專利名稱：一種基因芯片及利用該芯片鑒別高效浸礦菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片及用該基因芯片進(jìn)行微生物篩選的方法，尤其涉及用于從大量浸礦微生物中快速篩選高效浸礦菌株的基因芯片及篩選方法。
背景技術(shù)：
微生物冶金是以微生物的作用為能源，通過微生物氧化分解礦物，使金屬離子進(jìn)入溶液，進(jìn)一步分離、提取金屬的技術(shù)。微生物冶金具有流程短、成本低、環(huán)境友好和低污染等特點(diǎn)，特別是能處理低品位、復(fù)雜、難處理的礦產(chǎn)資源，是21世紀(jì)礦物提取前沿科學(xué)技術(shù)。微生物冶金的關(guān)鍵在于獲得氧化活性高、專屬性強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)性好的優(yōu)良菌種，以提高浸出率和浸出速度。嗜酸氧化亞鐵硫桿菌是生物冶金最常用的菌種之一，但該菌種不同菌種之間浸礦性能差異很大，而在進(jìn)行篩選時，往往從采集幾百份樣品中分離純化到的幾百個菌中，只能獲得數(shù)十株有效菌，而從這數(shù)十株有效菌中僅能篩選到幾株高效菌株。傳統(tǒng)的菌株篩選方法主要有以分離培養(yǎng)為基礎(chǔ)的形態(tài)觀察，如觀察細(xì)菌個體細(xì)胞形態(tài)和群體組合的群落；測定菌株生理生化指標(biāo)，如營養(yǎng)源、產(chǎn)酶種類與反應(yīng)特性、代謝產(chǎn)物的種類、數(shù)量等指標(biāo)測定；還有對菌株培養(yǎng)特性與浸礦試驗(yàn)，如菌株對溫度、氧需求，菌株在搖瓶、柱浸出、堆浸實(shí)驗(yàn)過程的浸出速率和浸出率分析等。這些方法過程冗長復(fù)雜，如浸礦試驗(yàn)往往需要幾個月甚至更長的時間，且測定得到的都是浸礦微生物表型特征和外觀性狀，而這些特征值受各種物理、化學(xué)和生物等環(huán)境因子的影響很大。因此，利用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行菌株篩選存在工作量大、時間長、可靠性差的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過控制浸礦性能相關(guān)功能表達(dá)情況的分析，提供一種基因芯片。并利用該基因芯片，提供一種從基因水平進(jìn)行嗜酸氧化亞鐵硫桿菌高效菌株快速、準(zhǔn)確鑒別的方法，以解決浸礦菌株篩選工作量大、時間長、可靠性差的難題。
以下是本發(fā)明的具體技術(shù)方案
本發(fā)明的基因芯片包括基片及固定于基片上的探針，這些探針包括從嗜酸氧化亞鐵硫桿菌模式菌株ATCC23270的全長基因中選取的如表1～4所列的80％以上的基因，即包含如表1所列的與亞鐵、硫氧化等能量代謝相關(guān)基因58～72個，如表2所列的耐高溫相關(guān)基因13～18個，如表3所列的抗有毒金屬離子相關(guān)基因28～35個，如表4所列的與DNA復(fù)制重組修復(fù)作用相關(guān)基因16～20個，以及如表5所列的5個人類基因作為對照。
表1 72個與亞鐵、硫氧化等能量代謝相關(guān)的基因


表2 35個與抗有毒金屬離子相關(guān)基因

表3 18個耐高溫相關(guān)基因

表4.10個與DNA復(fù)制、重組與修復(fù)相關(guān)的基因

表5作為對照的5個人類基因

本發(fā)明的基因芯片通過下述方法制備得到根據(jù)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌模式菌株ATCC 23270的全部3217個基因序列信息，構(gòu)建該菌的全基因組基因芯片，將基因芯片與高活性菌DNA和RNA雜交后，找到與浸礦性能直接相關(guān)的135個功能基因，這135個功能基因具體如表1～4所列。選取的如表1～4所列的80％以上的基因，即包含如表1所列當(dāng)中的58～72個與亞鐵、硫氧化等能量代謝相關(guān)基因，如表2所列當(dāng)中的13～18個耐高溫相關(guān)基因，如表3所列當(dāng)中的28～35個抗有毒金屬離子相關(guān)基因，如表4所列當(dāng)中的與16～20個DNA復(fù)制重組修復(fù)作用相關(guān)基因，以及5個如表5所示的人類基因作為對照，構(gòu)建基因芯片探針。將所選取的基因通過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，點(diǎn)樣于基片上，制成嗜酸氧化亞鐵硫桿菌浸礦功能基因芯片。
利用本發(fā)明的基因芯片鑒別高效浸礦菌株的方法為提取待測菌株DNA和RNA并進(jìn)行熒光標(biāo)記，與本發(fā)明的功能基因芯片雜交，對功能基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，根據(jù)功能基因的表達(dá)情況確定菌株的浸礦性能。
與傳統(tǒng)的浸礦菌篩選方法相比，利用本發(fā)明的基因芯片篩選高效浸礦菌株，快速便捷，靈敏度高。本發(fā)明使菌種浸礦性能的檢測時間由幾個月縮短到3～5天，而且由于通過基因芯片對控制生物冶金微生物浸礦性狀相關(guān)基因的全面檢測而對其性能進(jìn)行評判，克服了傳統(tǒng)浸礦方法只測定菌株表型特征，受環(huán)境影響很大，結(jié)果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。


圖1待測A.f菌CMS05與模式A.f菌ATCC 23270浸礦效果比較圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明基因芯片的制備本發(fā)明首先構(gòu)建模式A.f菌ATCC 23270的全基因組基因芯片，該芯片包含該菌株全部3217個基因。將5株高活性A.f菌基因組DNA與所構(gòu)建的基因芯片雜交，發(fā)現(xiàn)它們共同含有320個與亞鐵和硫氧化以及抗性等功能有關(guān)的基因。進(jìn)一步提取5株高活性菌RNA與基因芯片雜交，通過基因表達(dá)圖譜分析發(fā)現(xiàn)，在320個特征基因中共有135個基因在不同的高活性菌中高度表達(dá)，從而找到了與浸礦性能直接相關(guān)的功能基因135個，135個基因具體如表1～4所列，它們包括72個與亞鐵、硫氧化等能量代謝相關(guān)基因、18個耐高溫相關(guān)基因和35個抗有毒金屬離子相關(guān)基因以及20個與DNA復(fù)制重組修復(fù)作用相關(guān)的基因。同時，挑選了如表5所示的5個人類基因作為陰性對照或定量對照。
對上述每一基因設(shè)計(jì)一對引物，采用下列反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增1Taq酶緩沖液(10mM Tris-Cl[pH9.9]；1.5mM MgCl2；50mM KCl以及0.9％TritonX-100)；200M dNTPs；100pmol引物，1ng質(zhì)粒DNA或100ng染色DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?0℃下熱啟動30秒；94℃變性2分種；接著是在下列條件下進(jìn)行30循環(huán)的放大94℃變性30秒，60℃(nir和amoA基因)或58℃(16SrRNA基因和酵母基因引物)退火1分鐘，72℃延伸1分鐘；最后，在72℃延伸7分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色檢測PCR產(chǎn)物的大小及專一性。將PCR產(chǎn)物提純。
將提純得到的PCR產(chǎn)物加入到50％二甲基亞砜溶液中進(jìn)行稀釋，稀釋后DNA濃度為每200ng/ul，將每個基因的10ul樣品DNA轉(zhuǎn)移到384孔樣品盤備用。用芯片點(diǎn)樣儀，在相對濕度為62％的條件下將DNA樣品打印在硅化玻片表面，樣品點(diǎn)之間的距離為250um，所有140個探針排列成一個16行9列的矩陣，每個玻片上有3個基因陣列重復(fù)。
將打印好的芯片后處理，在60℃水浴箱上方對DNA芯片進(jìn)行重新水合化20秒鐘，迅速在80℃加溫板上干燥5秒鐘。之后，在65mJ下對DNA芯片進(jìn)行紫外聯(lián)接固定。緊接著封閉處理，將載有DNA微排列的玻片浸入95℃熱水中對DNA進(jìn)行2分鐘變性處理，在95％的酒精中浸洗5次，室溫下空氣干燥，貯存在室溫及黑暗條件下備用。封閉處理所用的封閉液的組成為4.28g琥珀酸酐溶于239.3ml的1-乙基-2-吡咯烷基中，隨后加入10.7ml硼酸鈉(pH8.0)。
實(shí)施例2用本發(fā)明的基因芯片鑒別高效浸礦菌株(1)待測樣品菌株的培養(yǎng)與DNA或RNA提取和熒光標(biāo)記從某銅礦分離得到一株A.f菌(CMS05菌株)作為待測樣品菌株，進(jìn)行樣品的擴(kuò)大培養(yǎng)，使用9K培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含3g(NH4)2SO4，0.1g KCl、0.5g K2HPO4、0.5g MgSO4·H2O、0.01g Ca(NO3)2、44.3g FeSO4·7H2O、5g單質(zhì)硫，并在樣品菌對數(shù)增長期的中期(細(xì)菌濃度不低于107個/mL，總量不得少于2L)添加醋酸鉛2000g、硝酸銀100g、硫酸汞0.4g、硫酸銅2500g、三氧化二砷(As2O3)100g，培養(yǎng)1小時后收集菌液。提取DNA或RNA并進(jìn)一步純化。
當(dāng)熒光標(biāo)記待測菌株基因組DNA進(jìn)行時，500ng的DNA與1.5μg六聚體堿基隨機(jī)引物混合(25μL)，在95℃下變性2min，迅速在冰上冷卻。變性的DNA溶液與15μL標(biāo)記反應(yīng)液混合，標(biāo)記反應(yīng)液的成分如下5mmol/LDatp、dTTP、dGTP和2.5mmol/L dCTP，1mmol/L Cy3-dCTP(熒光綠，激發(fā)波長520nm；發(fā)射波長550～600nm)或者Cy5-dCTP(熒光紅，激發(fā)波長647nm；發(fā)射波長660～705nm)；2.5mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)；10U Klenow大片斷DNA聚合酶I(Invitrogen，Calsbad，CA)。反應(yīng)混合物(40μL)在37℃下孵化2h，在100℃加熱板上變性3min，置于冰上迅速冷卻。隨后將標(biāo)記的DNA用QIAquick PCR純化柱進(jìn)行純化，純化液于40℃下濃縮1h，用適量的dH2O將濃縮的標(biāo)記DNA重新溶解。用于靈敏度實(shí)驗(yàn)時標(biāo)記DNA用2μL dH2O進(jìn)行溶解。為了對目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析，將已知濃度的人類基因PCR產(chǎn)物與待測菌株基因組DNA混合進(jìn)行標(biāo)記。
如果從待測菌株中提取的是RNA，則用反轉(zhuǎn)錄酶對RNA進(jìn)行標(biāo)記。首先將5μg的RNA與10μg的6堿基隨機(jī)引物混合(16.5μL)，在70℃下變性5min，在冰上迅速冷卻。變性的RNA溶液隨后與13.5μL標(biāo)記反應(yīng)液混合，標(biāo)記反應(yīng)液的成如下10mmol/L dATP、dTTP、dGTP和0.5mmol/L dCTP；1mmol/L Cy3-dCTP(熒光綠，激發(fā)波長520nm；發(fā)射波長550～600nm)或者Cy5-dCTP(熒光紅，激發(fā)波長647nm；發(fā)射波長660～705nm)[AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ]；2.5mM二硫蘇糖醇(DTT)；40U的RNase抑制劑，200U的Superscript反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)，1倍的Strand緩沖液。反應(yīng)混合物(30μL)在42℃下培養(yǎng)2h，在100℃加熱板上變性3min，置于冰上迅速冷卻。用與標(biāo)記DNA類似的方法進(jìn)行純化和濃縮。
(2)基因芯片雜交與圖象和數(shù)據(jù)處理所有基因芯片雜交均設(shè)3個重復(fù)。用適量的雜交液將濃縮的標(biāo)記DNA或RNA重新溶解，17.5μL雜交液的成分如下8.75μL甲酰胺，3倍SSC，1μg未標(biāo)記的青魚精子DNA，0.31％SDS。將熒光標(biāo)記的樣品和對照溶解后混合。雜交液在95℃下變性5min，冷卻并保持在50℃；此前，將待雜交的芯片和蓋玻片預(yù)熱到50℃；先將雜交液加到蓋玻片上，然后以DNA陣列面朝下放到蓋玻片上，將芯片翻轉(zhuǎn)后置于防水的雜交盒；為了保持雜交系統(tǒng)的濕度；在雜交盒兩端的小孔中各加入30μl 3×SSC；隨后，立即將雜交盒加蓋密封后放入50℃水浴箱雜交過夜(約15h)。從水浴箱中取出芯片后，盡快放入洗滌液中并使蓋玻片盡快脫離芯片。整個洗滌過程如下洗滌液1(1×SSC和0.2％SDS)1/5min，洗滌液2(0.1×SSC and 0.2％SDS)/5min，洗滌液3(0.1×SSC)/30s。離心(500g/5min)去除洗滌液并干燥。
在分辨率5μm下對基因芯片進(jìn)行掃描。激發(fā)光源為綠色HeNe或紅色HeNe(分別確定于所使用的熒光素Cy3或Cy5)，熒光素所發(fā)射的熒光由光電倍增管(PMT)在570nm(Cy3)或670nm(Cy5)進(jìn)行探測。對于靈敏度實(shí)驗(yàn)，激光強(qiáng)度和光電倍增率均為100％，對于其他芯片雜交實(shí)驗(yàn)，激光強(qiáng)度調(diào)整至不出現(xiàn)飽和圖像點(diǎn)。
對掃描獲得的圖像中的每一個雜交點(diǎn)的光素密度(或強(qiáng)度)進(jìn)行定量分析。將一個用來定義陣列中每一個DNA雜交點(diǎn)的圓圈疊加在圖像上，用以確定每一個被定量分析的熒光點(diǎn)。將每一熒光點(diǎn)所獲得的平均熒光強(qiáng)度作為其信號強(qiáng)度值，局部背景信號被自動地從每一單獨(dú)的熒光點(diǎn)雜交信號中減去；同時，從每一個雜交信號值中減去所有人類基因(陰性對照)熒光強(qiáng)度的平均值，作為雜交強(qiáng)度最后的定量值。軟件識別并標(biāo)記質(zhì)量不好的熒光點(diǎn)。根據(jù)下列公式計(jì)算信號干擾率(Signal-to-Noise Ratio，SNR)SNR＝(信號強(qiáng)度值-背景信號值)/背景標(biāo)準(zhǔn)偏差，通常將SNR＝3定為信號強(qiáng)度最小閾值，并將小于最小閾值的雜交點(diǎn)從數(shù)據(jù)集中去掉。
(3)數(shù)據(jù)分析與結(jié)果判斷將所獲得的樣品菌與標(biāo)準(zhǔn)菌的每一雜交點(diǎn)信號強(qiáng)度比值作進(jìn)一步分析。獲取樣品菌的135個重要功能基因的雜交信號，將雜交信號與模式菌ATCC23270相應(yīng)的135個基因雜交信號進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)信號強(qiáng)度比值≥2.0的基因數(shù)量，并計(jì)算其占模式菌135個基因的比例。當(dāng)其比例≥60％時，即可鑒別為高效菌株。
對待測樣品菌A.f菌(CMS05)進(jìn)行基因芯片檢測，結(jié)果顯示其與模式菌135個重要功能基因雜交信號強(qiáng)度比值≥2.0的基因數(shù)量為106個，其比例為78.5％。因此，鑒定該菌為高活性浸礦菌。經(jīng)培養(yǎng)性狀、形態(tài)、生理生化特征以及16S rDNA序列分析鑒定該菌株為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌。
進(jìn)一步的現(xiàn)場浸礦試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌浸礦75天后，其浸出率達(dá)到85.25％，標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC 23270為67.54％，另一株低活性菌YTW003僅為44.86％，如圖1所示。這一結(jié)果表明基因芯片檢測結(jié)果與菌種鑒定和浸礦試驗(yàn)結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒別高效浸礦菌株基因芯片，包括基片及固定于基片上的探針，其特征在于所述探針包括從嗜酸氧化亞鐵硫桿菌模式菌株ATCC23270的全長基因中選取的如表1所列的與亞鐵、硫氧化等能量代謝相關(guān)基因58～72個，如表2所列的耐高溫相關(guān)基因13～18個，如表3所列的抗有毒金屬離子相關(guān)基因28～35個，如表4所列的與DNA復(fù)制重組修復(fù)作用相關(guān)基因16～20個，以及如表5所列的5個人類基因。
2.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述基因芯片具有如表1～5所列的全部140個基因所構(gòu)建的140個探針。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于所述探針排列成的微陣列有3個重復(fù)。
4.應(yīng)用如權(quán)利要求1～3所述之一的基因芯片鑒別高效浸礦菌株的方法，其特征在于包含下述步驟提取待測菌株DNA或RNA并進(jìn)行熒光標(biāo)記；將經(jīng)標(biāo)記后的待測菌株DNA或RNA與所述基因芯片雜交，獲取雜交信號；將雜交信號與模式菌ATCC23270相應(yīng)的基因雜交信號進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)信號強(qiáng)度比值≥2.0的基因數(shù)量，并計(jì)算其占模式菌135個功能基因的比例，當(dāng)比例≥60％時，確定所述待測菌株為高效浸礦菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因芯片及利用該芯片鑒別高效浸礦菌株的方法。該方法構(gòu)建了由從模式菌株ATCC23270全長基因中選取的115～135個與浸礦性能直接相關(guān)的功能基因組成的基因芯片，以及應(yīng)用該芯片鑒別高效浸礦菌株的方法。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)浸礦菌株鑒別方法工作量大、時間長、可靠性差的問題，使菌種浸礦性能的檢測時間由幾個月縮短到3～5天，且由于通過基因芯片對控制生物冶金微生物浸礦性狀相關(guān)基因的全面檢測而對其性能進(jìn)行評判，鑒別結(jié)果更加準(zhǔn)確。
文檔編號C12Q1/68GK101033491SQ20071003475
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者邱冠周, 劉學(xué)端, 覃文慶, 劉新星, 申麗, 王軍 申請人:中南大學(xué)