專利名稱：與黃瓜雌性性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子標(biāo)記育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與黃瓜雌性性狀相關(guān) 的分子標(biāo)記、該分子標(biāo)記的獲得方法及該標(biāo)記在黃瓜雌性選育中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃瓜是世界上栽培面積最大的蔬菜作物之一。黃瓜植株性別表達(dá)類型豐 富，雌性系黃瓜是指植株只長(zhǎng)雌花而不長(zhǎng)雄花或長(zhǎng)極少量雄花的品系，往往 表現(xiàn)出早熟、瓜密、豐產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。利用雌性系制一代雜種無(wú)需去雄，節(jié)約了 勞動(dòng)力，降低了制種成本，所制成的一代雜種純度很高。用雌性系作母本配 制的一代雜種也多表現(xiàn)早熟、雌花多、采瓜期集中、豐產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。因此，雌 性系的選育與應(yīng)用便成為黃瓜育種中一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容。
目前，我國(guó)至少有80%以上的黃瓜品種實(shí)現(xiàn)了雜種一代優(yōu)勢(shì)利用，并且相 應(yīng)地育成了一批雌性、強(qiáng)雌性雜種一代品種。但我國(guó)黃瓜生產(chǎn)上FJ戈制種仍主 要采用化學(xué)(AgN03)去雄、人工去雄法來(lái)進(jìn)行，因此雌性系的選育工作進(jìn) 展較慢，迫切需要在黃瓜性別決定基因的遺傳規(guī)律、雌性基因的分子標(biāo)記輔 助選擇等工作上有所突破，從而加速?gòu)?qiáng)雌材料的選育與利用。
隨著乙烯的生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究的深入，從分子水平上深入研 究黃瓜性別決定機(jī)制成為可能。研究發(fā)現(xiàn)，ACC合酶是乙烯生物合成過(guò)程中 的關(guān)鍵酶，因而ACC合酶在高等植物性別表達(dá)過(guò)程中起著重要作用。乙烯不 敏感轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(ethylene insensitive 3， EIN3)是定位在細(xì)胞核上的乙烯信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)下游元件，其編碼的EIN3蛋白定位在核內(nèi)，與乙烯反應(yīng)相關(guān)基因的啟動(dòng) 子特殊序列結(jié)合，并激活這些基因的表達(dá)。EIN3基因不是通過(guò)乙烯直接誘導(dǎo)， 而是通過(guò)乙烯在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，從乙烯合成酶關(guān)鍵基因和乙 烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，篩選用于植物性別分化研究和分子標(biāo)記輔助選擇 育種的分子標(biāo)記無(wú)疑是很有意義的。
單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是指染色體基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起
的DNA序列多態(tài)性,是繼限制性酶切片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP， restriction fragment length polymorphism)、可變數(shù)量重復(fù)序歹ll (VNTR， variable number of tandem repeat)禾M散衛(wèi)星多態(tài)性(microsatellite polymorphism)之后的新一代 多態(tài)性遺傳標(biāo)記，已漸漸成為與分子標(biāo)記有關(guān)各領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。作為第三 代遺傳標(biāo)記，具有分布廣、密度高、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，且由于具有能直接 反映植物基因DNA水平上的差異、其測(cè)定過(guò)程不受植物發(fā)育階段的影響等優(yōu) 點(diǎn)，近十年來(lái)已被越來(lái)越多地用于植物性別分化研究和分子標(biāo)記輔助選擇育 種中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有黃瓜雌性系選育方法落后、效率低的不 足，提供一種用于黃瓜雌性系選育的雌性性狀相關(guān)分子標(biāo)記。
與黃瓜雌性性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，是EIN3基因在153bp和501bp處發(fā)生
兩個(gè)單核苷酸的變異(SNP)。其中純雌株帶有015鄉(xiāng)和T5。,bp特異性堿基或兩 者之一，兩性花株帶有A,53bp或A訓(xùn)bp。
本發(fā)明目的之二在于提供與黃瓜雌性性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的獲得方法。 該方法包括以下步驟
1、 按常規(guī)方法進(jìn)行材料培養(yǎng)和黃瓜性別的鑒定；
2、 采用改進(jìn)的CTAB法提取黃瓜幼嫩葉片基因組DNA，即在提取過(guò)程 中分別用1%CTAB、 5MKAc禾口 1MNaCl處理。
3、 根據(jù)EIN3與EIL基因mRNA的保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 引物為上游引物5，一ttggagaggaggatgtggag—3，，下游引物5'—ataata gcaagccaggtagc—3'。
PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性5min， 94°〇變 性lmin、 60。C退火lmin、 72。C延伸2min，共40個(gè)循環(huán)后于72。C延伸7min。
4、 PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序以及測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析，結(jié)果表明WI1983G 和WI1983H的EIN3基因序列基本相同，只是在153bp和501bp處發(fā)生兩個(gè)
單核苷酸的變異(SNPS)，分別為G!53bp和A^bp、 T訓(xùn)bp和A501bpO
5、 設(shè)計(jì)引物在親本及F2群體中進(jìn)行驗(yàn)證，它包括兩組引物，其中引物組
I上游引物具有序列表中SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列，引物組I下游引 物具有序列表中SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列，引物組II上游引物具有序 列表中SEQ IDN0.5所述的核苷酸序列，引物組II下游引物具有序列表中SEQ IDN0.6所述的核苷酸序列。
6、群體驗(yàn)證結(jié)果表明通過(guò)引物組I擴(kuò)增后性狀為全雌性的植株擴(kuò)增產(chǎn) 物為382bp左右，而兩性花株在相應(yīng)位置沒有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物；通過(guò)引物組II 擴(kuò)增后性狀為全雌性的植株擴(kuò)增產(chǎn)物為605bp左右，而兩性花株在相應(yīng)位置 沒有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明目的之三在于提供該分子標(biāo)記在黃瓜雌性選育中的應(yīng)用
1、 提取黃瓜幼嫩葉片基因組DNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行 PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序及測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析，若EIN3基因上帶有G,，p和
T5(Hbp分子標(biāo)記或兩者之一，則可判定該植株為純雌株。
2、 設(shè)計(jì)用于群體驗(yàn)證的引物，其中引物組I上游引物具有序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列，弓l物組I下游引物具有序列表中SEQ ID NO.4 所述的核苷酸序列，引物組II上游引物具有序列表中SEQ ID NO.5所述的核 苷酸序列，引物組II下游引物具有序列表中SEQIDN0.6所述的核苷酸序列。
若通過(guò)引物組I可特異性擴(kuò)增得到一條382bp大小的條帶或通過(guò)引物組 II可特異性擴(kuò)增得到一條605bp大小的條帶，即可判定該黃瓜植株為純雌株。 本發(fā)明的技術(shù)方案能產(chǎn)生以下技術(shù)效果
通過(guò)引物組I和引物組II擴(kuò)增后只有性狀為全雌性的植株才可擴(kuò)增得到 特異性產(chǎn)物。說(shuō)明兩個(gè)SNPs伴隨著性狀差異而分離，與控制黃瓜雌性性別表 達(dá)密切相關(guān)。與主要性別決定基因連鎖的分子標(biāo)記的獲得，可作為黃瓜雌性 選擇的特異性標(biāo)記，有利于黃瓜作物性別決定基因標(biāo)記輔助選擇育種，大大 縮短育種時(shí)間。


圖1 F2代部分群體DNA電泳檢測(cè)圖
1: Mark 2: 12 3: 4 4: 22 5: 17 6: 102 7: 113 8: 49
9: 55 10: 37 11: 72 12: 33 13: 43 14: 111 15: 149
16: 133 17: 122 18: 138 19: 2 20: 6 21: 51 22: 81
23: 9424: 10725: 118 26: Mark
圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖
M: Mark1: WI1983G2: WI1983H 3:
圖3質(zhì)粒DNA電泳檢測(cè)
M: Mark1: WI1983G2: WI1983H 3:
圖4質(zhì)粒DNA的PCR檢測(cè)
M: Mark 1: WI1983G/A2: WI1983H/A 3: F,/A 4: WI1983G/B
5: WI1983H/B6: F'/B
圖5重組質(zhì)粒DNA的酶切檢測(cè)
M: Mark 1: WI1983G 2: 'WI1983H 3: F,
圖6親本、F,代及部分F2代群體PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖(引物組I)
M:Mark 1:WI1983G 2:WI1983H 3:F,4:15 5:25 6:37
7:46 8:54 9:60 10:70 11:83 12:8513:99 14:115
15:13916:152 17:153
圖7部分F2代群體PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖(引物組I )
M:Mark 1:9 2:32 3:119 4:134 5:133 6:8 7:18 8:71 9:11 10:3 11:36
圖8親本、F,代及部分F2代群體PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖(引物組n) M:Mark 1:WI1983G 2:WI1983H 3:F, 4:4 5:37 6:46 7:51 8:949:99 10:100 11:112 12:115 13:126 14:129 15:131 16:133 17:134
圖9部分F2代群體pcR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖(引物組n)
M:Mark 1:18 2:35 3:44 4:88 5:77 6:153 7:24 8:39 9:32 10:119 11:2具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:與黃瓜雌性性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的獲得
一、 材料與試劑
純雌株系WI1983G和兩性花株系WI1983H為一對(duì)近等基因材料，由威 斯康星大學(xué)園藝系美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心J.E.Staub教授贈(zèng)送，其中 WI1983G雌性系來(lái)源于WI3122和WI3121雜交后代系統(tǒng)選育的高代自交系。 兩性花株系WI1983H來(lái)源于以抗枯萎、兩性花WI2189作為供體與WI1983G 經(jīng)5代回交3代自交的自交系。F,代為WI1983G與WI1983H的雜交后第一 代。F2代為F,代自交后代，共156株。
10xbuffer、 MgCl2、 dNTP、 TaqE均購(gòu)自大連寶生物公司；引物由上海生 工合成，均為PAGE級(jí)純化。
二、 方法1、 材料的培養(yǎng)和黃瓜性別的鑒定
采用營(yíng)養(yǎng)缽育苗， 一個(gè)月后移栽于防蟲網(wǎng)隔離的大棚內(nèi)，于先一天下午 進(jìn)行雄、雌花人工套袋，第二天上午人工雜交或自交。以WI1983G為母本， WI1983H為父本，獲得其雜交組合，獲得它們的F2群體材料。
黃瓜性別的鑒定按以下方法進(jìn)行:純雌株，在主蔓及側(cè)蔓上沒有雄花，所 有的節(jié)位均為雌花；雌雄同株，在低節(jié)位具有一段較長(zhǎng)的雄花節(jié)，然后一段 雌雄混合的節(jié)位，末端不出現(xiàn)連續(xù)的雌花節(jié)；雌雄同株型的強(qiáng)雌株(強(qiáng)雌株)， 第1 7節(jié)多數(shù)為雄花，8 1 l節(jié)以上為連續(xù)的雌花節(jié)，雌花率較高(平均61。^ 63 Q%，而普通的雌雄同株一般為21% 35%)，末端表現(xiàn)連續(xù)的雌花節(jié)；兩性花 株，全部表現(xiàn)兩性花，果實(shí)為大小不等的橢圓形。
2、 基因組DNA的提取
由于黃瓜是含糖量較高的園藝作物，為避免糖類物質(zhì)的影響，本試驗(yàn) 采用傳統(tǒng)的CTAB法提取基因組DNA，在提取過(guò)程中，還分別用1%CTAB、 5MKAc和1MNaCl處理。具體操作過(guò)程如下
2.1稱取3.0g黃瓜幼嫩健康葉片，用雙蒸水洗凈后加液氮于研缽中研磨成粉末。轉(zhuǎn)入50mL離心管，加入10mL預(yù)熱(6(TC )的DNA提取緩沖液(2。/。W/V CTAB， 1.4mmol/LNaCl， 20 mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH8.0， 0.2% V/V卩-巰基乙醇，1%PVP)中，充分混勻，6(TC水浴60 70min，其間
搖勻幾次；
2.2加入1/3體積的5mol/LKAc (pH4.8)，充分輕柔混勻后，冰浴30 min; 2.3加入等體積氯仿:異戊醇(24: 1)輕柔且充分混勻。靜置10min， 1,5000 rpm離心30 min;
2.4取上清，加入1/10體積的10。/。CTAB溶液，輕柔混勻，6CTC水浴10min 至CTAB徹底溶解；
2.5加入等體積氯仿:異戊醇(24 : 1)混勻，靜置10 min， 1，5000rpm離心 30 min;
2.6取上清，加入0.7體積的冷異丙醇，輕柔搖動(dòng)離心管充分混勻，置于
-20"301^11或者過(guò)夜；
2.7 1，5000rpm離心10min;
2.8小心棄去上清，加入3mL洗滌緩沖液(76。/。V/V乙醇，10mmol/L乙酸 銨)。室溫下靜置30min，間或輕柔搖動(dòng)； 2.9 1,5000rpm離心5 min; 2.10重復(fù)步驟2.8 2.9;
2.11將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mLEppendorf管中，加入400 ^tL TE，(過(guò)夜放置) 使之溶解；
2.12加入RNAase (100 pg/mL溶液)，37。C水浴2 4h;
2.13加入100 jiL5M的NaCl?；靹蚝笫覝叵蚂o置15 min;
2.14加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)混勻，靜置10min， l,OOOOrpm離
心10 min;
2.15取上清，加入2倍體積95。/。冷乙醇沉淀DNA，輕柔且充分混勻，于-2(TC
放置30min或過(guò)夜；
2.16 l，OOOOrpm離心5 min;
2.17棄上清，按步驟(2.15) (2.16)洗滌沉淀一至兩次，然后于空氣中干燥；
2.18加入200 500jaLddH20，過(guò)夜放置使沉淀溶解；
2.19 1,0000rpm離心5 min，取上清測(cè)定DNA濃度。余下保存于-40。C冰箱 中備用。'
3、 DNA樣品的檢測(cè)
取5pl DNA原液，上樣于0.8%瓊脂糖凝膠中，以lxTBE為電泳緩沖 液，120V穩(wěn)壓電泳進(jìn)樣后，100V穩(wěn)壓電泳至指示劑距底端約lcm處結(jié)束。
提取DNA原液稀釋20倍后，在分光光度計(jì)上測(cè)定DNA濃度及 OD260/OD28()。 OD26o/OD，不足1.8或超過(guò)2.0的均進(jìn)行重新純化。將純化后 的DNA分別稀釋至5-30ng L備用。
4、 獲得外顯子序列的引物設(shè)計(jì)
根據(jù)Genebank所報(bào)道的擬南芥、煙草和甜瓜￡/沼與基因mRNA的 保守序列，采用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外顯子序列。 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成
上游弓I物5，一ttg gag agg agg atg tgg ag—3 ，
下幼,弓I物5 ，一ata ata gca age cag gta gc—3 ，
5、 PCR擴(kuò)增
5.1 PCR反應(yīng)體系
成分 用量
ddH20 12.2nL
10xbuffer(+Mg2+) 2.0pL
dNTP (2.5mM/each) 1.6pL
Forward primer( 15 ng/(iL) 1 .OpL
Reverse primer( 15 ng/^L) 1.0|aL
模板DNA(30隱50 ng/(aL) 2.0(iL
TaqE (5U/pL) 0.2(aL
Total volume 20 混勻后，在反應(yīng)液上覆蓋一薄層液體石蠟油。
5.2 PCR反應(yīng)程序
擴(kuò)增程序?yàn)?4"C預(yù)變性5min， 94。C變性lmin、 60。C退火lmin、 72。C 延伸2min，共40個(gè)循環(huán)后于72'C延伸7min，反應(yīng)結(jié)束后4。C保存擴(kuò)增產(chǎn)物。
6、 PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序
6.1 PCR產(chǎn)物的純化回收
采用北京天為公司的DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。
6.2 PCR產(chǎn)物與載體的連接
Taq DNA聚合酶會(huì)在3'端加上多余的非模板依據(jù)堿基，而且對(duì)A優(yōu)先 聚合，所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分為A。利用T-Vector上3，端T 與PCR產(chǎn)物末端A互補(bǔ)并進(jìn)行連接，采用Promega公司的pGEM-T easy vector系統(tǒng)，反應(yīng)體系(10|iL)如下
用移液器吹打連接反應(yīng)液使之混勻后，室溫孵育lh。 6.3感受態(tài)細(xì)胞的制備
參照《分子克隆》第三版，采用CaCl2法制備。 6.4感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
參照《分子克隆》第三版進(jìn)行。 6.5重組質(zhì)粒的提取
參照《分子克隆》第三版，采用堿式裂解法進(jìn)行質(zhì)粒提取。 6.6重組質(zhì)粒的篩選與鑒定
PCR鑒定取培養(yǎng)的菌液lpL按外顯子的PCR混合體系和反應(yīng)條件在 PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。
酶切鑒定pGEM T-easy Vector兩頭均有一個(gè)￡coRl酶切位點(diǎn)，故可利
T4 DNA連接酶的2x快速連接緩沖液 pGEM -T Easy載體(50ng) PCR產(chǎn)物
T4DNA連接酶(3 Weiss單位/faL) 補(bǔ)加去離子水至終體積
5|xL
2|aL l|aL
用五coRl進(jìn)行酶切鑒定。反應(yīng)體系共20pL，即2.0pL純化質(zhì)粒DNA (如少 量可加大到5(iL)、 2.0|iL buffer、 l.O(iL五coiU、 15^iLddH20，在反應(yīng)液上加 一滴礦物油，37。C下反應(yīng)4h或過(guò)夜，1.5。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。 6.7陽(yáng)性克隆測(cè)序
將經(jīng)過(guò)酶切和PCR檢測(cè)為陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) 有限公司測(cè)序。
7、序列分析、引物的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證
根據(jù)測(cè)序結(jié)果利用Primier Premier 5.0軟件重新設(shè)計(jì)引物，并在親本及 F2群體中進(jìn)行驗(yàn)證，用于群體驗(yàn)證的上游引物3'端前6個(gè)堿基序列為3，ttgaag， 由10 20個(gè)堿基組成的DNA片段。反應(yīng)體系及程序同4.1和4.2，優(yōu)選的引 物序列組合由引物組I和引物組II組成，其中引物組I上游引物具有序列表 中SEQIDN0.3所述的核苷酸序列，引物組I下游引物具有序列表中SEQID N0.4所述的核苷酸序列，引物組II上游引物具有序列表中SEQIDN0.5所述 的核苷酸序列，引物組II下游引物具有序列表中SEQ ID NO，6所述的核苷酸 序列。
三、結(jié)果與分析
1、 基因組DNA的提取
結(jié)果顯示提取的DNA分子量均在23kb左右(附圖1)， OD26。/OD280 為1.8-2.0之間，RNA去除效果好，純度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求。
2、 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果
禾U用合成的引物對(duì)不同性別黃瓜基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到與預(yù)期 片段大小一致的725bp的目的片段(附圖2)。
3、 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定
利用Amp抗性篩選與(x-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的辦法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行篩 選。將篩選到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入50 pg/mL Amp LB液體培養(yǎng)基中37"振蕩培養(yǎng) 12小時(shí)。通過(guò)堿式裂解法提取質(zhì)粒(附圖3)。質(zhì)粒DNA分別經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè) (附圖4)和EcoRI酶切檢測(cè)(附圖5)，箭頭所指示的是目的片段大小和位
置。將雙重鑒定后的陽(yáng)性克隆送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行 測(cè)序，結(jié)果表明序列的兩端均有引物的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了克隆片段的 正確性。
4、 序列分析
由SEQNO.l序列可知，WI1983G和WI1983H的EIN3基因序列基本相同， 只是分別在153bp和501bp處發(fā)生兩個(gè)單核苷酸的變異(SNPs)，分別為G,53bp
禾口Ai53bp、 T501bp禾卩A50lbp。
5、 對(duì)親本、F,代及F2代群體進(jìn)行PCR驗(yàn)證
通過(guò)引物組I擴(kuò)增后的結(jié)果表明(附圖6和附圖7)，性狀為全雌性的植株 (WI1983G、 F，、 15、 25、 54、 70、 85、 139、 153和9、 32、 134、 8、 18、 3)擴(kuò) 增產(chǎn)物為382bp左右，而兩性花株(WI1983H、 37、 46、 60、 83、 99、 115、 152和119、 133、 71、 11、 36)在相應(yīng)位置沒有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。在整個(gè)F2群體 中驗(yàn)證的準(zhǔn)確率達(dá)96%以上。
通過(guò)引物組II擴(kuò)增后的結(jié)果表明(附圖8和附圖9)，性狀為全雌性的植株 (WI1983G、 F, 、 4、 51、 94、 100、 112、 126、 ]29、 134和18、 35、 153、 24、 32、 25)擴(kuò)增產(chǎn)物為605 bp左右，而兩性花株(WI1983H、 37、 46、 99、 115、 131、 133和44、 88、 77、 39、 119)在相應(yīng)位置沒有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。在整個(gè)F2 群體中驗(yàn)證的準(zhǔn)確率也達(dá)96%以上。
上述結(jié)果表明，引物組I和引物組II可以作為全雌性黃瓜選育的分子標(biāo)記。SEQUENCE LISTING
〈110〉 易克
湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120〉與黃瓜雌性性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
〈130〉
<160〉 6
〈170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 725
<212〉 ■
<213〉 Cucumis sativus
〈400〉 1
ttgg卿gga
60
ggatgtggag ggacaagatg cgtctcaaac gtxttaaaga gcaaagcaag
gttaaggaag ggatcg3tat tgtgaagcaa cgacaatctc aagaccsggc taggsggaag 120
犯gatgtcga gggcacatga tgggatcttg aagtatatgt tgaagattat ggaagtctgt 180
aatgctcaag gttttgtata cggaataatt cctgagaagg gaaaaccagt aaccggggca 240
tcggataatc tgcgagagtg gtggaaagac aaagtcagat ttgatagaaa cggaccagct 300
gccatagcca agtaccaggc agacaatgca attcctggac gaaatgatgg ctgtaattca 360
atcggtccaa ccxctcacac cttgcaggaa cttcaggata ccaccttagg ttctctttta 420
tcagctctga tgcagcactg tgaccctcct caaagaagat ttccattgga gaaaggagtt 480
cctccgccat 540
gaccaaggtc 600
ggtggcctac ctccgcccta
tggagtcgag g犯tggtggc caagaagcct catgacttga
ctcagcttgg agaaagcttg
attgccgaag gaaagtaggtgttttgactg cagtcatcaa gcatatgtcc 660
agac犯tcca agtgtttgca ggacaagatg 720
attat 725
<210> 2
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〈212> DNA
〈213〉 Cucumis sativus
200710035159.7
<400〉 2
ttgg卿gga
60
gttaagg犯g 120
aagatgtcga 180
satgctc犯g 240
tcggataatc 300
gccatagcca 360
atcggtccaa 420
tcagctctga 480
cctccgccat 540
gaccaaggtc 600
gttttgactg
ggatgtggag ggatcgatat gggcacatga gttttgtata tgcg柳gtg agtaccaggc
CCCCtC3C2LC
tgcagcactg ggtggcctac ctccgcccta cagtc3tc犯
ggaca,tg tgtgaagcaa tgggatcttg cggaataatt gtggaa卿c 3g3ca3tgca cttgcaggaa tgaccctcct aggagtcgag caagaagcct gcatatgtcc
cctgatattg actgccaagg
cgtctcaaac cgacaatctc aaatatatgt cctgag犯gg aaagtcagat attcctggac cttcaggata ca肪gsi3gat gaatggtggc catgacttga cctgatattg
ccaagatccg agagtgctac
gtcttaaaga aagaccaggc tgaagatta^ gaa肌ccagt ttgatagaaa gaaatgatgg ccaccttagg ttccattgga ctcagcttgg agaaagcttg cc肪gstccg
caagcttgtt ctggcttgct
gcaaagc犯g t鄉(xiāng)agg卿 gg犯gtctgt aaccggggca cggaccagct ctgtaattca ttctctttta ga肪ggagtt attgccgaag g犯agtaggt caagcttgtt
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卿caatcca agtgtttgca ggaca卿tg actgccaagg卿gtgctac ctggcUgct 720
attat 725
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<212〉 ■ <213〉人工序列
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catgatggga tcttgaag 18
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caccattcct cgactcca 18
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<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<400> 5
catgatggga tcttgaag 18
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〈212〉 腿 <213〉人工序列
〈400〉 6
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權(quán)利要求
1、與黃瓜雌性性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記是黃瓜EIN3基因在153bp和501bp處發(fā)生的兩個(gè)單核苷酸變異，見序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，這兩個(gè)單核苷酸變異分別為G153bp和A153bp、T501bp和A501bp。
2、 利用權(quán)利要求1所述的兩個(gè)單核苷酸的變異設(shè)計(jì)的兩組引物，其特征在于上游引物3'端前6個(gè)堿基序列為3'ttg aag，為10 20個(gè)堿基組成的DNA片段。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于它包括兩組引物，其中引物組 I上游引物具有序列表中SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列，引物組I下游引物具有序列表中SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列，引物組II上游引物具有序 列表中SEQ IDN0.5所述的核苷酸序列，引物組II下游引物具有序列表中SEQ IDN0.6所述的核苷酸序列。
4、 一種獲得黃瓜雌性性狀分子標(biāo)記的方法，其特征在于包括以下步驟1) 材料培養(yǎng)和黃瓜性別的鑒定；2) 黃瓜幼嫩葉片基因組DNA的提??；3) 根據(jù)EIN3或EIL基因mRNA的保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4) PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序及測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析；5) 根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)兩組引物引物，在親本及F2群體中進(jìn)行驗(yàn)證。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的獲得黃瓜雌性性狀分子標(biāo)記的方法，其特征在于基 因組DNA提取過(guò)程中分別用lQ/oCTAB、 5MKAc禾Q 1MNaCl處理。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的獲得黃瓜雌性性狀分子標(biāo)記的方法，其特征在于PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94。C預(yù)變性5min， 94。C變性lmin、 60。C退火lmin、 72°C 延伸2min，共40個(gè)循環(huán)后于72"C延伸7min。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的獲得黃瓜雌性性狀分子標(biāo)記的方法，其特征在于用 于群體驗(yàn)證的上游引物3，端前6個(gè)堿基序列為3'ttgaag，為10 20個(gè)堿基組 成的DNA片段。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的獲得黃瓜雌性性狀分子標(biāo)記的方法，其特征在于用 于群體驗(yàn)證的兩組引物分別為由序列表中SEQIDNO,3、 SEQIDNO,4構(gòu)成 的引物組I和由序列表中SEQ ID NO. 5 、 SEQ ID NO. 6構(gòu)成的引物組II 。
9、 黃瓜EIN3基因的分子標(biāo)記在選擇育種上的的應(yīng)用，其特征在于E工N3基因上帶有G^bp和T5cnbp分子標(biāo)記或兩者之一的植株均為純雌株。
10、 黃瓜EIN3基因的分子標(biāo)記在選擇育種上的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)引物 組I可特異性擴(kuò)增得到一條382bp大小的條帶；或通過(guò)引物組II可特異性擴(kuò) 增得到一條605bp大小的條帶，即可判定該黃瓜植株為純雌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與黃瓜雌性性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記是黃瓜EIN3基因在153bp和501bp處發(fā)生的兩個(gè)單核苷酸變異(SNP)位點(diǎn)，其中純雌株EIN3基因上帶有G_153bp和T_501bp分子標(biāo)記或兩者之一。獲得該分子標(biāo)記的方法為提取黃瓜幼嫩葉片的基因組DNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序及測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析，最后重新設(shè)計(jì)引物在親本及F₂群體中進(jìn)行驗(yàn)證。該分子標(biāo)記可作為黃瓜雌性選擇的特異性標(biāo)記，用于黃瓜性別決定基因標(biāo)記輔助選擇育種，能大大縮短育種時(shí)間。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101113469SQ200710035159
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2007年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日
發(fā)明者盧向陽(yáng), 徐向麗, 克 易, 剛 陳 申請(qǐng)人:易 克;湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)