專利名稱：一種用于分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的基因組芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片，尤其涉及用于分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的基因組芯片。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的微生物群落研究方法是以分離培養(yǎng)為依據(jù)，包括對(duì)微生物細(xì)胞形態(tài)、生長適溫、pH值、GC含量、微生物總量、生物量、呼吸效率、酶活性等性質(zhì)的測(cè)定和分析。盡管這些傳統(tǒng)的方法仍然是微生物群落研究的基礎(chǔ)，但是由于不同種類微生物對(duì)培養(yǎng)要求的差異，以分離培養(yǎng)為基礎(chǔ)的微生物群落分析不能提供足夠準(zhǔn)確而豐富的信息。特別是在在酸性環(huán)境中存在的微生物大多數(shù)是屬于化能自養(yǎng)的嗜酸性細(xì)菌，這些細(xì)菌在人工條件下很難進(jìn)行分離培養(yǎng)，特別是在固體培養(yǎng)基上。雖然熒光顯微鏡法、掃描電鏡法和透射電鏡法等方法能觀察微生物個(gè)體豐度和形態(tài)，但仍不能提供微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的足夠信息。20世紀(jì)80年代末90年代初發(fā)展了以核酸(基因)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)，該方法大大地減輕對(duì)微生物培養(yǎng)的依賴性，并迅速地廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。但是，目前在微生物群落分析中所用的核酸限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP/Restriction Fragment Length Polymorphism)和變性梯度凝膠電泳(DGGE/denatured gradient gel electrophoresis)等方法靈敏度低、特異性不高，而基因克隆與序列分析則工作量大。FISH檢測(cè)技術(shù)盡管靈敏度高、特異性強(qiáng)，但存在熒光染料種類的限制，每次檢測(cè)的微生物種類有限。因此，這些方法都難以同時(shí)、快速、準(zhǔn)確、靈敏地進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)的分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的群落基因組芯片。利用該芯片，可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、靈敏地對(duì)酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和研究。
本發(fā)明的基因組芯片由基片及固定于基片之上的細(xì)菌DNA探針組成，這些探針包括至少10株氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、至少2株嗜酸氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillus thiooxidans菌)、至少1株喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus菌)、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亞鐵微螺菌(Leptospirillum sp.菌)、至少8株異養(yǎng)嗜酸菌(Acidiphiliums sp.)、至少1株金屬硫葉菌(Sulfolobus Metallicus)、至少1株嗜酸兩面菌(Acidianus sp)、至少1株勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)和至少2株嗜熱硫化桿菌(Sulfobacillus)的全基因組DNA。
這些探針最好包括16株氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、3株嗜酸氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillus thiooxidans菌)、3株喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus菌)、2株Acidithiobacillus albertensis菌、10株氧化亞鐵微螺菌(Leptospirillum sp.菌)、14株異養(yǎng)嗜酸菌(Acidiphiliums sp.)、1株金屬硫葉菌(Sulfolobus Metallicus)、1株嗜酸兩面菌(Acidianus sp)、1株勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)和3株嗜熱硫化桿菌(Sulfobacillus)的全基因組DNA。
與現(xiàn)有的微生物群落分析方法相比，利用本發(fā)明的基因組芯片對(duì)微生物進(jìn)行群落分析，克服了過程復(fù)雜、耗時(shí)長、勞動(dòng)強(qiáng)度大、嗜酸性細(xì)菌很難進(jìn)行分離培養(yǎng)的缺點(diǎn)。利用這種芯片，能夠檢測(cè)環(huán)境中豐度較低的微生物，適用于分析酸性環(huán)境中微生物群落。具有高通量、同時(shí)、快速、準(zhǔn)確、靈敏地分析酸性環(huán)境中微生物群落組成的優(yōu)點(diǎn)。


圖1使用Acidithiobacillus ferrooxidans菌的全基因組DNA與本發(fā)明的基因組芯片雜交后進(jìn)行特異性評(píng)估的雜交結(jié)果圖；圖2使用Acidithiobacillus ferrooxidans菌的全基因組DNA與本發(fā)明的基因組芯片雜交后進(jìn)行靈敏度評(píng)估雜交圖；圖3使用Acidithiobacillus ferrooxidans菌的全基因組DNA與本發(fā)明的基因組芯片雜交后進(jìn)行定量性能評(píng)估線性圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明基因組芯片的制備將至少10株氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、至少2株嗜酸氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillus thiooxidans菌)、至少1株喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus菌)、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亞鐵微螺菌(Leptospirillum sp.菌)、至少8株異養(yǎng)嗜酸菌(Acidiphiliums sp.)、至少1株金屬硫葉菌(Sulfolobus Metallicus)、至少1株嗜酸兩面菌(Acidianus sp.)、至少1株勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)和至少2株嗜熱硫化桿菌(Sulfobacillus)的全基因組用DNA抽提試劑盒進(jìn)行抽提。以抽提的全基因組DNA作探針，將其用50％的DMSO溶解，到終濃度為50pmol/μl，然后在相對(duì)濕度為55～58％的環(huán)境條件下使用OmniGridAccent Arraying System(Genomic Solutions，美國)將探針點(diǎn)樣在經(jīng)氨基化表面處理的硅化玻片上。每一玻片上有8個(gè)探針陣列重復(fù)。點(diǎn)好的芯片處于室溫下干燥過夜，最后在600mJ的輻射劑量下對(duì)芯片進(jìn)行紫外線交聯(lián)。
實(shí)施例2芯片雜交特異性評(píng)估選取氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，簡稱A.f菌，來檢測(cè)芯片探針的雜交特異性。將A.f菌全基因組DAN用cy3熒光染料標(biāo)記后與寡核苷酸芯片在50℃雜交，結(jié)果顯示芯片上與A.f菌對(duì)應(yīng)的探針位置點(diǎn)上都產(chǎn)生了很強(qiáng)的熒光信號(hào)(如附圖1所示)，并且在芯片上沒有發(fā)現(xiàn)與非靶標(biāo)基因間的非特異性交互雜交現(xiàn)象。說明特異性的寡核苷酸探針與其對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因之間具有很強(qiáng)的特異性。
實(shí)施例3芯片雜交靈敏度檢測(cè)使用Acidithiobacillus ferrooxidans 23270的純基因組DNA來檢測(cè)本發(fā)明芯片的靈敏度。將純基因組DNA按照一定的濃度梯度稀釋(濃度分別為0.11，1.15，11.5，115ng/ul)，并使用cy3進(jìn)行標(biāo)記后與芯片雜交。從芯片雜交分析結(jié)果(見附圖2)發(fā)現(xiàn)，該芯片對(duì)純培養(yǎng)微生物基因組DNA的檢測(cè)極限為0.11ng/ul。
實(shí)施例4芯片的定量性能測(cè)定通過測(cè)定目標(biāo)DNA濃度與芯片雜交信號(hào)之間的關(guān)系評(píng)估了芯片的用于核酸定量的能力。將純的Acidithiobacillus ferrooxidans 23270基因組DNA按照梯度稀釋后使用cy3進(jìn)行標(biāo)記并與芯片進(jìn)行雜交，每一濃度的DNA制備三個(gè)平行雜交，每一探針對(duì)應(yīng)的信號(hào)取其均值，以DNA濃度的對(duì)數(shù)值和對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)數(shù)值為座標(biāo)點(diǎn)作圖(見附圖3)，并對(duì)DNA濃度與熒光信號(hào)強(qiáng)度作線性回歸分析。結(jié)果顯示DNA濃度在1到500ng之間時(shí)，DNA濃度與信號(hào)強(qiáng)度之間存在很強(qiáng)的線性相關(guān)性，r2＝0.982，同樣的線性相關(guān)性也存于16s rRNA基因探針的數(shù)量與信號(hào)強(qiáng)度之間。此外，當(dāng)DNA濃度范圍在0.11到115ng/ul之間時(shí)，DNA濃度與芯片的總信號(hào)強(qiáng)度之間也存在很強(qiáng)的線性關(guān)系，r2＝0.91，p＜0.05。這一結(jié)果表明芯片雜交對(duì)于特定濃度范圍內(nèi)的DNA具有定量作用，因此也說明了本發(fā)明構(gòu)建的芯片可以作為一種定量工具使用。
權(quán)利要求
1.一種用于分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的基因組芯片，包括基片及固定于基片之上的細(xì)菌DNA探針，其特征在于所述探針包括至少10株氧化亞鐵硫桿菌、至少2株嗜酸氧化硫硫桿菌、至少1株喜溫嗜酸硫桿菌、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亞鐵微螺菌、至少8株異養(yǎng)嗜酸菌、至少1株金屬硫葉菌、至少1株嗜酸兩面菌、至少1株勤奮金屬球菌和至少2株嗜熱硫化桿菌的全基因組DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的基因組芯片，其特征在于所述探針包括16株氧化亞鐵硫桿菌、3株嗜酸氧化硫硫桿菌、3株喜溫嗜酸硫桿菌、2株Acidithiobacillus albertensis菌、10株氧化亞鐵微螺菌、14株異養(yǎng)嗜酸菌、1株金屬硫葉菌、1株嗜酸兩面菌、1株勤奮金屬球菌和3株嗜熱硫化桿菌的全基因組DNA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基因組芯片，其特征在于每個(gè)探針設(shè)8個(gè)重復(fù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的基因組芯片。該芯片的探針包括至少10株氧化亞鐵硫桿菌、至少2株嗜酸氧化硫硫桿菌、至少1株喜溫嗜酸硫桿菌、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亞鐵微螺菌、至少8株異養(yǎng)嗜酸菌、至少1株金屬硫葉菌、至少1株嗜酸兩面菌、至少1株勤奮金屬球菌和至少2株嗜熱硫化桿菌的全基因組DNA。這種芯片，能夠檢測(cè)酸性環(huán)境中豐度較低的微生物，具有高通量、同時(shí)、快速、準(zhǔn)確、靈敏地分析酸性環(huán)境中微生物群落組成的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101033490SQ20071003475
公開日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者邱冠周, 劉學(xué)端, 覃文慶, 劉新星, 申麗, 王軍 申請(qǐng)人:中南大學(xué)