專利名稱：：唐魚β-actin基因遠端調(diào)控序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及唐魚P-actin基因遠端調(diào)控序列、重組表達載體及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)基因魚的研究作為轉(zhuǎn)基因動物研究領(lǐng)域的一部分，它的誕生是動物基因工程研究最突出的方面，也是目前國內(nèi)外獲得最成功的轉(zhuǎn)基因動物之一。與哺乳類相比，轉(zhuǎn)基因魚有其自身的優(yōu)點，如魚類產(chǎn)卵量大、胚胎經(jīng)基因轉(zhuǎn)移操作后不需放回母體內(nèi)培育，攜帶的與人類相關(guān)的病原體較少等，所以通過轉(zhuǎn)基因魚進行基因表達調(diào)控、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)等基礎(chǔ)研究具有潛在的經(jīng)濟價值。因為遠源基因存在著在受體魚細胞屮的表達調(diào)控與生物學(xué)效應(yīng)以及轉(zhuǎn)基因魚消費安全等問題，使用同源或親緣關(guān)系較近的魚類功能基因和調(diào)控序列不但具有安全性而且有助于魚類轉(zhuǎn)基因的有效表達，提髙轉(zhuǎn)移基因的表達水平，所以從魚類基因組DNA中提取功能基因和調(diào)控序列在生物工程中有著重要的經(jīng)濟利用價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有強啟動活性的唐魚(3-actin基因遠端調(diào)控序列，以提高外源基因在轉(zhuǎn)基因魚類中的表達水平。本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有上述唐魚p-actin基因遠端調(diào)控序列的重組表達載體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有上述唐魚p-actin基因遠端調(diào)控序列的重組微生物。本發(fā)明的進一步目的是提供上述唐魚(3-actin基因遠端調(diào)控序列在轉(zhuǎn)基因魚類表達調(diào)控中的應(yīng)用。本發(fā)明將唐魚基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶EcoRV消化純化后與試劑盒GenomeWalkerUniversalKit提供的接頭連接，RT-PCR擴增得到1800bp的特異帶，克隆測序為卩-actin5'側(cè)翼序列；根據(jù)此序列及已獲得的唐魚P-actin近端調(diào)控序列設(shè)計一對引物，以唐魚基因組DNA為模板，RT-PCR擴增出一條3000bp的特異帶，切膠回收后與載體pMD19-T連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌^.co/0DH5a，測序確定為p-actin遠端調(diào)控序列，命名為TLA，包含1.8kb的5'側(cè)翼序列以及長為1.2kb的(3-actin的第一個不翻譯的外顯子和第一個內(nèi)含子。重組子命名為TLA-T。本發(fā)明將唐魚P-actin基因遠端調(diào)控序列經(jīng)粘端連接插入紅色熒光表達載體pDsRed2-l屮，得到重組表達載體，命名為pTLA-DsRed(7.1kb)。本發(fā)明克隆獲得的唐魚P-actin基因遠端調(diào)控序列具有強的啟動活性，其參與構(gòu)建的重組表達載體經(jīng)顯微注射到唐魚體內(nèi)后外源基因可在唐魚體內(nèi)高表達。將線性化后的重組熒光表達載體通過顯微注射入唐魚的受精卵中并孵化培育，熒光顯微鏡下觀察熒光，轉(zhuǎn)基因唐魚仔魚(孵化出膜72h)的體表可見紅色災(zāi)光，部分轉(zhuǎn)pTLA-DsRed仔魚則在解剖鏡下就可觀察到魚體背部呈現(xiàn)紅色熒光，而轉(zhuǎn)基因唐魚成魚在肉眼下則可觀察到紅色'災(zāi)光；以已獲得的轉(zhuǎn)pTLA-DsRed基因唐魚和野生型唐魚的cDNA第鄰為模板，對RFP和P-actin基因進行擴增及電泳。Alphalmager圖像分析系統(tǒng)的相對半定量分析顯示轉(zhuǎn)基因唐魚能檢測出外源基兇RFP的mRNA，且mRNA有較高的表達量，其RFPmRNA的表達量比由唐魚p-actin近端調(diào)控序列啟動的轉(zhuǎn)pTA-DsRed基因唐魚高35.7%。這與用熒光顯微鏡觀察RFP的表達的結(jié)果相同，說明3.0kb的唐魚(3-actin基因遠端調(diào)控序列具有強的啟動活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1、P-actin是管家基因，也是最主要的非肌肉型或胞質(zhì)肌動蛋白異型體，從唐魚基因組DNA中得到f3-actin基因遠端調(diào)控序列，包含有CCAAT框，TATA框、CArG框的上游調(diào)控序列以及下游的第-一個外顯子和第一個內(nèi)含子，該序列具有有效的驅(qū)動基因表達的功能，為下一歩進行功能基因的轉(zhuǎn)移打下了基礎(chǔ)；2、由該遠端調(diào)控序列與紅色熒光表達載體構(gòu)建的重組熒光表達載體，轉(zhuǎn)入魚卵后對成魚進行檢測證實，該重組熒光表達載體能使外源基因在魚類體內(nèi)高效表達；3、本實驗得到的轉(zhuǎn)熒光基因唐魚體色紅艷，其體色不需要熒光燈的照射白天在室內(nèi)也同樣艷麗，具有較高的觀賞性，有很高的經(jīng)濟價值。圖1為轉(zhuǎn)基因重組表達載體的詳細構(gòu)建過程；圖2為遠端調(diào)控序列TLA驅(qū)動的RFP基因在唐魚中的表達；圖3為RFP在轉(zhuǎn)基因唐魚中表達的半定量分析；圖4為轉(zhuǎn)基因唐魚中RFP與p-actinmRNA表達量比值。具體實施方式實施例1采用PCR法從唐魚基因組DNA中擴增并克隆出唐魚P-actin基因遠端調(diào)控序列，具體歩驟如下1、唐魚{3-actin基因遠端調(diào)控序列5、上游遠端調(diào)控序列的獲得根據(jù)已獲得的唐魚P-actin近端調(diào)控序列并搜索NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫，比較分析鯉科魚類P-actin基因上游調(diào)控序列，并根據(jù)GenomeWalkerUniversalKit使用手冊，將基因組DNA用EcoRV消化，內(nèi)切酶消化后并與試劑盒所提供的接頭進行連接。以連接產(chǎn)物為模板，以API(5、-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3、)禾USPl(5、-TTACCTTAGGTTTGGGGGGGGTTGTCG-3、)為引物進行第'次PCR擴增，反應(yīng)條件為94°C25s，72°C3minx7;94°C25s，67°C3minx32;67°C7min。PCR反應(yīng)體系如表l:表l.PCR反應(yīng)體系ddH2033.5pL10xLABuffer(Mg2+plus)5(iLdNTPMix8|iLAPIluLSP1luL連接產(chǎn)物l^LLATaq(TaKaRa)O單Total50pL取l^il1stPCR產(chǎn)物加入49^ddH20中，稀釋50倍配制PCR反應(yīng)液，以稀釋液為模板，以AP2(5、-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3、)禾口SP2(5、-GCTGTTTTATACGACACCACATGCCCG-3、)為引物進行二次PCR，反應(yīng)條件為94°C25s，72°C3minx5;94°C25s，67°C3minx20;67°C7min。反應(yīng)體系如表2:表2.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>PCR擴增產(chǎn)物根據(jù)膠回收試劑盒(E,Z.N.AGelExtractionKit)使用手冊所提供的方法回收后與pMD19-TEasyVector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌CB.CO//)DH5a進行初歩鑒定后委托上海英竣生物公司進行DNA序列測定。測定結(jié)果用DNA分析軟件VECTORVTI8.0進行分析，并進行同源性比較，確定為唐魚p-actin基因5'上游側(cè)翼序列。2、唐魚p-actin基因遠端調(diào)控序列的獲得根據(jù)所得的唐魚p-actin基因5'上游側(cè)翼序列及已獲得的唐魚p-actin近端調(diào)控序列設(shè)計設(shè)計上下游引物TB-F(5、-GGGAATTCGGCTGGTATCTTATGTC-3、)，TB-R(5、-GAGGATCCGGCTGAACTGTAAATGTG-3、)。為了便于將遠端調(diào)控序列插入到熒光蛋白基因載體上，在上游引物TB-F引入五coRl酶切位點，下游引物TB-R引入萬鍾HI酶切位點。以高質(zhì)量的唐魚基因組DNA為模板，以TB-F，TB-R為弓I物進行PCR擴增，擴增反應(yīng)體系如表3:表3.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>基因組DNA引物TB-F引物TB-RLATaq酶一總體積100pL反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min后進入循環(huán)94°C變性50s，53。C退火lmin，72'C延伸lmin，共30個循環(huán)，最后72'C延伸10min。擴增產(chǎn)物膠回收后與pMD19-TVector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(￡xo//)DH5a,進行初歩酶切鑒定后委托上海英竣生物公司進行DNA序列測定，重組子命名為TLA-T。唐魚卩-actin基因遠端調(diào)控序列核酸序列測序結(jié)果如SEQIDNO:l所示。實施例2轉(zhuǎn)基因重組表達載體詳細構(gòu)建如圖l，取重組子TLA-T經(jīng)五coRI和SamHI雙酶切l(wèi)Hj收后，與經(jīng)同樣酶切消化后的紅色熒光表達載體(pDsRed2-l)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取陽性質(zhì)粒，進行初歩酶切鑒定進行DNA序列測定，測序結(jié)果表明遠端調(diào)控序列與載體連接正確，命名為pTLA-DsRed(7.1kb)。將質(zhì)粒pTLA-DsRed用內(nèi)切酶歷'mim線性化后，通過顯微注射將重組質(zhì)粒注射到唐魚的受精卵中，進行孵化、培育，用熒光顯微鏡(帶有2072濾光片組合)檢測RFP的表達情況。觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因唐魚仔魚(孵化出膜72h)的體表均可見紅色熒光，部分轉(zhuǎn)pTLA-DsRed仔魚則在解剖鏡下就可觀察到魚體背部呈現(xiàn)紅色熒光，而兩種轉(zhuǎn)基因唐魚成魚在肉眼下則可觀察到紅色熒光(圖2);實施例3轉(zhuǎn)基因唐魚中的外源基因RFP的RT-PCR檢測分別取孵化出膜15d的轉(zhuǎn)pTLA-DsRed基因唐魚(熒光顯微鏡下巳檢測出有RFP表達的仔魚)，和野生唐魚各20尾進行RFPmRNA的半定量分析。根據(jù)SVTotalRNAIsolationSystem試劑盒所提供的方法提取總RNA。取l嗎總RNA，以O(shè)ligo(dT)2o為引物按照TOYOBOReverTraAce(TOYOBO，Japan)7的使用說明合成CDNA第一鏈。以2pLcDNA第一鏈為模板，以卩-actin-F(5、-GTGCCCATCTACGAGGGTTACGC-3、)禾卩p-actin-R(5、-TGGTCTCGTGGATACCGCAAG-3、)為引物擴增卩-actin基因預(yù)期長為346bp的中間片段，反應(yīng)條件為PCR擴增反應(yīng)條件為94"C預(yù)變性3min;然后進行30個循環(huán)反應(yīng)，94。C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin;循環(huán)結(jié)束后72。C再延伸7min。PCR反應(yīng)體系如表4:表4.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>同時以Red-F(5、-GTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGT-3、)禾口Red-R(5、-CTACGGAACAGGTGGTGGCGG-3、)為引物擴增紅色熒光蛋白基因預(yù)期長為487bp的片段。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性94。C3min;94°C30s，58°C30s'72°Clmin，30個循環(huán)；；72°C10min。反應(yīng)體系如表5:表5.PCR反應(yīng)體系成分體積ddH2016.25^L10XPCRBuffer2.5^Taq0.25^L上游引物Red-F0.5^下游引物Red-R0L反轉(zhuǎn)錄液2|aL總體積25^LPCR產(chǎn)物各取5nL于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用AlphalmagerTM圖像分析系統(tǒng)觀察、記錄電泳結(jié)果，并用其軟件進行濃度分析。AlphalmagerTM圖像分析系統(tǒng)的相對半定量分析顯示轉(zhuǎn)基因唐魚均能檢測出外源基因RFP的mRNA(圖3)，且有較高的表達量(圖4)，這與用熒光顯微鏡觀察RFP的表達的結(jié)果相同，說明3.0kb的唐魚(3-actin基因遠端調(diào)控序列具有強的啟動活性。至此，本實驗已通過紅色熒光蛋I'::KRFP)基因的表達產(chǎn)物一紅色熒光，以及RFP的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的存在證實了所使用的啟動調(diào)控序列確實具有有效轉(zhuǎn)錄啟動活性。唐魚13-actin基因遠端調(diào)控序列及其應(yīng)用序列表.txtSEQUENCELISTING<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所<120>唐魚e-actin基因遠端調(diào)控序列及其應(yīng)用<130><160>1〈170>Patentlnversion3.2<210〉1<211〉2995<212〉DNA<213>唐魚(Tanichthysalbonubes)<400〉1gaattcggctggtatcttatgtcatggggcaaagctgaagttcattaggatagtacctta60tttagagatgaatgggaaggctgaagtggggg貼ggccggctgctatcaggg33gggtgg120t.ggtcctcagggg33Ct3tggactcacaaaagcacatctgctgtaacaagaccccagtcc180aacaagttacaaagagatgcatggttgttc240aaacaggctatttatat.cacatctcatttacatagtttgatgcctagttt300ctatttgcaaatggtttgttt肪卿gggatggatgtttggcattctttaaaacaagttt360ggggg"ggg鄉(xiāng)aag柳cCtt3ttggtgagtxcctattgatgtxctgt.tagtagataa420accttttagatgtttacttgtataaccattttctcatgaaatctgtcaatgtcggttgga480aaaatagttgtgtattt.agtcagtagttatactcaaegtttaataaacta540att.caaatac3ttttt3C￡iacaagaacttgagatttt.aaagcattxttgtcaaacatgtt600gtaaaaacataaatataagtcacaggccactggctttagttatt.ttcgac660ataatcagctgtttttgtttataactgcattgt.gcattactcccaagtta720cacattaaaa犯gtcacatgttgcttaccaacatcacttctgctcaagtgcagectttat780ctattattgaaacgtctgaaceicccccca3aacatt.ttgtccatatcttggasaacaatg840ttctaaagcgtata.aatatatccaatcaataagttcattatcaacaatat900gtaatgtaatatatattttg犯tgccaaaccagacttacccatgaaacatctacaacaag960accttcaattttgacgtcataacctgggctaggcccacttacagecatxa1020acaagggctgateateateateatxacegtgtcacgtgcacaaactgacc1080tgtgcatctaC3C3C3tC3Ctcctgtaaaagagtgagatctgtgaattaggcaaatcaga1140attaaccttattggaattaattccaagtttcatt.3ctatttcagcattaatgatctcagt1200ccagctagttgc卿gacagttgtgtcacttggttatcat.catatcaatgaaa犯c3ccc1260atattttgcatagag￡iagtacttggtagatccacac3C站^tt3tt.￡lt.ggtattattgt1320g^cac^taagaagtaaatgacctacagagetgetgettgaaaacatatcacaggacca1380actgtccacaactatgttgaccaataccggcacttgaaaacgt;Ug犯ag1440gttgaatagcgttctttcagcattatcacaaaactatgtattaaaattgt1500agtcagtttggatcaaaaccgcctaggcctttattgtttaactagtctagcttxcccttc1560tttcact.ctcaagttgcaagaaagcaagtgtagcaat.gtgcacgcgacggccgggtgtgt1620gacgctgaacgcagagttccgagagttt.accttttatggctagagceggg1680catgtggtgtcgtataaaagatgcgcgcccagcttttcctcctcact.ttgagctcctccac1740唐魚e-actin基因遠端調(diào)控序列及其應(yīng)用序列表.txtacgcagctagtgcggaatatcatcagcttgtaacccattctcttaagtcgacaacccccc1800ccaaacctaaggtaagttagt.ttctcagcttttggtgcattttcctgaattt.atttttaa1860agttaattaatatttattaatgtattgctaaaatgtctatatttaacacg1920atatttact,agtatttgtatgctaacacctgctaaaaaggatgcttatttgtggtcacaa1980attgcggcattcttaacttcatgtaaatgttagcgcgctagacctgtcaggtggaagtga2040ccgtaaccgttggaagcacgactttgaataggccggtgtgaaat朋gtttaacatgtcag2100gttaccaatgcccagctggtttaatcgcaactttgcagtttaagggtgtt2160cgtgaggcat;gttgcacacttgatggatagccggcatggggagctctttgtgcaggcagc2220gctgcagcgcagggtgtgacct.agtttagctagccggctaaccagcattcaccttccgtt2280aacccgatggatctgactctcacttataccatctatcaactaagtaacggtagcctttga2340gcaattactttcaacacttctgtgaaccgacatagtccttcactctttgc2400ttgagactgaaggtta宮cgaagcgtttaattttcacgttgaactgcaaggtgtggtcgat2460ccttaatggctagtgtaaagcgtttaaacaacccaaatgt;gtcgaac犯tttctcattga2520taaactxtagg組ggactgatgatgaagtcgtctttcattggagtgact2580gcagatctgtgacgcagtaatgttgggcagacacccgccgaaagt.cggttgtgt.aattga2640tacgaggcgccttcattcgtgggagtggccctggcgtgat2700ggatgtcgaaatctgttcctttttactgaactxtgactttggctgagcgcC3C￡lCCgCC32760gcagccgcaaagcggctxgatccatt.gccttttatggtaataatgagagaatgcggaggg2820acttcctttgtctgacatattctgaggcgcgctttgtcactccagcaccgactagcggtc2880agacggtagaatgcagcacgaaacaggaagttgactccacatgctcactgatgccgtctt2940tcatggtagcggtgcactaaaactttcttttcacatttacagttcagccgg3tCC299權(quán)利要求1、一種唐魚β-actin基因遠端調(diào)控序列，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2、一種重組表達載體，含有權(quán)利要求l所述的唐魚卩-actin基因遠端調(diào)控序列。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達載體，其特征在于所采用的表達載體為紅色熒光表達載體。4、一種重組微生物，含有權(quán)利要求1所述的唐魚P-actin基因遠端調(diào)控序列。5、權(quán)利要求1所述唐魚P-actin基因遠端調(diào)控序列在轉(zhuǎn)基因魚類表達調(diào)控中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公布了一種唐魚β-actin基因遠端調(diào)控序列及其應(yīng)用。它是采用RT-PCR方法從唐魚基因組DNA中得到的。本發(fā)明將該遠端調(diào)控序列插入到紅色熒光表達載體(DsRed2-1)上，構(gòu)建了pTLA-DsRed(7.1kb)重組表達載體，隨后在轉(zhuǎn)基因唐魚中通過表達水平的半定量分析證實，該重組表達載體在轉(zhuǎn)基因唐魚體內(nèi)得到表達，且證實唐魚β-actin基因遠端調(diào)控序列具有強的啟動活性。文檔編號C12N15/85GK101260400SQ20071003144公開日2008年9月10日申請日期2007年11月16日優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日發(fā)明者勞海華,星葉,夏仕玲,王海英,白俊杰,清簡,郁二蒙申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所