專利名稱：：一種藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藻類高密度培養(yǎng)，具體說(shuō)是一種藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，可用于培養(yǎng)藻類、生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品或提供水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料等。技術(shù)背景藻類可利用氣體中的二氧化碳進(jìn)行光自養(yǎng)，富含蛋白質(zhì)、脂肪和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有繁殖快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，常作為水產(chǎn)養(yǎng)殖用的餌料。同時(shí)，藻類遺傳及生化組成特殊性及代謝途徑的復(fù)雜性，決定其潛在的營(yíng)養(yǎng)與藥學(xué)價(jià)值，人類可從中開(kāi)發(fā)出大量結(jié)構(gòu)特異的高附加值的生物活性成分。亞心形扁藻規(guī)模化培養(yǎng)存在的主要問(wèn)題是藻細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，倍增時(shí)間長(zhǎng)制約了亞心形扁藻在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。藻類規(guī)模化人工培養(yǎng)目前主要有開(kāi)放式培養(yǎng)和封閉式光生物反應(yīng)器二類方式。開(kāi)放式培養(yǎng)相對(duì)簡(jiǎn)單、投資低；但該方式培養(yǎng)微藻的產(chǎn)率低，存在嚴(yán)重的生物污染，限制藻類培養(yǎng)和資源開(kāi)發(fā)。復(fù)雜的封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)藻類易于控制生物污染，產(chǎn)率相對(duì)高，但成本相對(duì)也高。因此，開(kāi)發(fā)高密度培養(yǎng)基及構(gòu)建低廉高效的光生物反應(yīng)器裝置成為開(kāi)發(fā)藻類資源的關(guān)鍵核心技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供的一種藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，本發(fā)明將優(yōu)化培養(yǎng)基與光生物反應(yīng)器聯(lián)用，可達(dá)到藻類高密度培養(yǎng)的目的，培養(yǎng)所需時(shí)間短，可大幅度地減少投資，達(dá)到藻類資源開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)可行的。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為-一種藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，于光生物反應(yīng)器中添加高密度培養(yǎng)基，將微藻細(xì)胞接種于光生物反應(yīng)器中，接種密度為0.1xl06lxl()6cells/mL，平均光強(qiáng)為4000~6000lx，采用左右兩個(gè)方向采光，溫度控制在15~30°C，光暗時(shí)間比為10-24h:14-0h，每升培養(yǎng)基通氣量為0.05-1L/min;所述高密度培養(yǎng)基是由經(jīng)砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營(yíng)養(yǎng)鹽制成，營(yíng)養(yǎng)鹽的添加量為NaN0341360mg/L,NaH2P04'2H2012100mg/L，Tris0~1000mg/L,CH3COOH0~2ml，EDTA-Na20~60mg/L,H3B0325~50mg/L，F(xiàn)eCl3.6H2015mg/L,MnCl2.4H200~0.5mg/L，ZnCl20~0.05mg/L,CoCl2.6H20(M).05mg/L,CuS04.5H2000.05mg/L。通入的氣體為空氣或空氣與二氧化碳(包括大氣中的C02及工廠排放氣中的C02)的混合氣，二氧化碳與空氣的體積比例為0.05~10%;微藻包括來(lái)自淡水或海水的藻類，最好為綠藻或金藻。所述高密度培養(yǎng)基是由經(jīng)砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營(yíng)養(yǎng)鹽制成，營(yíng)養(yǎng)鹽的添加量最好為NaN03807mg/L，NaH2PCV2H2055mg/L，Tris830mg/L，CH3COOH0.6ml,EDTA-Na45mg/L,H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3'6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200，mg/L。所述光生物反應(yīng)器由氣源經(jīng)主管路與培養(yǎng)單元相連接構(gòu)成；其中培養(yǎng)單元為1個(gè)或1個(gè)以上的多個(gè)并聯(lián)；培養(yǎng)單元由透明材質(zhì)(透明材質(zhì)為玻璃管和塑料袋包括聚丙烯、聚氯乙烯或聚丙烯等)制成，培養(yǎng)單元的左右兩側(cè)均設(shè)置有光源(光源為太陽(yáng)光和人工光源)；培養(yǎng)單元的底部設(shè)置有由多孔材料構(gòu)成的布?xì)馄?，布?xì)馄飨露嗽O(shè)置有與外管路相通的進(jìn)氣Ch所述氣源為相互并聯(lián)的氣瓶與壓縮泵，它們分別通過(guò)氣體控制閥和氣體流量計(jì)與主管路相連通。所述多孔材料可為玻璃泡、篩板、珊瑚礁或氣石等，最好為篩板。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)-本發(fā)明通過(guò)合理配置氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度、碳源、光強(qiáng)、有效接收轉(zhuǎn)化光能、藻液的攪動(dòng)程度，實(shí)現(xiàn)藻類短期內(nèi)快速增殖，縮短培養(yǎng)時(shí)間。本發(fā)明的光生物反應(yīng)器能充分利用轉(zhuǎn)化光能，有效保障體系內(nèi)部的藻液營(yíng)養(yǎng)分布均勻一致，避免光反應(yīng)器內(nèi)存在的死角問(wèn)題，氣體交換(補(bǔ)償二氧化碳)充分，降低了細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，極大提高微藻培養(yǎng)效率。本發(fā)明適于微藻高密度規(guī)模生產(chǎn)，為微藻資源綜合開(kāi)發(fā)利用提供經(jīng)濟(jì)效益。圖1為本發(fā)明光生物反應(yīng)器正面觀示意圖；圖2為本發(fā)明光生物反應(yīng)器側(cè)面觀示意圖；注l.氣瓶；2.壓縮泵；3.氣體控制闊；4.氣體流量計(jì)；5.光生物反應(yīng)器;6.光源；7為布?xì)馄鳎?箭頭表示氣流方向)圖3為不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式扁藻細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)圖譜。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法與結(jié)果進(jìn)行說(shuō)明，本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)參照申請(qǐng)人已申報(bào)的專利(申請(qǐng)?zhí)?3110981.0，發(fā)明名稱一種海洋綠藻兩步法生物光解水制氫方法)進(jìn)行，其他試劑均為商業(yè)化的試劑。所述光生物反應(yīng)器由氣源經(jīng)主管路與培養(yǎng)單元5相連接構(gòu)成；所述培養(yǎng)單元5為多個(gè)并聯(lián)；培養(yǎng)單元5由透明材質(zhì)制成，培養(yǎng)單元的左右兩側(cè)均設(shè)置有光源6;培養(yǎng)單元5的底部設(shè)置有由篩板制成的布?xì)馄?，布?xì)馄飨露嗽O(shè)置有與外管路相通的進(jìn)氣口；所述氣源為相互并聯(lián)的氣瓶1與壓縮泵2，它們分別通過(guò)氣體控制閥3和氣體流量計(jì)4與主管路相連通。實(shí)施例1亞心形扁藻由遼寧省大連水產(chǎn)研究所提供，并經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)室平板純化。用經(jīng)砂濾的天然海水ll(TC高壓蒸汽滅菌15min，冷卻后添加不同營(yíng)養(yǎng)鹽，配制康維方培養(yǎng)基(NaN03100mg/L，NaH2P04'H2020mg/L，EDTA—Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3-6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L)。從瓊脂平板挑取的單細(xì)胞藻落，經(jīng)逐級(jí)放大培養(yǎng)，獲得種子細(xì)胞。細(xì)胞接種密度為0.6xl06cells/mL，平均光強(qiáng)為5000lx，采用左右兩個(gè)方向采光，溫度控制在25'C，光暗時(shí)間比為14h:10h。依照均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)要求將氮、磷、Tris-HAc按不同比例配制成10培養(yǎng)基，其中氮摩爾濃度為0.0516mM，磷摩爾濃度為0.01lmM，Tris-HAc濃度從1.6540mM(以Tris計(jì)，Tris:HAc=10mM:lml)，各培養(yǎng)基中微量元素含量均同康維方培養(yǎng)基。對(duì)培養(yǎng)10天的結(jié)果進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，并取200ml勻勻的藻A菱離心、精'洗、烘干、稱重。結(jié)J艮如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由上表可知7~10號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)效果均明顯優(yōu)于其它培養(yǎng)基，即氮源濃度在4~16mM范圍內(nèi)能有效促進(jìn)扁藻細(xì)胞快速增殖，其獲得藻細(xì)胞數(shù)量均為在康維方培養(yǎng)條件下的1.98倍以上，最高達(dá)2.3倍。利用10種培養(yǎng)基獲得扁藻細(xì)胞干重對(duì)其培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，在不計(jì)微量元素的情況下，由Matlab統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算得到優(yōu)化培養(yǎng)基為N03—-N9.50mM，P043—_P0.34mM，Tris-HAc6.7mM。實(shí)施例2亞心形扁藻由遼寧省大連水產(chǎn)研究所提供，并經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)室平板純化。5用經(jīng)砂濾的天然海水ll(TC高壓蒸汽滅菌15min，冷卻后添加營(yíng)養(yǎng)鹽，配制康維方培養(yǎng)基(NaN03100mg/L，NaH2P04'H2020mg/L，EDTA—Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3.6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L)和優(yōu)化培養(yǎng)基(NaN03807mg/L,NaH2P04.2H2055mg/L,Tris830mg/L,CH3COOH0.6ml，EDTA-Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3.6H201.3mg/L,MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04'5H200.02mg/L,(NH4)6M07024.4H200.009mg/L))。。從瓊脂平板挑取的單細(xì)胞藻落，經(jīng)逐級(jí)放大培養(yǎng)，獲得種子細(xì)胞。細(xì)胞接種密度為0.6xl06CellS/mL，將藻液分為兩組，一組進(jìn)行康維方培養(yǎng)基搖瓶靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)搖46次，另一組放入12個(gè)培養(yǎng)單元裝置，透明材料為玻璃管，底部通氣裝置多孔材料為篩板，均勻設(shè)計(jì)得到的優(yōu)化培養(yǎng)基，通入空氣培養(yǎng)，流速為200ml/min，平均光強(qiáng)為5000lx，采用左右兩個(gè)方向采光，溫度控制在25t:，光暗時(shí)間比為14h:10h。從圖3可以看出，培養(yǎng)到第15天，采用搖瓶靜置培養(yǎng)的方式，細(xì)胞密度達(dá)2X10^dls/mL，而采用光生物反應(yīng)器優(yōu)化培養(yǎng)基通空氣培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)8X10^ells/mL。利用光生物反應(yīng)器，光自屏蔽現(xiàn)象得以改善，光能利用率提高，氣體交換通暢，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。權(quán)利要求1.一種藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于于光生物反應(yīng)器中添加高密度培養(yǎng)基，將微藻細(xì)胞接種于光生物反應(yīng)器中，接種密度為0.1×106～1×106cells/mL，平均光強(qiáng)為4000～6000lx，采用左右兩個(gè)方向采光，溫度控制在15～30℃，光暗時(shí)間比為10-24h∶14-0h，每升培養(yǎng)基通氣量為0.05～1L/min；所述高密度培養(yǎng)基是由經(jīng)砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營(yíng)養(yǎng)鹽制成，營(yíng)養(yǎng)鹽的添加量為NaNO34～1360mg/L，NaH2PO4·2H2O12～100mg/L，Tris0～1000mg/L，CH3COOH0～2ml，EDTA-Na20～60mg/L，H3BO325～50mg/L，F(xiàn)eCl3·6H2O1～5mg/L，MnCl2·4H2O0～0.5mg/L，ZnCl20～0.05mg/L，CoCl2·6H2O0～0.05mg/L，CuSO4·5H2O0～0.05mg/L。2.按照權(quán)利要求1所述藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述通入的氣體為空氣或空氣與二氧化碳的混合氣，二氧化碳與空氣的體積比例為0.05~10%。3.按照權(quán)利要求1所述藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述微藻為綠藻或金藻。4.按照權(quán)利要求1所述藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述高密度培養(yǎng)基是由經(jīng)砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營(yíng)養(yǎng)鹽制成，營(yíng)養(yǎng)鹽的添加量為NaN03807mg/L，NaH2P(V2H20:55mg/L,Tris830mg/L,CH3COOH0.6ml,EDTA-Na45mg/L,H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3.6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L,ZnCl20.021mg/L,CoCl2-6H200.02mg/L,CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L。5.按照權(quán)利要求1所述藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述光生物反應(yīng)器由氣源經(jīng)主管路與培養(yǎng)單元(5)相連接構(gòu)成；其中培養(yǎng)單元(5)可為1個(gè)或1個(gè)以上的多個(gè)并聯(lián)；培養(yǎng)單元(5)由透明材質(zhì)制成，培養(yǎng)單元的左右兩側(cè)均設(shè)置有光源(6);培養(yǎng)單元(5)的底部設(shè)置有由多孔材料構(gòu)成的布?xì)馄?7)，布?xì)馄飨露嗽O(shè)置有與外管路相通的進(jìn)氣口；所述氣源為相互并聯(lián)的氣瓶(1)與壓縮泵(2)，它們分別通過(guò)氣體控制閥(3)和氣體流量計(jì)(4)與主管路相連通。6.按照權(quán)利要求5所述藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述多孔材料為玻璃泡、篩板、珊瑚礁或氣石。7.按照權(quán)利要求5所述藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述多孔材料為篩板。全文摘要本發(fā)明涉及藻類高密度培養(yǎng)，具體說(shuō)是一種藻類細(xì)胞快速高密度培養(yǎng)方法，于光生物反應(yīng)器中添加高密度培養(yǎng)基，將微藻細(xì)胞接種于光生物反應(yīng)器中，采用左右兩個(gè)方向采光。本發(fā)明通過(guò)合理配置氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度、碳源、光強(qiáng)、有效接收轉(zhuǎn)化光能、藻液的攪動(dòng)程度，實(shí)現(xiàn)藻類短期內(nèi)快速增殖，縮短培養(yǎng)時(shí)間。本發(fā)明的光生物反應(yīng)器能充分利用轉(zhuǎn)化光能，有效保障體系內(nèi)部的藻液營(yíng)養(yǎng)分布均勻一致，避免光反應(yīng)器內(nèi)存在的死角問(wèn)題，氣體交換充分，降低了細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，極大提高微藻培養(yǎng)效率。本發(fā)明適于微藻高密度規(guī)模生產(chǎn)，為微藻資源綜合開(kāi)發(fā)利用提供經(jīng)濟(jì)效益。文檔編號(hào)C12N1/12GK101265449SQ20071001059公開(kāi)日2008年9月17日申請(qǐng)日期2007年3月14日優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日發(fā)明者遠(yuǎn)劉,衛(wèi)張,虞星炬,禎郭,金美芳,陸洪斌,陳兆安申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所