濾機濾除絕大部分菌體。用0.1μm的微濾膜對酶液進行純化處理，進一步除去殘存的微量的菌體。
4)用6000分子量的超濾膜對稀酶進行處理，濃縮除去部分水和無機鹽類物質(zhì)。
5)DNS法檢測發(fā)酵液酶活力。在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，酶活可達1500～1600μ/ml。
6)中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液低溫下(0～4℃)貯存。
實施例3細胞高密度培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶1)一級液體培養(yǎng)從斜面到三角瓶的放大培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為魔芋降解液150ml，酵母浸粉10g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，其余為水加水至500ml，PH6.5～7.5，接種量為斜面菌一環(huán)，30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24小時。
2)小罐發(fā)酵產(chǎn)酶10L發(fā)酵罐進行，培養(yǎng)基組成魔芋降解液(糖度10BX)1000ml，胰蛋白胨100g，酵母浸粉100g，Na2HPO4·12H2O 100g，KH2PO425g，NaCl 25g，NH4Cl 5g，豆粕粉250g，玉米渣100g，全氟化碳50g，吐溫80 50g，其余為水加水至5升。接種一級液體種子400ml，在30～35℃，PH6.5～7.5，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，連續(xù)培養(yǎng)24～48小時。
在發(fā)酵旺盛時通入純氧，和空氣一起組成富氧空氣，提高發(fā)酵過程中細菌生長及產(chǎn)酶所需的溶氧，應用電腦監(jiān)控系統(tǒng)對溫度、PH、溶氧、轉(zhuǎn)速等參數(shù)進行監(jiān)控，根據(jù)各參數(shù)的曲線變化特征，實時分析發(fā)酵情況，在發(fā)酵過程中采用定時分批補料，滿足細胞生長與產(chǎn)酶需要的營養(yǎng)物質(zhì)。補料時用的培養(yǎng)基為魔芋降解液(糖度10BX)1～3％，胰蛋白胨0.1～1％，酵母浸粉0.1～1％，NaCl0.1～0.5％。發(fā)酵20小時后，每隔6小時測酶活力，達到產(chǎn)酶高峰時終止發(fā)酵，得到高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液。
3)發(fā)酵完成后，用沉降式離心機以2800rpm的速度將發(fā)酵液中培養(yǎng)基殘余物及部分菌體除去。用硅藻土過濾機濾除絕大部分菌體。用0.1μm的微濾膜對酶液進行純化處理，進一步除去殘存的微量的菌體。
4)用6000分子量的超濾膜對稀酶進行處理，濃縮除去部分水和無機鹽類物質(zhì)。
5)DNS法檢測發(fā)酵液酶活力。在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，酶活可達1500～1600μ/ml。
6)中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液低溫下(0～4℃)貯存。
酶活力測定方法1、DNS法測酶活以0.5％特級魔芋精粉為底物，50℃水浴保溫反應10min，加入DNS試劑，沸水浴中顯色10min，用純水稀釋定容到25ml。用721分光光度計，在520nm處進行比色。通過測定OD值求出對應的還原糖含量，再用酶活公式計算求出酶活力。酶活力定義為在50℃、pH6.0條件下，每分鐘生成1μmol相當于D-甘露糖(D-mannose)的還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。
酶活計算公式為公式X＝A×1ml/V×F×1/T×1000/180式中X-酶活力μmol/mlA-D-甘露糖生成量mgV-吸取酶液體積0.05ml F-酶液稀釋倍數(shù)一般100～200倍T-反應時間5分鐘細胞高密度培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酶酶活力結果見表1

2、降解測粘法酶的生產(chǎn)過程中，檢驗酶液質(zhì)量的另一方法是1ml酶液，于50℃，pH7.0左右，將10～20g魔芋精粉(底物濃度10～20％)降解成甘露低聚糖。降解所需時間為2～4小時，降解液粘度為60～120mPa.s。該方法和生產(chǎn)實踐聯(lián)系密切。
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtill)TQS6，其保藏號為CCTCCNoM207001。
2.按權利要求1所述的枯草芽孢桿菌CCTCC M207001發(fā)酵生產(chǎn)高活力中性β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于包括以下步驟1)一級液體培養(yǎng)即從斜面到三角瓶的放大培養(yǎng)，接種量為TQS6 CCTCCM207001斜面菌一環(huán)，在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24小時，培養(yǎng)基配方按質(zhì)量百分比計離心魔芋降解液(糖度10BX)10～30％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，Na2HPO4·12H2O1～3％，KH2PO40.1～0.5％，NaCl 0～0.5％，NH4Cl 0～0.5％，豆粕粉1～5％，玉米渣1～5％，其余為水加水至1000ml；2)小罐發(fā)酵產(chǎn)酶10L發(fā)酵罐進行，接種量2～10％，在30～35℃，PH6.5～7.5，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，連續(xù)培養(yǎng)24～48小時，即可得到高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶粗酶液，培養(yǎng)基配方按質(zhì)量百分比計為離心魔芋降解液(糖度10BX)10～30％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，Na2HPO4·12H2O1～3％，KH2PO40.1～0.5％，NaCl 0～0.5％，NH4Cl 0～0.5％，豆粕粉1～5％，玉米渣1～5％，全氟化碳1％，吐溫80 0.5～1％，其余為水加水至5L；3)發(fā)酵完成后，用沉降式離心機以2800rpm的速度將發(fā)酵液中培養(yǎng)基殘余物及部分菌體除去，用硅藻土過濾機濾除絕大部分菌體，用0.1μm的微濾膜對酶液進行純化處理，進一步除去殘存的微量的菌體；4)用6000分子量的超濾膜對稀酶進行處理，濃縮除去部分水和無機鹽類物質(zhì)；5)DNS法檢測發(fā)酵液酶活力，在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，酶活可達1500～1600μ/ml，6)中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液在低溫下(0～4℃)貯存。
3.根據(jù)權利要求2所述的枯草芽孢桿菌TQS6 CCTCC M207001發(fā)酵生產(chǎn)高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶的方法，其特征在于實現(xiàn)細胞高密度培養(yǎng)包括以下步驟1)一級液體培養(yǎng)從斜面到三角瓶的放大培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為魔芋降解液150ml，酵母浸粉10g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，其余為水加水至1000ml，PH6.5～7.5，接種量為斜面菌一環(huán)，30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24小時；2)小罐發(fā)酵產(chǎn)酶10L發(fā)酵罐進行，培養(yǎng)基組成魔芋降解液(糖度10BX)1000ml，胰蛋白胨100g，酵母浸粉100g，Na2HPO4·12H2O 100g，KH2PO425g，NaCl 25g，NH4Cl 5g，豆粕粉250g，玉米渣100g，全氟化碳50g，吐溫80 50g，其余為水加水至5升，接種一級液體種子200～500ml，在30～35℃，PH6.5～7.5，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，連續(xù)培養(yǎng)24～48小時；在發(fā)酵旺盛時通入純氧，和空氣一起組成富氧空氣，提高發(fā)酵過程中細菌生長及產(chǎn)酶所需的溶氧，應用電腦監(jiān)控系統(tǒng)對溫度、PH、溶氧、轉(zhuǎn)速等參數(shù)進行監(jiān)控，根據(jù)各參數(shù)的曲線變化特征，實時分析發(fā)酵情況，在發(fā)酵過程中采用定時分批補料，滿足細胞生長與產(chǎn)酶需要的營養(yǎng)物質(zhì)，補料時用的培養(yǎng)基為魔芋降解液(糖度10BX)1～3％，胰蛋白胨0.1～1％，酵母浸粉0.1～1％，NaCl0.1～0.5％，發(fā)酵20小時后，每隔6小時測酶活力，達到產(chǎn)酶高峰時終止發(fā)酵，得到高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液；3)發(fā)酵完成后，用沉降式離心機以2800rpm的速度將發(fā)酵液中培養(yǎng)基殘余物及部分菌體除去，用硅藻土過濾機濾除絕大部分菌體，用0.1μm的微濾膜對酶液進行純化處理，進一步除去殘存的微量的菌體；4)用6000分子量的超濾膜對稀酶進行處理，濃縮除去部分水和無機鹽類物質(zhì)；5)DNS法檢測發(fā)酵液酶活力，在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5條件下，酶活可達1500～1600μ/ml；6)中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液在低溫下(0～4℃)貯存。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種采用UV(紫外線誘變)和NTG(亞硝基胍誘變)復合誘變，誘導培養(yǎng)能高效表達中性β－甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌TQS6 CCTCCM207001及其發(fā)酵生產(chǎn)高活力中性β－甘露聚糖酶的生產(chǎn)方法，對該菌株進行斜面培養(yǎng)，一級、二級培養(yǎng)后進行發(fā)酵培養(yǎng)，在選定的培養(yǎng)基中，加入不完全降解液，該降解液來源于生產(chǎn)中的離心糖液。并且在發(fā)酵過程中通入富氧空氣增加溶氧，在優(yōu)化產(chǎn)酶條件下可發(fā)酵得到高活力中性β－魔芋甘露聚糖酶。通過本技術生產(chǎn)出的酶具有產(chǎn)酶量高，酶活力高，產(chǎn)酶穩(wěn)定，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低等特點。從而能高效經(jīng)濟地轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甘露低聚糖。
文檔編號C12N13/00GK101016531SQ20071005143
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月30日 優(yōu)先權日2007年1月30日
發(fā)明者彭冬秋, 黃代勇, 劉全新, 萬霞, 李小虎, 黃芳 申請人:武漢東方天琪生物工程有限公司