專利名稱：從動物血中分離三種酶(制劑)的聯(lián)產(chǎn)工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分離酶的生產(chǎn)工藝，尤其是涉及一種從動物血中分離 三種酶的聯(lián)產(chǎn)工藝，屬于生物化學制備領域。
技術背景S0D、 CAT、 T服都是酶，它們主要功能有S0D是一種藥用酶， 它是一種活性氧自由基的轉移清除劑，在臨床上主要用于胂瘤、自身 免疫性疾病、心血管疾病、放射治療后遺癥及有矢炎癥的防止上，此 外在食品、曰化等領域也己廣泛得到應用；THR是機體凝血系統(tǒng)中的 天然成分，在臨床上已開發(fā)成為一種新型局部止血藥。而CAT在現(xiàn)代 紡織業(yè)、乳業(yè)、造紙業(yè)及食品醫(yī)藥行業(yè)上已有應用，用于清除過量的 (殘余的)過氧化氫。目前許多專利文獻對上述三酶的制備方法均有大量的報道，但大 都是單產(chǎn)。聯(lián)產(chǎn)工藝報道較少，主要有王永權等，生物工程學報 [2005， 21 (3): 466、72]報道從紅細胞中采用推層析法分離S0D、 CAT和血紅蛋白新工藝(二酶聯(lián)產(chǎn))；辛春艷等，[河北省科學院學報, 2002， 19 (4): 250 253]從豬血中獲得凝血酶、S0D和水鮮蛋白(二 酶聯(lián)產(chǎn))；凌敏等，[廣西醫(yī)科大學學報，2005， 22 (3): 363 364] 研究了從豬血中分離S0D、血紅素和蛋白胨工藝；美國專利，[1982， US patent, 4341867。 Jack T. Johaiisen， Rungsted K'yst, Denmark, Process for recouering eng， ymes from Blood]報道從血液中同時提取S0D、 CAT及碳酸酐酶的工藝(三酶聯(lián)產(chǎn))。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是，根據(jù)上述的技術缺陷，提出了一種簡化工藝、 避免用有機溶劑等化學方法、提高工藝效率和產(chǎn)品質量的從動物血中 分離三種酶的聯(lián)產(chǎn)工藝。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的 一種從動物血中分離三種酶的 聯(lián)產(chǎn)工藝，其工藝步驟為1、 新鮮動物血加檸檬酸三鈉抗凝劑，充分攪拌，通過離心機離心 (3000rpm， 30min)得血漿和血球。血漿提取凝血酶，血球提取SOD和CAT。2、 凝血酶提取1) 血漿加水稀釋，用1%乙酸調(diào)節(jié)PH5. 3，離心5-10min，離心棄去 離心液，收集沉淀，的凝血酶原。2) 分離、沉淀、洗滌取凝血酶原溶于NaCl溶液中(0.9%)加入 CaCl2 (1.5%)，攪拌10min，冷室放量ln，離心分離，沉淀為血 纖維蛋白，溶液加等量丙酮，靜置過應，沉淀用乙醚洗滌，真空 干燥的粗制凝血酶。3) 除雜質、沉淀、干燥，去粗酶溶于0.9Q/oCaCl2溶液中，0'C放置6h 過濾，然后用1%乙酸條PH至5. 5，離心棄沉淀。清夜加工倍量冷 丙酮，沉淀分別用乙醇、乙醚洗滌，真空干燥即得精致凝血酶。3、 SOD和CAT混合液制備將血球加等體積0. 9%NaCl溶液洗二次，獲得了干凈的紅細胞，然后加等體積的去離子水溶血30min，溶血液加二價金屬氯化物用于去除 雜蛋白。65。C加熱10 min,離心的含SOD和CAT的粗酶液。然后用截留分子量10萬的過濾膜將二酶分開，過濾流擊液含分子量較小的 SOD等蛋白，濃縮液含分子量較大的CAT等蛋白。過濾液備用分別用 作提取SOD和CAT等酶的原料。4、 SOD提取上述過濾清液加入0.3mol/L的CuCl2和ZnCl2溶液，充分混勻，然后 用截留分子量10000的過濾膜濃縮至原體積的1/10 1/2的過濾濃縮 液。熱度性(65。C， 10min)去雜蛋白，離心的清液，接著DEAE—S印hadex A-50柱，即可得比活在5000u/ (mg。蛋白)的高純度S0D。 SOD在液體中易失活，通常將其制成凍干粉。5、 CAT的提取上述濃縮液，加等量0. 3mol/L的溶液，充分攪拌，然后用截留10萬 分子量的過濾膜濃縮至原體積的1/2，重復二次。然后條PH至4. 5， 先逬行等電點沉淀，然后加蛋白沉淀劑聚丙烯酸鈉(PA)，離心棄沉 淀(3000rpm， 30min)，這樣就可以得到CAT的精制溶液。在常溫下， CAT易失活，通常在精制液中加0.5%*25203和3%的甘油保護劑，這樣 CAT的保存活力至少在半年以上。
具體實施方式
一種從動物血中分離三種酶的聯(lián)產(chǎn)工藝，其工藝步驟為 1、 將20克檸檬酸三鈉加入到1000克的牛血中，3000rpm離心 30min，得到600克血漿和400克血球。2、 SOD提取將血球用重量濃度為0. 9%的NaCl水溶液洗滌，然 后在3000rpm的轉速下離心，獲得紅血球，重復二次。然 后將干凈血球加入等量水溶血30min，充分攪拌，獲得溶血 液接著加入重量濃度為3. 5%0￡12溶液16ml去除血紅蛋白， 離心的粗酶液。然后用截留分子量為10萬的過濾膜過濾至 原來體積的1/5。獲得過濾清液A和過濾濃縮液B。 A用作 提取S0D， B用作提取CAT。將A液繼續(xù)用截留10000分子量的膜過濾至1/2，接著熱變 性(65° C， 10min) 3000 rpm離心30min。棄沉淀，清液上 DEAE—S印hadex A-50層析柱。收集有SOD活性的層析液， 過濾濃縮至沒ml含2-3萬活性單位的SOD ，加1. 5%甘露 醇，冷凍干燥，獲10—25萬活性單位的S0D，比活大于 3000u/mg'proto3、 CAT的提取B液加等量水，繼續(xù)用截留分子量10萬的膜過濾至原體積 的1/2,調(diào)pH至6. 0—6. 5加1%PA， 3000rpm離心30min， 棄沉淀，然后加入0.5% Na2S203ffi 15%的甘油，4'C冷藏， 亦可冷凍干燥長期保存。按此工藝可獲得CAT。4、 T服的提取500ml血漿加入5L蒸餾水稀釋，用150rall。/。乙酸調(diào)節(jié)pH5. 3 離心5-10min，棄離心液得沉淀，此沉淀為凝血酶原。 接著去凝血酶原在25—30。C溶于350ml的0. 9%氯化鈉溶液中，加入1.5%氯化鈣，攪拌10min，冷室放置lh，離心分 離，清液加等量冷丙酮，攪拌靜止過后，沉淀真空干燥即 為粗凝血酶。粗制酶溶于100mlNaCl溶液中，0° C放置5h，離心去沉淀， 清液用1柳AC調(diào)pH至5. 5，離心后棄沉淀，加2倍量丙酮， 靜放2h后再離心，這吋的沉淀經(jīng)干燥后即為精致凝血酶約 0.4克。
權利要求
1. 一種從動物血中分離三種酶的聯(lián)產(chǎn)工藝，其工藝步驟為A.新鮮動物血加檸檬酸三鈉抗凝劑，充分攪拌，通過離心機離心(3000rpm，30min)得血漿和血球。血漿提取凝血酶，血球提取SOD和CAT；B.凝血酶提取a.血漿加水稀釋，用1％乙酸調(diào)節(jié)pH5.3，離心5-10min，離心棄去離心液，收集沉淀，的凝血酶原；b.分離、沉淀、洗滌取凝血酶原溶于NaCl溶液中(0.9％)加入CaCl2(1.5％)，攪拌10min，冷室放量1n，離心分離，沉淀為血纖維蛋白，溶液加等量丙酮，靜置過應，沉淀用乙醚洗滌，真空干燥的粗制凝血酶；c.除雜質、沉淀、干燥，去粗酶溶于0.9％CaCl2溶液中，0℃放置6h過濾，然后用1％乙酸條pH至5.5，離心棄沉淀。清夜加工倍量冷丙酮，沉淀分別用乙醇、乙醚洗滌，真空干燥即得精致凝血酶；C.SOD和CAT混合液制備將血球加等體積0.9％NaCl溶液洗二次，獲得了干凈的紅細胞，然后加等體積的去離子水溶血30min，溶血液加二價金屬氯化物用于去除雜蛋白。65℃加熱10min，離心的含SOD和CAT的粗酶液。然后用截留分子量10萬的過濾膜將二酶分開，過濾流擊液含分子量較小的SOD等蛋白，濃縮液含分子量較大的CAT等蛋白。過濾液備用分別用作提取SOD和CAT等酶的原料；D.SOD提取上述過濾清液加入0.3mol/L的CuCl2和ZnCl2溶液，充分混勻，然后用截留分子量10000的過濾膜濃縮至原體積的1/10~1/2的過濾濃縮液。熱度性(65℃，10min)去雜蛋白，離心的清液，接著DEAE-SephadexA-50柱，即可得比活在5000u/(mg。蛋白)的高純度SOD。SOD在液體中易失活，通常將其制成凍干粉；E.CAT的提取上述濃縮液，加等量0.3mol/L的溶液，充分攪拌，然后用截留10萬分子量的過濾膜濃縮至原體積的1/2，重復二次。然后條pH至4.5，先進行等電點沉淀，然后加蛋白沉淀劑聚丙烯酸鈉(PA)，離心棄沉淀(3000rpm，30min)，這樣就可以得到CAT的精制溶液。在常溫下，CAT易失活，通常在精制液中加0.5％Na2S2O3和3％的甘油保護劑，這樣CAT的保存活力至少在半年以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種簡化工藝、避免用有機溶劑等化學方法、提高工藝效率和產(chǎn)品質量的從動物血中分離三種酶的聯(lián)產(chǎn)工藝；本發(fā)明的方法，依次投料同時獲得三種酶制劑SOD、CAT和凝血酶，大大提高了血液的利用度。制備過程中采用離心、過濾、熱變性等新思路，有效地將三種酶一一分開。
文檔編號C12N9/08GK101275129SQ200710021100
公開日2008年10月1日 申請日期2007年3月28日 優(yōu)先權日2007年3月28日
發(fā)明者周永祥, 袁勤生 申請人:蘇州市勁奧醫(yī)療器械有限公司