專利名稱：與癲癇相關(guān)scn1a基因的啟動子及其構(gòu)建方法和臨床應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與癲癇相關(guān)的5t)VW基因的啟動子及其構(gòu)建方法和臨床應(yīng)用，適用于癲癇及 其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷。屬于人體基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癲癇(Epil印sy)是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導致反復發(fā)作的大腦功能障礙的一種 慢性疾病。其發(fā)病率高，病程長，對家庭及社會的影響大。離子通道的活動是神經(jīng)系統(tǒng)電興 奮性的基礎(chǔ)。已有研究表明基因突變后導致離子通道結(jié)構(gòu)和功能的改變以及離子通道基因 表達水平的異常改變在癲癇發(fā)生中起重要作用，其中電壓依賴型鈉通道在動作電位的產(chǎn)生和 傳播中起關(guān)鍵作用，因而成為近年來癲癇及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究和臨床診斷的焦點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多編碼I型電壓依賴型鈉通道a亞基(Navl.l)的5^yVM基因的突變位 點與癲癇發(fā)生相關(guān)，許多全面性癲癇伴熱性驚厥(GEFS+)及嚴重性嬰兒肌陣攣(SMEI)患者 的5"GVW基因不同位點發(fā)生錯義突變、無義突變或缺失突變等。其中一半以上的SMEI突變位 點導致蛋白質(zhì)翻譯時被剪切(Truncation),成為無功能蛋白(Loss of function),這表明 SO(M基因的表達水平下降與癲癇發(fā)病密切相關(guān)。小鼠的5TyVW基因單倍敲除實驗也證實 SCvVM基因單倍表達不足(Haploinsufficiency)會導致癲癇發(fā)生。最新研究發(fā)現(xiàn)5TA^基 因異常表達或突變會導致海馬抑制性中間神經(jīng)元的興奮性下降，而不影響海馬興奮性錐體神 經(jīng)元的功能，從而推斷這些異常導致海馬回路的興奮性增高，引起癲癇發(fā)作。調(diào)節(jié)基因表達的機制比較復雜，有功能蛋白的合成要受mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯以及翻譯 后水平的加工、包裝及運輸?shù)雀鱾€因素的影響，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，由 于基因啟動子是mRNA轉(zhuǎn)錄所必需的，并且它決定了基因表達的空間、時間和表達的強度等； 因此，鑒定出5GVW基因的啟動子對于癲癇患者的臨床診斷，指導癲癇的治療具有重要價值。本發(fā)明的第一個目的，是為了提供一種與癲癇相關(guān)的沉JVW基因啟動子。 本發(fā)明的第二個目的，是為了提供一種與癲癇相關(guān)的5^yVW基因啟動子的構(gòu)建方法。 本發(fā)明的第三個目的，是為了提供一種與癲癇相關(guān)的5"6)V"基因啟動子的臨床應(yīng)用。 本發(fā)明的第一個目的可以通過采取如下措施達到 與癲癇相關(guān)的5"CVW基因啟動子，其特征是1) 基因啟動子的核苷酸序列為序列表中SEQID 1的DNA序列；2) 由核心啟動子及其上游調(diào)控區(qū)序列和5'非翻譯區(qū)外顯子序列構(gòu)成，其中，序列表中 非劃線部分為核心啟動子及其上游調(diào)控區(qū)序列，劃線部分為5'非翻譯區(qū)外顯子序列。本發(fā)明的第一個目的還可以通過采取如下措施達到本發(fā)明的一種實施方式是基因啟動子的5'非翻譯區(qū)由三個外顯子和兩個內(nèi)含子構(gòu)成，三個外顯子通過轉(zhuǎn)錄后加工，組成成熟mRNA的5'非翻譯區(qū)；成熟mRNA的5'非翻譯區(qū)的結(jié) 構(gòu)是外顯子大小分別為86 bp, 92 bp和49 bp，分布在第一個編碼外顯子上游75 kb片段 內(nèi)，第一個非編碼外顯子與第二個非編碼外顯子相之間的內(nèi)含子長約為71 kb，第二個非編 碼外顯子與第三個非編碼外顯子之間的內(nèi)含子長約4 kb，第三個非編碼外顯子緊鄰第一個編 碼外顯子。本發(fā)明的一種實施方式是能使熒光素酶報告基因在神經(jīng)來源的成神經(jīng)纖維瘤母細胞 SH-SY5Y中表達，而在非神經(jīng)來源的人胚腎293細胞HEK-293中沒有表達，即該啟動子包含 了神經(jīng)性細胞特異轉(zhuǎn)錄功能基序。本發(fā)明的第二個目的可以采取如下措施達到與癲癇相關(guān)的5GVM基因啟動子的構(gòu)建方法，其特征是1) 利用正常人的外周血制備基因組DNA,利用正常人海馬組織及大腦皮質(zhì)制備總RNA;2) 準備好所需的菌株、細胞株及質(zhì)粒；3) 準備好所需的試劑及試劑盒，利用試劑抽提白細胞基因組DNA和腦組織總RNA;4) 以序列表中SEQID Na: 2作為引物，進行PCR擴增，獲得與癲癇相關(guān)的5GW/!基因 啟動子序列，并構(gòu)建該啟動子的表達載體。本發(fā)明的第二個目的還可以通過采取如下措施達到如前所述的與癲癇相關(guān)的5T/VM基因啟動子的制備方法，其特征是利用5'-Full RACE法獲得5^A(W基因5'非翻譯區(qū)全長；具體步驟如下1) 采用TRIzol試劑從正常人海馬組織和大腦皮質(zhì)中分別提取總RNA，加/Wawl消化 去除殘存的DNA;2) 用Tobacco Acid Pyrophosphatase即TAP去掉mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)；3) 再用T4 RNA Ligase將5，-Full RACE Adaptor連接到mRNA的5'端后，用 特異性引物WP79逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈；4) 使用5'-Full RACE Ad即tor上的外側(cè)引物與沉附J基因特異性的外側(cè)引物WP79進行 第一輪RT-PCR反應(yīng)，再用5，-Full RACE Adaptor上的內(nèi)側(cè)引物與沉7VM基因特異性的內(nèi)側(cè)引 物WP80進行第二輪RT-PCR反應(yīng)，高特異性地擴增到5DVW基因cDNA 5'末端的全長序列。如前所述的與癲癇相關(guān)的5"6)VW基因啟動子的構(gòu)建方法，其特征是將基因啟動子與5'非翻譯區(qū)所有外顯子連接構(gòu)成具有神經(jīng)細胞來源的表達盒，該表達盒 的構(gòu)建步驟是1)提取正常人白細胞的基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，用引物WP119和 WP109進行PCR擴增；2) 獲取轉(zhuǎn)錄起始點及其上游2.5 kb片段，再以該2.5 kb的PCR片段及5，-Full RACE片 段作為模板；3) 用2.5 kb片段上游引物WP119和5，-RACE片段的下游引物WP108,進行融合PCR， 獲得2.7 kb長的完整啟動子片段；4) 該片段用《;7" I和///"cni1進行雙酶切反應(yīng)，酶切片段克隆到pGL4.10載體上，重組 質(zhì)粒命名為pGL4-lA-5U;5) 構(gòu)建一個不含5'非翻譯區(qū)的啟動子表達載體，以.2.7 kb長的完整啟動子片段作為模 板，用引物WP119和WP106擴增，PCR片段經(jīng)I和///"d III雙酶切后克隆到pGL4.10 載體上，重組質(zhì)粒命名為pGL4-lA。本發(fā)明的第三個目的可以采取如下措施達到與癲癇相關(guān)的5"CA^基因的啟動子的臨床應(yīng)用，其特征是將5"07^基因啟動子與5'非翻譯區(qū)所有外顯子連接起來構(gòu)建成具有神經(jīng)細胞來源的高 效特異地表達盒，可用于癲癇和其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的50^4基因啟動子及5'非翻譯區(qū) 所有外顯子突變的功能鑒定，以及在癲癇及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療。與癲癇相關(guān)的5"CVM基因的啟動子的臨床應(yīng)用，其特征是1) 篩査癲癇患者SCWL4基因的啟動子，具體步驟如下 首先，提取癲癇的外周血基因組DNA作為PCR模板；然后，以序列表中SEQID Na: 3作為引物，將SCWA4基因啟動子區(qū)及5'非翻譯區(qū)外 顯子分為7個片段進行PCR擴增；2) 采用儀器進行測序，所述儀器可以是3137型自動型測序儀；3) 采用常規(guī)生物學軟件分析癲癇患者SCA7」基因啟動子的序列與正常人的差異；4) 將該突變位點引入到SCWL4基因啟動子表達載體，檢測該突變對啟動子功能的影響， 分析其與疾病的關(guān)系。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明是現(xiàn)有的單獨存在的核心啟動子及其上游調(diào)控區(qū)序列(序列表中SEQ ID Na: 1 中非劃線部分)與5'非翻譯區(qū)外顯子序列連接起來，構(gòu)建成一個完整的有活性功能的基因 啟動子。經(jīng)過反復試驗證明，本發(fā)明的啟動子序列能使熒光素酶報告基因在神經(jīng)來源的成神 經(jīng)纖維瘤母細胞(SH-SY5Y)中表達，而在非神經(jīng)來源的人胚腎293細胞(HEK-293)中沒有 表達，這說明該啟動子包含了神經(jīng)性細胞特異轉(zhuǎn)錄功能基序。在SH-SY5Y細胞中，沉WM基 因啟動子所啟動的熒光素酶報告基因表達水平與高效啟動子SV40啟動子的表達水平?jīng)]有顯 著差異，比5'非翻譯區(qū)外顯子缺失的5^yVM基因啟動子的表達水平顯著增高(『20， P〈0.05)， 說明5'非翻譯區(qū)外顯子具有增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的功能。本發(fā)明所鑒定的啟動子區(qū)能用于癲 癇患者的臨床篩查。本發(fā)明將5GVM基因啟動子與5'非翻譯區(qū)所有外顯子連接起來構(gòu)建成 具有神經(jīng)細胞來源的高效特異地表達盒，可用于癲癇和其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的5T;V^基因啟動子及5'非翻譯區(qū)所有外顯子突變的功能鑒定，同時還可攜帶治療基因，將在癲癇及其 它神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。


圖1為通過5'-Full RACE法獲得正常人的海馬及大腦皮質(zhì)的RT—PCR片段。M, DNA分子量標記；1，空白對照(以不加反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板)；2,海馬總 RNA的RT-PCR; 3，大腦皮質(zhì)總RNA的RT-PCR:箭頭表示目標片段。圖2為正常人的海馬及大腦皮質(zhì)的5TyV"基因5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)結(jié)構(gòu)示意圖。圖3a 圖3e為5T/VM基因啟動子(含5'非翻譯區(qū)所有外顯子序列)表達載體及其它載 體的示意圖。圖4為5tWM基因啟動子(含5'非翻譯區(qū)所有外顯子序列)及構(gòu)建該啟動子表達載體所 需要的所有引物。圖5為熒光素酶報告基因分析5TA7力基因啟動子(含和不含5'非翻譯區(qū)所有外顯子) 指導的細胞特異性表達柱狀圖。
具體實施方式
實驗材料1、組織:正常人和癲癇患者外周血；正常人海馬組織及大腦皮質(zhì)。2、 菌株、細胞株及質(zhì)粒菌種大腸桿菌T0P10為本實驗室保存；細胞株SH-SY5Y， HEK293(為美國ATCC公司產(chǎn)品);質(zhì)粒pGL4.10 vector, pRL-TK vector, pGL4. 13(為美國 Promega公司)。3、 主要試劑及試劑盒腦組織總RNA抽提試劑TRIzol為Invitrogen產(chǎn)品，白細胞基 因組DNA抽提試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，5'-Full RACE Kit為TaKaRa公司產(chǎn)品。4、 用于構(gòu)建基因啟動子表達載體的引物序列 WP79: 5' - TCCTGGTGGTACMGCACTGTTTGC- 3'CTGTTTGCTCCATCTTGTCATCCTGCAC- 3'WP80: WP106 WP107 WP108 WP109 WP1195， 5， 5， 5' 5, 5，-AAGAAGCTTTCTGGAGGMCAGTTCC-3， 3'-GAMCTCATGGMCTGTTCCTCCAGA--ATCAAGCTTCTTGTCATCCTGCACAT- 3， -GCTCAGCTTCCTCCAGCTTCCA- 3, -TAGGGTACCCAGTTATGACCCATAGGC- 3，(〃jW III)(歷/7(/ III)(必"I)5、用于臨床診斷檢測的引物序列FP1 RP1 FP2 RP2 FP3 RP35' - CTCATGGCACAGTTCCTGTATCAG- 3' 5' - GTCTGGTTTGGGATTCTTTGCC- 3' 5' - GTTGGAATCATACTGTATGTCCATTTTAG- 3' 5， -AAGCAAAATGGTACAGCAACTTGG- 3， 5' - GTCATGGTACAGGACTTTACTGATAGC- 3' 5， -CTGCACCTCTCAGCATGACTGAC— 3'FP45'-CTGACATTTATCGGCAACCCAC- 3，RP45'- GTGGGAAGMTGACCAGAAGCAT- 3'FP55'- GGTTCCTTCTCTATTTCTGTTACCTCAG-RP55'-GGATATCAAATTCAGAACGTGGTGG-3'FP65，-CACTGTACATCAAGCCTTTACTCCAG--3'RP65'-CCCAAATGTGTGCAATGCAAG- 3'FP75'-CATTCAGCAAACACTTATTGGAGGC-3'RP75'-GCCTGACATAGAGGAAGAGGTGAGTG-3'實施例1鑒定5KVW基因的轉(zhuǎn)錄起始點及5'非翻譯區(qū)1、 5，-FULL RACE法獲得5"(3V^基因5'非翻譯區(qū)全長5'-FullRACE獲取轉(zhuǎn)錄起始點的操作過程參照TaKaRa生產(chǎn)的試劑盒(貨號D315)說明 進行。采用TRIzol試劑從正常人海馬組織和大腦皮質(zhì)中分別提取總RNA，加ZWa化I消化去 除殘存的DNA; 然后用Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)；再 用T4 RNA Ligase將5，-Full RACE Adaptor連接到mRNA的5'端后，用5"CA^4基因特異性引物 (WP79)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈；使用5，- Full RACE Adaptor上的外側(cè)引物與沉附j(luò)基因特 異性的外側(cè)引物(WP79)進行第一輪RT-PCR反應(yīng)，再用5，-Full RACE Adaptor上的內(nèi)側(cè)引物 與5"CV"基因特異性的內(nèi)側(cè)引物(WP80)進行第二輪RT-PCR反應(yīng)，高特異性地擴增到SCVM 基因cDNA 5'末端的全長序列(圖l)。2、 序列比較法分析5"^V"基因5'非翻譯區(qū)的結(jié)構(gòu)PCR產(chǎn)物經(jīng)測序并在NCBI BLAST程序進行對比，發(fā)現(xiàn)5DVM基因5'非翻譯區(qū)分成三個外 顯子(圖2):大小分別為86bp， 92 bp和49 bp，分布在第一個編碼外顯子上游75 kb片段 內(nèi)，第一個非編碼外顯子與第二個非編碼外顯子相之間的內(nèi)含子長約為71 kb，而第二個非 編碼外顯子與第三個非編碼外顯子之間的內(nèi)含子長約4 kb，第三個非編碼外顯子緊鄰第一個 編碼外顯子。5T7VM基因的轉(zhuǎn)錄起始點位于第一個編碼外顯子上游約75 kb處，轉(zhuǎn)錄起始點 附近存在一個轉(zhuǎn)錄起始子(其一致序列為5' -YYCARR-3')。實施例25J3VW基因啟動子的構(gòu)建及其活性鑒定 1、啟動子表達盒相關(guān)載體的構(gòu)建為了研究5CyVM基因啟動子的活性，提取正常人白細胞的基因組DNA,以該基因組DNA 作為模板，用引物WP119和WP109進行PCR擴增；獲得轉(zhuǎn)錄起始點及其上游2.5kb片段，再 以該2. 5 kb的PCR片段及5，-Full RACE片段作為模板，用2. 5 kb片段上游引物(WP119) 和5'-Full RACE片段的下游引物(WP108),進行融合PCR，獲得2. 7 kb長的完整啟動子片段； 該片段用I和^Vk/ III進行雙酶切反應(yīng)，酶切片段克隆到pGL4.10載體上，重組質(zhì)粒命 名為pGL4-lA-5U (圖3)。為了研究沉WM基因5'非翻譯區(qū)對表達活性的影響，構(gòu)建一個不含 5'非翻譯區(qū)的啟動子表達載體，以2.7 kb長的完整啟動子片段作為模板，用引物WP119和 WP106擴增，PCR片段經(jīng)I和//i'; c/ III雙酶切后克隆到pGL4. 10載體上，重組質(zhì)粒命名 為pGL4-1A (如圖3所示)。2、 SCNIA基因啟動子的活性分析(1) 2.7 kb啟動子指導熒光素酶報告基因的細胞特異性表達SH-SY5Y細胞在完全培養(yǎng)基(45% MEM+45% F12+10%胎牛血清+ 10 ng/ml鏈霉素)中200710031681.8說明書第6/9頁貼壁生長，在5% C02和37'C條件下培養(yǎng)；HEK-293細胞則用DMEM培養(yǎng)基(90% DMEM+10%胎 牛血清+10嗎/ml青霉素)培養(yǎng)。將生長良好的細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加0.5 ml 培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后細胞匯合到50 80%可進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時 改用無酚紅和血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h后，將1叫待檢測的質(zhì)粒和0.1叫作為內(nèi)標的pRL-TK 質(zhì)粒和1 nl脂質(zhì)體lipofectamine及4 Plus (Invitrogen)混勻，室溫放置15 min形成 DNA-lipofectamine復合體，用500 pl無血清培養(yǎng)基稀釋后添加到24孔板中。37。C培養(yǎng)5小 時后換成正常含10%血清的培養(yǎng)基。48 h后收集細胞，進行熒光素酶活性檢測。用1 ml的 PBS緩沖液洗細胞三次，每孔加入100pl新鮮配制的細胞裂解液，室溫下振搖15min，將細 胞裂解液移至1.5 ml離心管中，室溫下12000 rpm離心1 min。取20 pl的上清加入100 pl熒 光素酶反應(yīng)底物溫勻后，用發(fā)光計測定熒光素酶的發(fā)光值，然后加入100 pi的反應(yīng)終止液， 測定作為內(nèi)標的及em7/"熒光素酶的發(fā)光值，兩者的比值即為熒光素酶的相對活性。將2.7kb 啟動子所指導表達的熒光素酶的相對活性除以SV40啟動子所指導表達的熒光素酶的相對活 性即為SOVL4基因啟動子相對于SV40啟動子的活性，其數(shù)值為10-20次重復實驗結(jié)果的平 均值土標準差。結(jié)果表明(圖5示)本發(fā)明的啟動子序列能使熒光素酶報告基因在神經(jīng)細胞來源的 SH-SY5Y細胞中表達，其活性達到SV40啟動子的85M;本發(fā)明的啟動子在非神經(jīng)細胞來源的 HEK-293細胞中幾乎沒有活性，其活性僅為SV40啟動子的5免。這表明本發(fā)明的啟動子指導基 因表達的活性具有神經(jīng)來源細胞特異性。因此本發(fā)明的表達載體可應(yīng)用于攜帶治療基因，指 導目的基因在特異地細胞中表達。以達到基因治療的效果。同時5^yw^基因啟動子序列也可 應(yīng)用于癲癇患者的臨床篩査，并進一步進行突變啟動子的功能鑒定，以證實患者的病因，從 而指導臨床用藥。(2) 5'非翻譯區(qū)外顯子具有增強啟動子活性的功能 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報告系統(tǒng)的檢測及統(tǒng)計分析同步驟(1)。結(jié)果如圖5所示，移去5'非翻譯區(qū)外顯子的啟動子在SH-SY5Y細胞中的活性僅為SV40 的30%,為5DV/力基因完整啟動子的25. 5%，這說明5'非翻譯區(qū)外顯子含有增強啟動子活性的 序列。由此推斷，沉)V/力基因5'非翻譯區(qū)外顯子對于5^vVW基因的表達發(fā)揮重要作用。因此， 5'非翻譯區(qū)外顯子及對mRNA剪接起重要作用的部分內(nèi)含子序列也可應(yīng)用于臨床篩查，以期獲 得相關(guān)的致病突變。實施例3癲癇患者5KJVW基因啟動子區(qū)及5'非翻譯區(qū)外顯子區(qū)的篩査提取患者外周血基因組DNA,將5KW力基因啟動子區(qū)及5'非翻譯區(qū)外顯子區(qū)分為7個片 段進行PCR擴增，每個片段相互重疊150-200 bp (以保證測序的完整性)。通過測序?qū)ふ一?者5TA^基因啟動子的突變位點，并進一步通過定向誘變，將該突變位點引入到SCN1A基因 啟動子的表達載體，以證實該突變位點對啟動子功能的影響，從而分析其與疾病的關(guān)系。序列表<110>廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院<120〉與癲癇相關(guān)的5TA7力基因的啟動子及其構(gòu)建方法和臨床應(yīng)用 〈160>3〈210〉 1 <211〉2721 〈212〉腿 〈213〉人工序列〈220〉 〈223>〈400> 1CAGTTATGACCCATAGGCTATAAGTTAAAATCTCTAGGGGGTTTGGGAAAGCTCTTGGAG 60GAACCTGATTTAGCTGGCATGTGTCTTATGCCTTTTGGTCTTCCTATCCTTCTCCCTAGC 120ATGTAGTTAGGATGCTGGAAGTGAGGCAGCCATCTCAAGACCATGAAGCAACAAATAGAA 180GGATGAAAGTCACAAGCTGAGGATGTTTGAGAGGAAGAAAAATGAGCTTAGGCCTCTGAA 240GACTGTGAAGTCCTACCTTCAGACTAATGTCACTTAAGAAAAACGAACTTCTATTTTGGT 300TAAGTTAGTATATGTTTGATTATCTCTTACAAGCAGCCAAACCTATACCAAGTTGATCCA 360ATTAGAAGAATGTGCCAAAAAAATCTTTTAACCGTTTCCAAACGTGCATTTCAGAAGCAT 420TCATTTACTTTGGCAATTATTAAACTGATATATATTAGTAAAACATTTTTATACACTTCT 480TAAAATGACTCCTCCAAATAACTCTACTAGGCCATACTCTATGCACTTCCTATACAGGGA 540GGGACACATTATGAATACTTTTCATCCCTCCATTGATTCATTCAGCAAACACTTATTGGA 600GGCCCAGAAAGCATTGTGCTAGGGGCAGGGATGCAAGAATGAAAAACACACACCTGATTA 660CAAAAGGCTTAGTTTATTTGAAAAGAATAAGACAGAATATTTTTTAAAAACATTCTATTT 720TCCAGTTCTTTGCTTCCTGAGGGTTGTTTGTTTCACATACATTAGCTCTCCAAGGGATAG 780AGAAGCCTAGCACCATAATCAACATCAATAAAATAAAAGGATCTGAGCCAACAAATTGGT 840GTACATAGCTTAATGTTCAGAACACAAATTCATCATTGAATATTTAATTAAATGTTGCAC 900CAATGTGTTCATTACTGTTGTGAGAAATAACTGAAGAAAGTTTCTCATTCCAATCAGTAC 960AGAACTTGTTTTTCCAAAATCAGACTACTGCTAAAAGCAGATATTTAGTACTACTCCACT 1020TTTTTTTTCTGTCATTTGTATGATATAAAAAAATCACTGTACATCAAGCCTTTACTCCAG 1080TATCAAAAGACAATTATTCATTGCAGTATAGCTGACAAAATAACAAGTTAGTGTCAGGAA 1140AACCATTTTTCACTCACCTCTTCCTCTATGTCAGGCATATCATCTAACTTCTTTCTACCT 1200CAGTTTCCTTATGAGTTAAGTAATGGGTTGGAATTAGATCACTGTGTTCCCTCATAGATC 1260TAAATTCTCTTATTTCCTCACTCTACTTAGTGTGATGCATTAGCAGATAGGTTTCCCAGC 1320TAAGAGCAGAACATTAAGATTATTTTTAAATGATGTGTGGTTCCTTCTCTATTTCTGTTA 1380CCTCAGGAATTATACATATTAGCCAACAACTCATATCAAACCACAATTTTATATATAATT 1440AAACAATATAATGTCATCTTTTATTAATAATACTATATCACCATACTCAAAATCAGAATA 1500GAAGACTGGTTTTATTATTTCTAGCTTTTAAAAGCATAACTTGCATTGCACACATTTGGG 1560ATAATTGAAAGAAAATTAGATGGAGTGTACATTGTTTTAAATTTGCTGTTCACATTATCC 1620CCCAGATATCTAGGAGTAAGTCTAACACAGATTATCTCAAAAGCACAGCAATCCTCTTGC 1680TCCATTATAAGAAATTATTTTCAGAGTCTAAAAGATTGATTATATGCAAAATCTGAAAGC 1740TAAAATTAAGATCTTATTTTTCAGTATAGACAATAGAAGTAATTAATTAACACATCTGAC 1800ATTTATCGGCAACCCACCATAGGCAGAGATCTGCTTTCTTATTAGTTGCATAAGATTTTC 1860AGAAGTTGAAATACATTAAATACAACCAGTTTAACCCACCACGTTCTGAATTTGATATCC 1920TATTACCTTGCTCACAAACAAGATCTTTAAGGAACATAAACACTCTTTACAAATCCTTTA 1980GTTACCATCCTGCAAAACAACTCACACCCCCAATAATAATCTCATTACATATATACATAT 2040TTCCCTCTACTCACCACAATGAGTTAAAGGTGGACAAAAGCCCTCGGTGACTGTCTTTGA 2100GTTATTACTTTGCTTTACCATTTCCTTCCTTTTAGGTGTCATGGTACAGGACTTTACTGA 2160TAGCAATTCATTCTTGTTAGGTTTACTGCAAACACCAAAAGAGGTGTCTTGCACTTGCTG 2220GAAGACTTAGCTTTTATGCTTCTGGTCATTCTTCCCACAAAAAGAATGAGACCAGTTTCT .2280GAGCTATTCTTAACTCGCCTTCCAAAATATTTCAAAAGAGGAAGACAAGAAAGACTTCAT 2340GATTTCCATGCAAACTCCCAGCCTGCCTGGCTGCCTGCTGCTGCCAATACTTCTTGCTCT 2400TGCTGGTGATGACATTCAGAGAGCTCCCCAGCACTGGTGCTTCGTTATGTAAGGCTGTCT 2460AGGTCAAGTGTAGGAGACACACTGCTGGCCTGTGGAAACTCATGGAACTGTTCCTCCAGA 2520TTAACACTTCAGGGGTTATGGAAGCTGGAGGAAGCTGAGCTTTTACTACATCTTTTGGGG 2580GTTTGGGCAATTATGAATAAGGCTGCTGTATACATCCGTGTGCAGGATTTTGTGTGGACA 2640TAAGTTTTCAACTCCTTTGGTTAAATCCTAAGAAATTTCATATGCAGAATAAATGGTAAT 2700TAAAATGTGCAGGATGACAAG 2721210〉2〈211><212〉醒〈213>人工序列<220><223>為了構(gòu)建啟動子表達載體而設(shè)計的引物，用作PCR擴增。 〈400>2WP79:5，-TCCTGGTGGTACAAGCACTGTTTGC- 3'WP80:5,-CTGTTTGCTCCATCTTGTCATCCTGCAC-陽3';WP1065'-AAGAAGCTTTCTGGAGGAACAGTTCC-3'(AW III);WP1075'-GAAACTCATGGAACTGTTCCTCCAGA-3';WP1085'-ATCAAGCTTCTTGTCATCCTGCACAT-3'III);WP1095'-GCTCAGCTTCCTCCAGCTTCCA- 3';WP1195'-TAGGGTACCCAGTTATGACCCATAGGC--3'(輛I)<210> 3<211><212>DM〈213〉人工序列<220>〈223〉為了i會斷檢測而設(shè)計的引物，用作PCR擴增。 <400>3FP1:5'-CTCATGGCACAGTTCCTGTATCAG- 3'RP1:5'-GTCTGGTTTGGGATTCTTTGCC- 3'FP2:5'-GTTGGAATCATACTGTATGTCCATTTTAG- 3'RP2:5'-AAGCAAAATGGTACAGCAACTTGG- 3'FP3:5'-GTCATGGTACAGGACTTTACTGATAGC- 3'RP3:5'-CTGCACCTCTCAGCATGACTGAC- 3'FP4:5'-CTGACATTTATCGGCAACCCAC- 3'RP4:5'-GTGGGAAGAATGACCAGAAGCAT- 3'FP5:5'-GGTTCCTTCTCTATTTCTGTTACCTCAG- 3'RP5:5'-GGATATCAAATTCAGAACGTGGTGG- 3'FP6: 5' - CACTGTACATCAAGCCTTTACTCCAG- 3RP6: 5' -CCCAAATGTGTGCAATGCAAG- 3'FP7: 5' - CATTCAGCAAACACTTATTGGAGGC- 3'RP7: 5' - GCCTGACATAGAGGAAGAGGTGAGTG- 權(quán)利要求
1、與癲癇相關(guān)的SCN1A基因啟動子，其特征是1)基因啟動子的核苷酸序列為序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)由核心啟動子及其上游調(diào)控區(qū)序列和5’非翻譯區(qū)外顯子序列構(gòu)成，其中，序列表中非劃線部分為核心啟動子及其上游調(diào)控區(qū)序列，劃線部分為5’非翻譯區(qū)外顯子序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與癲癇相關(guān)的5EVM基因啟動子，其特征是5'非翻譯區(qū)由 三個外顯子構(gòu)成，三個外顯子通過轉(zhuǎn)錄后加工組成成熟mRNA的5，非翻譯區(qū)；外顯子大小分 別為86 bp， 92 bp和49 bp，分布在第一個編碼外顯子上游75 kb片段內(nèi)，第一個非編碼外 顯子與第二個非編碼外顯子相之間的內(nèi)含子長約為71 kb，第二個非編碼外顯子與第三個非 編碼外顯子之間的內(nèi)含子長約4 kb，第三個非編碼外顯子緊鄰第一個編碼外顯子。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與癲癇相關(guān)的5"0^4基因啟動子，其特征是能使熒光素酶 報告基因在神經(jīng)來源的成神經(jīng)纖維瘤母細胞SH-SY5Y中表達，而在非神經(jīng)來源的人胚腎293 細胞HEK-293中沒有表達，即該啟動子包含了神經(jīng)性細胞特異轉(zhuǎn)錄功能基序。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與癲癇相關(guān)的6KVW基因啟動子，其特征是將基因啟動子 與5'非翻譯區(qū)所有外顯子連接構(gòu)成具有神經(jīng)細胞來源的表達盒。
5、 與癲癇相關(guān)的6GVM基因啟動子的構(gòu)建方法，其特征是1) 利用正常人的外周血制備基因組DNA，利用正常人海馬組織及大腦皮質(zhì)制備總RNA;2) 準備好所需的菌株、細胞株及質(zhì)粒；3) 準備好所需的試劑及試劑盒，利用試劑抽提白細胞基因組DNA和腦組織總RNA;4) 以序列表中SEQID Na: 2作為引物，進行PCR擴增，獲得與癲癇相關(guān)的沉附J基因 啟動子序列,并構(gòu)建該啟動子的表達載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的與癲癇相關(guān)的5"CV^I基因啟動子的制備方法，其特征是利 用5'-Full RACE法獲得5"CyV7力基因5'非翻譯區(qū)全長；具體步驟如下1) 采用TRIzol試劑從正常人海馬組織和大腦皮質(zhì)中分別提取總RNA,加ZW3Ml消化 去除殘存的DNA;2) 用Tobacco Acid Pyrophosphatase即TAP去掉mRNA的5，帽子結(jié)構(gòu)；3) 再用T4 RNA Ligase將5，-Full RACE Adaptor連接到mRNA的5'端后，用5TA^基因 特異性引物WP79逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈；4) 使用5'-Full RACE Adaptor上的外側(cè)引物與沉)VW基因特異性的外側(cè)引物WP79進行 第一輪RT-PCR反應(yīng)，再用5'-Full RACE Adaptor上的內(nèi)側(cè)引物與6KVM基因特異性的內(nèi)側(cè)引 物WP80進行第二輪RT-PCR反應(yīng)，高特異性地擴增到5T;V^基因cDNA 5'末端的全長序列。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的與癲癇相關(guān)的5"CyV/力基因啟動子的構(gòu)建方法，其特征是將 基因啟動子與5，非翻譯區(qū)所有外顯子連接構(gòu)成具有神經(jīng)細胞來源的表達盒，該表達盒的構(gòu)建 步驟是1) 提取正常人白細胞的基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，用引物WP119和 WP109進行PCR擴增；2) 獲取轉(zhuǎn)錄起始點及其上游2.5 kb片段，再以該2.5 kb的PCR片段及5，-Full RACE片 段作為模板；3) 用2.5 kb片段上游引物WP119和5'-RACE片段的下游引物WP108，進行融合PCR， 獲得2.7 kb長的完整啟動子片段；4) 該片段用^7"1和州>^111進行雙酶切反應(yīng)，酶切片段克隆到pGL4.10載體上，重組 質(zhì)粒命名為pGL4-lA-5U;5) 構(gòu)建一個不含5'非翻譯區(qū)的啟動子表達載體，以2.7 kb長的完整啟動子片段作為模 板，用引物WP119和WP106擴增，PCR片段經(jīng)《; " I和///"J III雙酶切后克隆到pGL4.10 載體上，重組質(zhì)粒命名為pGL4-lA。
8、 與癲癇相關(guān)的5TyVM基因的啟動子的臨床應(yīng)用，其特征是將50^l基因啟動子與5' 非翻譯區(qū)所有外顯子連接起來構(gòu)建成具有神經(jīng)細胞來源的高效特異地表達盒，可用于癲癇和 其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的5DVM基因啟動子及5'非翻譯區(qū)所有外顯子突變的功能鑒定，以 及在癲癇及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療。
9、 如權(quán)利要求8所述的與癲癇相關(guān)的5"CYM基因的啟動子的臨床應(yīng)用，其特征是1) 篩査癲癇患者SCWL4基因的啟動子，具體步驟如下 首先，提取癲癇的外周血基因組DNA作為PCR模板；然后，以序列表中SEQID Na: 3作為引物，將SCiVL4基因啟動子區(qū)及5'非翻譯區(qū)外 顯子分為7個片段進行PCR擴增；2) 采用儀器進行測序；3) 采用常規(guī)生物學軟件分析癲癇患者SGVL4基因啟動子的序列與正常人的差異；4) 將該突變位點引入到SCiVL4基因啟動子表達載體，檢測該突變對啟動子功能的影響， 分析其與疾病的關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明涉及與癲癇相關(guān)的SCN1A基因的啟動子及其構(gòu)建方法和臨床應(yīng)用，其特征是1)基因啟動子的核苷酸序列為序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)由核心啟動子及其上游調(diào)控區(qū)序列和5’非翻譯區(qū)外顯子序列構(gòu)成，其中，序列表中非劃線部分為核心啟動子及其上游調(diào)控區(qū)序列，劃線部分為5’非翻譯區(qū)外顯子序列。其構(gòu)建方法是1)利用正常人的外周血制備基因組DNA，利用正常人海馬組織及大腦皮質(zhì)制備總RNA；2)準備好所需的菌株、細胞株及質(zhì)粒；3)準備好所需的試劑及試劑盒，利用試劑抽提白細胞基因組DNA和腦組織總RNA；4)以序列表中SEQ ID №2作為引物，進行PCR擴增，獲得與癲癇相關(guān)的SCN1A基因啟動子序列，并構(gòu)建該啟動子的表達載體。本發(fā)明可用于癲癇和其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的SCN1A基因啟動子及5’非翻譯區(qū)所有外顯子突變的功能鑒定，將在癲癇及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/12GK101255424SQ20071003168
公開日2008年9月3日 申請日期2007年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月26日
發(fā)明者廖衛(wèi)平, 易詠紅, 揚 曾, 石奕武, 蔡陽林, 趙綺華, 龍躍生 申請人:廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院